（环境科学专业论文）产脂肪酶微生物的筛选及其全细胞固定化研究.pdf

a b s t r a c t _ 一 a b s t r a c t u n d e rt h ep r e s s u r eo fc r u d eo i le x h a u s t i o na n dd e m a n di n c r e a s i n g ，t od e v e l o p t h eb i o d i e s e li so fs t r a t e g i ci m p o r t a n c et os u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n to fe c o n o m y , l i g h t e n i n g t h ee n v i r o n m e n t a ls t r e s s ，c o n t r o l l i n gg r e e n h o u s eg a s e m i s s i o na n d c o n s t r u c t i n gl o w c a r b o ns o c i e t y c o m p a r e dt oo t h e rm e t h o d st os y n t h e s i z eb i o d i e s e l ， u s i n gb i o l o g i c a le n z y m eh a sm a n ya d v a n t a g e s ，s u c h a sm i l dr e a c t i o nc o n d i t i o n s ， s m a l la m o u n to fa l c o h o l , 1 0 wc o n t e n to fw a t e ra n df r e ef a t t ya c i di nf e e d s t o c k ， n o n - p o l l u t i n ge m i s s i o na n ds oo n b u tf l e el i p a s ei se a s yt oc l u s t e ra n dv e r yu n s t a b l e a sw e l la sr u n n i n go f fs e r i o u s l yb e i n gd i f f i c u l tt ob es e p a r a t e d ，w h i c hm a k e sl i p a s e m e t h o dc o s tt o oh i g h l y , s ot e c h n o l o g yo fl i p a s ei m m o b i l i z a t i o nh a sd e v e l o p e dt o s o m ee x t e n t h o w e v e r , t h eh i g hc o s to ft h i st e c h n o l o g yr e s t r i c t st h ew i d e s p r e a d a p p l i c a t i o ni nt h ec o m m e r c i a lp r o c e s s t h e r ea l ea b u n d a n tm i c r o b i a lr e s o u r c e si ns o i l ，w h i l em o s to fm i c r o b i a lc a n s e c r e tl i p a s e ，s os o m el i p a s e - s e c r e t i n gm i c r o b i a li sf i r s ts e l e c t e df r o ms o i l sp o l l u t e d b yf a to rp l a n to i l ，o fw h i c ht h ee n z y m a t i ca c t i v i t ya n db i o l o g i c a lf e a t u r e sw e r e s t u d i e di no r d e rt os e a r c hak i n do fm i c r o b i a ls u i t a b l ef o rp r o d u c i n gb i o - d i e s e lf r o m p l a n to i la n dt h e r e f o r et ol o w e rt h ec o s to fb i o - d i e s e li n d u s t r yb ye n z y m e v i c t o r i a b l u ei su s e dt os e l e c tam i c r o b i a lw i t hg o o dl i p a s e s e c r e t i n ga c t i v i t y t h i sm i c r o b i a li s i d e n t i f i e dt ob ee n t e r o b a c t e rs p b y16 srr n am o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d t h el i p a s e a c t i v i t yo f t h em i c r o b i a li ss t u d i e di nt h i st e x t t os t u d yt h ei m p a c to fc u l t u r et i m ea n d t e m p e r a t u r eo nl i p a s e s e c r e t i n ga c t i v i t y , t h eb e s tc u l t u r ep e r i o do f4 d a y sa n db e s t c u l t u r i n gt e m p e r a t u r eo f3 2 。c a led e t e r m i n e d b yt h ep hc h a n g i n gf r o ms u b a c i d i t yt o a l k a l e s c e n c e t h e nt os t r o n gb a s i c i t y , l i p a s ea c t i v i t yf i r s tr i s e sa n dt h e nd e c l i n e s ， d e t e r m i n i n gt h eb e s tp h o f8 5 f r e ee n z y m ei se a s yt og a t h e rt o g e t h e r , e x t r e m e l yu n s t a b l ea sw e l la sd i f f i c u l tt o s e p a r a t e a n dl o s tt o om u c h ，w h i c hi n c r e a s e st h ec o s to fe n z y m a t i cp r o c e s so f b i o d i e s e ls ot h a t e n z y m a t i c i m m o b i l i z a t i o nh a sm a d es o m e p r o g r e s s t h e d i s a d v a n t a g e o ft h i s t e c h n o l o g y , i e 1 0 we n z y m ei m m o b i l i z a t i o n r a t e ，s e v e r e i i a b s t r a c t d e a c t i v a t i o na n dh i g hc o s t ，r e s t r i c t i n gt h ei n d u s t r i a l i z a t i o no fi t t h i sp a p e rh a st r i e d a n d c o m p a r e d s o m ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o do f l i p a s e o n e i s a d s o r b i n g i m m o b i l i z a t i o n ，a f t e ri m m o b i l i z i n gt h el i p a s eo nf i l t e r i n gp a p e rb ya m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o na n dv a c u u ml e a c h i n g ，5 0 o ft h ef r e ee n z y m a t i ca c t i v i t yc o u l db e r e t a i n e d b e s i d e s ，o n es o r b e n to fp o l y a m i n ec h i t o s a nb a l lb o n d i n gm e t a lc o m p l e x e s h a sb e e ns y n t h e s i z e dt oa d s o r bw h o l e c e l l ，b u tn oe n z y m a t i ca c t i v i t yi sd e t e c t e d t h e o t h e ro n ei sw h o l e - c e l li m m o b i l i z a t i o n ，c o c u l t u r es o d i u ma l g i n a t ea n df e r m e n t a t i o n b r o t h ，a n dt h e nc a l c i f yi tb yd r o p p i n gi n t oc a l c i u mc h l o r i d e s o l u t i o n ，o b t a i n i n g c a l c i u ma l g i n a t eg e lb a l lw i t hw h o l e c e l lm i c r o o r g a n i s mi ni t t h e nm a k et h eg e lb a l l s t a yi n s i d ec h i t o s a ns o l u t i o na n dan o b l ec a p s u l ec a l lb eg m n e d t h ec a l c i u ma l g i n a t e g e lb a l lc a nr e t a i n3 2 o ft h ee n z y m a t i ca c t i v i t y , w h i l et h a to fc a p s u l ec a n n o tb e d e t e c t e do b v i o u s l 5h o w e v e r , s o m ea c t i v i t yo fc u tc a p s u l ec a nb ed e t e c t e d k e y w o r d s ：b i o d i e s e l ，e n z y m a t i cm e t h o d ，l i p a s e s c r e t i n gm i c r o b i a l ，w h o l e c e l l i m m o b i l i z a t i o n i i i 第一章引言 1 1 1 研究目的 第一章引言 第一节研究的目的和意义 ( 1 ) 从富油土壤中自主筛选和优化培养具有新特性、高活性和低成本的脂 肪酶菌株，对其种属进行鉴定，研究其生物活性和酶学特性。 ( 2 ) 合成多孔多胺化壳聚糖金属配合物微球，吸附固定脂肪酶全细胞，研 究其利用植物油脂酯化合成生物柴油的催化性能及影响因素。 ( 3 ) 合成壳聚糖胶囊，包埋固定产脂肪酶菌株全细胞，研究其利用植物油 脂转酯化合成生物柴油的催化性能及影响因素。 1 1 2 研究意义 在石油资源日趋枯竭和需求量目益扩大的双重压力下，大力发展生物柴油 对推动经济可持续发展、减轻环境压力、控制温室气体排放和建设低碳社会具 有特别重要的战略意义。 生物酶法合成生物柴油与其他方法相比，具有反应条件温和、醇用量小、 对原料中水和游离脂肪酸含量要求低、无污染排放等优点。但是游离酶易聚集 成团，极不稳定，且不易分离，流失严重，使得酶法生产生物柴油成本过高， 所以酶的固定化技术得到一定发展。然而，目前酶的固定化技术由于固化效率 低和酶失活较严重，成本较高等原因，制约着该技术的产业化应用。 本课题在前期研究基础上，从富油土壤中筛选出对餐饮废油具有新特性和 高活力的产脂肪酶微生物，并提出利用多胺化壳聚糖金属配合物为载体，固化 产脂肪酶菌株全细胞，通过增加载体上活性胺基，提供更多活性位，提高载体 表面的金属离子含量，从而提高脂肪酶全细胞的固化效率；利用全细胞的固定， 避免了因为脂肪酶的提纯和分离及在固化过程中易失活而造成生产成本较高， 该研究获得成功可有效突破目前酶法生产生物柴油技术产业化的瓶颈。 第一章引言 1 2 1 能源形势严峻 第二节选题的背景 国际能源危机首次出现在在2 0 世纪7 0 年代，这时候发达国家的经济高速 增长。随着发达国家的能源需求种类结构逐渐向以石油为主导的能源结构迈进， 狭义上的能源危机主要是指石油的持续稳定供应危删。 目前探明全球剩余石油储量1 6 8 6 亿吨，以现有的发展速度计算还可以使用 4 0 年。我国石油剩余经济可采储量约为2 0 4 3 亿吨，2 0 0 7 年7 月在渤海湾地区 发现储量为1 0 亿吨的冀东南堡油田，即便这1 0 亿吨全部为经济可采储量，总 共也只有3 0 4 3 亿吨石油。而在2 0 0 9 年我国石油消费量达到4 亿吨，若全部利 用国产的原油，那么不到八年就将枯竭【2 】。 改革开放之后，我国开始进入轻工业加速发展时期，这个时期的产业结构 特征决定了经济社会的发展对能源需求并不十分强烈，而且，能够通过出口煤 炭、石油等能源以换取大量外汇储备。然而，随着我国逐步向重工业化阶段迈 进，尤其是2 0 世纪以来，国内的能源需求迅速增长，导致供求缺口不断扩大。 一方面，石油的对外依存度大幅度上升，容易造成石油突发事件的发生，但石 油危机管理体系建设的步伐跟不上石油供需缺口的迅速扩张。另一方面，我国 从此时开始出现煤炭净进口局面。数据表明，2 0 0 9 年我国累计进口煤1 2 6 亿吨， 比2 0 0 8 年同比增长超过2 1 0 ；出i s i 煤2 2 4 0 万吨，同比下降的幅度超过5 0 ， 导致全年净进口煤1 0 3 亿吨j 。 长期来看，我国能源形势十分严峻，但能源需求却不断增大。预测到2 0 5 0 年，我国能源年耗将达到标煤3 8 亿吨( 相当于2 0 0 0 年的3 倍) ，届时将成为 世界第一能耗大国p j 。 1 2 2 生物柴油兴起 在日益紧迫的能源形势下，可替代新能源不断发展，生物柴油就是其中一 个。有文章纠总结了2 0 0 2 年至2 0 0 9 年间生物柴油研究论文发表情况。从2 0 0 2 年的4 篇开始，逐年上升，到2 0 0 8 年达到最大值4 2 6 篇，之后出现下降。但总 的来说，我国已经拥有了自主开发生物柴油的技术，创新能力和知识产权意识 2 第一章引言 在不断增强，并且由于国家的高度重视，投资力度正不断加大，生物柴油的研 究逐步成为新能源领域的研究重点，为替代石化柴油奠定了一定的基础。 据统计，生物柴油的制备方法仍然是生物柴油的主要研究方向，占总数的 4 6 1 1 ，其他研究为关于原料、相关政策以及生物柴油特性研究。 研究物理法生产生物柴油的论文所占比重很小，约2 6 0 ，可能是由于由于 物理方法生产的生物柴油是一种分散的多相体系，存在着一系列问题，包括稳 定性、物化性能指标难以控制等。化学法研究约占研究论文的9 7 4 0 ，是目前 制备生物柴油的主要生产方法。化学法生产生物柴油的关键在于催化剂，根据 催化剂种类的不同，化学法又分均相催化法、非均相催化法、生物催化法和超 临界法等。由于均相催化过程中会产生废酸或者废碱液，容易对环境造成“二 次污染”，传统的均相催化法只占约2 0 7 8 。大约7 6 6 2 的研究都集中在如何 利用新型催化剂制备生物柴油上，其中以固体酸或固体碱非均相催化法研究最 多，占约4 5 4 6 ；其次为生物酶催化法，约占2 5 9 7 ；超临界甲醇法大概占 5 1 9 。 根据联合国粮农组织对全球生物柴油产量的估计 4 】，2 0 1 2 年预计达到2 0 0 亿升，2 0 1 7 年预计达到近2 5 0 亿升。其中最具代表性的是全球生产生物柴油最 多的地区欧盟，2 0 0 7 年，生物柴油总产量达到5 7 0 万吨，2 0 0 8 年增加到7 8 0 万 吨，已占成品油市场的5 以上，2 0 0 9 年为8 2 5 万吨。欧盟生产生物柴油的原料 主要是油菜籽，占用了约6 5 的油菜籽消耗量。由于油菜籽需求量不断增加， 使得菜籽价格上涨，一些生物柴油企业的生产和销售开始陷入停滞状态。 据粗略统计，截至2 0 0 7 年，我国已有万吨以上大型生物柴油生产企业5 0 余家，小型生产企业则更是到处可见【5 1 。我国植物油资源紧缺，需要综合使用各 种原料。其中废油脂的利用对减少资源、能源及环境压力十分有利并具有重要 战略意义。还可扩大生物柴油原料来源，降低成本，提高生物柴油的市场竞争 力。 第一章引言 1 3 1 生物柴油概况 第三节文献综述 1 3 1 1 生物柴油基本概念 生物柴油是以大豆和油菜籽等油料作物、油棕和麻风树等油料林木果实、 工程富油微藻等油料水生植物以及动物油脂、餐饮废油脂等为原料制成的液体 燃料，主要成分是长链脂肪酸甲酯或者乙酯，作为一种清洁的可再生能源，生 物柴油是典型“绿色能源”，可以作为化石柴油替代品【6 1 。大力发展生物柴油， 可以有效促进经济可持续发展、推进能源替代以减轻环境压力，还可以控制城 市大气污染。生物柴油具有以下特性。 ( 1 ) 环保。由于生物柴油中硫含量低，燃烧后二氧化硫和硫化物的排放量 降低，正常情况下可减少约3 0 ( 有脱硫催化剂存在时为7 0 ) ；生物柴油中不 含芳香烃，因而其燃烧废气对人体损害低于化石柴油。 ( 2 ) 润滑性好。其优良的润滑性能使喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损率 低，可以延长机器使用寿命。 ( 3 ) 安全性好。生物柴油闪点高，不易白燃，运输、储存、使用过程有安 全保障。 ( 4 ) 燃烧性好。生物柴油具有较高的十六烷值，使生物柴油的燃烧性好于 一般的化石柴油。 ( 5 ) 可再生。不同于固定的石油储量，生物柴油可以获得源源不断的供应。 ( 6 ) 无须改造柴油机，直接使用，并且在使用时不必另外安装加油设备和 储存设备，也不需要对工作人员进行特殊的技术训练。 ( 7 ) 生物柴油按照一定比例与化石柴油混合使用，可以在降低油耗的同时 提高汽车动力性以及降低尾气污染。 1 3 1 2 生物柴油原料来源 目前生物柴油的原料来源挺多，主要包括食用草本植物油、木本油料植物 油、废弃油脂和水生植物油等。 4 第一章引言 ( 1 ) 食用草本植物油。食用油料作物主要指菜籽、大豆、花生、棉、米糠等， 利用这些原料生产出来的生物柴油品质好，质量比较稳定，来源充足。欧盟、 美国等发达地区或国家，生产生物柴油的主要原料一般是菜籽油。 ( 2 ) 木本油料植物油。木本油料植物种类非常广泛，主要有棕桐、麻疯籽、 黄连木、乌桕、文冠果、苦楝籽、油莎豆、果皮精、苦杏仁、花椒、松节等。 木本油料植物油成本低，产品生物柴油油品好，质量稳定，但目前原料产量很 少，难以满足需要。另外，有一些木本油料植物种子具有毒性，如麻疯果榨油 后的饼粕含有极毒的物质，安全问题要特别引起重视，以防止带来更大的环境 污染。 ( 3 ) 废弃油脂。据估计，我国每年产生大量的地沟油、煎炸油、油脚、酸化 油、废弃机油等废弃油脂，总量约4 0 0 - - 8 0 0 万吨【。7 1 。 ( 4 ) 水生植物油。藻类是水生微生物的一种，其太阳能利用效率高，可以从 中炼制植物油，通过一定地技术手段还可以提高单位面积产油量，使其达到大 豆等陆生油料作物的几十倍。 1 3 1 3 生物柴油生产方法 1 ) 化学法制备生物柴油 用化学法生产生物柴油仍然是当前的主要方式，其反应原理是，用动物脂 肪或植物油脂与甲醇或者乙醇等低碳醇作为反应底物，利用强酸或者强碱作为 催化剂，将反应体系置于高温( 2 3 0 2 5 0 ) 下进行酯交换反应，生成相应的脂肪 酸甲酯或脂肪酸乙酯，再经分离、洗涤、干燥等工艺即可获得生物柴油。甲醇 或乙醇在生产过程中保持过量，可循环利用，该工艺生产设备与一般制油设备 相同，生产过程的副产品主要是甘油，其产生量大概为1 0 左右。化学法合成 生物柴油具有较多缺点，其工艺复杂，操作不便，该生产过程中醇必须过量， 使得后续工艺必须有相应的醇回收装置，这就提升了生产能耗；另外，由于脂 肪中不饱和成分在高温下容易变质，使得生成的生物柴油色泽比较深；还有， 酯化产物难分离，回收成本高也是一个弊端；生产过程有废碱液排放，处理不 当容易造成二次污染。这一系列的问题都引起了相关研究领域的科研工作者的 重视【引，希望对相关工艺进行改良。 2 ) 酶法制备生物柴油 5 第一章引言 为解决化学法的一些问题，人们开始研究生物酶的催化性能，期望能够用 其作为新型催化剂合成生物柴油，用动物脂肪或植物油脂和低碳醇( 主要是甲 醇或者乙醇) 通过脂肪酶进行酯交换反应，制备相应的脂肪酸甲酯或者脂肪酸 乙酯。相对于化学法制备生物柴油，脂肪酶法具有很多优点，脂肪酶催化酯交 换反应条件温和，生产能耗较低，反应体系中产生的游离脂肪酸和水对该反应 的影响较小，并且脂肪酶还可以将各种类型的废弃油脂中的脂肪酸通过酯交换 反应转化合成生物柴油，达到无污染排放【9 】。目前用于催化合成生物柴油的脂肪 酶来源主要有酵母、根霉、毛霉、猪胰等。国内有很多大学采用脂肪酶制备生 物柴油，有一些取得了较好的效果，清华大学采用全新酶法工艺，在中试过程 中实现了常温常压下将动植物油脂转化生成生物柴油【1 0 】。目前脂肪酶对长链脂 肪醇的转酯化催化有效，而对低碳醇( 主要是甲醇或乙醇) 转化率低，低碳醇对酶 有较强毒性，很容易造成脂肪酶的使用寿命缩短。酶催化法生产生物柴油的副 产物主要是甘油和水，难于回收。一方面，过高的产物浓度会抑制催化反应的 进行，对产物形成不利，另一方面，过多的甘油对固定化酶有毒性，使固定化 酶使用寿命缩短。要想提升酶法生产生物柴油的生产效率，需要想方设法及时 去除反应副产物。 虽然含水量4 3 0 的大豆油和含水量7 5 的废油脂为原料生产生物柴油 已有报道【l l 1 2 13 1 ，但是当原料中含水量超过2 5 时，过量水分易引起酶活性中 心水簇的形成，可改变酶活性中心的结构，最终导致酶活性下降，使产率不尽 人意。寻求一种催化废油脂生产生物柴油过程中产率受含水量影响较小的高活 性、低成本的脂肪酶对促进酶法生产生物柴油的产业化发展具有重要意义，可 有效解决目前酶法生产生物柴油的瓶颈问题。 3 ) 工程微藻法制备生物柴油 所谓“工程微藻”，是硅藻类的一种，最初是由美国国家可更新实验室( n r e l ) 通过现代生物技术发明的。该微藻细胞中脂质含量获得大幅度提高。目前，正 在进行相关研究，希望能够选择合适的分子载体，引入a c c 基因后，使其在细 菌、酵母和植物中可以得到充分表达，还有研究进一步将修饰的a c c 基因引入 微藻中，期望获得更高效表达。利用“工程微藻”生产生物柴油具有重要的意 义，也具有很多优势：微藻自身繁殖能力极高，仅用海水即可作为天然培养基 进行培养，可以很大程度地节约农业资源；单位产油脂量比陆生植物高出几十 倍；生产出的生物柴油不含硫，燃烧后不会排放有毒有害气体，产物排入环境 6 第一章引言 中大多可被微生物降解，不会对环境造成环境污染 6 l 。发展富含油质的“工程微 藻”将是一个生产生物柴油的重要方向。 4 ) 超临界法制备生物柴油 超临界法制备生物柴油是由s a k a 提出 1 4 】的。所谓超临界状态，是指当温度 超过其临界温度，无法区分气态和液态的状态，此时物质处于一种流动状态， 施加任何压力都不会凝聚。由于其粘度低、密度高且扩散能力高，所以能够使 得产物提取与反应同时进行。国外也有报道在超临界c o z 流体中进行酶催化法 制备生物柴油【15 1 ，实验结果表明，用脂肪酶作催化剂在超临界c o ：中合成生物 柴油的产率小于在超临界甲醇中合成生物柴油的产率。该方法存在的问题主要 有：转化率比较低；脂肪酶种类的选择很重要，对于天然油脂来说，其组分复 杂，由于酶的催化具有专一性，要特别注意选择合适的酶；低碳醇( 主要是指 甲醇或乙醇) 对酶有一定毒性，容易导致酶失活；酶催化剂的价格非常昂贵； 还没有很好的方法可以延长酶的催化寿命；脂肪酶催化生产生物柴油生产周期 长。国内也有文献报道【1 6 1 1 7 】采用超临界法制备出了生物柴油。 1 3 2 脂肪酶概述 1 3 2 1 脂肪酶概念 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c 3 1 1 3 ，甘油酯水解酶) 是一类特殊的酯键水解酶。可 以催化甘油三酸酯及其他水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的 逆向合成等反应。取决于反应体系的特点，脂肪酶会表现出不同的催化活性， 在油水界面主要起水解作用，在有机相中主要起酶促合成和酯交换作用n 吼1 9 3 。 1 3 2 2 脂肪酶来源 土壤中蕴含丰富的微生物资源，脂肪酶在微生物中分布广泛。目前已报道 的产脂肪酶微生物大约6 5 个属，其中细菌2 8 个属、放线菌4 个属、酵母菌1 0 个属、其他真菌2 3 个属，但是实际上产脂肪酶微生物的分布要广泛的多，目前 还不断发现报道新的产脂肪酶的微生物。从微生物中筛选出具有新特性和高活 力的脂肪酶是一项非常有意义的工作。 第一章引言 脂肪酶的筛选，国内外进行了不少相关的研究，张振乾 2 0 等以橄榄油为唯 一碳源，在含维多利亚蓝的培养基上筛选来自油菜土壤的样品，获得一株活力 较高的e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s ，在最佳催化条件下，其粗发酵液催化含水量为 9 1 3 5 的芝麻油原料，产率可实现5 4 5 1 ，表明该菌可催化含水量较高的原料 生产生物柴油。虽然产率不高，但是该研究为脂肪酶催化含水量较多的废油脂 生产生物柴油提供一个重要研究思路。 燕清丽【2 l 】等从油污土壤样品中分离获得产脂肪酶菌株b a c i l l u sp u m i l u sb 2 ， 酶活性达到1 0 1 2u m l ；洪骏【2 2 】等以r o d a m i n eb 平板筛选得到碱性脂肪酶产生 菌p s e u d o m o n a ss p z j u 0 2 ，最适条件下培养7 2 h ，酶活性达8 6u m 1 ：杨永梅【2 3 】 等从油脂厂附近的土壤中筛选到1 株假单胞菌，培养4 8 h ，酶活性达1 9 1u m l ； e n s h y hl i n 2 4 1 等在5 甘油，o 5 n a n 0 3 ，0 1 v b l 下培养1 7 h ，酶活性达5 4u m l 。 但是这些方法由于培养基比较昂贵，酶活性不高，培养时间过长等原因，而不 适宜大规模工业化生产。 近年来，通过物理化学诱变、细胞杂交、蛋白质定向进化、以及转基因技 术等筛选特异性和高酶活菌株技术被广为关注。袁强【2 5 】等以实验筛选得到一株 酶活为2 7 3 5u m l 的细菌为出发菌，经过l o o s 的紫外诱变得到一株脂肪酶活为 6 0 2 5u m l 的突变株，酶活提高2 2 0 。经过五次代传实验平均酶活为5 8 6 3u m l ， 可以认定其遗传稳定性较高。t a nt i a i l w e i 【2 6 】等通过紫外、n g t ( n m e t h y l n n i t r o n n i t r o s o g u a n i d i n e ) 诱变、快中子辐射筛选得一株c a n d i d a s p ，其酶活从1 1 2u m 1 提高到1 1 0 8u m 1 。l i e b e t o n 等【2 7 】对铜绿假单胞菌脂肪酶 ( p s e u d o m e o u a sa e r u g i n o s al i p a s e ，p a l ) 进行定向进化，使其光学选择性突变至 野生型的2 5 倍以上。 1 3 3 产脂肪酶菌株全细胞固定 脂肪酶的固定是利用脂肪酶进行合成和转化得以工业化应用的关键。近年 来关于固定化全细胞催化剂催化酯化油脂为生物柴油的研究引起很多学者的关 注【2 8 2 9 3 0 1 。与固定化酶相比，无需酶的提取和纯化，减少了酶活损失，有效降 低脂肪酶催化剂的生产成本【3 1 ，3 2 3 3 】。日本学者率先报道【3 4 3 5 】了米根酶全细胞催 化植物油脂酯化的反应，3 步添加甲醇，7 2 h 后，得到9 0 以上的生物柴油；b a n 等 2 9 】研究发现，将全细胞经过戊二醛交联处理后，经过6 批次反应，胞内酶的 8 第一章引言 活力仍无明显降低。固定化全细胞催化技术的发展有利于促进酶法生产生物柴 油的工业化进程，但是相关的机理研究鲜有报道。 1 4 1 菌种筛选 第四节研究内容与方法 首先采用简便快速的平板检测法，通过观察培养基上生长的菌落直径和其 水解圈直径的大小，进行初筛。再用液体培养，采用滴定法测定酶活性，进行 复筛筛选出2 3 株优良菌株。 用稀释分离法，从采集的土样中用选择培养基 3 6 】分离产脂肪酶的微生物菌 种。 初筛：将分离得到的菌种接种到平板检测培养基【37 】上，定温定时培养后， 观察所长菌落周围有无蓝绿色水解圈，水解圈直径愈大，表示该菌株产脂肪酶 能力愈强，将其中水解圈直径与菌落直径差值较大者挑选出来进行复筛。 复筛：将初筛挑选出来的菌株接入复筛培养基( 学生食堂废油脂，n i s 0 4 ， c u s 0 4 ，( n h 4 ) 2 s 0 4 ，k h 2 p 0 4 ，m g s 0 4 ，大豆粉，葡萄糖，c a c 0 3 ，一定比例混 合，经高速乳化后灭菌) 中，在摇床上定温定时培养后，取发酵液用滴定法测 定酶活性，将产酶能力较高的菌株挑选出来供进一步实验。 1 4 2 菌种鉴定 根据微生物实验手册【3 引、常见细菌系统鉴定手册 3 9 1 和伯杰细菌鉴 定手册 4 0 】，对菌种进行形态学观察和生理生化实验。 1 6 s r d n a 序列同源性分析法对菌种进行鉴赳4 。 1 ) 菌种全基因的提取 以c t a b n a c l 法提取菌种全基因组d n a t 4 到。 2 ) p c r 程序扩增1 6 s r d n a 9 第一章引言 将16 s r d n a 的测定结果与g e n e b a n k 中的核酸数据对比分析，对其同源分 类鉴定。并对菌株的多项生理生化指标进行分析( 通过c l u o t a l x ( 1 8 ) 和t r e e v i e w 软件分析) 。根据1 6 s r d n a 序列同源性分析法鉴定菌株的种属原则，所鉴定菌 株与标准菌株的同源性达到9 5 以上者可认定为同属菌株。 1 4 3多子l 多胺化壳聚糖金属配合物小球载体的合成 首先配制一定浓度的壳聚糖乙酸溶液，然后边搅拌边加入一定量致孔剂乙 醇 4 3 1 ，混合均匀后，使用注射剂将上述壳聚糖乙酸溶液逐滴加入混合碱液( 乙 醇n a o h c h 3 c o o n a ) 中，制备得到多孔壳聚糖磁性微球，静置2 4 h 后，用蒸 馏水洗净，5 0 。c 恒温干燥。 然后在水和交联剂e c h 存在的条件下，8 0 恒温水浴加热，进行交联。利 用环氧氯丙烷与多孔壳聚糖磁性微球表面的c 6 o h 和- - n h 2 发生亲核取代反应， 分子中引入了烷基氯，烷基氯与另一分子或同一分子中另一结构单元的c 。o h 和- - n h 2 发生反应，实现交联，生成交联多孔壳聚糖微球，最后在胺化剂t e p a 和水存在下，6 0 恒温水浴加热，多胺化反应发生，通过四乙烯五胺取代交联 多孔壳聚糖微球中的烷基氯，使分子中引入大量的活性胺基，即得多孔多胺化 壳聚糖微球( p c c t s ) 4 4 】。 将p c c t s 分别置于一定浓度的c u s 0 4 或n i s 0 4 溶液中，震荡吸附一定时 间，取出，即得多孔多胺化壳聚糖金属配合物小球载体( p c c t s c u 、 p c c t s n j ) 。 1 4 4 多子l 多胺化壳聚糖小球固定产脂肪酶菌株全细胞 将p c c t s c u 、p c c t s n i 各两份在自制的脂肪酶全细胞溶解中浸泡，一 定时间后取出即得p c c t s c u c e l l 、p c c t s - n i c e l l 对这四种催化剂酶活性能 进行测试，若活性较高则对其微观结构进行表征。 使用仪器分析手段，研究固定化前后载体表面和脂肪酶的活性基团的变化 和反应情况；测定固化前后的脂肪酶活，对比研究多孔多胺化壳聚糖金属配合 物载体对酶活的影响。 1 0 第一章引言 1 4 5壳聚糖胶囊包埋产脂肪酶菌株全细胞 首先对发酵液实现固化，然后将固化物置于壳聚糖凝胶包围之内，再成型， 实现产脂肪酶菌株全细胞在壳聚糖内部的包埋。 第五节课题的特色与创新之处 1 5 1自主筛选菌株 从学生食堂地沟附近土壤、食用油加工厂的富油土壤中取样，进行培养， 分级筛选，获得具有新特性和高活性的多株菌株。以学生食堂废油脂为碳源， 在含有重金属c u 、n i 条件下，在摇床上定温定时培养，通过测定的酶活性，进 一步筛选出2 3 株对餐饮废油具有更高活性的菌株。 由于培养基的底物，不仅仅提供碳源和营养，还是脂肪酶产生的诱导物， 所以该筛选方法可以靶向筛选出对餐饮废油具有高催化活性且对c u 、n i 具有耐 受性的菌株。其中对金属的耐受性有利于后续的固定，即在使用壳聚糖金属配 合物载体的固定过程中，避免金属对其活性的抑制。如果成功获得高催化活性、 高稳定性和低成本的全细胞催化剂，将会解决我国生物柴油工业依靠国外昂贵 的商业脂肪酶的被动局面。 1 5 2 全细胞催化剂制备 全细胞催化剂的一大优势在于避免了酶的提纯和分离，降低成本，固化过 程不会引起酶活损失，并且回用稳定性高。 1 5 3 固定化载体新颖 制备多孔多胺化壳聚糖载体过程中，通过交联胺化引入大量活性胺基，这 些活性胺基，可为金属的吸附螯合提供更多活性反应位，即增加金属对脂肪酶 的吸附力，从而提高固化效率。另外，在合成催化剂过程中，未参与反应的胺 基，由于其亲水性，还可以避免因原料中的过量水分在脂肪酶活性中心形成水 簇而引起的酶活下降。 第一苹引言 制备包埋全细胞胶囊过程中，首先将产脂肪酶微生物固定在海藻酸钙凝胶 颗粒内，然后将海藻酸钙颗粒包埋到壳聚糖内部，希望获得具有一定缓释性能 的固定化全细胞胶囊。 第六节论文结构安排 第一章是引言部分，介绍了一下本研究的目的和意义，选题的背景，简要 做了一下文献综述，阐述了本研究的内容以及研究方法，本研究的特色以及创 新。 第二章包括本研究所包含的具体实验内容和方法。 第三章是对试验结果的展开分析和讨论。 第四章对本课题研究所获得的成果进行简短的总结，对相关研究进行了初 步展望。 1 2 第二章试验材料与方法 2 1 1 原料与试剂 第二章试验材料与方法 第一节试验材料 2 1 1 1 样品 天津市塘沽区某肉联厂附近富油土壤样品2 份，编号为f s l ，f s 2 ，水样1 份，编号为f s 3 ；天津市塘沽区某植物油厂附近富油土壤样品2 份，编号为p s l ， p s 2 ；南开大学食堂排污e l 附近富油土壤2 份，编号为r s l ，r s 2 。 2 1 1 2 主要试剂 表2 1 主要试剂 第二章试验材料与方法 ：= ： = ：= = = ：= = = = ：= = = = ：= = ：= = ：= = = = = = = = = = = 篁= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 一 氢氧化钠 分析纯天津光复科技发展有限公司 邻苯二甲酸氢钾 分析纯天津北方天医化学试剂厂 维多利亚蓝b分析纯 a l a d d i nc h e m i s t r yc o l t d 聚乙烯醇分析纯天津光复科技发展有限公司 酚酞分析纯天津北方天医化学试剂厂 海藻酸钠分析纯天津北方天医化学试剂厂 埃洛石工业纯郑州金阳光试剂 壳聚糖分析纯天津北方天医化学试剂厂 氯化钙分析纯天津北方天医化学试剂厂 柠檬酸钠分析纯天津北方天医化学试剂厂 丁酸对硝基苯酯分析纯青岛沃克试剂 对硝基苯酚分析纯天津北方天医化学试剂厂 异丙醇分析纯 a l a d d i nc h e m is t r yc o l t d 正己烷分析纯天津北方天医化学试剂厂 十七酸甲酯色谱纯 东京化成工业株式会社 油酸甲酯 色谱纯东京化成工业株式会社 亚油酸甲酯色谱纯东京化成工业株式会社 亚麻酸甲酯色谱纯东京化成工业株式会社 棕榈酸甲酯色谱纯梯希爱( 上海) 化成工业发展有限公司 硬脂酸甲酯色谱纯梯希爱( 上海) 化成工业发展有限公司 超净工作台 台式全温度恒温高速摇床h n y - 2 0 0 b 恒温水浴锅d k 2 0 0 0 l 压力蒸汽灭菌锅 s y q d s x 2 8 0 b 分析天平fa2004n 可调高速电动匀浆机 f s h 2 天津市中环实验电炉有限公司 天津欧诺仪器仪表有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 上海申安医疗仪器厂 天津欧诺仪器仪表有限公司 江苏金坛市佳美仪器有限公司 1 4 第二章试验材料与方法 - ! 一! ! = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 可见紫外分光光度计 7 5 2 n 上海精密科学仪器有限公司 气象色谱仪 p h 计 移液枪 各种常用玻璃仪器 g c 7 8 0 0 p h s 2 5 b q y - 1 0 0 0 a 京鲁科技发展公司 上海大普仪器有限公司 北京青云卓力精密设备有限公司 第二节产脂肪酶菌株分离、筛选与鉴定 2 2 1 培养基与试剂的制备 2 2 1 1 富集培养基 配方一：葡萄糖2 0 ，蛋白胨1 0 ，酵母浸膏0 5 ，食用橄榄油2 0 ， 蒸馏水1 0 0m l ，p h 自然，1 1 0 5p a 灭菌2 0m i n 。 配方二：橄榄油2 ，氯化钠0 1 ，硝酸铵0 1 ，硫酸铵0 1 ，七水硫酸 镁0 0 5 ，磷酸氢二钾0 1 ，蒸馏水1 0 0 m l ，p h 自然，1 1 0 5p a 灭菌2 0m i n 。 2 2 1 2 平板分离培养基 葡萄糖2 0 ，蛋白胨1 0 ，酵母浸膏o 5 ，琼脂2 0 ，食用橄榄油2 0 ，维多利亚蓝4m g ，蒸馏水1 0 0m l ，p h8 5 ，1 1 0 5p a 灭菌2 0m i n 。 2 2 1 3 斜面培养基 酵母浸膏0 5 9 ，葡萄糖2 o g ，蛋白胨1 0 9 ，琼脂2 0 9 ，橄榄油2 0 ，蒸 馏水1 0 0 m l ，p h 8 5 ，1 1 0 5p a 灭菌2 0m i n 。在超净台里制作斜面。 2 2 1 4 发酵培养基： 葡萄糖2 0 ，蛋白胨1 0 ，酵母浸膏0 5 ，硫酸铵0 1 ，硫酸镁0 0 5 ， 磷酸氢二钾o 2 ，食用橄榄油1 ( v v ) 。1m o l l 氢氧化钠溶液或盐酸溶液调 d h 。1 1 0 5p a 灭菌2 0m i n 。 1 5 第二章试验材料与方法 2 2 2 菌株的筛选与分离 2 2 2 1 制备土样稀释液 用天平称取5 9 土样( 或者l m l 水样) ，溶于装有约l o m l 无菌水的试管中，充 分摇匀，静置大颗粒物下沉【4 5 1 。对采集到的每一个土壤样品和水样依次进行以 上操作。 2 2 2 2 菌株的富集培养 以橄榄油作为碳源，能够起到一定的诱导作用，可加速产脂肪酶细菌产酶。 因此，对于各个样品进行以下操作： ( 1 ) 用2 5 0 m l 锥形瓶配制l o o m l 富集培养基，用l m l 刻度吸管取l m l 土 样上层悬浮液加入其中，适当摇匀； ( 2 ) 将培养基放置恒温摇床上振荡培养，培养条件：3 0 。c ，18 0r p m ，2d 。 ( 3 ) 每个样品重复3 次富集操作。 2 2 2 3 菌株的初筛 用维多利亚蓝b 作为酸碱指示剂【4 6 1 ，检测富集培养得到的菌落是否具有产 脂肪酶性能。在平板选择培养基灭菌结束后，待其稍微冷却至约6 0 。c ，置于于 6 0 。c 水浴锅中，加入维多利亚蓝b 粉末，分次少量，震荡片刻可使维多利亚蓝b 充分溶解。 ( 1 ) 用l m l 刻度吸管分别取lm l 富集培养液加至盛装有9m l 无菌水的 试管中进行倍比稀释，选择稀释梯度为1 0 、1 0 一、l o 。 ( 2 ) 用移液枪分别