（植物营养学专业论文）食物垃圾高效降解功能菌株的筛选、鉴定及其优化组配.pdf

摘要 摘要 一家一户的餐厨垃圾数量虽不多，但千家万户汇集的总量却相当庞大，因其 来源分散不易收集，难以进行堆肥或饲料加工等资源化利用，由于其有机质含量 高，水分大极易腐烂发臭，对垃圾填埋或焚烧处置带来诸多难题。研发家庭食物 垃圾的微生物降解原位消除技术，实现就地产生就地消纳，是解决城镇居民生活 有机垃圾造成严重环境污染问题的良好途径。为此，本研究在分离、筛选食物性 垃圾高效降解功能菌株的基础上，采用不同菌株的组合以及载体材料的组配制备 食物垃圾降解菌剂，对模拟食物垃圾和食堂餐余垃圾进行降解试验，取得如下结 果： ( 1 ) 通过对前期工作中初步筛选出的9 个食物垃圾降解菌株的生长曲线 测定；在蛋白质、纤维素、淀粉和脂肪固体培养基平板上的菌落或溶菌圈大小 观察；胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶活测定和菌株间的两两对峙试 验，结果表明菌株n o 1 、n o 2 、n o 3 、c d 4 、c d 6 和c d 8 具有或兼具较强的 蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶活性，是食物垃圾降解菌剂的良好候选菌 株。 ( 2 ) 通过形态学观察、生理生化测定和1 6 sr d n a 或1 8 sr d n a 的p c r 扩 增、序列分析，将菌株n o 1 鉴定为雅致放射毛霉( a c t i n o m u c o re l e g a n s ) ，n o 2 鉴定为蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 和n o 3 鉴定为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) ，分别命名为a e l e g a n sn o 1 、丑c e r e u sn o 2 和矗s u b t i l i sn o 3 。 ( 3 ) 以3 个菌株a e l e g a n sn o 1 、最c e r e u sn o 2 和b s u b t i l i sn o 3 组合与 土壤、木屑、谷壳和笋壳以3 ：4 ：4 ：1 配比制备的微生物菌剂，在食物垃圾降解处 理机内运行l 周，对模拟食物垃圾的平均日降解率达9 0 左右。发现降解率与 菌剂基质含水率和p h 有关，含水率介于2 5 3 0 ，p h 介于5 肚7 o 时降解 效率较高。 ( 4 ) 以3 个功能菌株a e l e g a n sn o 1 、晟c e r e u sn o 2 和丑s u b t i l i sn o 3 组合 与竹碳、棉籽壳、谷壳、木屑和土壤以4 ：5 ：6 ：8 ：6 配比制备的微生物菌剂，在向 外排风和向内送风的食物垃圾降解处理机中持续降解运行2 0d ，食堂餐余垃圾平 均降解率分别达7 1 和7 4 ，最高日降解率分别达1 2 8 和1 0 6 。本实验发现 摘要 适合微生物菌剂生长的最适c n 为3 0 ，在反应初期食堂餐余垃圾的投加能促使 接种微生物菌剂大量繁殖，合成自身有机物质。但是由于食堂餐余垃圾存在大量 的油类物质和盐类n a c l ，导致反应后期降解能力降低。 关键词：流加处理技术：有机垃圾；微生物菌剂；模拟食物垃圾；食堂餐余垃圾一 i i a b s t r a c t a b s t r a c t t h eq u a n t i t yo ff o o dw a s t e sw a sl i t t l ew h e ns e p a r a t e da m o n gf a m i l yu n i t s ，b u t w h e nc o m b i n e d ，t h et o t a lq u a n t i t yw a sa m a z i n g l yt r e m e n d o u s f o o dw a s t e s d i s p e r s e di nd i f f e r e n td i s t r i c t s ，s oi tw a sd i f f e r e n tt or e u s eo fr e s o u r c es u c ha s c o l l e c t i o n ，c o m p o s to rp r o c e s so ff e e & t u f f f o o dw a s t e sw e r ea b o u n d e di no r g a n i c m a t t e r sa n dw a t e r , s ot h e yw e r ee a s i l yt op u t r e f y , r e s u l t i n gi np r o b l e m si nw a s t e s l a n d f i l lo rc o m b u s t i n g r e s e a r c ho nf o o dw a s t e se l i m i n a t i o nt e c h n o l o g yi ns i t ub y m i c r o o r g a n i s m s s e e m st ob ea g o o dp a t h w a y t or e s o l v ee n v i r o n m e n t a l c o n t a m i n a t i o no fo r g a n i cw a s t e si nr u r a la n du r b a na r e a s t h i se x p e r i m e n ti n i t i a t e d 、) l ，i t l ls c r e e n i n gm i c r o b i a ls t r a i n so fh i g hp e r f o r m a n c eo ff o o dw a s t ed e c o m p o s i n g ， t h e nd i f f e r e n tm i c r o b i a ls t r a i n sa n dm a t r i x e sw a sa s s e m b l e dt om a k eu po fm i c r o b i a l c o m m u n i t i e so ff o o dw a s t e sw h i c hf i n a l l yw e r ep e r f o r m e di ne x p e r i m e n t so f s i m u l a t e df o o dw a s t ea n dr e f e c t o r yg a r b a g e ，r e s u l t sw e r e ： ( 1 ) n i n es t r a i n so fm i c r o b e sw h i c hw e r es c r e e n e di nf o r m e rr e s e a r c ht h a tc o u l d d e g r a d ef o o dw a s t ew e r es u b j e c t e dt oe x p e r i m e n t so fg r o w t hc u r v e ，h a l oo f d e g r a d a t i o no b s e r v a t i o n , a n t a g o n i s t i ct e s t i np r o t e i n , l i p i d ，c e l l u l o s ea n da m y l u m c u l t u r em e d i u m ，e x t r a - c e l l u l a re n z y m ea c t i v i t i e si n p r o t e i n , 1 i p i d ，c e l l u l o s ea n d a m y l u mi n c u b a t i o n ，a n dr e s u l t sc a m et ob et h a ts t r a i n so f n o 1 、n o 2 、n o 3 、c d 4 、 c d 6a n dc d 8h a ds t r o n g e re n z y m ea c t i v i t i e si np r o t e i n ，l i p i d ，c e l l u l o s ea n da m y l u m h y d r o l y s i s ，w e r ec a n d i d a t em i c r o b i a ls t r a i n sf o rf o o dw a s t ed e g r a d i n gm i c r o b i a l c o m m u n i t y ； ( 2 ) s t r a i n so fn o 1 ，n o 2a n dn o 3w e r ei d e n t i f i e dt ob ea c t i n o m u c o re i e g a n s ， b a c i l l u sc e r e u sa n db a c i l l u ss u b t i l i sr e s p e c t i v e l y , a n dw e r en a m e d a ，e e g a n sn o 1 ，丑 c e r e u sn o 2a n d 丑s u b t i l i sn o 3r e s p e c t i v e l y ； ( 3 ) m i c r o b i a lc o m m u n i t yw a sc o m p o s e do fa s s e m b l e dm i c r o b e so fa e l e g a n s n o 1 。b c e r e u sn o 2a n d8 。s u b t i l i sn o 3a n da s s e m b l e dm a t r i x e so fs o i l 。s a w d u s t ， c h a f fa n db a m b o os h u c ko fw h i c hm a t c h e dr a t i ow a s3 ：4 ：4 ：1 r e s p e c t i v e l y e x p e r i m e n t i i i a b s t r a c t w a sm a n i p u l a t e di nk i t c h e ng a r b a g ed e g r a d a t i o nm a c h i n ea n dp r o c e s s e df o r1w e e k , a n dr e s u l t st u r n e do u tt h a ta v e r a g ed e g r a d a t i o nc o m e n tp e rd a yo fs i m u l a t e df o o d w a s t ew a sa r o u n d9 0 m o i s t u r ec o n t e n ta n dp hw e r ek e yf - a c t o r s a f f e c t i n g d e g r a d a t i o nc a p a b i l i t yo ff o o dw a s t e ，a n dr e s e a r c hi l l u m i n a t e dt h a tp hs h o u l db e b e t w e e n5 0a n d7 o ；m o i s t u r es h o u l db eb e t w e e n2 5 a n d3 0 ； ( 4 ) m i c r o b i a lc o m m u n i t yw a sc o m p o s e do fa s s e m b l e dm i c r o b e so fa e l e g a n s n o 1 。b c e r e u sn o 2a n db s u b t i l i sn o 3a n da s s e m b l e dm a t r i x e so fb a m b o o c h a r c o a l ，c o t t o ns e e ds h u c k , c h a f f , s a w d u s ta n ds o i lo fw h i c h m a t c h e dr a t i ow a s 4 ：5 ：6 ：8 ：6r e s p e c t i v e l y 。e x p e r i m e n tw a sm a n i p u l a t e di nk i t c h e ng a r b a g ed e g r a d a t i o n m a c h i n ew i t hd i f f e r e n tv e n t i l a t i o n so fo u t e r - v e n t i l a t i o na n di n n e r - v e n t i l a t i o na n d p r o c e s s e df o r2 0d a y s ，r e s u l t st u r n e do u tt h a ta v e r a g ed e g r a d a t i o nc o n t e n tp e rd a yo f r e f e c t o r yg a r b l ew a sa r o u n d 71 a n d7 4 r e s p e c t i v e l y , w h e r e a st h eh i g h e s t d e g r a d a t i o nc o n t e n tp e rd a yw a s 12 8 a n d10 6 r e s p e c t i v e l y i nt h i sr e s e a r c h o p t i m a lc nw a s3 0f i x e di n o c u l a t e dm i c r o b i a lc o m m u n i t i e s ，a n di nt h eb e g i n n i n g , f e e do fr e f e c t o r yg a r b a g eb o o m e dq u a n t i t yo fi n o c u l a t e dm i c r o b i a lc o m m u n i t y , h e l p i n gt ob i o s y n t h e s i z es e l fo r g a n i cm a t e r i a l s r e f e c t o r yg a r b a g ea b o u n d e dw i l l i p i da n dn a c i ，w h i c hr e d u c e dd e g r a d a t i o nc a p a b i l i t yi nl a t e rp r o c e s s k e y w o r d s ：f e d - b a t c ht r e a t m e n t ；o r g a n i cg a r b a g e ；i n o c u l a t i o no fm i c r o b i a l c o m m u n i t y ；s i m u l a t e df o o dg a r b a g e ；r e f e c t o r yg a r b a g e i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得迸婆盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸婆盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月日签字日期：年月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 致谢 本论文是在导师方萍教授悉心指导和不断鼓励下完成的。从论文的选题、试 验方案设计及实施、论文的撰写与修改都倾注了导师大量的心血。方萍教授渊博 的知识、严谨踏实的治学态度、敏锐的学术洞察力和言传身教的精神都深深感染 和鼓励了我。慈母般无私的关爱和帮助，使我在学习之外的生活中都感觉到了家 的温暖。 在研究和学习期间得到许多老师的指导和启发，感谢石伟勇教授、林咸永教 授、倪吾钟研究员、徐正浩副教授、冯英副教授等对我的研究工作给予了很多有 益帮助和关心；感谢植保所的李红叶教授和生科院的贾小明副教授对菌种鉴定的 帮助；感谢研究生科的钱秀萍老师、陈秀美老师和丁小梅老师在学业和生活上给 与的关心和帮助。 感谢0 6 届研博会全体成员在组织上和生活上的帮助和支持，感谢农学院贾 成国、陈广进，环保所梁志伟、刘平、杨建军、朱妙军，环科所田宝莲等在研究 上的帮助和支持。 感谢同实验室的王月、朱日清、张晓玲、滕一波、腊贵晓、李亚娟、史琳娜、 杨俞娟在生活和学习上的帮助。感谢陈娇、陈林华、鲁洪娟、黄立东、朱伟锋、 刘婧、孙园园、管益东、张敏等同学在学习和生活上的帮助和支持。 感谢同寝室的另外三个兄弟孟现成、张巧生和雷剑提供一个融洽、真挚的生 活环境，两年时间虽短，但印象是深刻的，愿这份情谊常在。 感谢父母在这几年的默默付出，以及常在的殷切希望! 吴海龙 2 0 0 8 年5 月 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 国内外有机垃圾产生及处置现状 人们一直以来把城市生活垃圾叫做有机垃圾，是因为城市生活垃圾中的有机 成分比较大，含水量高，容易生物降解。但是对有机垃圾更加准确的定义应该为 城市生活垃圾的有机成分，这样才能把有机垃圾跟一般的建筑垃圾、塑料废物等 区别开来。 有机垃圾一般包括秸杆树叶、果壳木屑、人畜粪便等农林和养殖废物，又包 括厨余泔脚、食品废渣、下水道污泥等生产和生活垃圾。在各类城市垃圾中，有 机垃圾因为来源广、产量大、成分复杂，又常常带有各种病原体，因此比一般的 垃圾更难处理。以食物性垃圾为例，食物性垃圾包括城镇菜场垃圾、餐馆饮食业 垃圾、家庭厨房垃圾和各种市场的瓜果皮等城镇垃圾，又可以称为食物垃圾。这 些垃圾的共同特点是：含水率高( 一般高达8 5 - - 一9 0 ) 、有机质比例高( 占干物质 9 5 以上) 、氮磷钾等营养元素丰富和易腐烂( 耿土锁，2 0 0 2 ) 。 随着工、农、服务业的发展，尤其是居民生活水平的提高，有机垃圾的产量 逐年升高，全世界每年以8 l o 的比例递增( v o nf a h n e s t o c ke ta l ，1 - 9 9 6 ) 。 据统计，2 0 0 2 年全国有机垃圾的排放总量达4 1 1 3 - - - ，4 3 1 4 亿t ，其中蕴含粗有机 质1 2 1 2 7 亿t ( 李国学等，2 0 0 3 ) 。 现今城市生活垃圾的处理方法主要有卫生填埋、焚烧、堆肥。而这三种方法 各有优缺点。卫生填埋的优点是处理量大，总成本较低，缺点是土地占有量大， 且得考虑渗滤问题；焚烧可以在短时间内减量，回收能源，消灭各种病毒细菌， 但它的初期投资大，运行成本高，还会造成大气污染；堆肥的优点是资源化程度 高，但是垃圾成分复杂，工艺条件难以控制，且容易产生恶臭( 周富春等，2 0 0 4 ) 。 我国对城市生活垃圾的处理主要是填埋，约占全部处理量的7 0 以上；其次是 高温堆肥，约占2 0 以上；焚烧量甚微( 闵庆文，2 0 0 2 ) 。而据荣波等( 荣波等， 2 0 0 4 ) 对北京宣武区生活垃圾成分分析表明，该区生活垃圾适合堆肥、焚烧和填 埋处理的垃圾成分所占垃圾总量的比例为4 3 ：1 3 ：4 4 和4 0 ：1 9 ：4 l ，且目前北 京市生活垃圾处理方式很不合理，三种处理方式所占比例为4 6 ：5 8 ：8 9 6 ，没 有对生活垃圾真正做到减量化、资源化和无害化。但国外像美国等国家由于采用 第一章文献综述 的是垃圾处理收费制，因此垃圾资源化利用较高，2 0 0 2 年，其垃圾的回收、堆 肥、焚烧、填埋处理率分别占2 2 4 、7 2 、1 4 7 、5 5 7 ( 王星等，2 0 0 5 ) 。 因此，如何改善我国生活垃圾尤其是有机垃圾的处置方式是提高环境质量的重要 一步。 1 2 有机垃圾生物降解研究进展 1 2 1 好氧堆肥 利用微生物降解有机垃圾是国内外比较通行的方法，这与传统的焚烧或填埋 方法相比，不仅能够使资源得到有效利用，而且不会污染环境。其中好氧堆肥是 比较通用的办法。 好氧堆肥，是在通空气的条件下，好氧微生物起作用，最终将垃圾制成肥料。 堆肥过程是一个生物降解和生物转化有机垃圾的固相、自身产热及生物过程，它 一般包括四个不同的温度阶段，如中温、高温、降温和腐熟阶段( f o r g a r t y 和 t u o v i n e n ，1 9 9 1 ) 。各阶段活跃着不同的微生物。在堆肥过程中，主要影响因素有 环境温度、氧状况、c ：n ：p 、p h 等。堆肥时，温度应该在1 0 以上才能够保 证堆肥的正常进行( l iy xe ta l ，1 9 9 8 ) ；c ：n ：p 值在2 4 0 ：8 ：( 1 - 2 ) 时，有机垃圾。 才能被快速有效分解( 任连海等，2 0 0 3 ) 。对堆料中空气的含量应为8 1 8 ， 因为当低于8 时，好氧微生物活动降低，形成厌氧状态，易产生恶臭，并降低 堆肥的品质( 石磊等，2 0 0 4 ) 。另外，有的垃圾水分含量较高，容易形成粘稠状， 形成厌氧环境，对好氧堆肥不利；而粘稠状的环境也可使热量不容易散发，使温 度升高。因此，在有机垃圾堆肥过程中，我们可以通过适当添加锯末或纸屑来降 低含水量，添加蓬松剂和适度搅拌来增加氧含量。 温度影响有机垃圾堆肥的质量。在有机垃圾堆肥过程中，由于好氧微生物的 活动受到温度的限制，一般最佳温度在5 5 。c 一6 0 。c 之间，超过6 0 。c 时微生物受 到抑制。在食物垃圾堆肥研究中，堆肥在第2d 温度超过5 5 。c ，1 0d 后才稳定在 2 5 。但在第3d 温度就低于4 0 。c ，只在第6d 后才能继续保持高温状态( j a y an a i r 甜a ，2 0 0 6 ) 。而据w h 和s m i t h ( 1 9 9 9 ) 的研究，要想堆肥彻底，并使病菌大量 减少，至少要保持1 5d5 5 。c 的高温。如果在食物垃圾中加入锯屑和落叶，便能 继续保持1 4d 的高温状态( d o n a j u e ，dw m e ta l ，1 9 9 8 ) 。 2 第一章文献综述 p h 值也影响堆肥的进程。一般认为，堆肥过程处于碱性状态，并且碱性随 温度的升高而升高( v u j i t a ke ta l ，1 9 8 5 ) 。而p h 的升高是由于n h 4 + 的生成导致 的( k i t a w a k ise ta l ，1 9 8 4 ) 。于是，当反应中有机酸含量增大而导致p h 值降低 时，可以通过石灰水淋洗等手段加以调节，或适当增加通风量保证好氧状态堆肥 过程顺利进行。而且s a k a eh o r i s a w a 等人( 2 0 0 1 ) 发现，p h 的变化可导致微生 ： 物菌群种类的变化。 添加微生物菌剂能大大提高有机垃圾堆肥的性能，h a s s e na b d e n n a e e u r 等人 ( 2 0 0 1 ) 用细菌、真菌、酵母菌、放线茵、乳酸菌、固氮菌、纤维素分解菌等多 种微生物经特殊方法培养而组成高效复合微生物菌群。与单一菌种相比，这些复 合微生物菌群依靠相互间的协同作用，可更迅速地分解垃圾中的有机物，代谢出 抗氧化物质，生成复杂而稳定的生态系统，并抑制有害微生物的生长繁殖；袁月 祥等人( 2 0 0 2 ) 对有机垃圾堆肥过程中的微生物研究指出，对有机垃圾进行堆肥 处理时需先进行通气处理，以加快好氧发酵，可迅速提高垃圾的发酵温度，从而 达到无害化的作用，并且在堆肥初期需接种一些高温微生物，以缩短垃圾堆肥处 理的时间。薄一涛等人( 1 9 9 9 ) 则用固氮菌和纤维素分解菌联合培养来提高有机 垃圾降解程度。研究发现，自生固氮菌与纤维素分解菌混合培养可使固氮菌利用 纤维素分解菌分解纤维素产生的葡萄糖作为碳源，而纤维素分解菌利用固氮菌所 固定的氮为氮源。两者相互利用，相互依存，进行生长和繁殖，可大大提高生活 垃圾的降解速度，同时其降解物的含量也有明显的提高。这些研究成果，为提高 高效混合菌剂对有机垃圾的降解程度提供了理论基础。 1 2 2 厌氧发酵产甲烷 厌氧发酵产甲烷一般上是指厌氧发酵，是将有机废物在厌氧菌作用下，降解 产生沼气，用作能源，底物经脱水制成肥料。b r y a n t 等人曾提出厌氧消化3 阶段 理论：第一阶段，可称为水解发酵阶段，是指复杂的有机物在微生物作用下进行 水解和发酵。第二阶段，产氢、产乙酸阶段。第三阶段利用第一、二阶段产生的 二氧化碳、氢气合成甲烷。但是相对于好氧堆肥来说，厌氧发酵法存在着水力停 留时间( h r t ) 长、氧气控制难、搅拌不容易、有毒物质对微生物活性的抑制等 缺点( 任连海等，2 0 0 3 ) 。 第一章文献综述 s a n d e r s 等人( 1 9 9 9 ) 研究表明，垃圾的总表面积是水解过程的关键因子， 总表面积越大，水解越容易；而又有人指出( l e b r a t oj ，1 9 9 5 ) ，在厌氧发酵的 基质方面，不同的基质厌氧消化的速度不同，碳水化合物由于水解速度快，容易 分解，厌氧发酵的产气速度和产气率都比较高，蛋白质和脂肪次之，纤维素和木 质素最难分解，尤其是木质素。这些理论成果的应用，使厌氧消化法在摸索中稳 步前进，并取得一定的成果。 有机垃圾资源化是厌氧发酵的目的，因此，能够高效率地获得发酵产物 沼气是同行业所比较关心的。一般情况下，厌氧发酵法处理有机垃圾时加入的菌 种，其比例为料重的2 0 左右，能达到3 0 以上更好，这样可以提高产气速率 和早期沼气中甲烷的含量( 孙国朝，1 9 8 8 ) ；且最佳接种时间是在前一个发酵进 行1 8d - - 一3 8d 时用发酵料接种下一批量的发酵( s i l v e ypb l a c k a l l ，1 9 9 9 ) 。 另外，挥发性有机酸过多会抑制产甲烷过程，引起酸中毒( 张光明，王伟， 1 9 9 6 ) ，但丙酸对酸中毒的影响最大，当丙酸浓度在1 l 时就会出现明显的抑制 现象( m o s c h em ，1 9 9 9 ) 。此外，如果游离氨过多的话也会影响产甲烷细菌的活 性。因此，在厌氧发酵过程中，应时刻注意挥发性有机酸和游离氨的含量。 在厌氧发酵过程中，主要影响因子是水力停留时间( h i 玎) 、化学需氧量、 容积负荷、进料t s s 和发酵温度。金建祥等人( 2 0 0 5 ) 对餐饮有机垃圾进行实 验，发现当h r t 为2 0d ，进料t s s 为8 0 ，c o d 7 0g l ，且容积负荷小于2 5 gc o d ( l d ) 时处理效果较好。 ： 1 2 3 厌氧发酵产氢气 氢气是有机垃圾通过厌氧发酵转变成有机酸再被产甲烷菌所利用过程中的 中间产物。有机垃圾在厌氧发酵产甲烷过程中由于存在着产甲烷菌和脱硫菌，使 得氢气大量被消耗( m i z u n o0 ，2 0 0 0 ) 。因此，有机垃圾厌氧产氢气需要控制操 作条件。u e n o 等( 2 0 0 1 ) 报道说高温条件能抑制产甲烷过程，而且在有机垃圾 或污泥的处理之前先经过热处理能抑制产甲烷菌的生成( l i nc y ，2 0 0 4 ) 。产甲 烷菌群的生长对环境条件要求比较严格，其中p h 影响最大，一般要求在6 6 7 4 之间( r o y c h o w d h u r yse ta l ，1 9 9 8 ) ，当p h 低于6 3 时，产甲烷速率降低或 者停止( v a nh a a n d e la c ，1 9 9 4 ) ；而当p h 介于5 0 - 6 0 时适合产氢过程，并且 4 第一章文献综述 当p h 为5 5 时氢气产生效率最高( g i n k e ls v ，2 0 0 1 ) ，但是当p h 低于5 o 时能 抑制产氢过程( c h e ncc ，2 0 0 2 ) 。另外，水力停留时间( h r t ) 、底物组成、有 机负荷率等也影响产氢过程( h a n gs i ks h i n ，j o n gh oy o u n ，2 0 0 5 ) 。 微生物通过两种途径产氢气。这两种途径为( 任南琪，李建政等，2 0 0 2 ) ：( 1 ) e m p 途径中的丙酮酸脱羧产氢；( 2 ) 辅酶i 的氧化与还原平衡调节产氢。第一 个途径中产氢酶氧化铁硫还原蛋白，同时产氢。产氢产酸发酵细菌一般含有8 f e 铁还原蛋白，这种铁硫蛋白首先在巴氏梭状芽孢杆菌中发现，其活性中心为 f e 4 s 4 ( s c y s ) 4 型。螺旋体属亦为严格发酵碳水化合物的微生物，在代谢上与梭状 芽孢菌属相似，经糖酵解e m p 途径发酵萄糖生成c 0 2 、h 2 、乙酸、乙醇等作为 主要末端产物。该属也有些种以红还原蛋白替代铁还原蛋白，其活性中心为 f e 4 ( s c y s ) ( 任南琪，王宝贞，1 9 9 4 ) 。第二个途径中碳水化合物经e m p 途径产 生的还原型辅酶i ( n a d h + h + ) ，一般可通过与一定比例的丙酸、丁酸、乙醇或乳 酸发酵相耦联而得以氧化为氧化型辅酶i ( n a d + ) ，从而保证代谢过程中 m h + 矿n a d + 的平衡，这也是之所以产生各种发酵类型( 丙酸型、丁酸型及 乙醇型等) 的重要原因之一。生物体内的n a d + 与n a d h + 一的比例是一定的，当 n a d h + w 的氧化过程相对于其形成过程较慢时，必然会造成n a d h + 矿的积累。 为了保证生理代谢过程的正常进行，发酵细菌可以通过释放h 2 的方式将过量的 n a d h 盯氧化。 影响微生物厌氧发酵产氢气的因素很多，包括p h ( v a nh a a n d e la c ，1 9 9 4 ； c d n k e ls v ，2 0 0 1 ：c h e ncc ，2 0 0 2 ) 、温度( y uh 甜a l ，2 0 0 2 ) 、有机酸( v f a ) 生成情况( s u nk e eh a n ，2 0 0 4 ：王海宾等，2 0 0 5 ) 、底物浓度( f a n gh h p ，2 0 0 2 ： m o r i m o t om ，2 0 0 4 ) 、乳酸细菌等微生物的抑制作用( t a t s u y a n o i k e ，2 0 0 2 ) 等。 1 3 微生物菌剂在有机垃圾降解过程中的应用 本节以堆肥为例研究微生物菌剂在有机垃圾降解过程中的作用以及过程参 数的变化和微生物性能的关系。 堆肥是一个生物技术过程，在这过程中利用不同的微生物降解有机物质为简 单的成分。堆肥又是一个好氧过程，它需要氧气的补充，以及适合的湿度和孔隙 度( h a u grt ，1 9 9 3 ) 。传统的堆肥方法由于受到温度、有机成分、水分、氧气 第一章文献综述 等条件的限制，土著微生物发挥其功能的能力不可能完全表现出来。而且，对于 一些难以降解的物质如木质纤维素，由于它存在难降解的大分子物质，在堆肥过 程中容易产生植物性毒素( r e q u e n a , ne ta l ，1 9 9 6 ) 。因此，现在对堆肥的研究 慢慢转向加菌剂的方向上。关于在堆肥过程中接种微生物菌剂的方法是否能改善 堆肥工艺过程以及提高产品质量的争议一直存在。o h t a k i ( 1 9 9 8 ) 发现接菌能增 加微生物数量，形成有益的微生物种群，改善微生物质量并且产生各种适宜的酶 类；增加有机物转化能力并且减少恶臭。l e i ( 2 0 0 0 ) 在研究中指出，所接种的 微生物菌剂和土著微生物群都能不断地生长，导致在堆肥不同阶段出现不同的变 化。这种结果导致对相关接菌机理研究的困难度。s h i n 等人( 1 9 9 9 ) 也研究指出 依靠添加固体或液体微生物菌剂能提高堆肥效率。另有些报道指出在家禽废物堆 肥过程中接种富含羽质降解菌的菌剂能提高角蛋白的降解以及生物膜的形成( a h a t a k k a ，1 9 9 4 ) ，或者添加功能菌剂能显著改变堆肥环境中聚已酸内酯的降解能 力( kn a k a s a k ie ta l ，1 9 9 4 ) 。然而，另外一些类似研究发现添加微生物菌剂对 不同垃圾堆肥过程没有显著影响。导致这些结果的原因不同，譬如在堆肥材料中 存在大量的土著微生物，足以胜任堆肥过程( o h t a k i ，1 9 9 8 ；l e i ，2 0 0 0 ) ，或者 说在土著微生物和接种菌剂之间存在竞争等( s t e v e nd o n a l dt h o m a s ，1 9 9 5 ) 。还 有些研究尽管没有发现接菌产生的效应，却在堆肥过程中观察到过程变异性程度 的降低( p a g a m u t h ue ta l ，2 0 0 0 ) 。 堆肥是一个复杂的生物、化学过程，因此对它的操作条件要求很高。不同的 堆体材料、含水率、接菌状况，以及过程中的p h 、温度、c n 等变化都会导致 不同的堆肥结果。接种微生物菌剂能改变堆肥过程的理化性质、微生物群落结构、 以及堆肥肥料的腐熟度。 1 3 1 接种微生物菌剂对堆肥过程的影响 smx i q u i a 等人( 1 9 9 7 ) 利用微生物菌剂处理猪粪和锯末的混合物。他们设 置四个处理，堆料a 和b 不接微生物菌剂，堆料c 和d 接种微生物菌剂；堆料 a 和c 在堆肥过程中不调节水份，然而堆料b 和d 于2 0d ，4 1d ，5 5d ，7 6d 和9 0d 调节水份至6 0 。在堆肥过程中，他们发现，处理a 温度降低得最慢， 到堆肥结束时还未到达环境温度。而另外三个处理在5 6d 即降到环境温度，并 6 第一章文献综述 且保持到堆肥结束。并且接菌的堆体所达到的最高温度比未接菌的要稍微高一 点。堆体的基本理化性状如p h ，氨氮、硝氮浓度，c e c ( 阳离子交换量) 数据 显示处理a 所达到的腐熟程度不彻底，但是其他三个处理没有明显的差异。上 世纪8 0 年代末s e n e s i ( 1 9 8 9 ) 认为胡敏酸( h a ) ，胡敏酸：富里酸( h a ：f a ) 可 以作为有机物质降解程度和堆体腐熟度的标志。而b a r b e r i s 等人( 1 9 9 6 ) 研究指 出在堆肥过程中h a 增加并慢慢超过f a 的浓度，两者间的比值是标志堆肥腐熟 程度的一个重要指标。smt i q u i a 等人的实验有力地证明了上述论点。处理a 的 h a 及h a ：f a 在堆肥过程中缓慢上升，在6 3d 维持在一定浓度；而处理b 、c 、 d 的h a 及h a ：f a 增加较快，浓度也显著要高于处理处理a 。 脱氢过程是有机化合物生物氧化的基本过程，脱氢酶在有机物质氧化过程中 的作用非常重要，它们能把氢从基质转移到受体上。这种酶是组成整体微生物的 一部分，因此有人认为对脱氢酶活性的测定能够了解微生物群落的活力，是一个 鉴定微生物活性的很好方法( t a b a t a b a i ，m a ，1 9 8 2 ) 。同样a t p 含量是另外一个 测定微生物活性和生物量的通用参数( s k u j i n s ，j ，1 9 7 3 ) 。a t p 含量也同时代表 堆肥过程中整个微生物群细胞的代谢活性( j e n k i n s o n , dse ta l ，1 9 8 1 ) 。通过测 定脱氢酶活性和a t p 含量，实验发现处理a 在堆肥末期还有一定的活性，而其 他处理其活性急剧下降后并保持稳定一直到堆肥结束。通过实验，他们认为接种 微生物菌剂能很好的改善堆肥的工艺过程，虽然说调节水分含量也能代替接菌， 但接菌条件下堆肥的最高温度比没接菌时要高，而猪粪中本来就存在的微生物群 落促使接菌效果下降。 s h u h s i e nt s a i 等人( 2 0 0 7 ) 利用d y - 8 0 7 5 e 型机械降解机处理食物垃圾。与 对照相比，发现当接菌后( 接中温微生物和脂肪降解微生物) ，总氮从2 0 1 提 高到2 1 0 ，灰分从2 4 9 4 提高到2 9 2 l ，粗脂肪从4 8 8 降低到1 3 4 ， c n 从1 8 0 2 降低到1 7 6 5 。一般认为，食物垃圾中的过量油类对降解过程有抑 制效应，而且导致机器中油类的积累( b e c kf r i i sb ，2 0 0 1 ) 。因此，低的脂肪含 量可以适合微生物生长。使腐熟时间减少并且提高堆肥的质量。 fl e i 等人( 2 0 0 0 ) 则通过接种微生物菌剂及调整p h 观察葡萄渣和秸秆联合 堆肥中微生物群落的变化。微生物群落分析运用了磷酸脂肪酸法( p l f a ) 。p l f a 是构成活体细胞膜的重要组分，不同类群的微生物能通过不同生化途径形成不同 7 第一章文献综述 的p l f a ，因此p l f a 可以作为微生物生物量和群落结构变化的生物标记分子 ( r o b i ej ，1 9 8 9 ) 。磷脂在细胞死亡后迅速分解，代表了有活性的那部分细胞 ( t u n l i d a e t a l ，1 9 8 5 ) ，适合于微生物群落的动态监测。在现有的研究中，p l f a 一般只能粗略地区分革兰氏阳性、阴性菌，好氧细菌、厌氧细菌、真菌等( 表1 1 ) ( m a k u l ar a ，1 9 7 8 ：v e s t a lj re ta l ，1 9 8 9 ；t u n l i dae ta l ，1 9 9 2 ：j a i nd ke ta l ， 1 9 9 7 ) 。堆肥设置四个处理，1 处理加菌不调p h ，2 处理不加菌不调p h ，l 跟2 处理秸秆：葡萄渣为1 ：3 4 ；3 处理不加菌不调p h ，4 处理不加菌调p h 至6 左 右( 其余p h 为4 左右) ，3 和4 处理秸秆：葡萄渣为1 ：5 o 。实验表明接菌和调 整p h 并没有提高葡萄渣和秸秆联合堆肥的整体质量。而且接菌对堆肥高一中温 区和低一高温区的主要微生物群落结构构成没有显著效果，也不能提高升温速 度，但是接菌确实能够提高堆肥过程中4 0 以上温度的持续时间。 表1 - 1 指示特定微生物的p l f a 生物标记物 t a b l e1 - 1p l f ab i o m a r k e r sf o ri n d i c a t i n gt h et y p eo fm i c r o b e s 注：磷脂酸的命名按以下顺序：总碳原子数：双键数量，随后是从分子甲基末端数的双键位 置。c ，t 分别表示双键的顺式和反式结构，a ：i 和b r 分别表示指反异支链和异式支链脂肪 酸和未知结构支链脂肪酸，c y 表示具环状结构，1 0 m e 表示第l o 个碳原子的甲基( 从羟基 端起) 。 1 3 2 接种微生物菌剂量对堆肥过程的影响 r a q u e lb a r r e n a 等人( 2 0 0 6 ) 研究接菌量的不同对城市生活有机垃圾 ( o f m s w ) 堆肥的影响。设置四个处理，对照处理为不添加菌剂( c k ) ，a 处 理( 1 0 5c f u g - 1 0 f m s w ) ，b 处理( 1 0 6c f u g - 1 0 f m s w ) ，c 处理( 1 0 7 c f u g - i o f m s w ) 。尽管四个处理过程中温度和氧气含量变化都没有明显差异， 8 第一章文献综述 但是在堆肥过程中取样所测得处理b 和处理c 的呼吸运动指数无论在5 5 或 3 7 都下降得比较快。呼吸运动指数一般认为是跟好氧微生物活性有关，而且 被推荐作为堆肥过程的监测参数( m a r lie ta l ，2 0 0 3 1l i a n gce ta l ，2 0 0 3 ) 。因 此测定5 5 c 和3 7 下微生物的呼吸运动指数就可以分别表征升温状态和稳定状 态下堆肥的真实微生物活性。一般认为呼吸运动指数的值小于1 m 9 0 2 g t o m - 1 h 1 就认为堆肥进入稳定状态( c a l i f o m i ac o m p o s tq u a l i t yc o u n c i l ， 2 0 0 5 ) 。处理b 和处理c 的呼吸运动指数下降比较快，说明它们都能加速堆肥的 进程。但处理a 却没有如此效果。在欧洲，r o t t e g r a d e 自产热测定方法通常用来 量化堆肥的腐熟度，一般从i 到v 分为5 级( u sd e p a r t m e n to f a g r i c u l t u r ea n du s c o m p o s t i n gc o u n c i l ，2 0 0 1 ) 。r a q u e lb a r r c n a 等人发现当不加菌剂处理时( c k ) ， 堆肥腐熟达到级需要5 6d 。对于处理b ，到达腐熟程度只需2 8d ，4 9d 就可 以到达堆肥腐熟的最高等级v 级。处理a 的结果不大好，但比对照好一