（植物学专业论文）利用大豆低值蛋白开发大豆肽.pdf

d e v e l o p i n gp e p t i d ef r o mf e r m e n t a t i o nw i t hl o w e c o n o m i c v a l u es o y b e a np r o t e i n p r e s e n t e db y w u x i a n j i n g u n d e rt h es u p e r v i s i o no f z h u d a n h u a c o l l e g eo fc h e m i s t r ya n dl i f es c i e n c e s z h e j i a n gn o r m a lu n i v e r s i t y j i n h u a3 210 0 4 ，p r c h i n a 1 h 一 一 d i s s e r t a t i o ns nb m i t t e dt o z h e j i a n gn o r m a lu n i v e r s i t y i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t sf o r t h ed e g r e eo f m a s t e r c o m p l e t e di na p r i l ，2 0 1 0 c o m m e n c e m e n ti nm a y , 2 0 1 0 - 一 利用大豆低值蛋白开发大豆肽 摘要 大豆肽是大豆蛋白水解后产生的有生理活性的小分子短肽链，具有优良的加工特 性和生理功能，是大豆深加工的一个重要方向。利用微生物发酵制备大豆肽，具有酸 解和酶解法生产所不具备的很多优点。本课题主要对菌种的选育、发酵工艺的优化和 发酵液的分离纯化分析等几个关键环节进行初步研究。 选用实验室保存的米曲霉a s p3 0 4 2 作为初始发酵菌种，对其产蛋白酶性状进行 选育。利用浙江省农业科学院作核所的辐照源对米曲霉进行诱变育种，在初筛的过程 中，以透明圈直径大小作为初选指标，经过观察透明圈直径大小，并重复筛选得到 1 7 株诱变菌株，其菌落生长过程中产生的透明圈比原始菌株大，表明在诱变过程中 其分泌蛋白酶的能力发生突变，而有部分菌株生长性状也发生了改变。在进一步复筛 的研究中，发现初筛得到的诱变菌株发酵4 天的蛋白酶酶活和发酵8 天的粗肽含量基 本上都比原始菌株高，其中编号a 9 的菌株其发酵得到的粗肽含量最高，是诱变得到 的最佳菌株。 利用豆渣进行米曲霉产孢子的固体发酵实验，对固体发酵培养基中豆渣、麸皮、 水分、k h 2 p 0 4 、m g s 0 4 的含量进行单因素试验。在优化分析后，选择米曲霉固体发 酵产孢培养基组成比例为：豆渣8 9 ，麸皮2 9 ，水份2 0 9 ，蔗糖5 5 9 ，l m 2 p 0 4o 3 9 ， m g s 0 40 0 5 9 。在豆渣固体培养基优化条件下发酵培养米曲霉孢子，计孢子数接近 3 0 x 1 0 8 个m l ，能够达到较好的培养效果。 2 4 h 后固体培养基表面就长出白色的菌丝， 且米曲霉菌丝在培养基上生长良好，培养 在2 3 天的发酵培养后，米曲霉菌丝颜色 转为黄绿色并生成分生孢子体，一般培养4 天左右固体培养基表面长满绿色的孢予。 收集固体培养的米曲霉孢子，稀释至0 5 x 1 0 8 个i i l l ，接种制豆腐皮后剩余的豆 浆( 下浆水) 进行液体发酵培养，利用液体发酵制备大豆粗肽。采用响应面法对发酵 培养基成分进行优化。在单因素试验的基础上，首先用p l a e k e t t b u r r n a n ( p b ) 设计对 培养基中相关影响因素的效应进行评价，筛选出3 个有显著影响效应的因素，分别为 k h 2 p 0 4 、蔗糖、麸皮。然后进行最陡爬坡实验逼近最佳响应面区域，最后通过b o x b e h n k e n 设计及响应面分析确定了主要影响因素的最佳浓度，为k h 2 p 0 4 ：1 1 8 ，蔗 糖：o 2 4 ，麸皮：1 8 l ，m g s 0 4 ：0 2 ，n a c l 0 2 ，c a c 0 3 - 0 0 2 ，吐温：o 0 5 ， 起始p h 值7 。在优化条件下发酵8 d ，粗肽得率达到6 3 3 1 ，含量比发酵前提高了4 倍。 在最优液体培养基条件下，对发酵不同时间的发酵提取液测定每毫升样品的总抗 氧化能力，实验发现随发酵时间的延长，每毫升发酵液的抗氧化能力也不断增强。说 明发酵过程中，发酵原料中的大分子大豆蛋白被发酵过程中产生的蛋白酶分解成短 肽，提高了发酵液的抗氧化能力。 对发酵8 天的发酵液进行离心提取上清液后，进行超滤分离，得到分子量分别在 小于1 0 0 0 d a 、1 0 0 0 5 0 0 0 d a 、5 0 0 1 1 0 0 0 0 d a 和1 0 0 0 0 d a 以上的四个截留片段，其中 大于1 0 0 0 0 d a 的大分子物质抗氧化能力弱，1 0 0 0 5 0 0 0 d a 和5 0 0 1 - 1 0 0 0 0 d a 的截留溶 液抗氧化能力较强，1 0 0 0 d a 以下的溶液由于短肽大多分解成氨基酸，反而抗氧化能 力降低。对比1 0 0 0 5 0 0 0 d a 和5 0 0 1 1 0 0 0 0 d a 的截留溶液，5 0 0 1 1 0 0 0 0 d a 的溶液放置 一段时间，会出现蛋白质凝聚，出现沉淀，稳定性较差。而1 0 0 0 5 0 0 0 d a 的溶液较稳 定，淡黄色澄清，能放置较长时间。选择1 0 0 0 5 0 0 0 d a 的超滤片段通过凝胶过滤分析 得到三个主要组分，并测定抗氧化能力，其中组分1 和组分3 的抗氧化能力较强。 关键词：大豆肽；米曲霉；抗氧化能力；响应面法；辐照诱变；分离纯化 i i d e v e l o p i n gp e p t i d ef r o mf e r m e n t a t i o nw i t hl o we c o n o m i c v a l u es o y b e a np r o t e i n a bs t r a c t a sw ek n o w , s o y b e a np e p t i d e 晰t l l s p e c i a lp h y s i c a la c t i v i t y a n de x c e l l e n t c h a r a c t e r i s t i c so fp r o c e s s i n gi sh y d r o l y s i sf r o ms o yp r o t e i n t h ep r o d u c t i o no fs o y b e a n p e p t i d ei sa ni m p o r t a n tp a r to fs o yf o o dp r o c e s s i n g c o m p a r e d 、 ，i ma c i dh y d r o l y s i sa n d e n z y m a t i cp r o d u c t i o n ，s o y b e a np e p t i d ef r o mf e r m e n t a t i o nh a sm a n ya d v a n t a g e s w h i l et h i s r e s e a r c hm a i n l yf o c u so nt h es e l e c t i o no fm i c r o b i a ls t r a i n ，o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n f a c t o r s ，s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h ep e p t i d e t h er e s u l t sa r es u m m a r i z e dr e s p e c t i v e l ya sf o l l o w s l a b o r a t o r yp r e s e r v e da s p e r g i l l u so r y z a e3 0 4 2w a sc h o s e na so r i g i n a ls t r a i nt os e l e c t p r o t e a s et r a i t s i na s p e r g i l l u so r y z a es e l e c t i n g ，w eu s e dn u c l e a ri r r a d i a t i o ni nz h e j i a n g a c a d e m yo fa g r i c u l t u r a ls c i e n c e st om u t a t eo r i g i n a ls t r a i n a n dd u r i n gt h er e p e a t e d s c r e e n i n g ，t h et r a n s p a r e n tc i r c l es i z eo fc o l o n yw a sc o n s i d e r e da ss e l e c t i n gm a r k , f i n a l l y 17m u t a n t sw e r es e l e c t e dt h a th a db i g g e rt r a n s p a r e n tc i r c l es i z et h a no r i g i n a ls t r a i n ， w h i c h s h o w st h ep r o t e a s es e c r e t i o no fc h a n g e s ，e v e ng r o w t ht r a i t so fs o m es t r a i n sh a da l s o c h a n g e d i nf u r t h e rr e s c r e e n i n g ，w ef o u n dt h ep r o t e a s ea c t i v i t yo f4d a yf e r m e n t a t i o na n d p e p t i d ec o n t e n to f8d a yf e r m e n t a t i o nw e r eb e t t e rt h a no r i g i n a ls t r a i ni nt h es a m ec o n d i t i o n a m o n g a l lt h e s em u t a n t s ，t h es t r a i na 一9p r o d u c e dt h eh i g h e s tp e p t i d ec o n t e n t i ns o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ，b e a nd r e g sw e r eu s e dt op r o d u c ea s p e r g i l l u so r y z a cs p o r e t h em e d i u mc o m p o s i t i o ns u c ha st h er a t i oo fb e a nd r e g sa n db r a n ，c o n t e n to fw a t e r , k h 2 p 0 4a n dm g s 0 4w a ss e l e c t e db ys i n g l ef a c t o r s u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n ，t h em e d i u m w a sc o m p o s i t ew i t h8 9b e a nd r e g s ，2 9b r a n ，2 0 9w a t e r , 5 5 9s u g a r , o 3 9k h 2 p 0 4 ，0 0 5 9 m g s 0 4 a n da f t e rf e r m e n t a t i o ns p o r ed e n s i t yw a sg o tt o2 9 8 7 5 0 0 0 0 m 1 a n da s p e r g i l l u s o r y z a eg r o wb e t t e ro nt h eo p t i m u mm e d i u m ，w h e nf e r m e n t e df o r2 4 hh y p h ag r e wq u i c k l y o i ls o l i dm e d i u ma n da f t e r2 - 3d a yt h ec o l o ro fh y p h am i n e df r o mw h i t et oy e l l o wg r e e n ， s p o r e sw e r ea l s op r o d u c e d g e n e r a l l ys o l i dm e d i u mw e r ec o v e r e dw i t hg r e e ns p o r e sa f t e r4 d a yf e r m e n t a t i o n c o l l e c tt h ea s p e r g i l l u so r y z a es p o r e sf r o ms o l i dm e d i u ma n dd i l u t e dt h ed e n s i t yt o 0 5x10 5p e rm i l l i l i t e r i n o c u l a t e s p o r e si n t os o ym i l kr e m a i n e df r o mt h es o yf i l m i i i p r o d u c t i o na n df e r m e n tt op r o d u c es o y b e a r lp e p t i d e r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a s u s e dt oo p t i m i z em e d i u mc o m p o s i t i o no fs o y b e a r lm i l kr e m a i n e df r o mt h es o yf i l m p r o d u c t i o n b a s e d o nt h es t u d yo fs i n g l ef a c t o rt e s t si d e n t i f i e db yi n i t i a ls c r e e n i n gm e t h o d o fp l a c k e t t - b u r m a n ，t h ek h 2 p 0 4 ，s u c r o s ea n dw h e a tb r a n w e r es c r e e n e da st h ei m p o r t a n t i n f l u e n c i n gf a c t o r s t h e nt h ep a t ho fs t e e p e s ta s c e n tw a su n d e r t a k e nt oa p p r o a c ht h e o p t i m a lr e g i o n b o x - b e h n k e nd e s i g n a n dr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sw e r ea d o p t e dt o a s c e r t a i nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa sf o l l o w s ：k h 2 p 0 41 18 ，s u c r o s e0 2 4 ，w h e a tb r a n 1 8 1 ，m g s 0 40 2 ，n a c lo 2 ，c a c o s0 0 2 ，t w e e n0 0 5 a n di n i t i a lp h 7 u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s t h er a d i oo fp e p t i d er e a c h e dt o6 3 31 a f t e rf e r m e n t a t i o n ，f o u rt i m e s h i g h e rt h a nb e f o r e u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n ，w em e a s u r e dt h et o t a la n t i o x i d a n tc a p a c i t yo fs a m p l e s p i c k u pw i t hd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nt i m e t h er e s u l ts h o w e da n t i o x i d a n tc a p a c i t yg r o w n w i t hf e r m e n t a t i o nt i m ew h i c hi l l u m i n a t e ds o y b e a r lp e p t i d eh y d r o l y z e df r o ms o yp r o t e i n c a ni m p r o v ea n t i o x i d a n tc a p a c i t y a f t e rc e n t r i f u g e dt h ef e r m e n t a t i o ns a m p l e ，u l t r a f i l t r a t i o ns e p a r a t i o nw a su s e dt o s e p a r a t e t h es a m p l ei n t of o u rp i e c e sw h i c hm o l e c u l a rs i z ea r el e s st h a n10 0 0 d a ， 1 0 0 0 5 0 0 0 d a ，5 0 0 1 1 0 0 0 0 d aa n dm o r et h a n1 0 0 0 0 d a i na n t i o x i d a n ta b i l i t ys t u d yw e f o u n dt h a tt h ep i e c eo fm o l e c u l a rm o r et h a n10 0 0 0 d ah a sw e a ka n t i o x i d a n ta b i l i t ya n d a n t i o x i d a n tc a p a c i t yw a sm u c hb e t t e ri nt h ep i e c e so f10 0 0 5 0 0 0 d aa n d5 0 01 - 10 0 0 0 d a t h ea n t i o x i d a n ta b i l i t yo fp i e c ew h i c hm o l e c u l a rw a sl e s st h a n10 0 0 d ab e c a m ew e a k e r b e c a u s et h e r ea r em o r ea m i n oa c i d so rs o m es m a up e p t i d e c o m p a r e dw i t l l10 0 0 - 5 0 0 0 d a a n d5 0 01 10 0 0 0 d as a m p l ep i e c e s ，t h e10 0 0 - 5 0 0 0 d ap i e c e sh a db e t t e rs t a b i l i t yw h i l et h e s o l u t i o nw a sl i g h ty e l l o wa n dc l a r i f y s e p a r a t e10 0 0 - 5 0 0 0 d ap i e c e 、) l ，i 廿lg e lf i l t r a t i o n ，t h e a n a l y s i sr e s u l ts h o w e dt h a tt h r e em a i nc o m p o n e n t sw e r ec o n t a i n e d a n df r a g m e n t1 a n d3 h a ds t r o n ga n t i o x i d a n ta b i l i t y k e yw o r d s ： s o y b e a np e p t i d e ；a s p e r g i l l u so r y z a e ；a n t i o x i d a n ta b i l i t y ；r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d ；r a d i a t i o nm u t a g e n e s i s ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n i v 1 3 2 菌种诱变筛选6 1 4 发酵工艺的条件优化方法8 1 4 1 发酵条件优化8 1 4 2s a s 软件的优化应用9 1 5 大豆肽发酵液的分离纯化技术9 1 5 1 膜分离技术1 0 1 5 2 凝胶过滤技术1 0 v 1 5 3 高效液相技术1 1 1 6 大豆低值蛋白的深加工利用1 1 1 7 研究目标1 2 1 7 1 米曲霉菌种的筛选1 2 1 7 2 最佳发酵工艺条件的构建1 2 1 7 3 抗氧化特效功能肽的分离纯化和功能特性评价1 2 2 米曲霉菌种的诱变筛选1 3 2 1 引言。1 3 2 2 材料和方法1 3 2 2 1 实验材料1 3 2 2 2 实验方法1 5 2 3 实验结果及分析1 7 2 3 1 辐照诱变菌种致死率1 7 2 3 2 诱变菌株初筛。1 8 2 3 3 菌种复筛2 0 2 4 讨论与结论2 2 3 米曲霉发酵生产大豆肽的条件优化。2 3 3 2 实验材料和方法2 4 3 2 1 实验材料2 4 3 2 2 实验方法2 4 v i 3 3 实验结果及分析2 6 3 3 1 固体发酵产孢的单因素分析2 6 3 3 2 液体发酵生产大豆粗肽2 8 3 3 3 结论和讨论3 5 4 发酵产物分离纯化及抗氧化能力分析3 7 4 1 引言3 7 4 2 实验材料和方法3 7 4 2 1 实验材料3 7 4 2 2 实验方法。3 8 4 3 实验结果及分析4 0 4 3 1 发酵时间对抗氧化能力的影响4 0 4 3 2 超滤技术对发酵液的分级分离4 1 4 3 3 凝胶色谱分离组分4 2 4 4 讨论与结论4 4 4 5 展望4 5 参考文献4 7 致谢5 3 攻读学位期间取得的研究成果5 5 浙江师范大学学位论文独创性声明5 7 学位论文使用授权声明。5 7 v i i 1 1 大豆肽的研究进展 1 1 1 大豆肽的概述 1 绪论 研究发现，在人体消化吸收蛋白质的过程中，最终在胃肠道被吸收进入人体内的 物质并非以前认为的单纯的氨基酸形式，而更多的是以小肽的形式被吸收l l j 。小肽的 消化比氨基酸更快，吸收的比例更大，许多小肽物质具有原蛋白质和氨基酸不具备的 生理特性。肽可以作为营养物质与能量供给人体生长、发育所需，同时还有治病和调 节人体生理机能的功能特性。肽因为具有较高的生物效价和营养价值在近年来引起了 人们广泛的重视。 由于肽的结构和功能，在自然界中存在种类很多，功能研究较复杂。目前发现的 生物活性肽研究较热门有大豆肽、肌肽、谷胱甘肽等。其中大豆肽大多是由3 1 0 个 氨基酸组成的短肽链，主要生理活性的分子量范围在3 0 0 3 0 0 0 d a t 2 1 。通常大豆肽通过 大豆蛋白经酶解、酸解或微生物发酵得到，其氨基酸组成与大豆蛋白基本相同，含有 其它植物蛋白易缺的赖氨酸，必需氨基酸含量丰富、组成较平衡，具有较高的营养价 值。 1 1 2 大豆肽的功能和生理活性研究 由于大豆肽的结构和分子大小，与大豆蛋白质相比更易消化吸收，能迅速给机体 提供能量，可作为幼儿食品和强化营养品；无蛋白变性，无豆腥味，易溶于水，特别 是在酸性条件下，即使在5 0 的高浓度时仍能保持良好的流动性，因此可以用于饮料 加工；同时大豆肽的吸湿性和保湿性也很强，能作为化妆品添加剂。在生理功能研究 表明，大豆肽具有降血脂、降胆固醇、降血压、促进矿物质吸收和调节脂肪代谢的作 用【3 - 5 】。 特别是随着科技的发展和社会的进步，人们对延年益寿、抗衰老促健康的研究日 益关注和重视。在人的生命活动中，机体内会产生自由基，过剩的自由基对构成组织 细胞的生物大分子化学结构会产生破坏性反应，逐渐引起破坏层次的扩展，并对正常 1 绪论 组织形态和功能的完整性造成损伤【6 】。在正常情况下机体能清除部分自由基，使自由 基的产生与消失处于动态平衡。当机体的修复能力无法代偿损伤的程度时，组织器官 的机能就会发生紊乱及障碍，机体则逐渐表现出衰老的现象【7 诺】。因此普遍认为清除 自由基与延缓衰老具有密切关系。 通过抗氧化研究发现，一些外源性抗氧化剂对机体维持自由基的平衡具有很大帮 助。而近年来发现化学合成的抗氧化剂( b h a 、b h t 等) 在食品应用中存有不安全 性，使得天然抗氧化剂的研究成为人们关注的热点。特别是通过抗氧化活性的天然物 质进行研究，经分离纯化后，能开发出具有有效抗氧化能力的添加剂和保健食品。 在植物源的抗氧化活性肽的研究中人们认识到大豆蛋白水解产物具有抗氧化能 力【9 1 。1 9 9 1 年p r o k o m y 提出蛋白水解产物能降低自动氧化速率和脂肪的过氧化含量 【1 0 1 。c h e n 等【1 l 。1 3 】结合抗氧化能力的研究，通过大量的实验，证实大豆肽分子量在 6 0 0 1 7 0 0 d a 范围时具有较好的抗氧化效果，并从大豆蛋白质的酶解液中经分离纯化 得到6 种具有抗氧化性的多肽，同时通过氨基酸序列测定进行组成鉴定。这些多肽主 要由5 1 6 个氨基酸组成，含有较多的组氨酸和酪氨酸，推断这类肽的抗氧化性主要 是由于组氨酸和酪氨酸能消除自由基或对金属离子有整合作用的缘故。对于大豆多肽 抗氧化的机理目前有多种解释，国内有学者认为大豆多肽中的抗氧化基团最主要的是 巯基【l 引。而有实验表明大豆肽可以螯合金属离子、清除羟基自由基和氧自由基，从而 表现出较强的抗氧化活性l l5 。 1 2 大豆肽的研发 1 2 1 大豆肽研发现状 大豆含有4 0 左右的蛋白质，大豆蛋白含有人体必需的所有氨基酸，能够很好地 满足人体要求，是一种重要的优质植物蛋白资源。中国是大豆原产国，拥有优质的大 豆资源。而大豆加工业在我国仍不发达，产品种类少，综合利用层次低，主要是应用 在传统豆制品生产和肉制品添加上。同时由于食用大豆蛋白存在过敏反应源及多种抗 营养因子，极大地影响了其利用价值。从发展前景看，大豆蛋白水解生产大豆肽是大 豆深加工的一个重要方向。 国际上对大豆肽的研究在2 0 世纪7 0 年代就开始进行，其中处于大豆肽生产和利 用前列的是美国与日本【1 6 1 。美国于1 9 7 4 年成立了研究蛋白水解课题的专门机构。而 f t 本从7 0 年代到9 0 年代间森永乳业等公司在制油副产品和食品开发中也开展了大豆 肽的深入研究，从选育产酶菌种，至确定水解工艺条件、对水解产物进行脱苦处理均 2 1 绪论 取得了技术上的突破u 7 1 。目前我国也有数家单位在大豆肽方面进行相关研究，特别是 在蛋白酶的选择，酶解工艺参数的选择，对水解液进行脱苦、脱盐、分离精制等方面 取得了初步的成果【1 8 】。 1 2 2 制备大豆肽的主要方式方法 1 2 2 1 酶解法 与酸解法比较，酶法水解蛋白具有很多优点：蛋白质的酶水解是种不完全、不 彻底的水解，其产物主要是肽而不是氨基酸。反应条件温和，反应时间短，效率高， 不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，产品纯度高，产物易分离。文献中报道的蛋白质 酶解过程多采用碱性蛋白酶。该酶的有效成分枯草杆菌蛋白酶是一种非特异碱性内切 蛋白酶，主要作用于含疏水性羧基的肽键，催化部位是丝氨酸。郭兴风等1 1 9 1 采用枯草 杆菌蛋白酶水解大豆蛋白，水解度较低，在优化条件下只有l1 0 8 。班玉凤等1 2 0 l 通 过单因素和正交设计分析，确定了大豆蛋白水解反应的较佳条件，在此水解条件下， 水解液水解度达到了2 4 1 。 由于当前大豆肽生产尚处于起步阶段，主要存在缺乏高效高活的特异性蛋白酶、 酶成本高【2 l 】、酶解过程又缺乏可控技术和高效分离技术以及功能评价体系不健全等问 题，极大地限制了其应用。 1 。2 2 2 发酵法 用微生物发酵法制备大豆肽，将酶的生产和应用合二为一，较酶解法生产成本可 大大降低。国内外在这方面的研究较零散，研究水平也较浅。最早有科研报道的微生 物发酵法生产大豆肽的研究是南京农业大学的万琦等阱彩】，通过枯草芽孢杆菌发酵生 产大豆多肽，主要研究了脱苦大豆多肽生产菌株的筛选，发酵条件的优化及发酵所生 产的大豆多肽液的a n - r 功能特性等。在研究中筛选到一株能在发酵过程中分泌产蛋白 酶和外肽酶的枯草芽孢杆菌，通过利用此菌株的蛋白酶作用将大豆蛋白水解成短肽， 利用羧肽酶的作用切除短肽末端的疏水性氨基酸，最终实现了酶解和脱苦一步完成的 大豆肽生产过程。刘嫒媛等【2 4 】对微生物发酵豆粕的应用研究表明，微生物发酵豆粕对 动物的影响有提高动物的生产性能；有利于矿物质元素的吸收和利用：消除游离氨基 酸的吸收竞争，使摄入的氨基酸更加平衡；增加氨基酸的摄入吸收量：加快蛋白质的 合成；增强免疫功能等。王文娟等【2 5 1 采用黑曲霉发酵豆粕，研究其所产的蛋白酶的活 力。运用响应面分析法确定了黑曲霉发酵豆粕产蛋白酶的最佳发酵条件，有利于大豆 肽产率的提高。其中黑曲霉所产的蛋白酶有端肽酶，用它生产大豆肽不但能脱臭脱苦， 3 1 绪论 还能改善大豆肽的生理特性。并指出以豆粕为原料，采用发酵法生产大豆肽能改善口 感，广泛用于食品和医药工业；充分利用原料，一定程度上减少污染和浪费：发酵发 生产将大豆蛋白的水解与大豆肽的脱苦步骤合二为一，很大程度的降低了大豆肽生产 成本。崔广荣等【2 6 】以米皮粕和豆粕粉为原料，利用固体发酵成曲结合酵母发酵耗糖及 木瓜蛋白酶酶解生产酶解植物蛋白质。研究中随着豆粕含量的增加，蛋白酶活力及固 型物的含量也相应增加，大致呈正比例的关系，但是氨态氮的含量却不断减少。同时 指出固态发酵中，基质特性中影响微生物生长状况的重要因素之一，其中基质颗粒大 小、形态、空隙率、纤维含量等都是基质特性中的重要物理因素。最后得到棕黄色粉 末状产品，水溶性好、味鲜并具有浓郁的酱醇香味。 综上所述，微生物发酵具有很多独特的优点：不需要加热或者添加化学试剂，化 学残留量少，应用比较安全；对发酵原料中营养成分的影响与破坏较小，不容易造成 营养价值的降低，且能使营养物质更易被动物吸收；对比添加单一的酶制剂方法，发 酵过程可以同时作用并去除多种抗营养因子；对细胞壁破坏更加彻底，而原料中内容 物更易释放，促进动物更加快地吸收营养物质；增加了微生物的菌体，帮助维持动物 肠道菌群的平衡；分酵过程中能分解大豆蛋白产生多种小肽类物质。 1 2 3 发酵方式的选择 微生物发酵方式主要可以分为固态发酵和液态发酵两大类。 一般固态发酵的菌种为霉菌，这是因为霉菌在固态培养基中菌丝一般生长良好， 产酶的效率也比较好，可以产生数量较多的分子孢子。这是由于酶蛋白属于霉菌的次 级代谢产物，一般在霉菌分化时形成，而液体培养不容易导致霉菌的分化【2 。因此霉 菌如米曲霉可采用固态发酵的手段一般通过高效率的产酶利用发酵原料，并能生成很 多孢子体。而且固体发酵培养基中的水分含量相对比较低，不适于细菌的生长繁殖， 不容易受杂茵的干扰。而且固态发酵所需的设备简单，宜于生产。 液态发酵方式是一种很常见的方酵方法，主要能较高效率的利用原料，对发酵条 件容易进行控制操作，工作强度弱，方便自动化生产【2 羽。但在生产应用中液态发酵的 投入成本较大，对技术工艺条件要求较高，同时还是大量排放污水等的缺点。 在进行微生物发酵生产时应根据发酵的目的、条件和原料等因素选择合适的发酵 方式方法，以达到最佳生产效果。 4 i 绪论 1 3 发酵菌种的选育及相关研究 1 3 1 米曲霉的生长特性 生产优质大豆肽的关键因素是如何筛选和培养具有优良特性的菌种。发酵生产周 期的长短、最终产品粗蛋白含量的高低和其中抗营养因子的消除情况，取决于所选菌 种的性能。需考虑下列条件：a 、对大豆蛋白有较好地分解和利用，在以大豆蛋白为 底物的发酵原料上能够进行较好的生长、繁殖：b 、发酵培养中菌株繁殖速度快；c 、 生产安全方面无毒性和致病性；4 、菌种性能稳定【2 9 。 1 3 1 1 米曲菌菌种特点 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 是一种好气性真菌，分类学归属于半知茵亚门、曲 霉属。米曲霉菌落生长快，培养1 0 天时菌落生长直径可达5 - 6 c m ，质地较疏松，生 长前期菌丝为白色，生长旺盛时菌丝一般呈黄绿色，酸度较大的培养基上呈绿色，酸 度较小的培养基上呈黄色，老化后逐渐为淡绿褐色至褐色。米曲霉的菌丝是由多细胞 组成的，分生孢子梗生长在厚壁的足细胞上，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶形。 主要存在于粮食、发酵食品、腐败有机物、土壤等处，是我国传统酿造食品酱、酱油 和酒类的生产菌种，也可用于生产各种酶制剂、有机酸、糖化饲料、益生素等p 。 在众多曲霉属家族中，米曲霉占有着重要的地位，能产复合酶如蛋白酶、淀粉酶、糖 化纤维素酶、植酸酶等等【3 2 1 。米曲霉产生的蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱 性蛋白酶，其中酸性蛋白酶最适p h 范围在2 0 5 0 ，中性蛋白酶最适p h 范围在6 0 9 0 ， 碱性蛋白酶最适p h 范围绕为9 5 1 0 5 【3 3 】。主要产生中性和碱性两种蛋白酶，菌种稳 定性高，易于培养，且不产生黄曲霉素。在蛋白酶的作用下，可将不易消化的大分子 蛋白质降解为多肽、氨基酸等等，而酸性蛋白酶可以将多肽分解为游离的氨基酸增加 氨基态氮的含量。如果利用米曲霉来发酵大豆蛋白溶液生产大豆多肽，一方面可减少 生产成本，另一方面可降低发酵过程中所生产的苦味，提高发酵大豆多肽的品质p 训。 而且可以使辅料中粗纤维、淀粉、植酸等物质降解，提高营养价值、保健功效和消化 率，广泛应用于食品、饲料、制酱等发酵工业。 1 3 1 2 培养条件研究 在米曲霉生长的过程中可以利用的碳源很多，有单糖、双糖、多糖、淀粉、有机 酸、醇类等。氮源可以是硝酸盐、尿素、氨基酸、蛋白质、酰胺等。同时p 、k 、m g 、 s 、c a 等元素的添加都是促进米曲霉的快速生长，有利于发酵作用【3 5 1 。米曲霉分泌的 1 绪论 蛋白酶和淀粉酶属于胞外诱导酶，只有在发酵的过程中当发酵培养的原料里有适当的 蛋白含量或适当的淀粉含量时，才能诱导米曲霉生成较多的蛋白酶和淀粉酶，从而进 一步促进菌丝的生长并提高孢子的产量。一般情况下，米曲霉生长的最适温度为 3 2 3 5 c t 3 酗，若低于2 8 。c 或高于4 0 c 时引起菌株生长缓慢，在高于4 2 时菌株停止 生长，而培养温度过低时，菌株的产酶高峰较迟到达。在温度大于2 5 时，温度越 高则蛋白酶和谷氨酰胺生成越少，淀粉酶生成越多1 3 7 1 。因此在本实验中选用2 8 3 0 进行发酵有利于蛋白酶的生成和菌种的生长。 1 3 1 3 发酵应用现状 目前，国内外对米曲霉所分泌的酶种类和性质的研究很多，对酶的发酵生产也有 大量的报道。相比而言，米曲霉发酵分解大豆蛋白方面的研究较少。乐超银等【3 4 】试验 中以水解度为指标，通过考察米曲霉对大豆分离蛋白的水解情况，通过初步探索发酵 工艺条件，使水解度超过2 0 ，大豆多肽得率较高，口感也较好。说明利用米曲霉分 解大豆蛋白生产大豆肽在方法上是可以实现的。 1 3 2 菌种诱变筛选 在发酵生产的过程中，发酵菌种的特性决定了生产工艺的选择，更能影响发酵产 品的风味、质地和质量，在发酵工程中起决定性作用。因此在米曲霉发酵研究中筛选 具有高蛋白酶活性的菌株是一个重要内容，对发酵工艺的进一步研究具有非常重要的 理论和实践意义。 1 3 2 1 菌种诱变方法 进行诱变的原始菌株一般为单倍体纯种，具有优良的生产性状，如生长速度快， 营养要求较低而能较早产生较多的孢子等【3 8 】。在微生物育种工作中许多高产突变性状 往往要经过多次诱变逐步累积的过程才变得明显，所以在诱变育种中有必要挑选一些 已经过诱变的菌株作为出发菌株，进行多次多步育种，以确保获得高产菌株。 其中常用的菌种诱变方法有物理诱变、化学诱变和生物诱变法三大类【3 9 】。其中物 理诱变剂如紫外线、x 射线、丫射线和快中子等；化学诱变剂种类极多，主要有烷化 剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂有- 甲基- 硝基m 亚硝基胍 ( n t g ) 、甲基磺酸乙酯( e m s ) 、甲基亚硝基脲( n m u ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 和环氧乙烷 等。 接受诱变处理的细胞必需为均匀而分散的单细胞悬液，因为细胞处于分散状态时 6 一 l 绪论 能均匀的接触诱变剂，从而避免在筛选过程中出来不纯的菌落。由于诱变剂通常只作 用于d n a 双链中的其中一条单链，因此可能突变性状在当代不能表现出来，而是经 过d n a 的复制和细胞分裂产生子代后才表现出来，这样会出现不纯的菌洛，特别是 在诱变育种初筛得到的菌株经传代后可能会出现生产性状衰退的现象。在研究中也发 现菌株细胞所处的生理状态对诱变处理的结果也会产生很大的影响，其中如细菌的诱 变在对数期处理效果较好，而如米曲霉等霉菌的分子孢子一般都处于休眠状态，因此 培养时间的长短对孢子的影响不太大，但孢子在稍加萌发后的诱变效率可有所提高 【4 0 1 。在本实验中采用6 0 c o 射线对米曲霉孢子液进行辐照诱变。6 0 c o 吖射线是高能量 电离辐身，在电离作用下使菌种直接或间接的改变d n a 结构 4 1 屯j 。 1 3 2 2 菌种筛选策略 微生物育种工作离不开菌种筛选，特别是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难也 是最为重要的步骤。通常在经过诱变处理后，存活的细胞中突变个体只极少数，而其 中能提高生产性况的突变机率更小。为了以较小的工作量，在较短的时间里能达到最 好的筛选成效，就需要采用效率较高的科学筛选方案和手段。在实验研究过程中，往