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啤酒废酵母中活性物质分离纯化的初步研究 摘要 采用超声波进行样品预处理，以不同的乙醇浓度、温度、料液比 和时间对啤酒废酵母中活性成分的提取进行单因素和正交实验，考察 对海藻糖提取率和蛋白质含量影响。结果表明：1 4 0w 超声预处理 6 0m i n 后，用5 0 乙醇、料液比1 ：3 0 ，7 0 条件下冷凝回流和搅 拌加热6 0m i n 。此时海藻糖提取率较高，可达9 4 ，蛋白质含量为 5 2 8 3m g g 。 研究了中空纤维膜( 微滤和超滤) 分离酵母提取液中活性成分的 工艺。在膜通量试验基础上，选择料液浓度、p h 和操作压力为自变 量，海藻糖透过率和蛋白质截留率为响应值，采用b o x b e n h n k e n 设 计的方法，s a s 软件拟合得n - - 次多项式回归方程的预测模型，并确 定超滤膜分离工艺的最佳条件为压力1 8p s i ，温度2 4 、p h6 0 和料 液浓度3 o 。在此条件下，膜通量为2 0 6 2l m 2 h ，海藻糖透过率为 9 6 8 2 ，蛋白质截留率为9 5 0 4 。 采用超声酶碱法从啤酒废酵母中提取p 1 ，3 葡聚糖，在探讨超 声波预处理和酶解最佳条件的同时，利用响应曲面法研究了n a o h 浓 度、温度、用量和时间对p 1 ，3 葡聚糖得率、纯度和蛋白质含量的影 响。研究表明：酵母残渣中添加2 0 8u g 底物的木瓜蛋白酶，在5 0 、 p h6 0 条件下酶解8h ，蛋白质去除率可达到6 2 8 2 ，且回收到0 3 4 8 g l 多肽、氨基酸含量丰富的蛋白水解液；当加入2 0 5 的n a o h3 0 5 0 m l ，7 4 处理5 7h ，p - l ，3 葡聚糖的得率为1 0 2 1 ，纯度为8 8 1 4 ， 蛋白质含量为1 1 9 。超声酶碱法处理工艺具有j 3 i 1 ，3 葡聚糖得率、 纯度高，蛋白质含量低及提取时间短的特点。 关键词：啤酒废酵母海藻糖1 3 - 1 ，3 一葡聚糖蛋白质 i l s t u d yo ne x t r a c tio na n dp u riflc a tl0 n0 f e f f e c tlv ec o m p o n e n t sf r o m w a s t eb e e ry e a s t a b s t a r c t t h ew a s t eb e e ry e a s tw a sp r e t r e a t e dw i t hu l t r a s o n i c ，a n dt h e n e x t r a c t e db yd i f f e r e n tc o n d i t i o n sb a s e do ns i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a l d e s i g ne x p e r i m e n t ，u s i n gt h er a t eo ft r e h a l o s ea n dp r o t e i nc o n t e n ta s g u i d el i n e t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r es u p p o s e dt o b ef o l l o w s ： u l t r a s o n i cp o w e r14 0w ，u l t r a s o n i ct i m e6 0m i n ，c o n c e n t r a t i o no fa l c o h o l 5 0 ，r a t i oo fl i q u i d s o l i d1 ：5 0 ，t e m p e r a t u r eo fe x t r a c t i o n7 0 a n d e x t r a c t i n gt i m e6 0m i n ，t h er a t eo ft r e h a l o s ea n dp r o t e i nc o n t e n tc o u l d s e p a r a t e l yr e a c h9 4 a n d5 2 8 3m g g t h eh o l l o wf i b e rm e m b r a n em e t h o df o r s e p a r a t i n g e f f e c t i v e c o m p o n e n t so fy e a s te x t r a c tf r o mw a s t eb e e rw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r o nt h eb a s eo fm e m b r a n ef l u x e x p e r i m e n t s ，c o n c e n t r a t i o n ，p ha n d o p e r a t i o np r e s s u r ew e r es t u d i e dw i t hb o x b e n k n k e nd e s i g na n dt h e i r i n t e r a c t i o n so np e n e t r a t i o nr a t eo ft r e h a l o s ea n dr e t e n t i o nr a t eo fp r o t e i n w e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h ep r e d i c t i v ep o l y n o m i a lq u a d r a t i ce q u a t i o n s m o d e lw a sd e v e l o p e db ys a ss o f t w a r e t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e s u p p o s e dt ob ef o l l o w s ：o p e r a t i o np r e s s u r e18p s i ，t e m p e r a t u r e2 4 ，p h i i i 6 0a n dc o n c e n t r a t i o n3 0 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n st h em e m b r a n ef l u x w a s2 0 6 2l m 2 h ，p e n e t r a t i o nr a t eo ft r e h a l o s ew a s9 6 8 2 a n dr e t e n t i o n r a t eo fp r o t e i nw a s9 5 0 4 t h et e c h n o l o g yf o re x t r a c t i n gp 一1 ，3 一g l u c a nf r o mw a s t eb e e ry e a s tb y u l t r a s o n i c - e n z y m e - - a l k a l im e t h o dw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r a st h e o p t i m a lc o n d i t i o n s o fu l t r a s o u n da n de n z y m ew e r ed i s c u s s e d ，t h e r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a su s e dt oa n a l y z et h ee f f e c t so fn a o h c o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，u s a g ea n dr e a c t i o nt i m eo nt h ey i e l d ，p u r i t y a n dp r o t e i nc o n t e n to f1 3 1 ，3 一g l u c a n t h er e s u l ts h o w e dt h a tb r o k e nr a t eo f w a s t eb e e ry e a s tb yu l t r a s o u n dw a s9 4 2 2 ，t h er e m o v a lr a t eo fp r o t e i n b ye n z y m ew a s6 2 8 2 ；w h e nt h ee x t r a c t i o ni sc a r r i e do u tw i t h2 0 5 n a o hc o n c e n t r a t i o n ，5 7ha t7 4 a n du s a g ei s3 0 5 0m l ，t h ey i e l do f p - 1 ，3 - g l u c a ni s1 0 2 1 ，p o l y s a c c h a r i d ec o n t e n ti s8 8 1 4 a n dp r o t e i n c o n t e n ti s1 19 t h eu l t r a s o n i c e n z y m e a l k a l im e t h o ds h o w e dh i g h p 一1 ，3 一g l u c a ny i e l da n dp u r i t y ，l o wp r o t e i nc o n t e n ta s w e l la ss h o r t e x t r a c i t i o nt i m e k e yw o r d s ：w a s t eb e e ry e a s t ；t r e h a l o s e ；p - 1 ，3 一g l u c a n ；p r o t e i n i v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成 果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经 发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研 究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 ：刁霖卅年6 月妒 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 五日时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名3 翩躲产细妒严己月i 蝠 广西大学硕士掌位论文啤酒废酵母中活性物曩曙矿离纯化的初步研究 第一章绪论 1 1 啤酒废酵母的研究概述 啤酒废酵母是啤酒生产中的主要副产物之。近年来，随着国民经济的迅猛增长， 我国啤酒工业发展迅速。据统计，2 0 0 7 年产量为3 9 3 1 4 万t ，产生废酵母约5 8 9 7 万t ( 干重) 。但随之也带来一个难题，即如何更好处置啤酒生产副产物一废酵母问题。 啤酒废酵母在啤酒厂中无法再进行利用，主要是因为其黏度大、发酵能力低，已不符合 生产标准。但由于啤酒厂严格按照国家食品标准生产，经过处理后的酵母可以继续利用 提取其含有的功能性物质。 目前我国部分啤酒厂只是把它作为饲料，或者生产酵母味素，或者单一的生产多糖 产品，甚至还有部分工厂直接排放至下水道中，造成环境的严重污染【l 棚。若能以啤酒 废酵母为原料，联产多种糖类物质，将有效提高废酵母的附加值，并为啤酒工业治理“三 废”提供一个良好的方向。 1 1 1 啤酒废酵母的主要活性物质 啤酒废酵母营养丰富【熨，其中p 1 ，3 葡聚糖约占细胞壁干重的2 9 ，海藻糖约占细 胞干重的5 ，蛋白质约占细胞干重的4 5 6 0 ，它们对机体都具有良好的生理作用【6 7 】。 1 1 2 啤酒酵母主要活性物质的生理功能 1 1 2 1 海藻糖 海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半羧酸羟基缩合而成的非还原性双糖。海藻糖作为 一种应急代谢物【8 1 ，能在营养缺乏、高温、低温、干燥、高渗透压、有毒物质等恶劣环 境下，保护生物体的生物膜3 1 、脂质体、蛋白质 1 5 - 2 0 】等结构和功能不受损害。例如， 些耐冻昆虫在极低温度下仍能生存，主要是因为海藻糖通过降低冰的熔点来实现其生 物合成低温保护剂的作用【2 1 1 。另外，海藻糖可保护d n a 防止放射线引起的损伤，具有 防止人体骨质疏松，促进人体双歧杆菌增值，清除a 、b 射线所产生的o h 自由基，使 细胞d n a 不易发生突变【2 2 1 。更为重要的是外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子 有良好的非特异性保护作用【2 3 】。 海藻糖在低温或冷冻条件下有较为显著的防止淀粉老化的效果【2 4 】。在方便米饭中使 广西大掌硕士掌位沦文啤酒废酵母中活性物磺曙扩离纯化的初步研究 用海藻糖，能降低硬度，增加口感，改善透明度和色泽、抑制米糠臭味以及陈米味，使 产品整体质量得到提高，易于长期保存。海藻糖具有较高的玻璃化转变温度，可在很高 温度下保持活性蛋白的稳定性，以避免其在热加工中的失活1 2 5 1 。同时又由于海藻糖的低 吸湿性和不褐变性，使加入海藻糖的硬糖和软糖褐变程度降低，并有良好的保形性，在 糖果制品中具有较广阔的应用空间。在畜禽肉蛋加工品中加入海藻糖，能长时间保持肉 质鲜嫩柔软、抑制脂肪酸分解导致的肉躁味产生，并使产品经过冷冻、解冻和热加工后 效果依旧良好【2 6 1 。另外，由于海藻糖的甜度是蔗糖的4 0 - - 4 5 ，它可降低饼干、面包、 糕点等产品的甜度，使其具有清爽的口感，且基本上不会诱发龋齿【2 7 】。 海藻糖在人体内吸收缓慢，血糖反应平缓，糖尿病人可以食用【2 引。作为双歧杆菌增 殖因子f 2 9 1 ，能改善人体肠道生态环境，增强胃肠道吸收功能，有效排除体内毒素，增强 机体免疫抗病能力。另外，海藻糖能作为活菌制剂的干燥保护剂和作为进行皮肤、器官 活体保存的介质【3 0 3 。 化妆品中添加海藻糖可保护皮肤免受冷冻、干燥和日晒的伤害，如洗发水、护发素、 摩丝、洗面奶等，还可作为唇膏、口腔清洁剂、口腔芳香剂等的甜味剂和品质改良剂1 3 2 】。 将海藻糖合成酶基因导入植物中可培育出抗旱、抗寒、抗冻、耐盐植物。美国科学 家将来自酵母的海藻糖合成酶基因导入烟草已得到抗旱型植株，并正在研究将海藻糖合 成酶基因导入其它植物中【3 3 1 。 1 1 2 2d 1 ，3 葡聚糖 啤酒酵母葡聚糖含量丰富，分为碱不溶性、酸溶性和碱溶性三种葡聚糖。研究表明 3 4 - 3 7 ，1 3 葡聚糖是构成酵母细胞壁的主要成分，由p ( 1 3 ) 葡聚糖和b ( 1 - 6 ) 一葡聚糖 组成，两者比例为8 5 ：1 5 。葡聚糖的分支水平( d b ) 和化学修饰决定了葡聚糖的分子 量和溶解度，而后者决定了葡聚糖作为免疫调节剂的活力。一般葡聚糖最大活性时的分 子量为1 0 0 - 2 0 0k d a ，d b 为0 2 , - - 0 5 。其中，具有活性功能的葡聚糖主要是碱不溶性 葡聚糖，它有良好的免疫调节活性，能够活化嗜中性白血球等，是免疫系统中非常有效 的刺激剂，可增强宿主对细菌、病毒、真菌及寄生虫的感染与肿瘤的抵抗能力，在加强 机体抗辐射和促进伤口愈合等方面都有显著的作用【3 8 4 0 1 。 p 1 ，3 葡聚糖它具有调节免疫系统的作用，能够刺激免疫系统处于高度活性的状态， 从而行使自己的免疫功能【4 1 铂】。具体的免疫反应为，骨髓白细胞产生的巨噬细胞、中性 粒细胞和单核细胞攻击并吞噬有害的入侵物；动员免疫细胞运动到异物处；提高巨噬细 胞的吞噬能力，最终吞噬或毁灭入侵物。h o f e r 研究表明【4 5 】，酵母p 1 ，3 葡聚糖能与动 2 广西大掌硕士学位论文啤酒废酵母中活性物届妇铲离纯化的初步研究 物及人类的免疫细胞，包括单细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞发生特异性 结合，以增强宿主细胞免疫功能。p a t h c h c n 等研究表明】，水溶性葡聚糖可以提高钴一6 0 辐射损伤小鼠的骨髓活力，加速白细胞的生成，增强脾脏能力，迅速恢复受伤小鼠的机 体活力。b 1 , 3 d 葡聚糖参与机体的自然防御和加速皮肤创伤愈合的过程。细胞培养试 验表明，羧甲基葡聚糖抵御皮肤细胞抗氧化分子损耗和促进角质形成细胞和增殖。同时， p 1 ，3 一葡聚糖可以用作为渗透抑制剂，消除c s + 、c d + 、c o + 等金属离子的毒性【4 7 1 。 饲料用酵母葡聚糖可显著对抗侵入雏鸡内脏器官的肠炎沙门菌，是因为雏鸡血液中 分离到的白细胞的活性升高，其吞噬能力、杀菌作用和氧化能力增强，显著减少了肠炎 沙门菌对雏鸡内脏器官的损伤【船- 5 0 1 。在断奶仔猪日粮中添加啤酒酵母葡聚糖可以提高仔 猪的日采食量，从而增加仔猪的日增型5 1 澎】。e i c h c r 成功研制一种小牛饲料添加剂的特 别配方可以使小牛在应激状态下抵抗感染，降低细菌和病毒的感染【5 3 1 。另外，由于其在 人的消化器官内难以被消化，可以作为非卡路里食品添加剂，提供知道样口感，在冷冻 食品的生产中作为脂肪样口感，在冷冻食品的生产中作为脂肪替代物【5 4 1 。 1 1 2 3 蛋白质 表1 1 啤酒干酵母与理想蛋白含人体必需氨基酸对比【5 5 1 t a b l e1 - 1e s s e n t i a la m i n oa c i d so fd r i e db e e ry e a s tc o m p a r e dw i t hi d e ap r o t e i n 啤酒酵母啤酒酵母中含丰富的蛋白质，含有1 8 种氨基酸，其中人体必需的8 种氨基 酸含量及氨基酸的组成，比例接近联合国粮农组织( f a o ) 推荐的理想氨基酸的比例( 见 表1 1 ) ，能通过体内消化释放，并在动物的肠道消化过程中，充当新陈代谢的潜在生理 效应物。许多小分子肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质与能量，而且还具有 防治疾病、调节人体生理机能的功能【5 6 铘】。废酵母蛋白质经降解后的产物是肌苷酸和鸟 苷酸的复合物，可作为鲜味蛋白质广泛应用于肉类、水产品、酱油等食品工业，对改善产 品风味、提高产品质量、降低生产成本等方面起到积极的作用【5 9 舵】。 1 1 3 啤酒酵母主要活性物质的理化性质 1 1 3 1 海藻糖 3 广西大掌硕士掌位论文啤酒废醇母中活性物质分离纯化的初步研究 海藻糖是白色晶体，分子量为3 4 2 ，能溶于水、冰醋酸和热乙醇中，不溶于乙醚、 丙酮。化学性质稳定，不能使斐林试剂还原，也不能被a 糖苷酶水解，但在强酸条件下 能被水解为两个葡萄糖分子。 1 1 3 28 1 ，3 葡聚糖 d 1 ，3 葡聚糖色泽乳白，无味无臭，不溶于水、9 5 乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂， 也不溶于盐酸和碱液中，但能在二甲基亚砜中完全溶解并形成稳定溶液，能在强酸作用 下氧化为葡萄糖，与硫酸葸酮试剂起变色反应。 1 1 3 3 蛋白质 啤酒酵母蛋白为白色、无臭、无苦味、无异味的粉末状物质。 1 1 4 啤酒酵母主要活性物质的提取方法及影响因素 1 1 4 1 海藻糖 主要有直接提取法和酶促转换法。其中直接提取法主要以酵母中提取居多。在酵母 细胞中，海藻糖由于分布在子囊孢子和细胞质中，细胞破壁就成为一个极为关键的因素。 目前主要应用的破壁方法有超声处理法、微波破壁法、化学渗透法三种。研究较多是化 学渗透法中的乙醇破壁法，如邵漪【6 3 1 等从活性干酵母中用7 0 1 2 ，6 0 7 0 乙醇提取 液中经过1 0 1 5h 抽提得到海藻糖溶液，经后续处理后得率为1 1g 1 0 0g 干酵母，纯度 9 8 左右。微波破壁法特点是处理时间短，破壁效率高，但由于微波能量高，使得蛋白 质等杂质一起溶出，影响产品质量。超声处理法其机理是通过空化效应击破植物细胞膜， 增加了溶剂向细胞内的扩散和有效成分的溶出，从而大大缩短了提取时间，提高了提取 效率，低功率的超声不会造成蛋白质的分解。杨渝军畔1 等以啤酒废酵母为实验材料，以 海藻糖为研究对象，蒸馏水为提取剂对影响超声波技术辅助水浸提工艺的多个因素进行 了研究，优化了料液比、超声波作用时间、超声功率、浸提时间、浸提温度五个工艺条 件。通过l 9 ( 3 4 ) 正交试验，结果表明各因素影响程度依次为：浸提温度 浸提时间 超声功率 超声时间，得到最佳参数为：超声时间2 0m i n ，超声功率6 0 0w ，水浸提时 间6h ，浸提温度1 0 0 。在此参数条件下海藻糖得率达到7 7 2 。与乙醇浸提法相比， 超声波技术辅助水浸提法极大地降低了成本。 酶促转换法制取海藻糖具有规模化、成本低、质量高的特点，已成为当今生产海藻 糖的主流，其转化途径主要分为以葡萄糖、麦牙糖、淀粉为底物的3 种【6 5 椰】。葡萄糖途 径是通过利用酵母体内的葡萄糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶，两步磷酸化作用可将两个 葡萄糖分子转化为一个海藻糖分子。但因海藻糖磷酸化酶对底物专一性强，却需要较高 4 啤酒废醇母中活性物周e 伊离纯化的初步研究 能量，不宜工业化。麦芽糖途径是通过麦芽寡糖基海藻糖化酶和麦芽寡糖基海藻糖水解 酶合成海藻糖。此法也因需要能量高，酶不稳定等原因，难以实现工业化。淀粉途径是 通过麦芽寡糖基海藻糖合成酶的分子内转移作用和麦芽寡糖基海藻糖水解酶特异性水 解作用生成海藻糖。此法原料来源广泛，且两种酶的基因已克隆、表达，基因工程菌株 可以在常温培养，产酶活力高，极适合工业化生产。目前做的较好的主要有日本的林原 化工和中国的中诺生物工程有限责任公司。 1 1 4 2b 1 ，3 一葡聚糖 主要分为酸法、碱法和酶碱法三种，而酶碱法又分为一般酶碱法和自溶酶碱法 6 9 。7 2 】。 酸法和碱法由于生产的成品杂质多，质量差而只作为探索方法。酶碱法是先用蛋白酶去 除蛋白质，再用n a o h 等碱溶甘露糖等多糖。 徐希柱等【7 3 】得到的最佳条件是料液比1 1 5 加入3 的n a o h 溶液，8 0 水浴2h 、 离心、洗涤，调整p h 至8 5 9 0 ，用6 0 0u g 碱性蛋白酶，在5 5 下水解2 4h ，离心、 沉淀、干燥得到成品。p 1 ，3 葡聚糖的提取率为1 3 8 ，产品多糖含量8 5 2 。自溶酶碱 法是提高酵母内本身的蛋白酶的活性来分解蛋白质以降低其含量，其工艺主要为：酵母 一自溶_ 离心_ 沉淀_ 酶解一离心一沉淀碱溶_ 离心- 沉淀水洗、醇洗一成品。 唐治玉等f 7 4 】给出的条件是5 0 自溶6h ，加1 0 0u g 湿酵母木瓜蛋白酶，继续自溶 1 8h 后离心，沉淀用2 的n a o h 溶液分散，于8 0 水浴处理3h 后离心，沉淀用蒸馏 水清洗3 一- 4 次后进行真空冷冻干燥，粉碎得成品。成品得率1 0 8 0 ，其中多糖含量 8 7 7 0 、蛋白质含量0 4 5 、水分含量6 7 2 、灰分含量1 0 5 。 1 1 4 3 蛋白质 一般提取方法是根据酵母本身特性先自溶后进行提纯、除杂、脱色等工艺可以得到 一种以多肽为主要组分的蛋白水解液。需要注意的是，由于酵母中含有不易被人体吸收 的碱不溶性的葡聚糖等物质，在制作蛋白液时应尽量将其除去。 刘蓉等使用诱导剂+ 自溶+ 酶解法提取较好，最佳工艺条件为：温度5 0 、p h 值 7 0 、酶解自溶时间为4 0h 、中性蛋白酶用量2 5u g 干酵母、p 葡聚糖酶用量1 5u g 干酵 母。在此条件下，粗蛋白质得率达2 7 。 凌秀梅等 7 6 1 采用先自溶的方法，最佳条件为p h 值6 0 ，温度4 5 ，n a c l 用量4 o ， 自溶时间6 0h ，氨基酸态氮含量为4 0 5m g 1 0 0m l 。除杂最佳条件是将酵母蛋白液p h 值 调至2 5 ，离心( 3 0 0 0r m i n ) 5m i n ，此时，核酸去除率为1 3 5 9 。脱色最佳工艺条件是 将自溶蛋白液p h 调至6 5 ，以2m l m i n 流速流经装有活性炭的离子柱( 3 0m i n x3 0 0 m m ) ， 5 广西大学硕士掌位论文啤酒废酵母中活性物屈 ：伊离纯化的初步研究 脱色率达到6 9 5 7 。 张晓鸣等【7 7 】通过破壁预处理与复合酶解相结合的工艺，制取特定相对分子质量范围 的蛋白水解物，在温度5 5 6 0 ，p h6 6 6 8 ，p - 葡聚糖酶用量1 5 - - 2 0u g ( 以酵母计) 的条件下，有最高的肽提取率。酶解7h ，蛋白质提取率大于8 2 ，经h p l c 法，以蒸发 光散射监测器测定，水解产物中6 5 组分的相对分子质量在2 1 0 , - - 6 3 5 之间，处于二肽和 三肽相对分子质量范围。 1 1 5 分析方法 1 1 5 1 海藻糖 海藻糖的分析方法主要有层析法、葸酮硫酸法和高效液相色谱法。 层析法是利用化合物中各组分物理性质差异，使各组分在两相中分布不同，从而使 各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的，主要用于分析多糖组分，可以 作为定性分析的一个手段。周坚【7 8 】等建立了以正丁醇：乙醇：水= 2 ：l ：l 为展开剂，1 0 1 5 硫酸溶液为显色剂的海藻糖测定方法。 葸酮硫酸法是常规定量分析方法，一般在6 2 0n l l 下，硫酸与糖于沸水浴中加热生成 糠醛( 或糠醛衍生物) 后和蒽酮缩合成蓝绿色化合物，其颜色深浅与糖量成正比。此 法快速、灵敏、简便，但由于分光光度计的稳定性、温度和加热时间要求的严格性问题， 其数据不是很准确，只能得到大概范围，可预测糖的含量。 高效液相色谱法是利用溶质在流动相和固定相的分配系数不同来实现分离。其特点 是分离效能高、选择性高、速度快、结果准确，但设备投资高，运行成本和维护费用较 高。王成君等【7 9 】得到的色谱条件为：碳水化合物分析柱，洗脱剂为v ( 乙腈) ：v ( 水) = 8 0 ： 2 0 ，体积流量1m l m i n ，进样量2 0p l ，柱温为室温。麦芽糖和海藻糖的保留时间分别 为1 1 3m i n 和1 3 8m i n 。 1 1 5 2p 1 ，3 葡聚糖 主要有薄层层析法、红外色谱法和气相色谱法。使用薄层层析法时，由于样品不溶 于水，需要先用硫酸水解后，选择合适的展开剂和显色剂进行测定，若只与标准葡萄糖 在同一位置，则说明基本不含有其它糖类物质，纯度较高。 红外光谱法是把样品制成粉末经k b r 压片，在一定波长范围内进行扫描，根据特征 波长进行定性判断。若把样品在4 0 0 0c i n o - 5 0 0c l n - 1 区间进行红外扫描，则会在3 4 4 8c m 左右有强的o h 键的伸缩振动，1 6 4 1t i n 左右有c o 非对称伸缩振动峰，1 0 7 3c n l 左右有 o h 变角振动峰，8 9 6 锄处为吡喃型b 糖苷键的特征峰；若在8 1 0 锄和8 7 0 锄处没有吸收， 6 广西大掌硕士掌位论文啤酒废酵母中活性物曩e 铲离纯化的初步研究 就表明不含有甘露糖【8 0 1 。 气相色谱法是现在测定碱不溶性葡聚糖含量与纯度最准确的方法，由于样品不溶于 水，需要先用硫酸水解后再进行衍生化后进行分析。王淮【8 1 1 得到的色谱条件是：o v - 1 7 0 1 玻璃毛细管柱( o 3 2m x 3 0m ) ，n 2 为载气，流速5 0m l m i n ，氢火焰离子化检测器，h 2o 6 k g c m 2 ，空气0 5k g c m 2 ，进样口温度2 5 0 ，柱温采用程序升温，从0m i n 至0 6 6m i n 为 2 0 5 ，然后以2 0 m i n 的速率升至2 3 0 。 1 1 4 3 蛋白质 主要通过氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸的种类和含量。 1 2 本课题的研究目标及研究内容 1 2 1 研究目标 啤酒废酵母作为啤酒生产中的主要副产物未能很好应用。目前，国内啤酒厂对于啤 酒废酵母的使用集中在两个方面，一是作为廉价饲料，产品附加值极低；二是直接当作 废物排放，严重污染环境( b o d 和c o d 含量高达l 1 0 5 m g l ) 。因此，探讨废酵母的合 理利用是亟待解决的问题。本课题主要研究啤酒废酵母生产海藻糖和碱不溶性p 1 ，3 葡 聚糖，以及利用其含量丰富的蛋白质，提高回收啤酒废酵母的附加值，为啤酒工业治理 “三废提供一个良好的方向。 1 2 2 本课题研究的主要内容 ( 1 ) 啤酒废酵母预处理方法及成分分析：根据相关的国际方法或公认方法对啤酒 废酵母的海藻糖、蛋白质、碱不溶性d 1 ，3 葡聚糖含量进行测定，为啤酒废酵母的综合 利用提供基础数据。 ( 2 ) 啤酒废酵母细胞内物质的提取研究：以超声波辅助、乙醇溶液为提取溶剂进 行提取，采用正交试验确定最佳条件。 ( 3 ) 海藻糖和蛋白质膜分离条件研究：采用中空纤维膜，以料液浓度、料液p h 、 操作压力为指标研究微滤膜和超滤膜的分离条条件，并对超滤膜进行响应曲面分析( 以 料液浓度，料液p h ，操作压力为自变量，以蛋白质截留率和海藻糖透过率为响应值) 。 ( 4 ) 碱不溶性b - 1 ，3 一葡聚糖分离纯化研究：木瓜蛋白酶酶解蛋白质最佳条件( 影 响因素：木瓜蛋白酶用量、酶解温度、酶解时间、酶解p h 值；根据单因素实验进行正 交实验) ；n a o h 溶液纯化最佳条件( 影响因素：n a o h 浓度、n a 0 h 用量、温度、时间； 根据单因素实验进行响应曲面试验：以n a o h 浓度、n a o h 用量、温度、时间为自变量， 7 广西大学硕士掌位论文啤酒废酵母中活性物质分离纯化的初步研究 纯度、蛋白质含量和得率为响应值) 。 ( 5 ) 啤酒废酵母中活性物质的提取工艺：提取啤酒废酵母中活性物质的总工艺路 线；提取啤酒废酵母中活性物质的量化。 广西大掌硕士掌位论文啤酒废醇母中活性物扫e 分离纯化的初步研究 第二章啤酒废酵母预处理及成分分析 2 1 引言 啤酒废酵母不同于一般的啤酒酵母主要表现在以下几个方面：一、啤酒酵母是粉末 状，而啤酒废酵母是粘稠膏状，因此给直接处理造成困难。二、啤酒酵母有很强发酵能 力，而啤酒废酵母大多尚失了发酵能力，其自身糖类也有一定的分解，在糖分含量等方 面会有一定损失。三、啤酒废酵母在发酵过程中，带走了酒花、啤酒和一些谷类杂质物 质，有一定的苦味，因此在预处理过程中应尽量去除，从而为后续提取过程奠定基础。 另外，由于啤酒生产严格按照通用生产规范要求，啤酒废酵母中的啤酒可回收利用，增 加附加值。本文对啤酒废酵母进行了预处理及效果分析，根据相关的通用方法对啤酒废 酵母中的海藻糖、p 1 ，3 葡聚糖、蛋白质等相关成分、水分含量以及回收率进行测定， 为啤酒废酵母的综合利用提供基础数据。 2 2 材料与方法 2 2 1 原料 啤酒废酵母泥：由广西南宁青岛啤酒有限公司提供。 2 2 2 试剂 海藻糖( 纯度 9 8 ) ：由广西南宁中诺有限公司提供；葡萄糖、无水乙醇、蒽酮、 硫酸、三氯乙酸均为分析纯。 2 2 3 仪器 u v 2 0 5 1 p c 紫外可见分光光度计：日本岛津公司；贝克曼超速离心机：美国贝克曼 库尔特有限公司；2 0 0 目标准筛：浙江省上虞市公里仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱：上 海跃进医疗器械厂；天津市泰斯特仪器有限公司；高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器 有限公司。 2 2 4 实验方法 2 2 4 1 啤酒废酵母预处理 0 冰水浴条件下使啤酒废酵母絮凝沉淀，上清液是干净的啤酒回收液，沉淀用冰 水搅拌清洗3 次，过2 0 0 目标准筛，去除酒花等杂质。4 0 鼓风干燥处理7 2h ，磨粉。 9 广西大掌硕士掌位论文啤酒废酵母中活性物质分离纯化的初步研究 2 2 4 2 成分分析 取1g 干啤酒废酵母根据通用方法对其成分进行相关测定 8 2 - 8 3 】。 2 2 4 3 胞内海藻糖测定 冰水浴中用1 5 m l0 5m o l l 三氯乙酸溶液浸提3 次，每次3 0r a i n ，每次离心后上 清液定溶到2 5m l ，然后取不同体积测定海藻糖含量；标准曲线测定：分别取1 0 0p m l 的海藻糖标准液0 、0 2 、0 4 、0 6 、0 8 、lm l ，用蒸馏水定容至1m l ，于6 2 0n i n 下测 定，所得结果用e x c e l 绘出标准曲线。 2 2 4 4 总蛋白含量测定 采用自动定氮仪测定总蛋白含量。 2 2 4 5 碱不溶性d 1 ，3 葡聚糖含量测定 将测定海藻糖含量中的离心沉淀物经3 遍水洗，再用酶一碱法进行提取后测定碱不 溶性p - l ，3 一葡聚糖含量。测定方法：取样品1 0m g ，先用1 0m l8m o l lh 2 s 0 4 水解5m i n ， 然后加水将h 2 s 0 4 稀释到1 5m o l l ，在沸水浴下水解3h ，定容到2 0 0m l ，移取l m l 按 葸酮硫酸法测定多糖含量。 2 2 4 5 水分测定 直接干燥法。 2 2 4 6 湿酵母回收率测定 酵母粉回收率( ) = 酵母粉重量啤酒废酵母泥重量1 0 0 2 3 结果与讨论 2 3 1 啤酒废酵母预处理效果分析 由表2 1 可知，经预处理得到的废酵母为微黄色固体粉末，水分含量比未处理的废 酵母泥低，可回收到1 2l k g 洁净啤酒，酵母粉回收率可达到7 0 3 ，并且经预处理后 的啤酒废酵母更易保存和定性分析。 表2 - 1 啤酒废酵母泥预处理效果分析 t a b l e2 - le f f e c ta n a l y s i so fp r e t r e a t m e n tf o rw a s t eb e e ry e a s t 2 3 2 啤酒废酵母成分初分析 2 3 2 1 海藻糖标准曲线 1 0 j - - 西大学硕士掌位论文啤酒废酵母中活性物可髟扩离纯化的初步研究 y = 6 3 5 5 x 一0 0 0 4 5 r 2 = 0 9 9 9 5 00 0 20 0 40 0 60 0 8o 1 c o n c e n t r a ti o n ( m g m l ) 图2 - i 海藻糖标准曲线图 f i g2 - 1s t a n d a r dc u r v eo ft r e h a l o s e 2 3 2 2 蛋白质标准曲线 0o 0 20 0 40 0 6o 0 8o 1 c o n c e n t r a tio n ( m g m l ) 图2 2 蛋白质标准曲线图 f i g2 - 2s t a n d a r dc u r v eo f p r o t e i n 2 3 2 3 啤酒废酵母成分初成分 由表2 2 可以看出，经预实验后，测得的海藻糖平均值为4 7 2 ，葡聚糖含量平均 值为8 8 6 ，蛋白质含量平均值为3 8 4 2 。其中，蛋白质为总蛋白量，包括细胞内蛋白 质和细胞壁中的蛋白质。葡聚糖的测定方法取自文献中报道的酶碱法，仅作为参考。 啤酒废酵母中活性物屈| ：扩离纯化的初步研究 表2 - 2 啤酒废酵母成分初分析 t a b l e2 - 2 c o m p o s i t i o na n a l y s i so f w a s t eb e e ry e a s t 2 4 本章小结 新鲜的啤酒废酵母泥是乳白色膏状物质，其中还有的啤酒可回收利用，由于水分含 量较大，在常温下极易变质，不易保存，给后续提取分离工作造成极大困难。经过筛、 干燥、磨粉等预处理后，可得到微黄色粉末状啤酒废酵母粉，去除了酒花等杂质物质， 易保存，酵母粉回收率为7 0 3 ，回收到的啤酒量约为1 2l k g 。对啤酒废酵母粉进行 了相关测定分析，得出：水分含量为1 5 ，海藻糖含量为4 7 2 、葡聚糖含量8 8 6 、蛋 白质含量3 8 4 2 。 1 2 广西大学硕士学位论文啤酒废酵母中活性物屈| ：铲离纯化的初步研究 第三章啤酒废酵母细胞内活性物质的提取研究 3 1 引言 啤酒酵母中约含有5 的海藻糖( 干重) ，能在营养缺乏、高温、干燥、高渗透压 等恶劣环境下，保护生物体的生物膜、脂质体、蛋白质等结构和功能不受损害，在医疗、 食品和化妆品领域有广阔发展前景。另外，酵母中的蛋白质含量丰富，营养价值高，对 人体有特殊生理作用。 目前，废酵母的处理主要是作为普通饲料或部分生产酵母味素等初级产品，未能很 好利用废酵母本身价值。根据文献报道【8 粕9 1 ，当前啤酒废酵母研究主要集中在葡聚糖和 蛋白质的提取上，提取方法主要为醇溶和碱溶，但用超声波和醇溶相结合的方法同时提 取海藻糖和蛋白质却鲜有报道。 超声波技术是利用超声空化效应引起的冲击波和剪切力，使得分子剧烈振动，缩短 了溶剂到达有效部位和溶质溶出的距离，并且由于剧烈震荡和热效应，加快了传质过程， 能极快破坏细胞壁，使有效成分容易提取。 本研究采用超声辅助、醇提海藻糖和蛋白质，通过单因素和正交设计实验分析确定 了最适提取工艺，为啤酒废酵母的综合利用提供理论依据。 3 2 材料与方法 3 2 1 原料 啤酒废酵母泥：由广西南宁青岛啤酒有限公司提供。 3 2 2 试剂 海藻糖( 纯度 9 8 ) ：由广西南宁中诺有限公司提供；考马斯亮蓝g 2 5 0 ( 进口分 装) ：国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白( 进口分装) ：北京伯乐泰克生物有 限公司；无水乙醇、葸酮、硫酸、三氯乙酸均为分析纯。 3 2 3 仪器 u v 2 0 5 1 p c 紫外可见分光光度计：日本岛津公司；超声波发生器：必能信( 上海) 超声有限公司；旋转蒸发仪r 2 0 5 ：瑞士r u c h i 公司；贝克曼超速离心机：美国贝克曼 广西大掌硕士掌位论文啤酒废醇母中活性物曩曙扩离纯化的初步研究 库尔特有限公司。 3 2 4 实验方法 3 2 4 1 啤酒废酵母细胞内活性物质的提取 预处理后的酵母和水乙醇溶液混合置于圆底烧瓶中，接冷凝回流装置后，充分加 热搅拌提取，离心后取上清液，测定海藻糖和蛋白质含量，得到乙醇溶液提取的最佳条 件。随后在不同的超声时间下进行预处理，选用所得乙醇溶液最佳条件进行实验，得到 最优超声波辅助提取条件。 3 2 4 2 测定方法 海藻糖含量测定：硫酸葸酮比色法； 海藻糖提取率：窒堕塑坚童塑量1 0 0 胞内海藻糖质量 蛋白质含量测定：考马斯亮蓝法【9 0 】；标准曲线测定：分别取1 0 0 m l 的蛋白质 标准液0 、0 2 、0 4 、0 6 、0 8 、lm l ，用蒸馏水定容至1m l ，于5 9 0n n l 下测定，所得 结果用e x c e l 绘出标准曲线。 3 2 4 3 试剂配制 葸酮试剂：0 1g 葸酮溶于5 0m l9 8 硫酸中，制得含量为2m g m l 的葸酮试剂； 考马斯亮蓝染色液：1 0 0m g 考马斯亮蓝g 2 5 0 溶于9 5 乙醇5 0m l ，加入8 5 的磷酸 1 0 0m l ，加水稀释到1 0 0 0m l ，制得含量为0 1 m g m l ；海藻糖标准液：0 2 5g 溶于2 5m l 容量瓶中配成母液。取lm l 定容到1 0 0m l ，制得1 0 0p m l 的海藻糖标准液；蛋白质 标准液的配制：0 0 1g 牛血清蛋白溶于1 0 0 m l 水中，制得1 0 0 u g m l 的蛋白质标准液。 3 3 结果与讨论 3 3 1 乙醇破壁的最优条件确定 3 3 1 1 温度对酵母提取液的影响 取1 0g 经过预处理的酵母加入5 0 7 , 醇溶液1 0m l ，分别在5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ，9 0 下于蒸发回流搅拌提取1 个小时，将提取液以4 0 0 0r m i n 离, l , 2 0m i n ，取上清液 测定海藻糖和蛋白质含量。 1 4 广西大掌硕士学位论文啤酒废酵母中活性物履略扩离纯化的初步研究 t e m p e r a t u r e ( ) 图3 - 1 温度对酵母提取液的影响 f i g3 - le f f e c to ft e m p e r a t u r eo ny e a s te x t r a c t 詈 i 暑 8 蜀 卫 星 由图3 1 知，随着温度增加，海藻糖提取率逐渐增高，7 0 时提取率达到高点 6 5 8 8 ，然后开始下降。有报道称【9 ，温度达到7 0 时，海藻糖酶基本失活，这就使 酵母菌内海藻糖稳定不会分解。但温度过高，细胞内结构损坏，挤压，影响了海藻糖的 溶出，导致提取率降低。蛋白质含量是在6 0 达到最大值，随后显著降低，这是由于 高温使蛋白质分解成氨基酸、多肽等物质的缘故。 3 3 1 2 乙醇浓度对酵母提取液的影响 取1 0g 经预处理酵母分别加入4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 浓度的乙醇1 0m l ， 7 0 提取1h ，具体操作同上。 ，、 琴 孑 答 石 奄 丑 o 荟 a 皇 u 量 必 幽 0 _ - - - b o 5 警 c o n c e n t r a ti