（发酵工程专业论文）corallococcus+coralloides+085b04次级代谢产物的分离与结构表征.pdf

， i t h e _ j 、， 学位论文独创性声明 本人声明，所旱交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同j 恙对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名：二雠 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相天的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及中请 专利等权利，同意学校保留并向n 家仃关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：蝴 导师签名亟 ，塾i 型 r 山东轻t 业学院硕l ：学位论文 目录 摘要。i - a b s t r a c t i f 第l 章绪论1 1 1 粘细菌的生物学特性l 1 2 卡占细菌产生的次级代谢产物特性2 1 2 1 粘球菌次级代谢产物的多样性2 1 2 2 粘球菌次级代谢产物的主要乍物活性3 1 2 2 1 呼吸链抑制类3 1 2 2 2 抑制蛋白质合成类4 1 2 2 3 蛋白质磷酸化系统抑制剂4 1 2 2 4 核酸合成抑制类5 1 2 2 5 细胞壁合成抑制剂6 1 2 3 其他一7 1 3 本课题的立题依据、目的和研究意义8 1 4 本课题的研究内容8 第2 章菌株生物学特征及鉴定1 1 2 1 实验材料11 2 1 1 仪暑譬11 2 1 2 培养基1 1 2 1 3 菌株11 2 2 实验方法1 1 2 2 1 粘细菌的培养观察1 1 2 2 2 粘细菌的分子生物学鉴定1 2 2 2 2 1 提取基因组d n a 1 2 2 2 2 2p c r 扩增16 sr d n a 13 2 2 2 3 连接l3 目录 2 2 2 4 转化1 3 2 2 2 5 序列分析及分子进化树的构建1 3 2 3 结果- j i , i 论1 3 2 3 1 菌株形态学观察1 3 2 3 2 分子生物学鉴定结果1 5 2 3 2 1 琼脂糖凝胶电泳1 5 2 3 2 21 6 sr d n a 测序结果1 6 2 3 3j 讨论17 第3 章珊瑚球菌发酵及次级代谢产物分离纯化1 9 3 1 实验材料1 9 3 1 1 菌株1 9 3 1 2 培养基1 9 3 1 3 试剂1 9 3 1 4 仪器2 0 3 1 5 层析系统和显色剂2 1 3 2 试验方法一2 1 3 2 1 珊瑚球菌发酵及次级代谢产物 h 提物的获得2 1 3 2 2 次级代谢产物的确认以及孑培养基成分的对比2 1 3 2 3 次级代谢产物的分离2 l 3 2 3 1 硅胶柱层析粗分离2 2 3 2 3 2 各组分化合物的纯化2 2 3 3 结果与讨论3 4 3 3 1 发酵及料产物提取3 4 3 3 2 次级代谢产物的确认以及与培养基成分的对比3 5 3 3 3 次级代谢产物的分离和纯化3 7 3 3 4 讨论3 9 第4 章结构鉴定4 l 4 1 实验仪器4 1 4 2 实验方法4 l 4 3 化合物结构解析4 l 4 3 1 化合物l 的结构鉴定4 l 2 唁 山东轻丁业学院硕 ：学位论文 4 3 2 化合物2 结构鉴定一4 2 4 3 3 化合物3 的结构鉴定一4 2 4 3 4 化合物4 的结构鉴定一4 3 4 3 5 化合物5 结构答定4 4 4 3 6 化合物6 结构签定一4 4 4 3 7 化合物7 结构答定一4 4 4 3 8 化合物8 的结构鉴定4 5 4 3 9 化合物9 的结构鉴定4 5 4 3 1 0 化合物l o 的结构鉴定4 6 4 3 1l 化合物1 l 的结构鉴定4 6 4 3 1 2 化合物1 2 的结构鉴定4 6 4 3 1 3 化合物1 3 的结构答定4 6 4 3 1 4 化合物1 4 的结构鉴定一4 7 4 3 15 化合物1 5 的结构鉴定一4 8 4 3 1 6 化合物1 6 的结构鉴定一4 8 4 3 1 7 化合物1 7 的结构鉴定一4 9 4 3 1 8 化合物1 8 的结构解析4 9 4 3 1 9 化合物1 9 的结构解析5 0 4 4 结果与讨论5 l 4 4 1 沈脱顺序与化合物之间的关系一5 l 4 4 2 化合物结构和术源之f 日j 的关系5l 第5 章m t t 法测定次级代谢产物的抗肿瘤活性5 3 5 1 实验材料5 3 5 1 1 实验仪器5 3 5 1 2 实验细胞株一5 3 5 1 3 试剂5 3 5 2 实验方法5 4 5 2 1 孵化细胞5 4 5 2 2 药物准备：5 4 5 2 3 铺板5 4 5 2 4 加药5 4 3 i ：1 录 5 2 5o d 值测定及i c 5 0 的计算5 4 5 5 筛选5 5 5 5 5 6 5 9 6 7 9 9 9 9 9 9 山东轻丁业学院顾f ：学位论义 摘要 粘细菌是一种革兰氏阴性、单细胞、杆状细菌，有独特的形念分化过程和社 会性行为，因其能够产生广谱次级代谢产物而被人们所熟知，已经成为继放线菌、 芽孢杆菌之后的第三大药源菌。 本文对粘细菌菌株c o r a l l o c o c c u sc o r a l l o i d e s0 8 5 8 0 4 的生物学特性及其次级 代谢产物进行了研究。通过显微观察和发酵培养等方法，掌握了粘细菌的生长习 性及生活史，获得了粘细菌发酵液的乙酸乙酯萃取物。 使用高效液相色谱法对乙酸乙酯萃取的粗产物和培养基的乙酸乙酯萃取物进 行对比，通过分析发现，粗产物的色谱峰比v y _ 2 培养基多1 2 个。 将发酵液料提物通过硅胶色潜( 石油醚丙酮) 梯度沈脱分离后，多次使f 】硅 胶色谱、凝胶色谱和h p l c 等技术对各组分进行分离纯化，最终从中分离得到粘 细菌次级代谢产物1 9 个。通过1 h n m r ，1 3 c n m r 、二维核磁数据、质谱、红外 和紫外数据分析，对分离到的化合物进行了结构确证，其中化合物2 、1 5 和1 9 是新化合物，它们分别是1 - ( 1 h - p y r r o l o 3 ，2 - c q u i n o l i n 一4 - y 1 ) e t h a n o n e ， 5 - ( h y d r o x y i m i n o ) - 1 ，3 - d i m e t h y l 一1 h - p y r r o l 一2 ( 5 h ) - o n e 和8 - ( 色原烷一4 一甲酰) - 环( s - 脯氨酸r 亮氨酸) 。 通过m t t 法对得到的部分化合物作了抗肿瘤活性分析，得到了1 个对f i i j ；, 0 腺癌细胞( p c 3 ) 和h e l ay f p 细胞抗性较好的化合物1 6 ，其i c 5 0 分别为7 8 t g m l 和1 0 3g t g m l ；1 个对乳腺痛细胞( m c f 7 ) 细胞抗性较好的化合物1 8 ，其i c s o 为 1 3 7p g m l 。其中某些化合物，可能对其它肿瘤细胞具有很好的抗性，但需要进 一步的研究。 摘要 关键词：粘细菌；珊瑚球菌；次级代谢产物；抗肿瘤；结构鉴定 - 山东轻t 业学院帧i j 学位论文 a b s t r a c t t h em y x o b a c t e r i aa r e g r a m n e g a t i v e ，u n i c e l l u l a r b a c t e r i aw i t hr o d s h a p e d v e g e t a t i v ec e l l s ，w h i c hh a v et h eu n i q u em o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o na n da m a z i n g s o c i a lb e h a v i o r s b e s i d e st h er e a d i l ye s t a b l i s h e dm i c r o b i a l s e c o n d a r ym e t a b o l i t e p r o d u c e r sa c t i n o m y c e t e sa n db a c i l l u s ，m y x o b a c t e r i ah a v eb e c o m et h et h i r dl a r g e s to n e ， w h i c ha r ek n o w nf o rt h e i r a b i l i t yt op r o d u c eab r o a ds p e c t r u mo fs e c o n d a r y m e t a b o l i t e sa n df o r mf r u i t i n gb o d i e su p o ns t a r v a t i o n i nt h i s t h e s i s ，t h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n ds e c o n d a r ym e t a b o l i t e so f c o r a l l o c o c c u sc o r a l l o i d e s0 8 5 8 0 4h a v eb e e ns t u d i e d b yt h em e t h o d so fm i c r o s c o p i c o b s e r v m i o na n df e r m e n t a t i o n ，t h eg r o w t hc h a r a c t e r sa n dl i f ec y c l eo f m y x o c o c c u sh a v e b e e nd i s c o v e r e d ，a n dt h ea c e t i ce t h e re x t r a c t so ft h em y x o b a c t e r i a lf e r m e n t a t i o nb r o t h h a sb e e no b t a i n e d i ti sf o u n dt h a tt h e r ea r e12m o r ep e a k si nr e s i d u et h a nt h a ti na c e t i ce t h e re x t r a c t s o ft h ev y - 2m e d i u m ，b yc a m p a r i n gw i t ht h e i rh p l c p r o c e d u r e s e p a r a t i o no ft h ec r u d er e s i d u eb yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yo v e rs i l i c ag e lb y c o n s e c u t i v e l ye m p l o y i n gp e t r o l e u me t h e ra n da c e t o n ea se l u e n t sg a v es o m ef r a c t i o n s t h e n ，f r a c t i o n sw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i c a t e db ys i l i c ag e lc h r o m a t o g r a p h y , s e p h a d e x l h 2 0g e lc h r o m a t o g r a p h ya n dh p l ct e c h n i q u e s f i n a l y , 19m e t a b o l i t e so ft h e m y x o b a c t e r i aw e r eo b t a i n e d t h ec h e m i c a ls t r u c t u r e sw e r ec o n f i r m e db y 1 h n m r ， 1 3 c - n m r ，2 d n m r ，m s ，i ra n du v c o m p o u n d s2 ，1 5a n d1 9a r en o v e l ，w h i c ha r e n a m e d 1 - ( 1 h - p y r r o l o 3 ，2 一c q u i n o l i n 一4 - y 1 ) e t h a n o n e ，5 - ( h y d r o x y i m i n o ) - 1 ，3 一d i m e t h y l - 1h - p y r r o l 2 ( 5 h ) 。o n ea n d8 - ( c h r o m a n 一4 - y 1 ) c y c l o ( s ) 一p r o - ( r ) - l e u ，r e s p e c t i v e l y t h ea n t i t u m o rb i o a c t i v i t i e so ft h ep r e p a r e ds a m p l e sw e r ee v a l u a t e dw i t ht h e m c f - 7 ，p c 3a n dy f pc e l ll i n e su s i n gam t ta s s a y t h er e s u l t ss h o wt h a t ，c o m p o u n d 1 8e x h i b i t e dm o d e r a t ea c t i v i t yw i t hi c 5 013 7g g m la g a i n s tm c f - 7 a n d c o m p o u n d1 6 a b s t r a c t e x h i b i t e dh i g hc y t o t o x i c i t ya g a i n s th u m a nt u m o rp c 3a n dy f pc e l ll i n e s ，w i t ht h e i r i c 5 07 8i r t g m la n d10 3l 上8 m l ，r e s p e c t i v e l y m o r e o v e r , s o m eo ft h e s ec o m p o u n d s m a ye x h i b i t em o r es i g n i f i c a n t l ya g a i n s to t h e rt u m o rc e l l s ，a n dt h i sp r o j e c tn e e d sm o r e f u r t h e rs t u d y k e yw o r d s ：m y x o b a c t e r i a ，c o r a l l o c o c c u sc o r a l l o i d e s ，m e t a b o l i t e s ，a n t i c a n c e r ， s t r u c t u r ee l u c i d a t i o n 山东轻丁业学院帧l j 学位论义 第1 章绪论 近年来，困际t 兴起了对粘细菌研究的热潮，从德国g b f ( 日，德幽困家g i 物 技术中心川) 到荚国加州的k o s a n 生命科学公刮2 1 ，从韩国建因火学【3 垮u 巾困的山 东大学微，物国家重点实验室【4 1 等，世界上多个实验室都在进行着粘细菌的基础 和功能等方面的研究。种种迹象表明粘细菌是不同寻常的菌株，具有不同于其他 菌的独特之处，i f 冈为如此，才值得世人如此的关注。 1 1 粘细菌的生物学特性 粘细菌( m y x o b a c t e r i a ) ，单细胞、杆状，专性好氧，属于革芝氏阴性细菌， 处于变形菌纲的6 分支，通常生长在树皮、腐败的植物和十壤中，但海水环境中 也有它们生长的踪迹【4 5 】。 目前，己发现的粘细菌分为3 个亚目，即孢囊杆菌、形h ( c y s t o b a c t e r i n e a e ) 、 堆囊菌亚目( s o r a n g i n e a e ) 和小囊菌亚目( n a n n o c y s t i n e a e ) ：6 个科，包括粘球 菌科( m y x o c o c c a c e a e ) ，孢囊杆菌科( c y s t o b a c t e r a c e a e ) ，多囊f f - i - ( p o l y a n g i a c e a e ) ， 小囊菌科( n a n n o c y s t a c e a e ) ，h a l i a n g i a c e a e 科和k o f l e r i a c e a e 科；粘球菌属 ( m y x o c o c c u s ) 、珊瑚球菌属( c o r a l l o c o c c u s ) 、p y x i c o c c u s 、孢囊杆荫属 ( c y s t o b a c t e r ) 、原囊菌属( a r c h a n g i u m ) 、h y a l a n g i u m 、蜂窝囊淆属( m e i i t t a n g i u m ) 、 标桩菌属( s t i g m a t e l l a ) 、多囊菌属( p o l y a n g i u m ) 、b y s s o p h a g e 、软骨霉状菌属 ( c h o n d r o m y c e s ) 、单囊蔺属( h a p l o a n g i u m ) 、j a h n i a 、堆囊菌属( s o r a n g i u m ) 、 小囊菌属( n a n n o c y s t i s ) 、h a l i g a n g i u m 和k o f l e r i a1 7 个属，大约5 0 个种。 其中人们研究最透彻、了解最深入的是粘球菌，它也足最容易培养、生长繁 殖最迅速的一类粘细菌。但是，迄今为止还有一些粘细菌只能从环境中检测到它 们基因的存在，而无法对它们进行人工培荆6 1 。 粘细菌具有独特的社会性行为和生活史，在营养充足的液体培养基中生长时， 粘细菌营养细胞个体通常是相互独立的。但是，在固体培养基表面上时，粘细菌 第1 章绪论 之问互相影响并聚集在培养基表面，以便能够得到不在它们附近的养料。很多种 类的粘细菌分泌溶解酶，便于它们捕食其他细菌和酵母【7 引，然后消化被释放出的 蛋白质、脂类和核酸。当没有任何养分时，粘细菌停止聚集，而大量堆砌，这一 过程直到最后形成子实体j 结束。这个复杂的生活周期包括了营养细胞的分化和 自溶、粘孢子的形成和子实体的生成，其中成熟子实体中的卡 孢子是粘细菌的显 著特征。 粘细菌的另一个典型特征是基冈组庞大。纤维堆囊蔺s oc e 5 6 的基因组是目前 所知细菌中最大的，达到了1 3 0 3 3 8m b t 9 1 。s t i g m a t e l l aa u r a n t i a c a 的基冈组大小估 计是9 5 m b t l0 1 ，黄色粘球菌d k l 6 2 2 肇冈组大小是9 1 4m b 1 1 , 1 2 】。 1 2 粘细菌产生的次级代谢产物特性 天然产物是人类发现新型结构和作用机制药物的巨大宝减，而粘细菌是能够 产，l 丰富活性天然产物的新型药源菌。目日仃，在原核，- 物中，粘细菌在已发现的 次级代谢产物数量方面暂时处于放线荫和芽孢杆菌之后，而化于假单孢杆菌之前。 g b f 进行的筛选研究结果显示，从7 0 0 多株不同的粘细菌中分离得到了1 0 0 多个新 的母核结构和将近5 0 0 个衍生物1 3 , 1 4 , 1 5 】。粘细茼产生的多种次级代谢产物，其中很 多化合物具有生物活性，部分化合物表现较强的抗细菌、抗真菌、抗肿瘤活性， 而且作用机制新颖多样。 1 2 1 粘球菌次级代谢产物的多样性 作为粘细菌中的一个属，粘球菌同样具有出色的产生次级代谢产物的能力， 其次级代谢产物同样具有多种多样的结构及作用机制。粘球菌产生次级代谢产物 具有如下特点： ( 1 ) 粘球菌产生的次级代谢产物类型较多，有大环内酯类、芳香类、杂环类、 多烯类、萜烯类等，如图1 1 ，其中列举了一些粘球菌次级代谢产物的结构。( 2 ) 粘 球菌次级代谢产物人部分具有各种不同活性，如抗肿瘤、抗真菌、抗病毒等。( 3 ) 粘球菌次级代谢产物结构新颖，大部分化合物为粘细菌所独有。( 4 ) 粘球菌次级代 谢产物活性作用机制多种多样。( 5 ) 粘球蔺不同种的菌株可以产生同一个化合物， 山东轻r 业学院顾l ：学位论文 如m y x o v a l a r g i l l s ，分别从粘球菌m y x o c o c c u s f u v u sm xf 6 5 和m y x o c o c c u s 访r e s c e n s m xv 4 8 中分离得到。( 6 ) 同一菌株可以产生一系列家族式化合物，如从菌株 m y x o c o c c u s x a n t h u sm xx 1 2 中发现了m y x a l a m i d s 的四种同系物。 p l ，l 芦洲： n 弋叭人 r h 洲2 c m 一 p o g0 o h n h 2 图1 1 一些料细菌次级代谢产物的结构 a ) m y x o t h i a z o l ；b ) m y x o v i r e s c i na ；c ) s a f r a m y c i nm x l ；d ) r m z o p o d i n ；e ) r 蔓j 2 - 丁堆、2 内幕、乙基和甲皋时分j ； 对h i m y x a l a m i d sa 、b 、c 和d ：f ) ( 1 ( 10 ) e ，5 e ) g e r m a c r a d i e n - ii - - , - o l ；和g ) ；d k x a n t h e n e - 5 3 4 1 2 2 粘球菌次级代谢产物的主要生物活性 1 2 2 。1 呼吸链抑制类 19 8 0 年，k g e r t h ，h i r s c h i k 等人从粘球菌m y x o c o c c u s i d v u sm xf16 中分离 得到新的抗真滴抗生素m y x o t h i a z o i 【1 6 】，结构如图1 1 a ，它的主要作用部位是细胞色 素b c l 复合物( 在q 0 部位k d = 1 0 。1 m o l l ) 、细胞色素c 2 氧化还原酶( 细荫光合 系统) 及其复合物，此类化合物可用于抗真菌药物或杀虫剂【t 7 , t 8 。对很多真菌和 少部分革兰氏阳性菌有活性，对酵母和革兰氏阴性菌没有抑制作用。浓度达到2 第1 帝绪论 i t g m l 时完全抑制冻七毛霉m u c o rh i e m a l i s 的生长。另外，它对鸡胚成纤维细胞 有很高的毒性，对小鼠有剧毒( 半数致死量l d 5 0 达到2 m k g ) 1 6 l 。 1 9 8 3 年，k g e r t h ，r j a n s e n 等人从菌株m y x o c o c c u s x a n t h u sm xx 1 2 中发现 一类多烯化合物m y x a l a m i da ，b ，ca n dd ( 如图1 1 e ) ，它们具有抑韦t j n a d h 氧化 的作用。m y x a l a m i d s 被证明有剧毒，在小鼠皮| f 注射时绝对致死量l d l o o 是3 m g k g ( 最大耐受剂量l d o ，l m g k g ) ，口服时l d l o o 达到1 0m g k g ( l d o ，3m g k g ) 1 9 1 。 1 2 2 2 抑制蛋白质合成类 19 8 2 年，h i r s c h i k ，k g e r t h 等人从粘球菌m y x o c o c c u s 乃 ，u sm xf 6 5 和 m y x o c o c c u sv i r e s c e n sm xv 4 8 中分离到多肽类抗生素m y x o v a l a r g i n s 。其中 m y x o v a l a r g i na 的分了量为1 7 0 0 ，含有1 4 个氨基酸，其氨基酸末端足3 - o d i 萎t 酸， 羧基端是胍丁胺。m y x o v a l a r g i na 是原核乍物蛋白质合成的特效抑制剂，体外实 验中，m y x o v a l a r g i na 作用于细菌核糖体的a 位点，通过与氨酰- t r n a 结合而阻 断转肽反应。在低剂量( 1 p g m l ) 时，m y x o v a l a r g i na 瞬时特异性的阻断蛋白质的 合成；高剂量( 大于5p g m l ) 条件下，可导致细胞膜结构的破坏，而使细胞内容 物释放；高剂鼍条件f 对动物也有细胞毒活性，对小鼠的l d 5 0 是1 0m g k 9 2 0 1 。 m y x o v a l a r g i n s 类抗尘素对肠杆菌有特效，其m i c 约为1 g m l ；在较低浓度下即 对革兰氏阳性菌明显抑制作用( m i c0 3 - 5p g m l ) ，在较高浓度时对草兰氏阴性菌 ( m i c6 1 0 0i t g m l ) 也有作用，但对酵母和霉菌无效，并且产生菌自身敏感 ( m i c 4 6j x g m l ) t 2 。 1 2 2 3 蛋白质磷酸化系统抑制剂 1 9 9 3 年，s a s s e 等人在粘球菌m y x o c o c c u ss t i p i t a t u s d p 发现了种大坏内酯类化 合物r h i z o p o d i n ，它不抑制细菌生长，对酵母和霉类也只有轻微的抑制，但可使附 着的小鼠成纤维细胞变形为长的、有分支的根瘤状结构，并且这种作用是不可逆 的，最终导致细胞死亡；而悬液中的细胞系却在细胞表面产生泡状结构，最终也 会死亡。对细胞系b h k 、c h o 、l 9 2 9 和k - 5 6 2 的i c 5 0 分别为3 0n g m l 、1 2n g m l 、 4 山东轻t 业学院硕l j 学位论文 1 5n g m l 矛u 1 5n g m l 2 2 】。 2 0 0 8 年，g r e g o rh a g e l u e k e n ，s i m o n ec a l b r e c h t 等人用x 射线晶体学方法对 r h i z o p o d i n 与肌动蛋白的聚合物进行了细致的研究，从而对r h i z o p o d i n 进行了绝 对构型的重新认定，认为它是一个具有c 2 对称、含1 8 个手性中心的3 8 元双内酯、 两个双取代嗯唑和两个共轭二烯的系统( 如图1 1 d ) ，而4 i 是之日i 认定的单体结构 ( 如图1 2 ) 。同时，这个结构也可以更好的解释r h i z o p o d i n 的作用机理，r h i z o p o d i n 作为二价的抑制剂处在两个肌动蚩白分子之间，并与它们形成三元聚合物( 如图 1 3 ) ，阻止了两个肌动蛋白分子的聚合，这就解释- t r h i z o p o d i n 作为高活性肌动 蛋白聚合抑制剂的原刚2 3 , 2 4 1 。 e h 3 n 汐 h 图1 2r h i z o p o d i n 单内酯结构 图1 3r h i z o p o d i n ! jg - 肌动蛋白结合模利 1 2 2 4 核酸合成抑制类 1 9 8 3 年i r s c h i kh 和g e r t hk 等人从菌株m y x o c o c c u sf u l v u sm xf 5 0 中发现细菌 r n a 聚合酶抑s f j 齐l j m y x o p y r o n i na 平i i b ( 如图1 4 ) 。m y x o p y r o n i na 能抑制金黄色 葡萄球菌的r n a 合成，并在e c o l i 中得到确证，它能强烈抑制依赖d n a 的r n a 聚 合酶的活性，但对d n a 的合成影响不大。同时，m y x o p y r o n i n s 能够抑制受试的大 部分革兰氏阳性细菌，对大部分革兰氏阴性菌、酵母和霉菌不敏感，而且m 危 ，u s m xf 5 0 具有自身敏感性【2 5 】。 1 9 8 8 年l r s c h i k 等人从m y x o c o c c u sx a n t h u s 菌株m x x 4 8 的培养物中分离到化合 物s a f r a m y c i nm x l ，它是一种杂环醌类物质( 如图1 1 c ) 。对革兰氏阳性菌和盐杆 菌有很强的生长抑制作用，对部分草兰氏阴性菌有效，并且发现产生菌自身对 第1 章绪论 s a f r a m y c i n 敏感，而对酵母和霉菌不敏感。在浓度达到0 51 t g m l 时，几乎能完全 快速的抑制丽印砂l o c o c c u sa u r e u s d n a 、r n a 和蛋白质合成。其作用机理是通 过静电效应与d n a 双螺旋表面的小沟相结合，使d n a 链断裂2 6 1 。s a f r a m y c i nm x l 同时还具有抗肿瘤的活性【2 7 】。 r m y x o p y r o n i n s o l | n h c c h 3 o h n h 2 o h n h 2 m y x o p y r o n i n sa ：r = n - c 3 h 7 m y x o p y r o n i n sb ：r = n - c 4 h 9 拿w ：f o 毗 o r 图1 4m y x o p y r o n i n s 、d k x a n t h e n e s 春l l m y x o c h r o m i d eb 3 的化学结构 1 2 2 5 细胞壁合成抑制剂 19 7 3 年，r o s e n b e r ge 等人从粘球菌m x x a n t h u st a 中发现了抗尘素t a ，它 是一种细胞壁合成抑制剂，| 司时也是从粘细菌中分离到的第一个抗生素【2 8 】。t a 与 m y x o v i r e s c i na 是同分异构体，具有相同的核磁共振和紫外吸收光谱数据，但熔 点不刚2 9 1 。抗生素t a 能够抑制二氨基庚二酸和尿嘧啶二磷酸- 乙酰葡糖胺j j e c o l i 细胞壁的结合，向不改变交联葡聚糖和1 e 交联葡聚糖的比例。t a 能阻碍脂质中 i 日j 代谢物的形成，说i j f j t a 影响了二糖血肽脂的聚合【3 0 】。 y 德国g b f 科学家1 9 8 2 年在菌株m y x o c o c c u sv i r e s c e n sm xv 4 8 中发现了另一 个细胞壁抑制类抗生素m y x o v i r e s c i n s 。m y x o v i r e s c i n a ( 如图1 1 b ) 在浓度1 5l a g m l 时能够对大部分革兰氏阴性菌产生抗菌活性；对真菌和酵母没有抑制活性；抗生 6 山东轻t 业学院硕f j 学位论义 素在牛物体内起作用时，阻止- 乙酰葡糖胺进入细胞人分子，进而抑制细胞擘的 合成。粘细菌细胞的丙酮或甲醇提取物中没有发硎7 , , l v l y x o v l r e s c l na ，只能在对数期 的发酵液中榆测到，在稳定期之前便会消失。原始产乍荫m v i r e s c e n sm xv 4 8 由于 自身敏感，m y x o v i r e s c i n 的产率很低，只有0 2p g m l ，而在突变株m xv 4 8 m 1 0 中 则达到了8i - t g m l 3 1 , 3 2 】。 1 2 3 其他 p e t e rm e i s e r ，h e l g eb b o d e 等人2 0 0 6 年从菌株肜x a n t h u sd k l 6 2 2 中分离到 一类家族式化合物d k x a n t h e n e s ( 如图1 4 ) ，是粘细菌形成子实体过程中孢子成熟 所必需的成分，而且具有消除自由皋防止自身氧化损伤的功能【33 1 。 b i r g i to h l e n d o r f 等人2 0 0 8 年从粘球菌中新发现tm y x o c h r o m i d e 家族的新成 m y x o c h r o m i d eb 3 ( 如图1 4 ) ，在1 0p g m l 时对2 8 种供试肿瘤没有发现抑制作 用，对多种微生物的测试结果也没有活性作用【3 4 】；ae 1a k o u m h 和m v i j a y a l a k s h m i 等人在1 9 8 7 年发现了一种热稳定性糖肽m y ) ( a l i n e ，主要功能是血液抗凝血剂【3 5 1 ， 1 9 9 2 年发现它还能有效抑制血栓形成【3 6 】；1 9 9 2 年t r o w i t z s c h k i e n a s tw 等从菌株 m x s t i p i t a t u sm xs 4 0 中分离的p h e n a l a m i d ea 1 具有h i v 1 抑制活性【37 1 。2 0 0 3 年 m p o z a 等人从菌株m y x o c o c c u sx a n t h u s4 2 2 中分到分了最4 0k d a ，等电点5 0 的乳 凝酶【3 8 】。 此外，科学家们通过分子手段对粘细菌的次级代谢产物及其机制方面也做了 大量的研究工作，测定- j m y x o c o c c u sx a n t h u s 的基凶纽人小为9 1 4m b ，分离了1 8 个生物合成基冈簇，其中大部分合成基因簇生在1 5 和3 5m b 以及4 4 和5 8m b 之i 、日j 【3 9 1 。s t a r k sc m 等人将修饰过的聚酮合成酶基阗( p k s ) 通过基因工程技术在 橙黄色粘球菌( m y x o c o c c u sx a n t h u s ) 中异源表达，分离f l j 9 种新的e p o t h i l o n e 类似 物，并发现4 去甲基1 0 ，1 1 一去氢e p o t h i l o n ed 具有较强的，- 物活性，通过实验发现 它对乳腺癌细胞m c f 7 ，耐药乳腺癌细胞n c i a d r ，非小细胞肺癌细胞n c i h 4 6 0 和神经胶质瘤细胞s f 2 6 8 均有较高的抑制作用【删。 第1 章绪论 1 3 本课题的立题依据、目的和研究意义 首先，从已经取得的成果来看，粘细菌的次级代谢产物种类繁多，结构新颖， 生物活性机制多种多样，是丌发新的抗真菌、抗肿瘤和抗病毒药物的重要资源。 而且，目前世界时粘细菌的研究机构屈指可数，对粘细菌的研发，尤其是粘细菌 次级代谢产物的研究不够深入，所以从粘细菌巾选材进行研究，可以取得大量新 的研究成果。 同时，癌症对于人类的威胁是不言而喻的，世界卫生组织在2 0 1 0 年2 月2 f 1 1 警告说，如果人们不认真采取措施预防痛症，到2 0 3 0 年全球每年的癌症死亡人 数将可能在现有基础一l 翻番，达1 7 0 0 万。而仅2 0 1 0 年预计全球将有7 6 0 万人死 于痛症。如果不紧急行动起来应对这一公共卫生挑战，癌症死亡人数还将持续激 增。在我国，肺癌位居男性恶性肿瘤发病第。位、乳腺癌位居女性恶性肿瘤发病 第一位。因此，全球的抗癌形势非常严峻，迫切需要有好的抗癌药物来控制和降 低癌症发病率。 目前临床上比较成功的抗肿瘤化疗药物有紫杉醇和埃博霉素类似物等，但是 紫杉醇的水溶性低，而且化疗过程中出现了细胞耐药性等问题，而埃博霉素类药 物对病人来说显得非常昂贵，所以从粘细菌中筛选具有更好的化学性质、生物学 性质和药理学性质的质优价廉抗肿瘤新约湿得尤为迫切和重要。 本课题的研究目的是要从粘细菌中筛选具有抗肿瘤活性的化合物，作为新药 的资源储备。 1 4 本课题的研究内容 本实验对初筛具有抗肿瘤活性的粘细蔺菌株进行发酵，从发酵液中萃取获得 粗产物，将粗产物通过多种分离技术分离得到次级代谢产物，对得到的化合物进 行结构鉴定，并通过m t t 法筛选出具有抗肿瘤活性的化合物。技术路线如图1 5 。 山东轻t