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双溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖月桂酸酯的研究 摘要 蔗糖酯是蔗糖与各种脂肪酸结合而成的一大类有机化合物的总称。蔗 糖酯无毒性、无嗅、无色，无味，对人体皮肤无刺激作用。水解后成为蔗 糖和可食用的脂肪酸，具有营养价值。与一般合成的表面活性剂不同，蔗 糖酯在好氧和厌氧的条件下都能生物降解，是一种绿色表面活性剂。不同 取代度的蔗糖酯已被广泛地用于食品、医药、化妆品和洗涤剂中。此外， 它们的抗肿瘤、抗菌和杀虫活性也已被报导。 蔗糖酯可以通过化学法或酶法进行合成。化学法反应条件苛刻，区域 选择性低，并且有很多的副产物。而酶可以区域选择性地合成蔗糖酯。高 纯度的蔗糖月桂酸单酯有明显的杀菌、抑菌活性。 对不同有机溶剂中蔗糖溶解度与酶催化活性的相关性进行研究，在有 机溶剂对酶活与蔗糖溶解度的影响上确立了一个最佳点。确定了基础反应 体系中有机溶剂体系以及蔗糖的浓度分别为d m s o ：叔戊醇( 1 ：4 ) 作为反应 溶剂，蔗糖浓度为2 0 6 m g m l ( 0 0 6 m ) 。所用蔗糖必须经过研磨。 对四种脂肪酶以酯化活力为标准进行筛选。发现n o v o 一4 3 5 及c r u g o s a 有较高的酯化活力。利用这两种酶分别研究了有机溶剂种类、酶的加入量、 底物摩尔比、反应初始水活度、反应温度、反应时间、反应中是否添加分 子筛及摇床转速等对酯化率的影响。发现对于n o v o 4 3 5 而言在d m s o ： 叔戊醇( 1 ：4 ) 溶剂体系中，酯化率最高；最佳酶加入量为5 0 m g ；最适酸糖 摩尔比为3 ：1 ；初始水分活度为o 7 5 时获得了最高的酯化率；催化的酯化反 应最适温度为6 0 。c ；最佳反应时间为1 8 h ；在反应过程中加入适量的分子 筛有利于反应平衡向合成的方向进行；最适摇床转速为1 5 0 r m i n 。获得6 8 的酯化率。而对于c m g o s a 来说，在d m s o ：叔戊醇( 1 ：4 ) 溶剂体系中酯化 率也是最高；最佳酶加入量6 0 m g ；最适酸糖摩尔比为4 ：1 ；在初始水分活 度为o 4 3 时获得了最高的酯化率；催化的酯化反应最适温度分别为5 0 ； 最佳反应时间为3 0 h ；在反应过程中加入适量的分子筛同样有利于反应平衡 向合成的方向进行；最适摇床转速为1 6 0 r m i n 。获得7 5 的酯化率。利用 t l c 和h p l c 对合成的蔗糖酯进行了定性分析，发现利用c m g o s a 进行催 化时只有两种单酯生成，推测单酯可能为蔗糖6 月桂酸酯和蔗糖6 月桂酸 酯。而n o v o 一4 3 5 作为催化剂时除了两种单酯外还有二酯生成。推测分别 为蔗糖一6 月桂酸酯，蔗糖6 月桂酸酯和6 , 6 一蔗糖月桂酸二酯。 关键词：双溶剂体系蔗糖月桂酸脂肪酶蔗糖月桂酸酯薄层层析 色谱高效液相色谱 l i p a s ec a t a l y z e ds y n t h e s i s0 f s u c r o s el a u r a t ei nt w oo r g a n i c s o l v e n tm i x t u r e a b s t r a c t s u c r o s ee s t e ri sag e n e r a ld e s i g n a t i o no fal a r g ec l a s so f o r g a n i cc o m p o u n d s s y n t h e s i z e db ys u c r o s ea n df a t t ya c i d s s u c r o s ee s t e ri sn o n t o x i c ，o d o r l e s s ， c o l o r l e s s ，t a s t e l e s s ，a n dh a v en os t i m u l a t i o nt oh u m a ns k i n a f t e rh y d r o l y s i s s u c r o s ee s t e rw i l lb es u c r o s ea n de d i b l ef a t t ya c i d sa n dh a v en u t r i t i o n a lv a l u e d i f f e rw i t hg e n e r a ls u r f a c t a n t ；s u c r o s ee s t e r sc a nb eb i o d e g r a d a b l ei nn e r o b i c a n da n a e r o b i cc o n d i t i o n s s oi ti sak i n do fe n v i r o n m e n tf r i e n d l ys u r f a c t a n t i t h a sb r o a da p p l i c a t i o n si nt h ef o o di n d u s t r y o t h e rf i e l d so fa p p l i c a t i o ni n c l u d e c o s m e t i c s ，d e t e r g e n t s ，o r a l c a r ep r o d u c t s a n dm e d i c a l s u p p l i e s t h e i r a n t i m i c r o b i a l ，a n t i t u m o r a la n di n s e c t i c i d a lp r o p e r t i e sh a v eb e e nr e p o r t e da n d m i g h to p e nn e wm a r k e t s s u c r o s ee s t e r sc a nb es y n t h e s i z e d u s i n g e i t h e rc h e m i c a lo r b i o l o g i c a l m e t h o d s t h ec h e m i c a ls y n t h e s i si su s u a l l yb a s eo nh i g ht e m p e r a t u r e s i th a sa p o o rs e l e c t i v i t ya n dg i v e sr i s et oc o l o u r e ds i d e p r o d u c t s e n z y m e sh a v eb e e n u s e dt oc a t a l y z et h er e g i o ns e l e c t i v ea c y l a t i o no fs u c r o s ee s t e r s i th a v eb e e n r e p o r t e dt h a th i g hp u r i t ys u c r o s el a u r a t eh a v et h ea n t i m i c r o b i a lp r o p e r t y t h ec o r r e l a t i o no fs u c r o s e s o l u b i l i t y i nd i f f e r e n to r g a n i cs o l v e n t sa n d e n z y m ec a t a l y t i ca c t i v i t yh a sb e e nr e s e a r c h e dt od e t e r m i n et h eb a s i cr e a c t i o n s y s t e m t h em e t h o dw a sb a s e do nt h eu s eo fm i x t u r e so fat e r t i a r ya l c o h o l ( 2 - m e t h y l - 2 - b u t a n 0 1 ) a n dap o l a rs o l v e n t ( d i m e t h y l s u l f o x i d e ) a sr e a c t i o nm e d i a ， w h i c hr e p r e s e n tac o m p r o m i s eb e t w e e ne n z y m ea c t i v i t ya n ds u g a r s o l u b i l i t y t h eo r g a n i cs o l v e n ts y s t e mi s d m s o ：t e r t a m y la l c o h o l ( 1 ：4 ) a n dt h e a m o u n to fs u c r o s ei s 2 0 6 m g m l ( 0 0 6 m ) i nt h i sb a s i cr e a c t i o ns y s t e m t h e s u c r o s et ob eu s e dw a sg r i n d e di n t op o w d e r t h r o u g hs c a n n i n gs y n t h e t i cd y n a m i co fd i f f e r e n tt y p e so fd o m e s t i ca n d f o r e i g nl i p a s e ，n o v o 一4 3 5a n dc r u g o s ah a v eh i g h e rs y n t h e s i sd y n a m i c u t i l i z i n gn o v o 一4 3 5a n dc r u g o s a ，t h ei n f l u e n c eo ft h ek i n d so fo r g a n i c s o l v e n t s ，a m o u n to fl i p a s e ，m o l a rr a t i oo fs u b s t r a t e s ，a w ，t e m p e r a t u r e ，t i m e ， m o l e c u l a rs i e v ea n dr o t a t i o n a l s p e e dt oy i e l do fs u c r o s el a u r a t eh a v eb e e n r e s e a r c h e d f o rr e a c h i n gh i g h e s ty i e l do fs u c r o s el a u r a t e ，d m s o ：t e r t a m y l a l c o h o l ( 1 ：4 ) ，5 0 m gl i p a s e ，m o l a rr a t i oo fs u c r o s et ol a u r i ca c i da s3 ：1 ，a wa s o 7 5 ，t e m p e r a t u r ea s6 0 。c ，t h eb e s tr e a c t i o nt i m ei s18 h ，r o t a t i o ns p e e da s 15 0 r m i na n da d d i n gm o l e c u l a rs i e v eh a v eb e e nu s e di nr e a c t i o ns y s t e m ，w h e n n o v o - 4 3 5i su s e d t h er a t eo fc o n v e r s i o nt os u c r o s ee s t e ri s6 8 f o r c r u g o s a t h ec o r r e s p o n d i n gr e s u l ta r ed m s o ：t e r t a m y la l c o h o l ( 1 ：4 ) ，6 0 m gl i p a s e ，m o l a r r a t i oo fs u c r o s et ol a u r i ca c i da s4 ：1 ，a wa s0 4 3 ，t e m p e r a t u r ea s5 0 ，t h eb e s t r e a c t i o nt i m ei s30 h ，r o t a t i o ns p e e da s16 0 r m i na n da d d i n gm o l e c u l a rs i e v e t h e e s t e r i f i c a t i o nr a t ew a s7 5 u s i n gt l ca n dh p l c ，s u c r o s ee s t e r sh a v eb e e nq u a l i t a t i v ea n a l y s i s e d t h e r ea r eo n l yt w ok i n d so fm o n o e s t e r sb ef o u n dw h e nc r u g o s aa sc a t a l y z e r i t m a y b et h em o n o e s t e r si nt h e6 一a n d6 一h y d r o x y lg r o u p s ；w h e nt h en o v o - 4 3 5 a sc a t a l y z e r ，d i e s t e ra r eg e n e r a t e di na d d i t i o nt ot h et w om o n o e s t e r i ti sd e d u c e d t h a tt h ed i e s t e ri s6 ，6 一d i o l a u r o y l s u c r o s e k e yw o r d s ：t w oo r g a n i cs o l v e n tm i x t u r e ；s u c r o s e ；l a u r i ca c i d ；l i p a s e ； s u c r o s el a u r a t e ；t l c ；h p l c 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得 的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名 单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人 已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对 本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致 谢。 论文作者签名：尉儡渤 刁年厂月知日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：名苕漏，函导9 勰；雹巧，加班月功日 广西大掌硕士学位论文双溶剂体系中脂肪酶催- r e 合成蔗糖月桂酸酯的研究 1 1 前言 第一章绪论 蔗糖是自然界中分布最广的二糖，其全球年产量约为1 2 4 亿吨，是一种价格低、纯 度高、可再生的绿色原料。目前，蔗糖的主要用途是经过简单加工作为食品的甜味佐料。 我国蔗糖资源相当丰富，有很大的开发潜力。以蔗糖为原料可以获得许多有经济价值的 产品，蔗糖化学产品的发展前景十分广阔。2 0 世纪6 0 年代以来，欧美一些产糖国家成立 了专门研究蔗糖衍生物的机构，已研究出一万多种化合物或中间制品 1 1 。在本世纪，以 石油化学为基础的经济将转移至以碳水化合物为基础的经济。蔗糖作为重要的碳水化合 物，将在未来发展中起到举足轻重的作用【2 1 。 因为蔗糖是一种纯度高，价格低廉的有机化学品，并且它有许多羟基可以与很多试 剂进行修饰反应，所以对制备各种不同性能的单体来说它是一个很有价值的原料。蔗糖 分子中含有多个羟基( 图1 1 ) ，因此具有很高的亲水性，它的高亲水性提示其具有高度生 物相溶性。 h o 图1 - 1 蔗糖分子结构 fig1 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fs u c r o s e 以蔗糖为原料可以开发一系列化学产品，其特征是可生物降解、安全无毒、对环境 友好。因此，国际上已经出现- - f q 专门研究以蔗糖为开发原料的化学学科，称为“蔗糖 化学，f 3 1 。用蔗糖作为化工原料应用于各种合成目的的研究已被广泛探，并已成功制备了 l 广西大掌硕士掌位论文双溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖月桂酸酉旨的研究 多种蔗糖衍生物，比如蔗糖素( s u c r a l o s e ) ，异麦芽酮糖醇( 1 s o m a l t ) ，硫糖铝( s u c r a l f a t e ) ， 和奥利斯特拉( o l e s t r a ) 1 4 等品牌产品。m a r c y l 5 1 9 9 7 年报道，自1 9 5 0 年以来，以蔗 糖为原料的合成已有了大量研究。国际上从2 0 世纪9 0 年代开始有人研究以蔗糖为原料 来制备无毒、可降解的聚合物。 蔗糖作为化工原料特别是精细化工原料，具有以下优点： l 、蔗糖产量大，集中供应充足 蔗糖全球年产量约为1 2 4 亿吨，人均蔗糖占有量达2 0 千克以上。然而除食用消费 外，如仍有库存，则会导致糖价下跌。蔗糖化学深加工的最初目的是为剩余蔗糖寻找新 的市场。蔗糖化学工业的发展能够促进糖业的发展；糖业的发展又可为蔗糖化学工业提 供充足的原料。另外，发展蔗糖工业及其深加工对发展地方农业及边远地区脱贫致富、 促进国民经济发展有着重要作用。 2 、蔗糖无毒、安全，纯度高 蔗糖产品的纯度高达9 9 7 5 。作为化工原料，它是无毒无害的，不存在对健康有害 物质。由蔗糖通过化学或微生物转化得到的成品及半成品，因杂质很少，提取和精制较 其他原料也容易。因此，国外大规模生产黄原胶、衣康酸、低聚糖等产品，均不再用糖 蜜为原料，而改用蔗糖。 3 、蔗糖可以再生 甘蔗是高产作物，是取之不尽的可再生资源。相反，石油、煤等矿物资源是不可再 生的，总有一天是要枯竭的。 4 、调节平衡食糖的供求 开发蔗糖的深加工产品，能在一定程度上调节平衡食糖的供求，解决周期性的食糖 库存量过多而导致糖价下跌的被动局面，对稳定糖价起积极作用；更为重要的是，开发 蔗糖的深加工产品，可有效地提高糖厂的经济效益，全年开工生产，提高糖厂的劳动生 产效率，加速资金周转；缓解糖厂开榨初期收购甘蔗资金困难的局面。 要发展我国蔗糖产业，除了逐步减小化学合成甜味剂生产量外，开发蔗糖为原料的 深加工产品，也是当前对策之一。蔗糖是目前公认的最佳营养性甜味剂。在过去，9 8 的蔗糖用作食品甜味剂。随着科学技术进步，蔗糖已不只是作甜味剂，利用它的其他物 理、化学与生物特性和功能，人们已经开始开发蔗糖的其他用途。 以蔗糖为原料经过化学或生物途径开拓蔗糖非食品用途所占的比例，也在逐渐增 加。6 0 年代以来，欧美一些产糖国家成立了专门研究蔗糖的机构，已研究出一万多种化 2 双溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖月桂酸酯的研究 合物或中间制品，包括表面活性剂、洗涤剂、塑料、医药、农药等产品。以下是几种具 有发展前景的蔗糖深加工产品： l 、低聚果糖 低聚果糖是蔗糖分子上结合l 3 个果糖分子的低聚糖。工业上生产低聚果糖是以 蔗糖为原料，通过果糖转移酶的作用而获得。低聚果糖具有低热值、稳定、安全、无毒 等优良的理化特性，是人体肠道内有益健康的活化增殖因子，具有预防和间接治疗多种 疾病，增进人体健康的生理功能。 。 法国有关学者调查疾病起因后指出：今后人类肠道疾病将会增加，肠道细菌的介入 将是关系健康的极重要因素。因此，低聚果糖作为优良的促菌物质进行开发意义极大。 2 、山梨醇、甘露醇 以蔗糖为原料，可制取、甘露醇、山梨醇等甜味剂。山梨醇可用作食品添加剂、防 腐剂、保鲜剂，因其是无糖低热甜味剂，可用作制取胶姆糖、口香糖的原料和糖尿病人 的甜味食品：在日化用品上，可用作化妆品的保湿剂，牙膏赋形剂、保湿剂、防冻剂、 甜味剂；还可作为乙醇、丙二醇和甘油的代用品，除了用于生产乳化剂、增塑剂、除垢 剂、粘结剂外，还可广泛应用于烟草、造纸、纺织、塑料、橡胶、树脂、涂料等行业； 并且可制作液体炸药。还可以进一步精制、加工成硬质结晶山梨醇，用作药品压片的填 料，注射用结晶山梨醇等。目前，全国需求量己达1 2 万吨，产量约为6 万吨，缺口比 较大。甘露醇在医药、食品及化工方面的用途也正在逐步扩大。医药上，主要作为脱水 剂、利尿剂等。在食品上用作低热量甜味剂，清凉爽口的添加剂。化学工业上是生产聚 醚与聚酯的重要原料。 3 、蔗糖酯 蔗糖酯在食品工业作表面活性剂有优于其他表面活性剂的性能。首先，其亲水亲油 平衡值最宽，乳化力最好，具有其他食品乳化剂不可比拟的优势。另外，蔗糖酯基本没 有其他表面活性剂所具有的肥皂或脂肪气味，用于食品没有异味。蔗糖酯用于含油食品 还还可作抗氧化剂防止酸败和褪色，延长食品保存期：蔗糖酯可提高食品加工的耐热性、 冷藏稳定性，耐酸耐碱性和防止蛋白质沉淀；对与淀粉可防止老化与颗粒膨胀，提高糊 化温度与保水性。另外，蔗糖酯对结晶有促进成长和阻碍生成两方面作用，还有抗菌、 保鲜和发泡等作用。在化妆品工业，酯化度为4 以上的蔗糖酯用以配制膏状、乳液等化 妆品，此外还大量用于餐具、食品洗涤剂，还用于植物防病剂，食品加工机械的无毒防 广西大掌硕士学位论文双溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖月桂酸酯的研究 锈剂、饲料添加剂，而且又是医药、农业、塑料、纤维、烟草和建材等的助剂。因此， 进行蔗糖酯的研究具有极其重要作用。 1 2 蔗糖酯的概况 蔗糖酯是蔗糖与各种脂肪酸结合而成的一大类有机化合物的总称，白色至黄褐色粉 末或无色至微黄色黏稠液体，无气味或稍有特殊气味，有旋光性，易溶于乙醇和丙酮【每7 j 。 蔗糖有八个羟基，每个羟基都能被亲电试剂酰化，产生不同取代度的蔗糖酯。最早研究 蔗糖酯的是s n e l l ，他在2 0 世纪5 0 年代首先合成了蔗糖酯，日本首先实现工业化生产。 一般来说，对蔗糖酯的研究分为两大部分：一部分以日本为代表，研究开发h l b 值为 2 1 6 的系列蔗糖酯产品，其主要应用为，用在食品行业中作食品乳化剂；日本是世界 上蔗糖酯的生产、消费大国。1 9 5 9 年批准蔗糖酯作为食品添加剂使用。另一部分以美国 为代表，是从人类营养学出发，开发出脂肪替代品一蔗糖多酯。日本第一制药株式会社 于1 9 7 1 年实现蔗糖酯水溶剂法工业化生产，之后不断改进工艺。一些主要工业国家， 如英国、法国、意大利、比利时、澳大利亚、荷兰等国均有蔗糖酯生产，并被获准用作 食品添加剂【8 】。 我国自2 0 世纪8 0 年代初开始蔗糖酯的研发，首先由西南化工研究院建成溶剂法食品 级蔗糖酯装置。1 9 9 0 年，国内蔗糖酯的总生产能力达2 0 0 0 吨。近年来，蔗糖酯工业发展 迅速，主要生产厂家有湛江油脂化工厂、湛江食品添加剂厂、浙江金华第二制药厂、大 连振兴化工厂、上海伊凡尔精细化工公司、苏州吴县蔗糖酯厂等。目前共有3 0 多个生产 企业，总生产能力达到l 万吨年，产量约为3 5 0 0 吨。 浙江金华第二制药厂在相融法生产中添加适量甲醇，生产出h l b 值2 1 6 系列 产品，但是其品种以低油溶性( h l b 为5 9 ) 为主，不能满足市场需要。四川日化研 究所采用二甲基甲酰胺法，以阴离子交换树脂作催化剂，进行蔗糖酯中试研究，并且通 过了轻工部鉴定。清华大学化工系首次采用无溶剂法合成蔗糖酯，于1 9 8 5 年通过省级 鉴定，次年进行了中试试验。南宁市信德食品助剂厂摸索出无溶剂非均相法的反应条件， 广东省湛江市廉江食品厂利用该技术，于1 9 8 8 年生产出3 0 0 多吨蔗糖酯，多为油溶性 低h l b 值产品。广西化工研究所研究了丙二醇法，提出常温常压下也能进行酯交换反 应的理论，结果为产品总酯含量达8 5 以上。江苏省农科院与江苏金湖县油化厂合作开 发无溶剂法生产蔗糖酯，产品质量与日本的同类产品相当，并通过省级鉴定。华南理工 大学推出一种新的方法，采用中性皂熔融法，这种反应具有体系稳定，熔融状态良好， 4 广西大掌硕士掌位论文双溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖月桂酸酯的研究 反应速度快等特点。杭州瑞霖化工有限公司先后与中国科学院上海有机化学研究所、浙 江大学等单位合作，不断探索蔗糖酯的合成工艺，近来又采用了先进的薄膜蒸发器和喷 雾干燥对产品进行纯化干燥，其产品质量已达到了出口标准。由于蔗糖酯原料易得，使用 安全并有抑菌作用，因此需求量仍在逐年增加。 在科研方面，无锡轻工大学是我国最早开展蔗糖酯研究的单位，早在1 9 7 8 1 9 7 9 年研究了丙二醇法生产蔗糖酯。清华大学化工系、山东医学科学院对蔗糖多酯合成进行 大量研究与探索，以棉子油和蔗糖为原料，选用安全无毒溶剂，进行高酯化蔗糖酯的合 成研究已取得成功，并通过有关部门的鉴定，产品质量符合食品级要求，并具有良好的 发展前景。 虽然在蔗糖酯合成的研究上取得了一些成果，但总体上说，目前我国蔗糖酯的生产 技术相对落后，生产规模小、成本高，产品质量有待提高，应用领域尚需拓展。 在合成蔗糖酯的酯交换反应中，控制蔗糖酯中脂肪酸残基的个数，即可获得任意亲 水亲油平衡值( h l b ) ，蔗糖酯的h l b 取值范围为1 1 6 。不同取代度的蔗糖酯已被广泛 地用于食品0 1 、医药、化妆品【l l 】和洗涤剂中。此外，它们的抗肿瘤、抗菌和杀虫活性 也己被报道 1 2 - 1 4 】。 蔗糖酯的溶解性取决于分子中的脂肪酸残基数量：高级脂肪酸的单酯易溶于水，而 双酯、三酯和多元酯等难溶于水，但这类化合物却溶于酒精、丙酮，以及其它极性有机 溶剂。 蔗糖酯无明显熔点，高温熔化时易分解发黑，其原因是蔗糖基易焦化。由于蔗糖分 子中含有8 个o h 基团( 具有很高的亲水性) 和脂肪酸分子具有许多烷基单位( 具有很高的 亲脂性) ，所以蔗糖酯具有很高的亲水性和亲脂性，其亲水性高于甘油( 含3 个o h ) 和山梨 醇( 含6 个o h ) 。此外，蔗糖酯的h l b 也很高。已被批准的作为食品添加剂中，以蔗糖酯 的h l b 为最高。例如，甘油单硬脂酸酯为3 8 ，失水山梨醇单硬脂酸酯为4 0 ，而蔗糖单 硬脂酸酯为1 0 8 。 蔗糖酯无毒性、无嗅、无色、无味，对人体皮肤无刺激作用。蔗糖酯水解后成为蔗 糖和可食用的脂肪酸，具有一定的营养价值。与一般合成的表面活性剂不同，蔗糖酯在 好氧和厌氧的条件下都能生物降解，这给环境的三废处理带来了方便。因此它是一种绿 色表面活性剂。因此，蔗糖酯可作为非离子型的表面活性剂，广泛应用于食品、化工、 医药等工业。 蔗糖酯由于其良好的性能自上市以来需求量快速增加，近l o 年来国际市场以年均 s 双溶剂体系中脂g b 酶催化合成蔗糖月桂酸酯的研究 8 1 0 的速度增长。目前世界各发达国家和地区均生产这种产品，其中日本产量和 消费量很大，据统计，仅日本菱糖公司的生产能力就超过6 0 0 0 吨年。 蔗糖酯商业上的制备通常是通过蔗糖和酰氯的酯化或蔗糖和脂肪酸酯的酯交换反 应实现。由于这些方法制备蔗糖酯不能进行区域选择，产品中有大量的异构体，同时反 应条件较苛刻，因此限定了蔗糖酯的应用范围。近些年来，水解酶由于在有机溶剂中对 糖类酯化的区域选择性而逐渐被关注起来【1 5 1 。酶法催化合成蔗糖酯克服上述缺点，反应 条件温和，产品易于纯化、色泽浅，且酶具有高立体选择性、区域专一性和位置选择性， 可合成光学纯的糖酯，在医药工业上备受瞩目，因此具有重要的理论意义和应用价值【l 6 1 。 区域选择性酯化的蔗糖酯具有传感、特殊稳定和乳化等功能特性，可望作为经皮和 局部药物传输的吸收促进剂、内膜蛋白分离表面活性剂、人造血液乳化剂、抗菌剂、活 性杀虫剂和药物中间体等方面广泛应用【1 7 1 。另外，糖酯在糖厂煮糖过程中也得到了很好 的应用【1 8 捌】。糖酯类表面活性剂的表面性能和药理免疫功能都是和其结构密切相关的， 所以合成糖酯，考察它结构中亲水部分、亲油部分对其功能的影响是一项很有意义的工 作【2 2 】。同时，纯度较高的蔗糖单酯在食品、医药、化妆品等领域应用广泛【2 3 埘】。 蔗糖酯对微生物具有较广泛的抑制作用，其中蔗糖酯对革兰氏阳性菌( g + ) ，特别 是形成孢子的g + 的抑制作用较强。研究发现，枯草杆菌在蔗糖酯的作用下会出现细胞 裂解现象，认为可能是细菌在蔗糖酯诱导下产生自溶酶作用的结果【2 5 之6 1 。而蔗糖酯对乳 酸菌的生长没有影响，所以其在一下发酵食品制造中仍可使用。将蔗糖酯加入涂膜剂中， 可以抑制青霉菌对柑橘的危害，延长柑橘储藏时间【27 1 。 1 3 蔗糖酯合成 蔗糖酯是由蔗糖和脂肪酸或脂肪酸衍生物通过酯化或酰化及酯交换反应得到的产 物。由于蔗糖的三个伯羟基间以及它们和其它仲羟基间反应活性相近，合成的蔗糖酯通 常都是由蔗糖单酯、二酯和多酯等组成的混合物。 蔗糖酯的合成方法有多种分类法，从反应状态分，有均相法和非均相法；从反应方 式分，有酞氯法、酯交换法等；从工艺条件分，有溶剂法、微乳化法和无溶剂法等。到 目前为止，蔗糖酯的合成方法主要有化学法、微生物法和酶法，而微生物法和酶法由于 生产成本高目前仅限于实验室研究，化学合成蔗糖酯则己有几十年的历史，早已实现工 业化生产。早期的化学合成方法大多采用了有毒溶剂，后来逐渐改进生产工艺，不断向 无毒方向发展，其生产方法主要包括s n e l l 法、丙二醇法、水溶剂法、无溶剂法等【8 】。 6 广西大掌硕士掌位论文双溶剂体系中脂肪酶催化= - d - 成蔗糖月桂酸酯的研究 1 3 1 化学法 化学法合成蔗糖酯已经有5 0 多年的历史，经过各国科学家的努力已经成功实现了 工业化。使用化学法对蔗糖进行选择性酰化是一个复杂的过程，经常要先屏蔽其它羟基 的活性，在反应结束后再恢复其活性，很容易发生副反应，使得产物体系是一个复杂的 混合物，给分离纯化带来一定困难。 1 3 1 1 溶剂法 将蔗糖溶于d m f 中，加脂肪酸甲酯和催化剂k 2 c 0 3 ，在减压加热条件下进行酯交换 反应，同时蒸去甲醇，反应结束后除去溶剂和未参与反应的原料，并在乙醇中重结晶后 干燥粉碎而成。该法工艺简单，反应条件温和，蔗糖不会焦化，脂肪酸甲酯的酯化率高。 但是，溶剂价格昂贵、易燃、有毒，而且产品纯化较难，因此随后又出现了由二甲基亚 砜、苄胺、环己胺等取代d m f 的方法。催化剂除k 2 c 0 3 外，还有k h c 0 3 、硬酯酸钾、 n a h c 0 3 、n a o h 等。但由于甲醇有毒，所以，以脂肪酸乙酯、丙二醇酯等代替脂肪酸甲 酯。此外，加助剂如二甲苯的各种同分异构体、乙苯、丙苯、甲乙苯等，可使反应时间 缩短，催化剂用量减少，皂生成量减少，同时减少了溶剂损失和副反应。但由于不能完 全除去蔗糖酯中的有毒溶剂d m f ，所以食品级蔗糖酯不能用此法合成。 1 3 1 2 微乳化法 该法不含有毒溶剂，反应条件温和，但体系不够稳定，工艺要求高。根据溶剂的不 同，又可分为n e b r a s k a - s n e l l 法和n e b r a s k a - d k s 法。 n e b r a s k a s n e l l 法是以丙二醇为溶剂代替d m f 。所用乳化剂脂肪酸钠及催化剂 k 2 c 0 3 ，在1 0 0 与蔗糖、脂肪酸甲酯形成乳化液状，再减压升温进行酯交换反应，溶剂 在反应过程中不断蒸出，然后在1 2 0 下减压馏去残余丙二醇，冷却粉碎后溶于丁酮中， 除去不溶物得到蔗糖酯。此法工艺简单，溶剂易回收，即使残留于成品中也不妨碍食用， 脂肪酸甲酯的酯化率达到9 8 。该法的缺点是由于反应温度较高，蔗糖易焦糖化，从而 造成蔗糖的损失，且成品的色泽较深。 n e b r a s k a d k s 法又称水乳化法，是在n e b r a s k a s n e l l 法的基础上发展起来的，它以 水代替丙二醇，先使蔗糖在脂肪酸皂的作用下在水中成为均一的蔗糖一肥皂溶液。再提 高温度，同时加入催化剂和部分或全部硬脂酸甲酯进行减压脱水，所用温度和压力应保 7 双溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖月柱酸酯的研究 证硬脂酸甲酯不致发生水解。这种方法的特点是反应条件温和，不含有毒溶剂，而且反 应时间较短，原料酯化率约为8 5 9 5 。但该反应体系不稳定，脂肪酸甲酯易发生水 解，工业化生产有一定困难，反应物在水分蒸出后特别粘稠，难以搅拌，且微乳化操作 难控制。 吴谋成【2 9 1 等对蔗糖酯的水化法合成工艺做了正交设计试验，优选出蔗糖酯水化法合 成工艺参数。韦异等也研究了蔗糖酯水溶剂法合成工艺，得出水溶剂法合成蔗糖单硬脂 酸酯适宜的反应条件3 0 1 。 1 3 1 3 无溶剂法 以上提到的这些化学法合成蔗糖酯工艺的共同特点就是使用了溶剂，但无论使用什 么溶剂，都有明显的缺点，或是溶剂有毒，或是反应时间长、产率低，或是产生严重的 三废，因此人们开始研究无溶剂法。 无溶剂法可以分为非均相法、相溶法和熔融法3 种。其中，无溶剂非均相法，将蔗 糖、脂肪酸甲酯、k 2 c 0 3 在1 3 0 - 1 6 0 c 发生酯交换反应。这种方法的特点是：工艺简 单、原料酯化率较高。但不足在于，催化剂用量大，并且反应速度慢，产品灰分偏高； 而相溶法是借助一种亲和促进剂( 如蔗糖酯、肥皂等阴离子表面活性剂及非离子表面活 性剂) 使蔗糖和脂肪酸甲酯产生相溶性，从而实现酯交换。无溶剂熔融法，将蔗糖、中 性皂和原料酯置于带搅拌装置的反应器中，在惰性气体的存在下，加热至1 7 0 - - 1 8 5 ， 经短时间即可溶解或熔融成流动的均态物质，之后加酸使催化剂钝化，冷却提纯得到产 品。 李祖义【3 l 】等以生物表面活性剂为催化剂，采用均相无溶剂法在不同条件下合成了蔗 糖酯。王芬3 2 】等以乙醇为原料代替有毒的甲醇，用天然油脂替代单一脂肪酸进行反应生 成脂肪酸乙酯，脂肪酸乙酯与蔗糖在乳化剂的作用下熔融成均相，进行酯交换反应，来 合成蔗糖酯。张英珍【3 3 1 等以油脂和蔗糖为原料，不使用任何溶剂，直接反应合成脂肪酸 蔗糖甘油酯。胡建华通过进一步研究，确定了无溶剂法合成蔗糖酯工艺的基本参数：n ( 蔗糖) ：n ( 硬脂酸甲酯) = 1 ：1 1 ：4 ，反应温度1 3 5 ，反应3 5 h ，压力在1 3 3 k p a 以 下，采用硬脂酸钾助熔，在此条件下即可达到良好的均一熔融相，反应平稳进行，产品 收率达8 2 。l i u l 3 4 】等研究了蔗糖酯的合成，发现中性油酸锂皂催化效果较好，将碱金 属皂以适当比例混合能提高蔗糖酯得率。许延军【3 5 】等以猪油、砂糖、甘油和k 2 c 0 3 为 8 广西大掌硕士掌位论文双溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖月桂酸酯的研究 原料，采用常压无溶剂法合成了蔗糖酯型洗涤剂。所得粗产物除去脂肪皂、无机盐和蔗 糖等即可得到含脂肪酸蔗糖酯和单脂肪酸甘油酯的混合物。该方法体系稳定，容易控制， 分离方法简单。目前已经进行工业化生产，产品符合国家标准【3 6 1 。1 9 7 5 年，英国最大 的砂糖公司t a t e & l y l e 公司将蔗糖在k z c 0 3 催化和氮气保护下，于无溶剂下合成了蔗糖 酯，然后用丁酮溶剂进行萃取分离、干燥制得蔗糖酯。 1 3 1 4 其他方法 s i m p s o n 3 7 】用原乙酸三甲酯在对甲苯磺酸的催化下，在d m f 中和蔗糖的4 、6 位羟 基形成一个环状化合物，然后水解得到4 乙酰基蔗糖和蔗糖6 酯的混合物。在有机碱的 作用下使绝大部分的4 乙酰基蔗糖转化为蔗糖一6 一酯。其中的原乙酸三甲酯可以用原乙酸 三乙酯代替。原乙酸三甲酯可用乙腈、无水甲醇和干燥的氯化氢气体制备【3 8 9 1 。 m e n t e c h l 4 川用偶氮二甲酸异丙酯在苯甲酸催化下于d m f 中和蔗糖反应形成6 苯甲 酰基蔗糖来保护6 位羟基。但是，该方法中偶氮二甲酸异丙酯的用量较大、回收难，原 料成本太高。 m u f f i 4 1 1 等用乙酸酐在吡啶催化下与蔗糖反应。反应速率与蔗糖和乙酸酐的浓度成 正比，蔗糖过量有利于生成蔗糖单酯。该方法易产生多乙酰化的蔗糖酯衍生物。主产物 是蔗糖一6 一酯，但收率较低，只有4 0 左右，且产物较难分离。 戴愈攻【4 2 】等对乳化法和中性皂融法作了改进，以水醇作为溶剂，在一定的物料配 比和乳化条件下合成了较高纯度的蔗糖月桂酸单酯。整个过程在一个反应器中较温和的 温度下进行，因此既避免了丙二醇乳化法中高温加热带来焦糖化的不利，又避免了溶剂 法中有毒溶剂带来的危害。 1 3 2 生物法 生物法合成蔗糖酯又分为微生物法渊和酶法。微生物法合成蔗糖酯反应条件较难控 制，同时提取分离较困难。与微生物方法相比较，酶法合成的表面活性剂分子多是一些 结构相对简单的分子，但同样具有优越的表面活性2 2 1 。 2 0 世纪6 0 年代以来，随着生物工程技术的发展，人们发现某些微生物也能产生蔗 糖酯，它不仅具有乳化、润湿和增溶等作用，还具有增强免疫、抗肿瘤等性能。用根霉、 肠杆菌、曲霉、假单胞菌、色杆菌、念珠菌、粘液菌和青霉属的脂肪酶，可使蔗糖和硬 9 广西大掌硕士学位论文双溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖月桂酸酉旨的研究 脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸等反应生成蔗糖酯【4 3 】。李祖义等用一株节杆菌在3 0 ， p h 7 0 ，含6 8 蔗糖的培养液中生长4 天，经适当代谢控制得到蔗糖酯。 其实，不论微生物法还是酶法其实质都是酶在起催化作用，因此都可以归结为酶法。 酶法的特点是：( 1 ) 高效性：酶是自然界中催化活性最高的一类催化剂，比有机催化剂的 催化效率高1 0 6 l o b 倍；( 2 ) 高选择性：酶对于所催化的底物分子表现出不同的选择性， 并能对同一分子的不同活性基团进行区位选择；( 3 ) 反应条件温和：通常在常温常压的中 性有机溶液中进行反应，从而使得一些不希望的副反应如分解、异构化、消旋化和重排 反应可以减d , n 最低限度；( 4 ) 酶对环境没有污染。 长期以来人们一直错误地认为酶只能在水溶液中使用，若与有机溶剂接触，就会变 性失活。1 9 8 4 年z a l ( sa 和k l i b a n o vam 首次发表了关于有机相介质中脂肪酶的催化行 为及热稳定性的研究报道，从而彻底地突破了酶只能在单一的水溶液介质中应用的局 限。传统的酶学领域迅速产生了一个全新的分支一非水酶学。现在非水酶学方法在多肽 合成、聚合物合成、药物合成以及立体异构体拆分等方面已经显示出广阔的应用前景。 正因为酶催化剂的这些特点，使得酶促合成蔗糖酯成为近几年来研究的热点。通过 不同酶催化所得到的区域选择性产物具有许多特殊的用途】。蔗糖的化学酰化和酶酰化 有不同的区域选择性，在大多数实验条件下，化学酰化的区域选择优先顺序是6 - o h 芝6 - o h i - o h 4 5 】( 图1 3 ) 。而酶促反应中，不同的酶其区域选择性是不同的。众多 学者对此进行了大量的研究，发现许多酶，如蛋白酶、脂肪酶、抗体酶均能用来合成蔗 糖酯。归纳起来有如下几点特征：来自枯草杆菌的蛋白酶的区域选择性体现在蔗糖的 i - o h ，另外还有其他几种蛋白酶表现了对2 o h 的选择性。但蛋白酶通常不接受长链 ( c 。 1 2 ) 脂肪酸作为酰基供体，因此限制了蛋白酶在表面活性剂制备方面的适用性。 与蛋白酶相比较，脂肪酶可催化宽范围的脂肪酸蔗糖酯的合成，其酰化部位一般发生 在6 - o h 。最近研究发现抗体酶也能催化合成蔗糖酯。它的意义在于：不仅增加了合 成蔗糖酯的酶的种类，而且由抗体酶可能得到更纯的6 o 蔗糖单酯。酶促合成蔗糖酯反 应中对酶的选择是至关重要的，为了找到合适的酶，不仅要了解酶的结构特征、催化机 制，而且还要进行大量的试验【4 6 1 。 1 0 广西大掌硕士掌位论文双溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖月桂酸酯的研究 h o 化学法1 6 z 6 1 脂肪酶 图l - 2 不同方法合成蔗糖酯作用住点 f i g1 - 2t h ea c t i o ns i t ei ns u c r o s eo fd i 仃e r e n ts u c r o s ee s t e r ss 姗e s i sm e m o d s 国内外研究现状分析 酶催化合成蔗糖酯主要有两种方法。第一种是在溶解糖和酰化剂的溶剂存在下合成 蔗糖酯；第二种是基于被修饰蔗糖的疏水性在无溶剂状态下合成蔗糖酯，或者是通过活 化酯进行酯交换1 7 】。目前，国内外利用酶法合成蔗糖酯的研究基本都是基于这两种方法 进行的。主要的研究成果如下： 1 3 2 1 国内研究： 1 李祖义等用一株节杆菌，在3 0 ，p h 7 0 ，含6 8 蔗糖的培养液中培养4 天，经适 当代谢控制得到蔗糖酯。 2 潘冰峰，李祖义【4 7 】研究了不同糖脂化合物修饰的脂肪酶在有机溶剂中催化长碳链脂 肪酸和脂肪醇的酯化反应。不同的脂肪酶经糖脂修饰后，催化活性均有不同程度的 提高。 3 冯雷刚等1 1 6 】以固定化脂肪酶作为生物催化剂在无溶剂体系中初步合成了蔗糖月桂酸 酯。以熔融态的月桂酸作为反应溶剂( 同时也是反应底物) ，对脂肪酶催化合成蔗糖月 桂酸酯进行了初步研究。最高转化率为3 4 7 ，其中单酯含量为8 5 ，二酯为1 5 。