（材料学专业论文）温敏聚合物薄膜的制备及对细胞粘附和分离的调控研究.pdf

摘要 摘要 生物材料( b i o m a t e r i a l ) 能够以一种安全、可靠、经济且生理相容的方式在 结构或功能上代替身体部分组织或器官的功能。硅基材料在生物医学和生物技术 的发展中扮演着重要的角色，而改善硅基材料表面的生物相容性非常重要。我们 利用表面引发的原子转移自由基聚合( a t r p ) ，将温敏聚合物聚m 异丙基丙烯酰 胺) ( p n i p a a m ) 接枝到硅片表面，制备了温敏的细胞培养表面，研究了温敏表 面对细胞粘附和温敏分离的调控。 通过表面引发的原子转移自由基聚合，在硅片表面接枝了p n i p a a m 聚合 物膜，并用原子力显微镜、椭偏仪、x 射线光电子能谱、接触角、石英晶体微天 平等对表面进行了表征。结果表明，p n i p a a m 成功地接枝到了硅片表面， p n i p a a m 分子量即表面聚合物膜的厚度具有很好的可控性，且表面具有温度敏 感性。利用注射法结合表面引发原子转移自由基聚合，制备了p n i p a a m 的厚度 梯度，研究了p n i p a a m 刷厚度对细胞粘附和温敏分离的影响。结果发现，在 p n i p a a m 接枝表面，适于细胞粘附和温敏分离的厚度为2 0 4 5 r i m 。 聚乙二醇( p e g ) 分子的引入可以促进p n i p a a m 链的水化作用。利用a t r p 聚合在硅片表面接枝了一层p e g 分子，再以p e g 为大分子引发剂引发n i p a a m 聚合，得到p ( p e g m a ) b p n i p a a m 的嵌段聚合物刷。与注射法相结合，得到不 同梯度走向的三种共聚物梯度表面，发现p e g 大分子的引入，使表面在温度降 低时的水化速度加快，从而促进了细胞从表面分离。 为了改善p n i p a a m 表面的细胞粘附，我们在表面固定了r g d 肽。首先用 表面引发原子自由基聚合接枝了p n i p a a m 刷，再以p n i p a a m 的活性端基为引 发剂，通过丙烯酸钠的a t r p 聚合接枝聚丙烯酸( p a a ) ，再通过羧基与氨基之 间的官能团偶合，将r g d 肽固定到了温敏表面。利用梯度法研究了r g d 接枝 量对细胞粘附和温敏分离的影响。结果发现，随p a a 接枝量增大，r g d 的含量 增加，细胞在表面的粘附增多，r g d 的表面固定促进了细胞在温敏表面的粘附。 本研究为硅基温敏表面在生物医学及材料学上的研究及应用提供了理论和 实践基础。 关键词： 生物材料、聚( n 异丙基丙烯酰胺) 、原子转移自由基聚合、温敏表面、 细胞分离 a b s t r a c t a b s t r a c t b i o m a t e r i a ls c i e n c ei sa ni m p o r t a n t i n t e r d i s c i p l i n a r ys u b j e c td e r i v e df r o m m a t e r i a ls c i e n c ea n dl i f es c i e n c e b i o m a t e r i a l so r b i o m e d i c a lm a t e r i a l sc o u l d s u b s t i t u t et h ef u n c t i o no fap a r to ft i s s u e so ro r g a n i c st h r o u g has a f e ，r e l i a b l e ， b i o c o m p a t i b l ew a y t h et h e r m o r e s p o n s i v ep o l y ( n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ) ( p n i p a a m ) h a sal o w e rc r i t i c a ls o l u t i o nt e r m p e r a t u r e ( l c s t ) a ta b o u t3 2 。ci np u r ew a t e r i ti s u s e f u lf o rc e l lr e c o v e r yw i t h o u te n z y m a t i cd i g e s t i o n c e l l sc a na d h e r e ，s p r e a d ，a n d p r o l i f e r a t eo nt h es u r f a c eg r a f t e dw i t hp n i p a a ma t3 7 ( 2 ，b u tc a l lb es p o n t a n e o u s l y d e t a c h e db yo n l yl o w e r i n gt h ec u l t u r et e m p e r a t u r et ob e l o wt h el c s to fp n i p a a m h e r e ，w ef a b r i c a t e dt h e r m o r e s p o n s i v ec e l lc u l t u r es u r f a c e su s i n gs u r f a c e i n i t i a t e d a t o mt r a n s f e rr a d i c a lp o l y m e r i z a t i o n ( s i a t r p ) o fn i p a a mo nt h es i l i c o ns u b s t r a t e s a n dt h e ns t u d i e dt h em a n i p u l a t i o no ft h es u r f a c eo nc e l la d h e s i o na n dd e t a c h m e n t f i r s t l y , 3 - ( a m i n o p r o p y l ) t r i e t h o x y s i l a n e ( a p s ) w a si m m o b i l i z e do nt h es i l i c o n s u r f a c et oi n t r o d u c e - n h 2g r o u p so nt h es u r f a c e t h e nt h es u b s t r a t ew a st r e a t e dw i t h a t r pi n i t i a t o r , b r o m o i s o b u t y r y lb r o m i d e ，t o g i v er i s e t ot h es i b rs u r f a c e t h e s i _ - a t r po fn i p a a mo nt h es i - - b rs u r f a c ew a sc a r d e do u tu s i n gar e a c t i o nm i x t u r eo f n i p a a m ，c u b r , p m d e t a ( 1 ，1 ，4 ，7 ，7 - p e n t a m e t h y l d i e t h y l e n e t r i a m i n e ) ，h 2 0 m e o h a f t e rp o l y m e r i z a t i o n ，t h ep n i p a a m g r a f t e ds u r f a c e sw e r ec h a r a c t e r i z e db ya t o m i c f o r c es p e c t r o s c o p y ( a f m ) ，e l l i p s o m e t r y , x r a yp h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p y ( x p s ) ， c o n t a c ta n g l e ，q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( q c m ) ，r e s p e c t i v e l y t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a tp n i p a a mc h a i n sh a db e e ns u c c e s s f u l l yg r a f t e do nt h es i l i c o n s u r f a c e s ，t h ec h a i n so fp n i p a a mg r e wl i n e a r l yf r o mt h es i l i c o ns u b s t r a t e s ，a n dt h e p n i p a a ms u r f a c e ss h o w e d t e m p e r a t u r es e n s i b i l i t y a t3 7 。c ，c e l l s a d h e r e ， p r o l i f e r a t eo nt h ep n i p a a ms u r f a c e s ，w h i l el o w e r i n gt h ec u l t u r et e m p e r a t u r et ot h e l c s to fp n i p a a m ，c e l l sd e t a c h e ds p o n t a n e o u s l yf r o mt h es u r f a c e s t os t u d yt h ee f f e c to ft h et h i c k n e s so fp n i p a a m g r a f t e do nt h es i l i c o ns u r f a c eo n c e l la d h e s i o na n dd e t a c h m e n t ，t h et h i c k n e s sg r a d i e n ts u r f a c eh a sb e e np r e p a r e du s i n g ac o m b i n a t o r i a lm e t h o d ：am i c r o p u m pw a su s e dt oc o n t r o lt h e p o l y m e r i z a t i o nt i m eo f d i f f e r e n tp o s i t i o n so nt h es i l i c o ns u b s t r a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es u r f a c eb e c a m e l l a b s t r a c t m o r eh y d r o p h i l i cw i t ht h ei n c r e a s eo ft h et h i c k n e s so fp n i p a a m w h e nt h et h i c k n e s s o fp n i p a a mw a sh i g h e rt h a n4 5 n m ，c e l l sc o u l dn o ta d h e r eo nt h es u r f a c e l o w e r t h a n2 0 n m ，t h ec e i l sc o u l dn o td e t a c hf r o mt h es u r f a c ea s l o w e r i n g c u l t u r e t e m p e r a t u r et o2 0 。c s ot h es u i t a b l et h i c k n e s sf o rc e l la d h e s i o na n dt h e r m o r e s p o n s i v e d e t a c h m e n to fp n i p a a mo nt h es i l i c o ns u r f a c ew a sa b o u t2 0 4 5 n m i n t r o d u c i n gp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ( p e g ) m o l e c u l e si n t op n i p a a mc h a i n sc o u l d a c c e l e r a t et h eh y d r a t i o no fp n i p a a mc h a i n s s oal a y e ro fp e gw a sf i r s t l y i m m o b i l i z e do nt h es i l i c o ns u r f a c eb yt h ea t r po fp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) m e t h y l m e t h a c r y l a t e ( p e g m a ) ，t h e np n i p a a mc h a i n sw e r ef o r m e df r o mt h ep e gs u r f a c e u s i n gp ( p e g m a ) a sm a c r o m o l e c u l a ri n i t i a t o r s t h u sb l o c kc o p o l y m e rb r u s h e so f p ( p e g m a ) b - p n i p a a mw e r ea c h i e v e d c o m b i n e dw i t ht h ei n j e c t i n gm e t h o d ，t h r e e t y p e so fg r a d i e n ts u r f a c e sw i t hd i f f e r e n tg r a d i e n td i r e c t i o nw e r ef a b r i c a t e do nt h e s i l i c o ns u b s t r a t e s c e l lc u l t u r er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n t r o d u c t i o no fp e g m o l e c u l e s m a d et h ep n i p a a mc h a i n sh y d r a t eq u i c k l yd u r i n gt h ep r o c e s so fl o w e r i n gt h ec u l t u r e t e m p e r a t u r e ，t h u st h ec e l l sc o u l dd e t a c hq u i c k l yf r o mt h ep n i p a a ms u r f a c e s t oi m p r o v ec e l la d h e s i o no nt h ep n i p a a m g r a f t e ds u r f a c e ，a r g g l y a s p ( r g d ) p e p t i d ew a sg r a d i e n t l y i m m o b i l i z e do nt h et h e r m o r e s p o n s i v e s u r f a c e f i r s t l y , p n i p a a mb r u s h e sw e r eg r a f t e do nt h es i l i c o ns u r f a c eb yt h es i a t r po fn i p a a m ， t h e np o l y a c r y l i ca c i d ( p a a ) c h a i n sg r e wf r o mt h ep n i p a a ms u r f a c et h r o u g ht h e a t r po fs o d i u ma c r y l a t e f i n a l l y , t h er g d p e p t i d ew a sc o v a l e n t l yg r a f t e do nt h e s u r f a c eb yt h ef u n c t i o n a lg r o u pr e a c t i o no fc a r b o x y lg r o u pa n da m i n og r o u p t h e e f f e c to fp a ag r a f t i n gt h i c k n e s sa n dr g d g r a f t i n gq u a n t i t yo nc e l la d h e s i o na n d d e t a c h m e n to ft h e r m o r e s p o n s i v es u r f a c ew a ss t u d i e d w i t ht h ei n c r e a s eo fp a a t h i c k n e s s ，g r a f t i n gq u a n t i t yo fr g d i n c r e a s e da n ds ot h ec e l l sa d h e r e do nt h es u r f a c e b u tw h e nt h ep a at h i c k n e s si n c r e a s e dt os o m ec o n t e n t ，t h e n e g a t i v ee f f e c to f c a r b o x y lg r o u p so nc e l la d h e s i o na p p e a r e d ，b e c a u s et h es u r f a c eb e c a m em o r e h y d r o p h i l i ca n dt h e r e b yt h en u m b e ro fc e l l sa d h e r e do nt h es u r f a c ed e c r e a s e d k e yw o r d s ：b i o m a t e r i a l s ，p o l y ( n i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ) ，a t o mt r a n s f e rr a d i c a l p o l y m e r i z a t i o n ，t h e r m o r e s p o n s i v es u r f a c e ，c e l ld e t a c h m e n t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝望盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者躲彦静学签字嗍沙叩年咋月如日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者虢赫咯 签字r 期训夕7 年垆月知日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： l p 月弓d 日 念_ 枷吁 致谢 致谢 2 0 0 5 年春我来到浙江大学高分子系攻读博士学位，有幸师从高长有教授从 事生物医用材料研究。 从论文的选题、实验的开展到论文的完成，其工作量是巨大的，事情繁多而 琐碎，在这过程中，高老师都倾注了大量的心血和精力。高老师眼界开阔、思路 敏捷、治学严谨，特别是其工作上的拼搏精神和旺盛的精力，以及对科研工作的 热爱，令学生钦佩不已。在高老师的悉心指导下，我的论文得以顺利的完成。在 此向高老师表示由衷的敬意和感谢! 同课题组的陈义镛教授、马列副教授和徐建平副教授对我的工作给予了许多 帮助，陈老师多次提出富贵意见，向他们表示我深挚的感谢! 感谢实验室己毕业的江兵兵、洪奕、赵庆贺、毛峥伟、仝维錾、封志强、谈 华平、王丰等博士对我博士论文期问给予的关心和帮助，他们作为我的师兄，是 我在攻读博士学位期间学习的楷模和榜样。感谢已出站的杨捷和黄爱宾博士，我 们共同渡过了两年美好时光，留下了宝贵的回忆。感谢已毕业的石延超、陈波、 刘云肖、何涛、王淳、赵海光、王颖俊、许海棠、王洪霞、刘慧等硕士给予我的 帮助。周杰、胡玲、张裕英、胡小红、彭采宇、朱一、王志鹏、龚晓、王玮、郭 瑞、李丹、吴金丹、韩璐璐、劳丽红、邱缓、李博、刘幸等同学也给予我很多有 益的建议和帮助，向他们表示由衷的感谢。 感谢我敬爱的父母，养育之恩，永志不忘! 感谢我的两位哥哥对我的学业一 直以来的支持。特别感谢我的妻子章慧女士及岳父母给予的理解和支持。 衷心感谢所有帮助过我的老师和亲友! 感谢国家自然科学基金项目( 7 7 4 0 8 4 ) 、国家重点基础研究发展规划项目 ( 2 0 0 5 c b 6 2 3 9 0 2 ) 和8 6 3 计划项目( 2 0 0 6 a a 0 2 a 1 4 0 ) 的资助。 浙江大学名人辈出，人杰地灵。在浙大求学几年，受百年求是学风之熏陶， 深知为人、做事当求真务实。前方路途遥远，借用浙大登攀节口号以自励：前行 路引路，登攀峰上峰! 李林辉 2 0 0 9 年2 月于求是园 第一章绪论 第一章绪论 1 1 生物材料简介 生物材料科学是介于材料科学与生命科学之间并相互渗透而产生的个重 要边缘学科。生物材料( b i o m a t e r i a l ) 能够以一种安全、可靠、经济且生理相容 的方式在结构或功能上代替身体部分组织或器官的功能【l 】。它可以定义为直接和 生理系统相接触并发生相互作用，能对细胞、组织和器官进行诊断治疗、替换修 复或诱导再生的一类天然或人工合成的特殊功能材料【2 1 。生理系统不仅包括体内 的生理环境，如血液、组织和细胞等，还包括体外的生理环境，如细胞培养皿、 培养液等。在这些生理环境中，生物材料所接触的除了无机物质外，还有器官、 组织、细胞及生物大分子等不同层次的具有活性的有机体。因此，生物材料不仅 要有生物功能性，即能够对生物体进行诊断、替代或修复，还要有生物相容性， 即不引起生物体组织、血液等的不良反应。现代医学进步与生物材料的发展紧密 联系在一起。生物材料已成为现代生物工程、医学工程和制药工程等进一步发展 的重要物质支柱，其研究与开发既具有重要的科学和技术价值，又具有重大的社 会需求和巨大的经济效益。 生物材料根据临床用途，可分为骨骼一肌肉系统修复和替换材料、软组织材 料、齿科材料、心血管材料、组织胶粘剂和缝合线材料、药物释放载体材料、临 床诊断及生物传感材料。按照材料组成和性质分为生物金属材料、生物高分子材 料、生物无机材料、生物杂化材料和生物复合材料【3 】。 生物材料发展与进步的根本源动力是健康的需要。人们对生物材料与生命体 相互作用的现象和规律进行了深入研究。目前，生物材料的发展前沿在于： ( 1 ) 生物相容性材料。由于生物材料直接与细胞、组织和宿主的生理系统相接 触，因此生物材料不仅要求无毒、化学稳定性好，还必须具有生物相容性。 ( 2 ) 组织工程。组织工程是指应用生物科学与工程原理及方法构建一个生物装 置来维护、增进人体细胞与组织的生长，以恢复受损组织或器官的功能。 组织工程的基本原理和方法是，将体外培养的组织细胞吸附扩增于一种生 物相容性良好并可被人体逐渐降解吸收的生物材料上，形成细胞一生物复 合材料。 ( 3 ) 纳米生物材料。纳米生物材料，如荧光量子点可以作为检测和诊断试剂， 第一章绪论 在分子层次上观察和研究生命活动过程。纳米材料也可作为经皮或吸入治 疗的药物载体，促进新治疗方法的实现。但对纳米材料的长期生物相容性 和生物安全性需特别关注，尤其对于非生物降解性纳米微粒。 ( 4 ) 生物矿化材料。天然的生物矿化材料由简单的“原材料 经活的有机体合 成，性能大大优于人工合成材料。受此启发，通过仿生的方法合成的有机 无机复合体，可以作为优异的人体组织修复材料，如骨修复材料、牙齿 修复材料等。 ( 5 ) 仿生智能材料。生物体中细胞能分泌出特有的细胞外基质( e c m s ) ，它 们是由蛋白质和糖胺聚糖( g a g s ) 构建的物理、化学交联网络。细胞与 e c m s 组成一个物质、能量和信息传递的开放体系，构成要素间存在多重 相互作用。深入了解生物大分子的协同相互作用，模仿其协同行为构思生 物材料，可使材料具有所期望的宿主响应性，即实现智能化。智能材料的 设计、制造、加工和性能结构特征均涉及到了材料科学的最前沿领域，智 能材料代表了材料科学的最活跃方面和最先进的发展方向。 1 2 细胞与生物材料表面的相互作用 1 2 1 细胞与细胞外基质 生物学反应常常被认为发生在溶液相，但实际上生物学上的大多数反应是发 生在界面上的，典型的生物学界面包括：细胞表面细胞外基质；细胞表面植入 材料表面；细胞外基质生物大分子：水化组织空气( 肺) ；矿物质蛋白质( 骨) 。 在生命体系中，细胞与外界的相互作用是通过细胞膜表面的受体( r e c e p t o r ) 和细胞外与其相对应的信号物质分子即配体( l i g a n d ) 相互作用来完成的，这一 过程称为“生物识别”( b i o r e c o g n i t i o n ) 。细胞在生物材料表面的粘附也是通过生 物识别来实现的【2 1 。细胞膜表面的寡糖链形成细胞外被，细胞膜下的表层溶胶中 有细胞骨架成分组成的细胞网络结构，对质膜有支持作用外，还与维持质膜的功 能有关，所以又称这部分细胞骨架为膜骨架。细胞外被、细胞膜和表层胞质溶胶 构成细胞表面。 2 第章绪论 f i g1 - 1s c h e m eo f t h es t r u c t u r e o f l n k g r i n 细胞外基质由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，构成复杂的网架结 构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。在生物学上，细 胞外间质或细胞外基质是动物组织的一部分，不属于任何细胞。细胞外间质决定 结缔组织的特性。细细胞外基质的组成可分为三太类：糖胺聚糖 ( g l y c o s a m i n o g l y c a n s ) 、蛋白聚塘( p r o t e o g l y c a n ) ，它们能够形成水性的胶状 物，在这种胶状物中包埋有许多其它的基质成分；结构蛋白，如胶原和 弹性蛋白，它们赋予细胞外基质一定的强度和韧性；粘着蛋f q ( a d h e s i v e ) ： 如纤粘连蛋白和层粘联蛋白，它们促使细胞同基质结合。其中以胶原和蛋 白聚糖为基本骨架在细胞表面形成纤维网状复合物，这种复合物通过纤粘 连蛋白或层粘连蛋白以及其他的连接分子直接与细胞表面受体连接：或附 着到受体上。由于受体多数是膜整合蛋白，并与细胞内的骨架蛋白相连，所 以细胞外基质通过膜整合蛋白将细胞外与细胞内连成了一个整体。 第一章绪论 构成细胞外基质的大分子种类繁多，可大致归纳为四大类：胶原、非 胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、以及弹性蛋白。上皮组织、肌组织及 脑与脊髓中的e c m 含量较少，而结缔组织中e c m 含量较高。细胞外基质的组 分及组装形式由所产生的细胞决定，并与组织的特殊功能需要相适应。例 如，角膜的细胞外基质为透明柔软的片层，肌腱的则坚韧如绳索。细胞外 基质不仅静态的发挥支持、连接、保水、保护等物理作用，而且动态的对 细胞产生全方位影响。 细胞粘附分子( c e l la d h e s i o nm o l e c u l e ，c a m ) 是参与细胞与细胞之 间及细胞与细胞外基质之间相互作用的分子。细胞粘附分子都是跨膜糖蛋 白，分子结构由三部分组成：胞外区，肽链的n 端部分，带有糖链，负责 与配体的识别；跨膜区，多为一次跨膜；胞质区，肽链的c 端部分，一 般较小，或与质膜下的骨架成分直接相连，或与胞内的化学信号分子相连， 以活化信号转导途径。多数细胞粘附分子的作用依赖于二价阳离子，如c a 2 + ， m 9 2 + 。细胞粘附分子的作用机制有三种模式：两相邻细胞表面的同种c a m 分 子间的相互识别与结合( 亲同性粘附) ；两相邻细胞表面的不同种c a m 分子 问的相互识别与结合( 亲异性粘附) ；两相邻细胞表面的相同c a m 分子借细 胞外的连接分子相互识别与结合。整合素( 图1 1 ) 为特异性细胞粘附分子， 介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质问的相互作用。整合素是由o r , ( 1 2 0 1 8 5 k d ) 和p ( 9 0 1 l o k d ) 两个亚单位形成的异二聚体。迄今己发现1 6 种0 【 亚单位和9 种p 亚单位。它们按不同的组成构成2 0 余种整合素。虽然细胞表面的其 它的蛋白多糖和糖蛋白也具有粘附作用，如通过静电相互作用、疏水作用，但它 们都不具有特异性。细胞外基质( e c m ) 中的胶原蛋i 刍( c o l l a g e n ) 、纤维粘连蛋白 ( f i b r o n e c t i n ，f n ) 、玻璃粘连蛋( v i t r o n e c t i n ，v n ) 、层粘连蛋白( l a m i n i n ，l n ) 等都是整合素的配体，统称为粘附蛋白( a d h e s i o n p r o t e i n ) 。细胞与细胞外基质 之间的粘连就是靠细胞膜表面的整合素与粘附蛋白的相互作用来实现的( 图 1 2 ) 。在体外，细胞与生物材料表面之间的相互作用也遵循同样的机理。细胞 在生物材料表面的粘附必须依靠细胞膜表面的整合素与吸附于材料表面的粘附 蛋白的相互作用来实现。血液、组织液以及含有血清的培养基中含有多种水溶性 的粘附蛋白如f n 、v n 、l n 等。当生物材料与生理环境相接触时，首先到达生物 4 第一章绪论 材料表面的是水分子，其次是蛋白质分子，最后才是细胞 4 1 f 矗自 f i g1 - 2i n t e r a c t i o n sb e t w e e nc e i l sa n de x t r a c e l l u l a rm a t r i xv i a i n t e g r i n - l i g a n di n t e r a c t i o ni nv i v o 1 2 2 细胞与生物材料表面的相互作用 生物材料表面与细胞的相互作用，首先是材料表面与细胞表面的蛋白质的相 互作用。很多生物相容性好的材料植入动物体内，能促进伤口愈合、组织修复， 这些材料的共同特点是植入体内后很快被很多特异性蛋白及非特异性蛋白包覆， 在其表面形成蛋自质片层。蛋白在材料的表面吸附是一个非常快的过程，然后再 是一个动态吸附过程，吸附的蛋白种类跟材料表面化学性质、拓扑结构、表面电 荷、吸附时闻等均有关系。因此很难预测蛋白在某种材料表面的吸附性能。 在组织工程及再生医学研究中，需要将大量的支架等植入体植入动物及人体 内去诱导组织再生、进行组织修复。因此，材料表面与细胞的相互作用成为生物 材料领域研究的一大课题”。7 l 。细胞与材料表面的相互作用有两种主要方式：特 异性的作用和非特异性的相互作用。特异性的相互作用是基于细胞与材料之间特 定的化学及生物学，如a v i d i n 和b i o t i n 之间的特异结合。“生物仿生”材料和“生 物活性”材料由于能在一定程度上模拟及控制这种精细的特异性作用m 一，成为 近来生物材料领域研究的热点。而非特异性的相互作用所基于的性质是大多数细 胞所共有的，这种相互作用通常很难控制。 第一章绪论 1 3 温敏聚合物表面的制备及发展概况 近几十年里，仿生合成高分子由于具有广阔的科学研究和应用前景已经形成 一个非常活跃的领域。生物高分子的功能片段之间的相互协同的概念引领科学工 作者们去发掘新的合成高分子体系，使之能够以某些可控的方式对坏境刺激产生 响应1 0 j2 1 。刺激响应高分子能够将某种刺激认着一种信号，能够判断这种信号的 强度，从而改变自身的构象以产生直接的响应。智能高分子体系的这些响应在生 物学上是非常有用的，可用于药物输送n 3 1 鲫、生物技术【1 7 , 1 8 】、色谱分析【1 9 , 2 0 1 等。 温敏聚合物就是对温度变化能够产生响应的聚合物，而温度是环境响应性聚 合物体系里最常用的一种刺激。温敏聚合物的一个特殊性质就是存在临界溶液温 度。如果聚合物溶液在某一个特定的温度以下是均一相溶液态，而高于这一温度 时则发生两相分离，此相变化温度即为下临界溶液温度( 1 0 wc r i t i c a ls o l u t i o n t e m p e r a t u r e ，l c s t ) 。在l c s t 以上，聚合物链收缩，溶剂分子被排出，聚合物 分子间形成胶状收缩、胶束或物理交联。具有这一性质的温敏聚合物有n 一取代丙 烯酰胺类聚合物、聚羟丙基甲基丙烯酸甲酯、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、聚 乙烯基甲基醚等【2 l 】。 在各种温敏聚合物中，聚n 一异丙基丙烯酰胺( p n i p a a m ) 由于l c s t 为常温 且低于人体体温，相转变明显且随温度变化可逆，因而受到广泛的重视。1 9 6 7 年，s c a r p a 等人首次观察到了线型的p n i p a a m 水溶液具有l c s t 的温敏现象。 t a n a k a 等在1 9 7 8 年发现了p n i p a a m 水凝胶有温敏性，并提出第一个关于水凝胶 相转变的热力学理论。h i r o k a w a 、t a n a k a 等人于1 9 8 4 年首次报道了非离子型 p n i p a a m 在二甲基亚砜的水溶液中有体积相转变发生【2 2 1 。目前，p n i p a a m 以及 n 烷基取代丙烯酰胺聚合物是温敏高分子领域的一个研究热点。 1 3 1p n i p a a m 的温敏机理 近3 0 年来，科研工作者作对p n i p a a m 的温敏机理进行了大量的研究和探讨。 h i r o t s e 等人用f l o r y 不可压缩模型对p n i p a a m 的坍塌进行了预测，但这个模型由 于忽略了混合过程中的体积变化以及凝胶网络的拓扑限制等而不能完全解释相 转变区内的实验数据 2 3 , 2 4 l 。g r o s b e r g t 2 5 1 则把凝胶的蜷缩看成是相领交联点问的链 段从伸展到蜷缩的转变。陆大年等【2 6 1 研究- p n i p a a m 水凝胶的分子热力学模型， 6 第一章绪论 认为高分子凝胶网络中存在短链及勾结链等非理想结构的可能，对凝胶溶胀行为 有影响，并通过进一步修正弹性模型，结合格子流体模型提出了一个新的非离子 凝胶热力学模型，在解释凝胶相变行为以及关联温度敏感性水凝胶的溶胀平衡曲 线方面取得了良好的效果。 s h i g e os a s a k i 等人【2 7 1 从化学势的角度对p n i p a a m 的温敏机理进行了研究，通 过分析不同无机和有机助剂对p n i p a a m 的体积相变的影响，发现水的化学势与 凝胶的体积相转变密切相关，凝胶体积相转变这一复杂现象可借助水的化学势进 行描述。l e l e 等人【2 8 2 9 1 认为p n i p a a m 在水中存在两种状态：完全游离的水和通 过氢键以及疏水作用互相结合到高分子链上的水即束缚水。结合水的总量可由凝 胶中的高分子水接触总数与每一结合水分子所接触的高分子水数目之比求得。 通过理论计算，在相转变温度点即p n i p a a m 凝胶的坍塌点，结合水含量非连续 下降，这与实验结果比较吻合。 g r a z i a n o 等人【3 0 ，3 1 对p n i p a a m 的温敏相转变的机理进行了研究分析。认为 p i n p a a m 分子内的疏水和亲水基团与水分子在分子内、分子间会产生相互作用。 当温度低于l c s t 时，p n i p a a m 与水分子之间的相互作用主要是酰胺基团与水分 子问形成氢键。由于氢键和范德华力的作用，p n i p a a m 分子链周围的水分子将 形成一种由氢键连接的、有序化程度较高的溶剂化层，并使高分子表现出一种伸 展的线团结构。当温度升高至i j l c s t 以上，部分氢键被破坏，大分子链疏水部分 的溶剂化层随之被破坏。温度升高对疏水基团的影响存在两个方面：一方面疏水 基团间的相互作用是吸热的“熵驱动”过程，随温度升高，聚合物溶液体系的熵 增加，疏水基团的缔合作用增强；另一方面，疏水基团的热运动加剧，疏水缔合 作用被削弱，同时水分子的热运动加剧，从而改变了疏水基团周围水分子结构与 状态，疏水缔合作用被进一步削弱。两方面的作用结果使p n i p a a m 分子内和分 子间的疏水相互作用增强，分子链的构象也由疏松的线团结构转变为紧密的胶粒 状结构。 新技术的发展为p n i p a a m 温敏机理的研究提供了有力的工具。l i n 等人1 3 2 】采 用衰减全反射傅利叶红外光谱( a t r f t i r ) 技术研究了p n i p a a m 与水分子的 相互作用，结果表明在l c s t 以上，p n i p a a m 分子之间的氢键占总的分子间作用 第一章绪论 的7 0 ，异丙基的疏水相互作用增长了1 5 倍，引发了体系的聚集沉淀。i t o ：等a 3 3 】 采用正电子湮灭寿命研究了p n i p a a m 水凝胶自由体积的平均尺、数量、大小分 布与微观结构的关系，发现在l c s t 以下，凝胶的平均自由体积半径为均一的 0 2 8 r i m ，但在收缩状态下却有两种自由体积半径：0 1 8 和0 3 3 n m 。吴奇等人【3 4 3 6 】 利用静态和动态光散射相结合的方法，研究了球型微凝胶在不同温度下的溶胀行 为。发现微凝胶并没有象大尺寸凝胶那样发生非连续的体积变化，认为高分子凝 胶实际上发生的是连续的体积相转变。而张广照等人3 7 1 用石英晶体微天平 ( q c m d ) 研究了温度诱导的表面接枝的p n i p a a m 构象变化，发现随温度升高 和降低，p n i p a a m 链是逐渐坍塌和溶胀的，并且其坍塌和溶胀存在几个不同的 动力学过程。 总的来说，g r a z i a n o 等人的观点为更多的研究者所接受。 1 3 2 温敏p n i p a a m 表面的制备 利用p n i p a a m 的这种温敏性质，将p n i p a a m 接枝到固体如聚合物、玻璃、 硅片等表面就可制备温敏表面，表面的亲疏水性可通过温度调控。当温度低于 3 2 0 c ，p n i p a a m 分子高度水合，使表面非常亲水；当温度高于3 2 0 c ，p n i p a a m 分子脱水，形成疏水表面。这一亲疏水变化是可逆的。 许多不同技术如等离子体聚合、氧化还原引发的自由基聚合、电子束聚合、 紫外光接枝、原子转移自由基聚合等被用于制备温度敏感表面f 3 8 “】。但并不是所 有技术都可用于制备生物相容的温敏表面，许多方法制备的p n i p a a m 表面并不 适于细胞或组织培养。下面对几种常用的制备生物相容的温敏p n i a a m 表面的技 术进行简述。 1 3 2 1 电子束聚合 目前制备温敏表面的最常用的方法是电子束聚合。将n 异丙基丙烯酰胺溶解 于异丙醇等溶剂中，置于培养皿t c p s ( t i s s u ec u l t u r ep o l y s t y r e n e ) 中，用电子 束辐照，n i p a a m 就接枝聚合到了t c p s 表面，接枝厚度可通过辐照时问进行控 制。o k a n o 等人【4 5 4 8 1 用电子束辐照聚合形成的p n i p a a m 膜可实现温度控制的亲疏 水性变化。当p n i p a a m 的接枝量在1 5t o2 0u g c m 2 时，细胞可以表面粘附、生 8 第一章绪论 长和进行温敏分离【4 9 ，5 0 1 。 u q u l d n 2 c o l d t r a p f i g 1 - 3 s c h e m a t i ci m a g eo fr a d i of r e q u e n c yc u r r e n tg e n e r a t o r 1 3 2 2 等离子体聚合 p a n 等人用图1 3 所示的射频电流反应器在硅片、玻璃、云母等表面实现了 n i p a a m 的等离子体沉积聚合【5 。等离子体聚合在表面产生交联结构的 ? n i p a a m 膜，膜的结构与性质与基底材料无关，并保留了n i p a a m 分子的结构 藕p n i p a a m 的相转变性质。和频振动谱( s u mf r e q u e n c yg e n e r a t i o nv i b r a t i o n a l s p e c t r a ) 结果显示，在温度高于l