（生理学专业论文）鱼类kisspeptin与gnih信号系统的鉴定及其在生殖调控中的作用研究.pdf

李水生中山人学博i ：学位论义2 0 1 0 年6 月 论文题目：鱼类k i s s p e p t i n 与g n i h 信号系统的鉴定及其在生 殖调控中的作用研究 专业：生理学 博士生：李水生 导师：林浩然院士 摘要 神经内分泌因子，k i s s p e p t i n 与g n i h ( g o n a d o t r o p i n - i n h i b i t o r yh o r m o n e ) 对 哺乳动物的生殖轴起着直接而相反的调控作用，k i s s p e p t i n 通过刺激下丘脑 g n r h 的分泌，从而促进脑垂体g t h 的合成与释放，而g n l h 则直接或通过g n r h 抑制g t h 的合成与释放。本文利用比较基因组学技术，结合分子生物学手段， 在斑马鱼( d a n i or e r i o ) 、金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 中鉴定了k i s s p e p t i n g p r 5 4 与 g n i h g n i h r 信号系统，研究了它们在青春期启动、g t h 分泌、性类固醇激素反馈 调控方面的作用，并检测k i s s p e p t i n 及其类似物对鱼类催产的效果。主要研究结 果如下： 1 与哺乳类不同，在鱼类中存在2 种k i s s p e p t i n ( k i s s i 、k i s s 2 ) 与2 种g p r 5 4 ( g p r 5 4 a 、g p r 5 4 b ) 基因。通过基因共线性分析：鱼类的2 种k i s s 来源于一个共 同的祖先基因，在脊椎动物发生早期，通过基因组或者染色体片段的复制而形成， 经过漫长的生物进化，在高等哺乳动物中已经丢失了k i s s 2 基因，而在鱼类仍然 保留着两个k i s s p e p t i n 基因。为了进一步研究它们的功能，我们在金鱼中克隆了 k i s s l 、k i s s 2 以及它们的受体g p r 5 4 a ，g p r 5 4 b 基因的c d n a 全长序列。组织分布 显示：k i s s l ，k i s s 2 、g p r 5 4 a 、g p r 5 4 b 在金鱼生殖相关组织或区域( 下丘脑、垂体、 性腺) 均有丰富的表达，提示k i s s p e p t i n s 可能参与鱼类的生殖调控。通过配体受 体结合实验，证实了两种k i s s p e p t i n s 均能结合g p r 5 4 s ( g p r 5 4 a 、g p r 5 4 b ) ，启动 下游信号通路，但存在一定的配体受体选择性差异。 2 通过同源比对搜索，在硬骨鱼类的基因组数据库中发现了g n l h 的同源基 因。同线性分析表明，g n i h 基因在鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类都维持着保守的 李水生中山人学博i ：学位论文2 0 1 0 年6 月 同线性结构；根据预测出来的序列，我们在斑马鱼中克隆了g n i h 基因以及三个 潜在的g n i h 受体基因( g n i h r l 、g n i h r 2 、g n i h r 3 ) 的c d n a 序列全长。同源比对 结果显示：g n i h 的氨基酸序列在不同物种中存在较大的差异。g n l h 受体的序列 同源比对和进化树分析都表明斑马鱼三个g n i h r s 属于g n i h 的受体。组织表达模 式研究显示：g n i h 与g n i h r s 主要在斑马鱼脑中表达，提示它们的作用区域主要在 脑区。此外，我们还研究了g n i h 与g n i h r s 在斑马鱼胚胎发育过程的表达变化。 g n i h 的表达在5 原基期首次被检测到，之后一直维持在相对恒定的水平；而三个 g n i h r s 在整个胚胎和早期发育过程都有表达。 3 运用r e a l t i m e - p c r 方法，我们检测了k i s s e s 、g p r 5 4 s 、g n i h 与g n i h r s 在 斑马鱼青春期发育过程中的表达变化。两个k i s s 基因在青春期启动前表达开始上 升，但它们的表达模式又有所不同；而两个g p r 5 4 s 的表达模式呈现互补的趋势； 提示它们在青春期发育的过程中可能具有不同的功能。g n i h 与g n i h r l 的表达在 斑马鱼青春期发育过程中没有显著变化，而g n i h r 2 ，g n i h r 3 在卵黄生成中期显著 升高，其中的分子机制目前还不是很了解。 4 通过化学合成金鱼k i s s p e p t i n s 与斑马鱼g n i h 的核心肽，在体注射成熟的 雌性金鱼，发现k i s s l 能显著刺激金鱼l h 的分泌，而k i s s 2 不能；在较高剂量， g n i h 亦能有效地抑制金鱼l h 的分泌。然而，在离体实验中，2 种k i s s p e p t i n 与 g n i h 对金鱼垂体细胞l h 的分泌均没有显著的影响，提示k i s s p e p t i n s 与g n i h 对 金鱼的l h 调控可能发生在下丘脑水平。 5 通过切除金鱼的卵巢，运用r e a l t i m e p c r 检测下丘脑k i s s l 、k i s s 2 与g n i h 的表达。研究发现：卵巢切除后下丘脑k i s s l 基因的表达没有显著性的变化；k i s s 2 的表达则升高了，在雌激素补偿后有所降低；g n i h 在卵巢切除后，表达量下降， 在雌激素补偿后，恢复到对照组的水平。提示性类固醇激素对金鱼下丘脑的k i s s 2 具有负反馈调控作用，对g n i h 具有正反馈调控作用。 6 用k i s s p e p t i n 和k i s s p e p t i n 类似物对金鱼、鲫鱼、泥鳅进行催产检测，发 现它们具有一定的催产效果，但是催产率不高。 关键词：k i s s p e p t i n ，g p r 5 4 ，g n i h ，g n i h r ，生殖调控 李水生中山人学博i ：学位论文2 0 1 0 年6 月 t i t l e ：i d e n t i f i c a t i o no fk i s s p e p t i na n dg n i h s i g n a l i n gs y s t e m sa n dt h e i rp o t e n t i a lr o l e si nf i s h r e p r o d u c t i o n m a j o r ：p h y s i o l o g y n a m e ：l is h u i s h e n g s u p e r v i s o r ：p r o f l i nh a o r a n ( a c a d e m i c i a n ) a b s t r a c t k i s s p e p t i na n dg n i h ( g o n a d o t r o p i n - i n h i b i t o r yh o r m o n e ) ，t h er f a m i n e p e p t i d e s ，p l a yi m p o r t a n t r o l e si nm a m m a l i a nr e p r o d u c t i v e s y s t e m k i s s p e p t i n s t i m u l a t e st h eg t h ( g o n a d o t r o p i n ) r e l e a s ea n ds y n t h e s i sv i ac o n t r o lo fg n r h ( g o n a d o t r o p i n - r e l e a s eh o r m o n e ) s e c r e t i o n i nc o n t r a s t ，g n l hi n h i b i t st h e ( i t h r e l e a s ea n ds y n t h e s i sd i r e c t l yo rv i ac o n t r o lo fg n r hs e c r e t i o n i nt h i s t h e s i s ， k i s s p e p t i n g p r 5 4a n dg n i r e g n i h rs y s t e mw e r ei d e n t i f i e di ng o l d f i s ha n dz e b r a f i s hb y c o m b i n a t i o nw i t hb i o i n f o r m a t i cm e t h o da n dm o l e c u l a rt e c h n i q u e a n dt h e nt h e i r p o t e n t i a lr o l e sw e r ei n v e s t i g a t e do nt h ep u b e r t yo n s e t ，g o n a d o t r o p i nr e g u l a t i o na n d s e xs t e r o i df e e d b a c k m o r e o v e r , t h ee f f e c t so fk i s s p e p t i no nt h ei n d u c t i o no fo v u l a t i o n w e r es t u d i e di nt e l e o s tf i s h t h em a i na c h i e v e m e n t so ft h i st h e s i sa r es u m m a r i z e da s t h ef o l l o w i n g ： 1 b yb i o i n f o r m a t i ca p p r o a c h ，t w ok i s sw e r ed i s c o v e r e di nt h eg e n o m es e v e r a l v e r t e b r a t e s ，i n c l u d i n gt h ej a w l e s sv e r t e b r a t e s ，s e al a m p r e y , a n dt w ot e l e o s tf i s h , z e b r a f i s ha n dm e d a k a , a n da m p h i b i a n ，a f r i c a nc l a w e d f r o g s y n t e n ya n a l y s e s i n d i c a t e dt h a tb o mk i s sg e n e sw e r ed e r i v e df r o md u p l i c a t i o no fa na n c e s t r a lk i s s l g e n e 。o n eo ft w ok i s sg e n e sw a sl o s ti ns o m es p e c i e sd u r i n gt h ee v o l u t i o n i no r d e rt o s t u d yt h e i rp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o ni nt e l e o s tf i s h ，w ec l o n e dt h ek i s s l ，k i s s 2t h e i r p u t a t i v er e c e p t o r s ( g p r 5 4 a ，g p r 5 4 b ) c d n a sf r o mg o l d f i s h r t - p c ra n a l y s i s i l i 李水生中山人学博j ：学位论文2 0 1 0 年6 月 d e m o n s t r a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no ft h ek i s s l s ，g p r 5 4 sw e r eo b s e r v e di nt h en e u r o n a l a n dr e p r o d u c t i v er e l a t e dt i s s u e s ，i n c l u d i n gt h eb r a i n ，p i t u i t a r y ，a n dg o n a d s ，s u g g e s t i n g t h e i rp o s s i b l er o l ei nt h ef i s hr e p r o d u c t i v es y s t e m s u b s e q u e n ts t u d i e sr e v e a l e dt h a t b o mm a t u r e g o l d f i s hk i s s p e p t i n - 1 0p e p t i d e s ( g f k i s s l 一1 0a n dg t k i s s 2 - 1 0 ) a r e b i o l o g i c a l l ya c t i v ea st h e yc o u l df u n c t i o n a l l yi n t e r a c tw i t ht h et w og o l d f i s hr e c e p t o r s e x p r e s s e di nc u l t u r e de u k a r y o t i cc e l l st ot r i g g e rt h ed o w n - s t r e a ms i g n a l i n gp a t h w a y s 、枋t hd i f f e r e n tp o t e n c i e s 2 t oi d e n t i f yp u t a t i v eg n i hg e n e si nt e l e o s tf i s h ，w eh a v es e a r c hf o rt h eg n i h c a n d i d a t e so nt h ee n s e m b la n dn c b ig e n o m ed a t a b a s e s p u t a t i v eg n i hg e n e sw e r e d i s c o v e r e di nt h eg e n o m e so fs e v e r a lv e r t e b r a t e s i n c l u d i n gz e b r a f i s h ，m e d a k a , t a k i f u g u ，a n ds t i c k l e b a c kg e n o m i cs y n t e n ya n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h eh i g h l y c o n s e r v e ds y n t e n i cb l o c kc o n t a i n i n gt h eg n i hg e n el o c iw e r ef o u n di nt e l e o s tf i s h ， a m p h i b i a n ，b i r da n dm a m m a l s ，i n d i c a t i n gt h eo r t h o l o g o u sr e l a t i o n s h i pa m o n gt h e p r e d i c t e dg n i hg e n e s f u l l - l e n g t hc d n as e q u e n c e se n c o d i n gt h eg i n ha n d t h r e eg n i h r s w e r es u b s e q u e n t l yi s o l a t e df r o mt h ez e b r a f i s hb r a i n s e q u e n c ec o m p a r i s o na m o n gt h e p u t a t i v ea m i n oa c i ds e q u e n c e so fv e r t e b r a t eg n l h ss h o w e dt h a tt h eg n l hp r o t e i n s s h a r er e l a t i v e l yl o ws e q u e n c ei d e n t i t y 、 r i t he a c ho t h e r t h et h r e ez e b r a f i s hg n i h r sa r e t y p i c a ls e v e nt r a n s m e m b r a n egp r o t e i n - c o u p l e dr e c e p t o r ss h a r i n gh i g l ls e q u e n c e h o m o l o g yw i t ht h em a m m a l i a na n da v i a nc m i h r s ( n p f f 1 r e c e p t o r s ) t i s s u e e x p r e s s i o ns t u d i e sr e v e a l e dt h a tz e b r a f i s h 访i sm a i n l ye x p r e s s e di nt h eb r a i n , c o r r o b o r a t i n gl a r g e l y 、衍t ht h et i s s u ee x p r e s s i o np a t t e r n so ft h eg n i h r si nz e b r a f i s h m o r e o v e r , t h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fg n i ha n di t sr e c e p t o r sa td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a l s t a g e so fz e b r a f i s hw e r ea l s os t u d i e d 访e x p r e s s i o nf i r s ta p p e a r e di nt h ep r i m - 5 s t a g e ，a n dt h e r e a f t e rm a i n t a i n e da tar e l a t i v e l yc o n s t a n tl e v e l t h et h r e eg n i h r sc o u l d b ed e t e c t e da ta l le m b r y o n i cs t a g e so fz e b r a f i s ha n da l s od u r i n ge a r l yd e v e l o p m e n t a f t e rh a t c h i n g 3 t h eb r a i ne x p r e s s i o np r o f i l e so fk i s s e s , g p r 5 4 s , g n i ha n dg n i h r sd u r i n gt h e p u b e r t a ld e v e l o p m e n ti nz e b r a f i s hw e r ea n a l y z e db yr e a l t i m e - p c r k i s s la n dk i s s 2 m r n al e v e l si n c r e a s e da tt h eb e g i n n i n go ft h ep u b e r t yo n s e t ，a l t h o u g ht h e ye x h i b i t e d d i f f e r e n te x p r e s s i o np a t t e r n s w h i l eg p r 5 4 aa n dg p r 5 4 bs h o w e dt h ec o m p l e m e n t a r y e x p r e s s i o np a t t e m s t h e s ed a t as u g g e s t e dt h e i rd i f f e r e n tr o l e sa c r o s st h ep u b e r t a l d e v e l o p m e n t t h ee x p r e s s i o no fg n i ha n dg n i h r l d i dn o tc h a n g es i g n i f i c a n t l yd u r i n g t h ep u b e r t a ld e v e l o p m e n t ，w h e r e a san o t a b l yi n c r e a s eo fg n i h r 2a n dg n i h r 3m r n a 李水生中山人学博l j 学位论文2 0 1 0 年6 月 o c c u r r e da tt h em i d v i t e l l o g e n i cs t a g e 4 t h ea c t i o n so fg f k i s sl 一10 ，g f k i s s 2 10a n dz e b r a f i s hg n i ho nl u t e i n i z i n g h o r m o n e ( l h ) s e c r e t i o nw e r ef u r t h e ri n v e s t i g a t e di nv i t r oa n di nv i v o i n t r a p e r i t o n e a l a d m i n i s t r a t i o no fg f k i s sl 10t os e x u a l l ym a t u r ef e m a l eg o l d f i s hc o u l di n c r e a s et h e s e r u ml hl e v e l s ，i n d i c a t i n gt h a tt h i sp e p t i d ei sa c t i v ei nv i v o w h e r e a sg t k i s s 2 10 a p p e a r e d t oh eam u c hl e s s p o t e n tp e p t i d ea si te x h i b i t sn os i g n i f i c a n ti n v i v o b i o a c t i v i t y o nt h eo t h e rh a n d ，i n t r a p e r i t o n e a la d m i n i s t r a t i o no ft h em a t u r ez e b r a f i s h g n i hp e p t i d e ( l p x r f ap e p t i d e 一3 ) c o u l ds i g n i f i c a n t l yr e d u c et h eb a s a ls e r u ml h l e v e l i ng o l d f i s h h o w e v e r ，t w og o l d f i s hk i s s p e p t i na n dz e b r a f i s hg n i hd i dn o ts i g n i f i c a n t l y i n f l u e n c el hr e l e a s ef r o mg o l d f i s hp i t u i t a r yc e l l si np r i m a r yc u l t u r e ，i n d i c a t i n gt h a t t h e s ep e p t i d ed i dn o te x e r ti t sa c t i o n sa tt h ep i t u i t a r yl e v e l 5 e x p r e s s i o no fh y p o t h a l a m i ck i s s l ，k i s s 2a n d 访m r n a i no v a r i e c t o m i z e d g o l d f i s h w e r em e a s u r e db yr e a l t i m e p c r t h em r n al e v e lo fk i s s li n t h e h y p o t h a l a m u sd i dn o t a f f e c t e db yt h e o v a r i e c t o m y , w h i l et h ee x p r e s s i o n o f h y p o t h a l a m i ck i s s 2w a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nt h eo v a r i e c t o m i z e dg o l d f i s h h o w e v e r , e s t r o g e na d m i n i s t r a t i o nc o u l dn o tc o m p l e t e l y r e v e r s et h i sn e g a t i v e l y f e e d b a c k t h eo v a r i e c t o m yi n d u c e dad e c r e a s ei ng n he x p r e s s i o n , b u tt h i se f f e c tw a s r e s t o r e db yt h ee s t r o g e nr e p l a c e m e n t ，i n d i c a t i n ga ne s t r o g e np o s i t i v ef e e d b a c ko n h y p o t h a l a m i cg n i he x p r e s s i o ni ng o l d f i s h 6 s i n c et h e i rs t i m u l a t o r ye f f e c t so nl hr e l e a s e ，k i s s p e p t i na n dk i s s p e p t i n a n a l o g sp o s s e s s e dt h ep o t e n t i a l so nt h ei n d u c t i o no fo v u l a t i o ni nt e l e o s tf i s h o u r e x p e r i m e n td e m o n s t r a t e dt h a tk i s s p e p t i na n dk i s s p e p t i na n a l o g sw e r ee f f e c t i v ei n i n d u c i n go v u l a t i o ni ng o l d f i s h , c r u c i a nc a r pa n dl o a c h , b u tt h eo v u l a t i o nr a t ew a sn o t h i g l l k e y w o r d s ：k i s s p e p t i n ，g p r 5 4 ，g n i h ，g n i h r , r e p r o d u c t i v er e g u l a t i o n v 中山大学博i ：学位论文 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：南l 4 1 日期：x1 年月 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：李沪乞 日期：弘c ，口年6 月3e t 李水生 中山人学博t ：学位论文 绪论 脊椎动物的生殖活动主要受“脑下丘脑脑垂体性腺”轴( h y p o t h a l a m u s p i t u i t a r y - g o n a da x i s ，h p g 轴) 的调控，脑下丘脑分泌产生的促性腺激素释放激 素( g o n a d o t r o p i nr e l e a s i n gh o r m o n e ，g r 瓜h ) 刺激脑垂体促性腺激素( g o n a d o t r o p i n ， g t h ) ，包括促黄体生成激素( l u t e i n i z i n gh o r m o n e ，l h ) 与促滤泡激素( f o l l i c l e s t i m u l a t i n gh o r m o n e ，f s h ) 的合成与释放，促性腺激素作用于性腺，增加性腺 类固醇激素的合成与分泌，促进性腺发育成熟、配子生成排放。性类固醇激素也 可以通过正、负反馈作用来调控上游脑垂体轴，从而影响g t h 的合成与释放， 维持体内g t h 水平的动态平衡【。 脑垂体分泌产生的g t h 在脊椎动物的生殖调控中起着主导作用，因此，对 于g t h 分泌的调节，一直以来都是生殖生理科学家们研究探索的重点。近年来， 在神经内分泌调控g t h 分泌的机理方面取得了突破性的进展。众所周知，下丘 脑分泌的g n r h 是促进g t h 释放的主控因子。l 强肽家族的k i s s p e p t i n 与 g n l h ( g o n a d o t r o p i n i n h i b i t o r yh o r m o n e ) 两种短肽，它们对生殖轴的调控起着直接 而相反的作用。k i s s p e p t i n 通过刺激g n r h 的分泌，促进g t h 的合成与释放，而 g n l h 则抑制g n r h 和g t h 的合成与释放【2 1 。 1k i s s p e p t i n g p r 5 4 信号系统的研究进展 1 1k i s s p e p t i n g p r 5 4 信号的发现 k i s s p e p t i n 于1 9 9 6 年在黑色素瘤细胞株中发现，由于其具有抑制肿瘤细胞迁 移的能力，所以也被称为m e t a s t i n l 3 1 。k i s s p e p t i n ，由k i s s 1 基因编码，经翻译后 断裂修饰产生包括k i s s p e p t i n - 5 4 、1 4 ，1 3 ，1 0 的酰胺化短肽，拥有相同的c 末端：a r g p h e - n h 2 【4 。5 】。k i s s p e p t i n 的受体为g 蛋白偶联受体，叫g p r 5 4 ，与 g a l a n i n 受体的氨基酸同源性达4 5 ，但并不能结合g a l a n i n 4 - 6 1 。在2 0 0 3 年，三 个独立的研究小组发现，编码g p r 5 4 的基因发生失活突变，将导致人类青春期 的停滞和性腺功能不育，而且，在g p r 5 4 基因缺失的小鼠中也发现类似的表现 型1 7 - 9 1 ，随后，在k i s s l 基因敲除的小鼠中得到更进一步的证实【l o 】，表明 k i s s p e p t i n g p r 5 4 信号对哺乳动物的生殖系统具有极其重要的生理意义。 李水生中山人学博i ：学位论文2 0 1 0 年6 月 1 2k i s s p e p t i n g p r 5 4 信号对g n r h 的调控 自7 0 年代在猪中分离出首个g n p 旺1 分子以来【l i 1 2 1 ，g n r h 在各个物种中得 到了广泛而深入的研究，对g n i 有直接或间接调控的分子也很多，例如瘦素 ( 1 e p t i n ) 、神经肽y ( n p y ) 、y 氨基丁酸( g a b a ) 、甘丙肽( g a l ) 、兴奋性氨基 酸( 谷氨酸、天冬氨酸、n 甲基d 天冬氨酸) 等等【1 3 1 ，但是，关于调控g n r h 的 主效分子却一直未清楚，也一直是研究的热点。 现今的研究发现：k i s s p e p t i n 是脑中g n r h 调控的关键分子。k i s s p e p t i n 通 过直接调控g n r h 的释放，从而刺激脑垂体g t h 的合成与释放，进而控制生殖 轴的各种生理活动。主要有以下证据： ( 1 ) 在小鼠、大鼠、仓鼠、羊、猴子、人以及其他哺乳动物中，k i s s p e p t i n 的 中枢或外周处理均能显著地刺激垂体l h 、f s h 的分泌【h 以】。但是，当与 g n r h 受体拮抗剂共处理后，k i s s p e p t i n 对垂体激素的刺激作用被完全阻 断【1 8 2 4 彩1 ，提示k i s s p e p t i n 对生殖轴的激活发生在下丘脑水平。 ( 2 ) k i s s p e p t i n 的处理能诱导g n r h 神经元的c f o s 表达，并且，电生理结果 显示k i s s p e p t i n 能直接激活小鼠脑碎片的g n r h 神经元 1 5 , 2 砚7 1 。 ( 3 ) 在离体、在体条件下，k i s s p e p t i n 均能够刺激下丘脑g n r h 的释放【1 6 , 2 8 1 ； ( 4 ) 原位杂交和免疫组织化学显示：k i s s p e p t i n 主要分布于下丘脑的弓状核区 ( a r c u a t en u c l e u s ，a r c ) 与前腹侧室旁核区( a n t e r o v e n t r a lp e r i v e n t r i c u l a r n u c l e u s ，a v p v ) ，其神经纤维一直延伸到g n r h 神经元聚集的视前区 ( p r e o p t i ca r e a , p o a ) ，并与g r 瓜h 神经元接触【2 9 。 ( 5 ) c m r h 神经元上具有g p r 5 4 的表达，提示k i s s p e p t i n 能直接刺激g n r h 细胞【1 6 ，2 5 3 2 。3 3 1 。 然而，一些研究发现：k i s s p e p t i n 处理原代培养的垂体细胞或垂体碎片后， 亦能促进垂体g t h 的释放【1 9 ，3 4 0 5 1 。k i s s l 与g p r 5 4 在垂体都有表达，特别是在促 性腺细胞中，并且还受性类固醇激素的调控【1 7 , 3 4 , 3 6 - 3 7 】。此外，在绵羊的垂体门静 脉血液中亦检测到k i s s p e p t i n 的存在1 3 7 1 ，这些证据表明k i s s p e p t i n 也可能通过直 接刺激垂体细胞释放l h 。但是，k i s s p e p t i n 的垂体功能调节角色仍存在争议，一 些研究小组在垂体孵育实验中发现k i s s p e p t i n 并不能刺激g t h 的分泌【2 2 3 引。 k i s s p e p t i n g p r 5 4 信号在生殖系统中的重要作用的发现引起了广泛的关注和 讨论，成为近几年来生殖神经内分泌的研究热点，极大地拓展了我们对生贿神经 2 李水生中山人学博i ：学位论文 内分泌网络调控的认识，方便我们更深入地了解性类固醇激素对g t h 的j 下负反 馈调控、雌性动情周期、青春期启动、季节繁殖活动调控等方面的分子机理【3 o l 。 1 3k i s s p e p t i n g p r 5 4 信号介导性类固醇激素对g t h 的反馈调控 脑垂体轴分泌的g t h 作用于性腺，刺激性腺类固醇激素的生成与分泌，而 性类固醇激素可以通过反馈信号来调控脑垂体轴g t h 的水平，维持生殖轴上各 个信号分子处于动态平衡中。性类固醇激素对脑垂体轴的反馈作用可以发生在 下丘脑与垂体水平，然而，一直以来，对于性类固醇激素在下丘脑水平对g n r h 反馈调节的分子机理仍未清楚。虽然，g n r h 神经元上有雌激素受体p ( e s t r o g e n r e c e p t o rd ，e r l 3 ) 的表达【4 l - 4 3 ，但是，却没有介导性类固醇激素反馈效应的相关 受体如雌激素受体a ( e s t r o g e nr e c e p t o rc t e r a ) 、雄激素受体( a n d r o g e nr e c e p t o r , a r ) 、孕激素受体( p r o g e s t e r o n er e c e p t o r , p r ) 以及一些对性类固醇激素敏感的分子 存在【4 4 舶】。这表明，在g n r h 的上游存在着对性类固醇激素敏感的神经细胞来介 导性类固醇激素对g n r h 的反馈调控。研究发现：小鼠下丘脑的a r c 和a v p v 区域含有大量对性类固醇激素敏感的神经元，其神经纤维一直延伸到g n r h 神经 元聚集的视前区，并与g n r h 神经元接触。性类固醇激素通过a r c 区域的神经 元实现对g n r h 的负反馈调控，从而抑制垂体g t h 的合成与释放；通过a v p v 区域的神经元从而介导对g n r h 的正反馈调控，产生g n r h l h 峰，进而促进 排卵【4 7 彤l 。作为调控g n r h 的关键分子，以及在a r c 和a v p v 区域大量表达， k i s s p e p t i n 的发现，对了解性类固醇激素对g n r h 反馈调节的复杂分子机理有着 重要的意义。近年来的研究观察，提示k i s s p e p t i n g p r 5 4 信号系统是性类固醇激 素对g n r h 反馈途径的一个重要的组成部分。对雄性老鼠、小鼠、仓鼠、猴子进 行阉割后，下丘脑的k i s s lm r n a 含量剧烈上升，特别在a r c 区域，这效应的 发生刚好与睾酮负反馈效应解除后( 阉割) 所导致的g n r h 与g t h 的升高相吻 合，在用激素( 睾酮、雌激素) 补偿后，k i s s l 的表达又恢复到原来的水平【2 5 ，外5 7 1 。 在雄性大鼠和小鼠里，k i s s p e p t i n 拮抗剂的处理能有效地阻断阉割后所导致的l h 升耐5 8 】。而且，几乎所有在a r c 区域处的k i s s l 神经元都有a r 和e r a 的表达， 在e r a 敲除或a r 亚等位基因的雄性小鼠里也证明了a r c 处的k i s s l 的表达调 控是e r a 和a r 依赖性的【5 7 1 。在雌性小鼠中，a r c 区域的k i s s lm r n a 水平随 着动情周期的而变化，在体内雌激素水平最高的时候a r c 处的k i s s lm r n a 水 李水生中山人学博i ：学位论文 平则最低【5 9 l 。在啮齿类、羊、猴子的卵巢切除后，会导致a r c 处的k i s s lm r n a 含量增加，在e 2 处理后这种效应则被逆转【5 4 , 6 0 - 6 5 】。在g p r 5 4 缺失的雌性小鼠中， 卵巢切除后，虽然a r c 处的k i s s lm r n a 含量显著增加，但血液中的l h 并没 有升耐硎。这些研究表明：不管是在雄性还是雌性中，性类固醇激素通过a r c 区 域的k i s s l 神经元从而实现对g n r h 的负反馈调控。 在啮齿类的发情前期，血液中雌激素的含量急剧上升，促进上游g n r h 与 l h 的大量分泌，从而诱导排卵，这就是雌激素对g n r h 的正反馈效应，这个作 用是由a v p v 处的对性类固醇激素敏感的神经元所介导【5 3 】。a v p v 是一个具性别 二态性的区域，在雌性中要比在雄性大很多惭】，而且在雌性中特异性地表达一些 基因，如酪氨酸羟化酶( t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ) ，k i s s l 等。这些基因被认为是介 导雌激素对g n r h 的正反馈效应的重要分子【6 7 石引。 a v p v 区域k i s s l 的表达具有性别差异，并受激素的控制【5 7 】；在雌性中的表 达量要比雄性高很多，刚出生的雌性小鼠经过雄激素处理，成年后其a v p v 区域 k i s s l 的表达类似于成年的雄性；同样，刚出生的