（发酵工程专业论文）IMSPCR检测食品中的单增李斯特菌.pdf

摘要 摘要 单增李斯特菌是自然界中一种常见的致病菌，能感染人类和动物；李斯特菌病是具 有高致死率的一种疾病。因此，采用科学的方法检测食品中是否含有单增李斯特菌就显 得非常重要。本文利用i m s p c r 法能快速、简便地从食品中检测出单增李斯特菌。 免疫磁珠法( i m m u n o m a g n e t i cs e p a r a t i o n 简称i m s 法或l i s t e r t e s t 法) 是利用抗原抗 体反应的原理，做单增李斯特菌的特异性和敏感性实验；p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 法是针对单增李斯特菌的却基因( 编码p 6 0 蛋白) 设计特异性引物，进行p c r 扩增 反应；做单增李斯特菌的特异性和敏感性实验。通过对这两种方法的分析和比较，建立 i m s p c r 法，利用p c r 法的引物，做单增李斯特菌的特异性和敏感性实验。同时，国 标法( 检测的标准方法) 和实时荧光定量p c r 法( 试剂盒) 作为i m s p c r 法的对照 同i m s p c r 法实验结果进行分析和比较。 i m s 法：能快速捕集细菌，在培养液中进行增菌( 3 7 1 4 1 8 h ) ；通过溶血反应 和鼠李糖反应确认是否为单增李斯特菌，需要3 - - 7 天，敏感性能达到1 0 7 。p c r 法： 从食品中获取单增李斯特菌到进行增菌培养要3 5 天，提取细菌基因组d n a ，并对其 进行了p c r 扩增，结果得到片段的长度为2 3 0 b p ，需要4 h 就得出结果，敏感性能达到 1 0 一。i m s p c r 法：从快速捕集细菌到进行增菌培养，再经p c r 扩增后得到片段长度 为2 3 0 b p ；只需在1 天内就能检测出单增李斯特菌，缩短了检测的时间；同时提高单增 李斯特菌检测的特异性和敏感性。i m s p c r 法的实验结果与国标法和实时荧光定量 p c r 法( 试剂盒) 法的结果相符，然而它比国标法简便、快速、灵敏度高，比实时定 量p c r ( 试剂盒) 法价格低；因此从经济和实用性上，i m s p c r 法有很好的应用前景 和研究价值。 关键词：单核细胞增生李斯特菌，国标法，免疫磁分离p c r ，模板，实时荧光定量p c r i m s - p c r a b s t r a c t 一一 a b s t r a c t l i s t e r i am o n o c y t o g e n e si sac o m m o nb a c t e r i u mi nn a t u r e ，w h i c hc a no c c u r sb o t hm h 啪a n sa i l di i la i l i m a l s l i s t e r i o s i si sa s e v e r ed i s e a s ea s s o c i a t e dw i t hah i g hc a s ef a t a l i t yr a t e s oi ff o o d sc o n t a i nl i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ，i t i sv e r yi m p o r t a n tt oa d o p ts c i e n t i f i cm e t h o d st o d e t e c tt l l e m i m s p c rm e t h o dc a i lq u i c k l yd e t e c tl i s t e r i am o n o c y t o g e n e si nf o o d s i m su t i l i z et h ep r i n c i p l eo fa n t i g e n a n t i b o d yr e s p o n s ea n dd ol i s t e r i am o n o c y t o g e n e s e x p e r i m e n t so fs p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t y p c ri s t h a to n es e to fp r i m e r sw a sd e s i g n e d a c c o r d i n g t ot h es e q u e n c e so ft h el a pg e n e ( p 6 0p r o t e i nc o d i n g ) o fl i t e r i am o n o c y t o g e n e sa n d c o n d u c t e dp c r ；a n dd ol i s t e r i am o n o c y t o g e n e s e x p e r i m e n t so fs p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t y a c c o r d i n gt oa n a l y z ea n dc o m p a r et h et w om e t h o d s ，w es e tu pi m s p c ra n de m p l o y t h e f o n n e rp r i i i l e rt od ol i s t e r i am o n o c y t o g e n e s e x p e r i m e n t so fs p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t y a l s o g u o b i a o ( s t a n d a r dm e t h o do fi n s p e c t i o n ) a n dr e a l t i m ep e r ( k i t ) t a k e a st h ec o n t r o lo f i m s p c r , t h e na n a l y z ea n dc o m p a r ei m s - p c r sr e s u l t s i m sc a nq u i c k l ye n t r a pb a c t e r i at oi n c r e a s et h e mi nc u l t u r ef l u i d ( 3 7 c1 4 - - 1 8 h ) ，a n d h e m o l y t i cr e a c t i o na n dr h a m n o s er e a c t i o nc a n c o n f i r mi fi ti sl i t e r i am o n o c y t o g e n e s ，a n d d e m 趾d s3 - 7d a y s ；s e n s i t i v i t yc a na t t a i n1 0 7 p c r ：o b t a i n i n gl i t e r i am o n o c y t o g e n e sf r o m f o o d st oc a r r yo u te n r i c h m e n tc u l t u r ew h i c hn e e d3 - 5d a y s e x t r a c tb a c t e r i a lg e n o m ed n a t oc a r r yo u tp c ra n dd e s e r v e2 3 0 b p , w h i c ha r r i v ea tr e s u l t sf o r4h o u r s ，i t ss e n s i t i v i t yc a l l a t t a i n10 5 i m s p c r ：f r o mf a s tc o l l e c t i n gb a c t e r i at op r o g r e s se n r i c h m e n tc u l t u r e ，t h e n d e s e l w e2 3 0 b pa f t e rp c r , i tc a nd e t e c tl i s i t e r i am o n o c y t o g e n e s i nad a y i tl e s s e n e dt h et i m e o fi n s p e c t i o n ，a tt h es a m et i m ei tr a i s e dd e t e c t i v es p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t yo f l i s i t e r i a m o n o c y t o g e n e s t h er e s u l t so fi m s p c ra g r e ew i t hg u o b i a oa n dr e a lt i m ep e r ( k i t ) ，t h e ni t i sm o r e c o n v e n i e n t f a s t e ra n ds e n s i t i v et h a ng u o b i a o ；a n dl o w e rc o s tt h a nr e a lt i m ep c r ( k i t ) s o f r o me c o n o m ya n dp r a c t i c a b i l i t y ，i m s p c rh a sag o o dp r o s p e c t t ou s ea n dv a l u et os t u d y k e yw o r d s ：li s t e r i am o n o c y t o g e n e s , g u o b ia o ，im u n o - m a g n e ticc el is e p a r a t io n ， p c r 。t e m p i a t e ，r e a i t i m ep c r ，i m s p c r i i 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：! 鳖二基捡型盒晶生鲍皇擅奎逝挂菌 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的规 定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 艺 是否保密( 包) ，保密期至年 月日为止。 学生签名：眸导师签名：惶塑逝 细芳年牛月日 第一章文献综述 第一章文献综述 单核细胞增生李斯特菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ) ( 以下简称单增李斯特菌或l m ) 是自然界中一种常见的致病菌i l 】。它是李斯特菌病的病原体之一，能感染人类和动物。 侵入性的李斯特菌病是很少见的，然而它是高致死率的一种严重疾病。尽管早在1 9 2 6 年单增李斯特菌就被认定为人类致病菌，直到二十世纪八十年代，它仅仅被证实为食源 性致病菌。几种食品( 牛肉、奶、蔬菜和鱼产品) 与李斯特菌病的流行性和散发性的病 例有关。1 9 9 5 年以来，芬兰每年都有1 7 - - 一4 1 例李斯特菌病的报道，但是确定传染源的 只有3 例。大多数散发性病例的存在使得对传染媒介的检测是困难的。而且，因为潜伏 期长，常常没有剩余食品检测；还有在各种各样的食品中检测到单增李斯特菌，从而阻 碍了李斯特菌病与特定食品间的联系。 现代化的加工和包装技术延长了食品的货架期。涉及到李斯特菌病，尤其加工食品， 较长货架期和方便性食品消费有助于单增李斯特菌生长，这些都是最值得关注的。单增 李斯特菌具有自然分布广和致病性，它的生长p h 值范围宽和水分活度范围广的特性使 得在产品和生产设备中控制细菌的难度很大。因此，要阻止单增李斯特菌对食品的污染， 知道食品加工工业中单增李斯特菌的污染途径是必要的。通过对有效的预防措施进一步 研究，李斯特菌病最终是能够预防的。 1 1 单增李斯特菌 1 1 1 简介 单增李斯特菌研究历史源于1 9 2 6 年，当时m u r r a y ，w e b b 和s w a r m ( 1 9 2 6 ) 在剑桥 从死亡的实验鼠和几内亚猪体内分离出一株长l - - 2 1 a m 和宽o - - - 5 1 a m 圆端的革兰氏阳性 菌，命名为单增杆菌。1 9 2 7 年，p i r i e 描述了非正常死亡的南非沙土鼠，而且命名发现 的杆菌为l i s t e r e l l ah e p a t o l y t i c a ，用来纪念l o r dj o s e p hl i s t e r 。因为与m u r r a y ( 19 2 6 ) 和p i r i e ( 1 9 2 7 ) 分离的菌株呈现出极大的相似性，该杆菌被重新命名为l i s t e r e l l a m o n o c y t o g e n e s 。然而，属名l i s t e r e l l a 以前一直用于原生动物，p i r i e ( 1 9 2 7 ) 提议改名 为单增李斯特菌。该名字被接受了，尽管它已经存在于植物学中，一种兰花命名为李斯 第一章文献综述 特；且在动物学中，双翅目也被称为李斯特( s e e l i g e r1 9 6 1 ) 。李斯特菌和b r o c h o t h r i x 属 是属于l i s t e r i a c e a e 科，b a c i l l a l e s 目，b a c i l l i 纲和f i r m i c u t e s 门。李斯特菌属共有6 种 菌：单增李斯特菌( l m o n o c y t o g e n e s ) 、绵羊李斯特菌他i v a n o v i i ) 、西尔李斯特菌 江s e e l i g e r i ) 、英诺克李斯特菌( l i n n o c u a ) 、威尔李斯特菌( l w e l s h i m e r i ) 和格式李斯 特菌( 三g r a y i ) ；其中单增李斯特菌和绵羊李斯特菌均有致病性。研究发现单增李斯特菌 包括致病性、弱致病性和非致病性3 种类型1 2 】。人类和动物的致病菌是单增李斯特菌， 但是一些人和某些较大范围动物的李斯特菌病病例，尤其是羊李斯特菌病，是由格氏李 斯特菌引起的。在样品检测时，英诺克李斯特菌会在增菌过程中产生 b l s ( b a c t e r i o c i n 1 i k es u b s t a n c e ，细菌素样物质) 抑制单增李斯特菌的增长，从而常常检 出英诺克李斯特菌【3 1 。单增李斯特菌能使人畜致病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎 和单核细胞增多，死亡率达2 0 - - - 3 0 n 。它在自然界中分布非常广，存在于土壤、污 水、人和动物的粪便、饲料以及多种食品中1 5 1 。有报道各种动物和人一直是单增李斯特 菌的健康携带者。正常人的带菌率在l 和6 之间变化。人们食用的肉奶蛋、水产品 和蔬菜等均有不同程度的污染，世界卫生组织( w h o ) 关于单增李斯特菌食物中毒的报 告中指出，4 8 的水产品，5 1 0 的奶及奶制品，3 0 以上的肉制品，1 5 以 上的家禽均被该菌污染 6 1 。食品中存在的单增李斯特茵对人类的安全具有较大威胁，该 菌在4 c 的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此， 在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 1 1 2 生物学特性 1 1 2 1 形态特征 产单核细胞增生性李斯特氏菌幼龄菌是革兰氏阳性小杆菌( 图1 1 ) ，陈旧培养物多 转为革兰氏阴性，大小约l 2 x 0 5 岬，通常呈v 型成对排列，偶尔可见双球状，不产 生芽孢，一般不形成荚膜。但在含血清的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜。在1 8 - - 2 0 时有动力( 图1 2 ) ，鞭毛染色可见鞭毛( 图1 3 ) ，3 7 c 培养时动力缓慢【7 1 。 1 1 2 2 培养和生化特性 本菌需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂平板上呈细小，半透明、边 缘整齐、微带珠光的露水样菌落，直径约0 2 - 0 3 m m 在斜射光下，茵落呈典型的蓝绿 色光泽( 图1 4 ) ；在血平板上培养，菌落呈灰白色、圆润，直径为1 0 1 5 m m ，呈现p 型溶血，溶血环直径3 m m ，4 c 放置4 天后，呈典型的奶油滴状，在t s a y e 平板上生 2 第一章文献综述 长为灰白色，半透明、圆润边缘整齐直径为0 7 1 0 m m 的菌落；在m m a 琼脂上用h e m g 侧光检查，可见蓝绿色光、在s s 平板和麦康凯平板上不生长1 7 8 j 。在e b 和葡萄糖肉汤 中呈浑浊生长，液面形成菌膜，后者不产气。在显微镜下观察该菌的室温肉汤培养物可 见翻转运动。可发酵多种糖类，3 7 。c 培养2 4 h 能迅速发酵葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、海 藻糖、水杨苷、果糖、七叶苷，产酸不产气，培养3 1 0 天可发酵阿拉伯糖、乳糖、蔗 糖、糊精、山梨醇和甘油，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子 糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，4 0 胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明 胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，v p 、甲基红试验和精氨酸双水解阳性瞵 1 0 l 。在3 , - - 4 5 。c 范围内生长，但最适宜温度为3 7 ，适宜中性或弱碱性条件下生长。 图1 1 单增李斯特菌革兰氏染色 f i g1 1g r a ms t a i no fl m o n o c y t o g e n e s 图1 2 单增李斯特菌动力学培养 f i g1 2k i n e t i c sc u l t u r eo fl m o n o c y t o g e n e s 图1 3 单增李斯特菌单个菌落的形态特征 f i g1 3s i n g l ec o l o n ym o r p h o l o g yo fl m o n o c y t o g e n e s 图1 4 单增李斯特菌菌落的形态特征 f i g1 4c o l o n ym o r p h o l o g yo fl m o n o c y t o g e n e s 注：图1 1 1 4 采集白张惠媛的单增李斯特菌枪测中的图j 1 3 第一章文献综述 1 2 亚分型 亚分型的英文名称有“s u b t y p i n g 。细菌亚分型的目的是确定两个或更多的分离株之 间的关系。比如在暴发流行的调查中细菌分离株亚分型的目的是确定是否两个或更多的 分离株具有共同的祖先。评价亚分型的标准有：辨别能力，价格，标准化与可重复性， 自动化程度，使用的方便性与广泛性等。亚分型的辨别能力通常用s i m p s o n 辨别指数( s i d ) 表示，该指数对两个不相关菌株被区分为不同亚型的可能性进行定量。至今还没有发现 上述标准都较好的单独亚分型方法，因此应用的目的决定了到底哪一个标准更重要。细 菌的亚分型方法主要有：传统表型法和遗传或d n a 法。 1 2 1 堋的传统表型亚分型法 l m 的传统表型亚分型法包括：血清分型，噬茵体分型及多区带酶电泳分型( m e e ) 。 1 2 1 。1 血清分型 血清分型是很多食源性病原体如沙门氏菌、l m 等的经典分型方法。血清分型的依 据是不同的菌株其表面抗原不同，这些表面抗原可以被抗体或抗血清所检测。血清分型 已被应用于流行病学调查，但是与其它亚分型方法尤其是分子亚分型方法相比其辨别能 力相对较差【l l j 。例如l m 有1 3 个不同的血清型，但是却有1 0 0 多个不同的分子亚型。因此 血清分型对于l m 亚型的区分和流行病学调查相对不太敏感。这就需要更具辨别能力的 方法对l m 进行亚型分析和食源性疾病暴发的污染源追踪。 1 2 1 2 噬菌体分型 噬菌体分型是按不同菌株对一整套标准噬菌体裂解的敏感性不同来分型的。噬茵体 分型首先需要有一整套裂解噬菌体。噬菌体分型虽然速度较快，但需要一套标准化的参 考噬菌体以使不同实验室之间的结果具有可比性。噬菌体分型的标准化也是一个挑战， 因为这种方法本身就受到生物学变异和实验变异的影响【1 2 1 。另# b c a p i t ar 等【1 2 】对9 6 株l m 噬菌体分型研究表明噬菌体分型对l m 的分辨率较低。在法国噬菌体分型已用于食品和 人群分离株的常规分型，并已检测出一起李斯特菌病的暴发【1 3 1 。 4 第一章文献综述 1 2 1 3 多区带酶电泳分型 多区带酶电泳分型( m e e ) 是根据不同组成型酶电泳迁移率的不同进行分型的。含有 可溶性酶的细胞提取液按分子量大小的不同在凝胶中分离。酶的活力通过产生颜色的配 体来测定。这种方法的分型的准确性达1 0 0 ，但是实验室间的标准化较难控制。m e e 已被广泛应用于l m 的种群遗传学研究【1 3 l ，但与分子亚分型相比辨别能力较弱。 1 2 2l m 的遗传亚分型 常用的以d n a 为基础的亚分型方法包括核糖体分型( r i b o t y p i n g ) 和d n a 序列分析等。 在很多方面以d n a 为基础的亚分型方法要优于传统的方法如血清分型。该法对菌株的分 辨力敏感，标准化程度高，重复性好。l m 最常用的分子分型方法是核糖体分型和脉冲 场凝胶电泳。有研究显示用核糖体分型法至少可将l m 分为5 0 个不同的型，脉冲场凝胶 电泳可分为7 2 个型。 1 2 2 1 核糖体分型 核糖体分型是另一种以d n a 为基础的亚分型方法。该法也是用限制性内切酶把细菌 d n a 切割成片段数较多( 3 0 0 - - - 5 0 0 ) 。用e c o ri 切割后，所有的d n a 片段在2 - 2 0k b 之间， 这些大小不同的d n a 片段通过琼脂糖凝胶电泳分开，接下来的s o u t h e r nb l o t 用d n a 探针 来特异性的标记并检测那些编码核糖体r n a ( r r n a ) 的细菌基因片段。所产生的d n a 条 带模式只是那些含r r n a 基因的d n a 片段。e c o ri 是l m 最常用的核糖体分型的限制性内 切酶。尽管使用e c o ri 的核糖体分型能将l m 区分为与表型和毒力相关的不同亚型，有 研究表明使用不同的内切酶如p i 可增强对菌株的区分能力【1 4 1 。目前 q u a l i c o n , i n c ( w i l m i n g t o n d e ) 已开发了一套全自动的核糖体分型系统( r i b o p r i n t e r ( r ) m i c r o b i a lc h a r a c t e r i z a t i o ns y s t e m ) ，并已进行商业化运作。 1 2 2 2 以d n a 序列为基础的亚分型 多位点序列分型( m u l t i l o c u ss e q u e n c et y p i n g ，m l s t ) 是指对多个基因或基因片段进 行测序来确定细菌的亚型及各分离株之间的遗传相关性。它已在多个微生物应用【1 4 1 6 】， 包括空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎淋球菌等。目前l m 的m l s t 已在多个实 验室建立，其建立的依据是发现了l m 一系列毒力基因及其在胞内感染过程中特异性功 能。l m 的感染过程：o l m 被宿主细胞内化；细菌逃离宿主液泡；细菌在宿主胞浆 复制，并通过细菌指导的宿主细胞肌动蛋白丝成核作用在胞浆中运动；细菌移动至宿 5 第一章文献综述 主细胞的浆膜处，并伸出伪足样结构；伪足样结构被临近细胞吞噬，细菌从双层膜的 液胞中逃离，开始下一轮的复制【l 。对上述每一步起作用的基因产物已被发现。已知的 有六个毒力基因( p r f a ，p i c a ，h l y a ，m p l ，a c t a 和p l c b ) 以基因族的形式出现。这些毒力 基因都是l m 所独有的，也是以d n a 序列分析为基础亚分型的靶基因。 目前已获得了这些基因在多个菌株中的序列。但是m l s t 的建立还需要知道那些基 因或基因片段在有代表性的l m 菌株群体中是具有高度多样性的，而且这些有代表性的 菌株群体还必须被其他亚分型方法分类，以比较m l s t 和这些方法的优缺点。一旦合适 的靶基因被找到后，建立m l s t d n a 序列的数据库对于m l s t 在l m 上的应用就显的尤为 重要。e r i e s s o n 掣1 8 】探索了某一单一基因( i n l b ) 测序对l m 分型的可行性，结果表明，i n l b 单一基因的序列分析可作为血清分型的一种补充分型方法。一般来说m l s t 的靶基因是 通过中性改变而引起的多样化基因( 通常是看家基因) ，而不选用阳性选择引起的多样化 基因( 毒性基因) ，因为这些基因并不能反应分离株之间的遗传进化关系。但是另一方面 由于毒力基因的多样性高，因此对独力基因的测序其区分能力更强。鉴于上述原因c a i 等【1 9 1 对1 5 个l m 分离株的两个看家基因( r e c a 和p r s ) 、一个应急反应基因( s i g b ) 、两个毒 力基因( a c t a 和伽朋) 和两个基因间序列( h l y - m p l 和p l c a h l y ) 进行了测序，结果发现a c t a 和 i n l a 的全长序列分别有1 5 和1 4 个等位基因型，对这两个基因内6 0 0 b p 的高变区测序发现了 1 5 和1 3 个基因型。看家基因和应急反应基因内的6 0 0 b p 高变区将1 5 个分离株分别分为8 和 1 2 个亚型。两个基因间序列3 3 5 b p 和2 4 2 b p 有8 和1 2 个等位基因型。结果表明用w i n d o w m i n 找到的每个基因内最具区分能力的高变区适合以d n a 序列为基础的亚分型。另外毒 力基因和看家基因联合测序适合l m 的亚分型l z 引。 1 3 毒力及对理化因素的抵抗力 1 3 1 毒力 单增李斯特菌是细胞内致病菌，雷祚荣等认为，李氏溶血素o 与内化素是单增李斯 特菌最主要的致病因子和侵袭性因子，这两个致病基因的位点均在染色体内，两者缺一 均无致病性。但付萍等研究发现，同时具有内化素基因和李斯特菌溶血素基因的菌株未 必全部表现出小鼠毒力，这可能与内化素和溶血素毒力，仅有内化素基因阳性的菌株偶 尔也表现出小鼠毒力，这可能与内化素和溶血素毒力基因是否很好的表达以及其他毒力 因子的作用有关。其他毒力因子包括增溶血因子、磷脂酶、铁蛋白、热休克蛋白、过氧 6 第一章文献综述 化氢酶、超氧化物歧化酶等致病力是多毒力因子作用的结果。外界环境如培养液、p h 、 温度、渗透压、气体成分等能否影响李斯特菌毒力因子的表达还需要进一步研究【2 l 】。 l m 是典型的胞内寄生菌，可在巨噬细胞和许多非吞噬细胞( 如上皮细胞、内皮细胞 和肝细胞) 内增殖。l m 编码与胞内寄生生活循环有关的毒力基因有2 簇，称为李斯特菌 毒力岛1 ( l i p i 1 ) 和李斯特菌毒力岛2 ( l i p i 2 ) 。l i p i 1 有6 个基因，两侧分别为p r s 和l d h 位点，枷下游开始，依次为p r f a 、p i c a 、h t y 、m p l 、a c m 、p l c b 。l i p i 一2 又称为内化素 小岛，内化素是指一个富含亮氨酸重复序列的蛋白质家族，分为2 个亚族，亚族l 的代表 是l 主t i n l a b 基因编码的加从和i n l b 多肽，亚族2 是由相对分子质量较小( 2 50 0 0 3 00 0 0 ) 的 蛋白质组成，原形来自l m 的砌，d 2 2 1 。 1 3 1 1 李斯特菌溶解素 李斯特菌溶解素( l i s t e r i o l y s i o n0 ，l l o ) 系由办陟基因编码的h l y 蛋白，是一种孔形成 毒素，与破坏吞噬体，促进菌体进入胞液有关，是细菌得以在胞液内增殖的先决条件， 是主要的毒力因子，它的缺失将会导致细菌毒力的全部丧失。不产生l l o 的l m 突变株 虽可在非吞噬细胞的胞液中生存一段时间，但却不能繁殖，并且因无法逃逸吞噬体而不 能对其他细胞的感染。除此之外，l l o 还参与了同l m 致病性有关的其它反应，研究显 示【捌：l m 感染鼠脾脏和骨髓的树突状细胞，可导致细胞的凋亡；不产生l l o 的l m 突变 体不能诱导细胞的凋亡，而提纯的l l o 则可引起这种程序性控制的细胞死亡。 1 3 1 2a c t a 蛋白 系由a c t a 基因编码的表面蛋白，通过诱导细胞肌动蛋白分子的聚合作用促使细菌在 细胞与细胞之间的传递，同时也与细菌被宿主细胞内化有关1 2 4 1 。 1 3 1 3 磷脂酶c i 扫p l c b 基因编码，具有锌依赖性，分为性质不同的两类，即磷脂酰肌醇磷脂酶 c ( p i p l c ) 和磷脂酰胆碱磷脂酶( p c p l c ) 。p i p l c 系以活化的形式合成，而p c p l c 贝i j 先以非活化的前肽被分泌出来，然后在胞外由，加，的基因产物m p l 蛋白酶加工。p i p l c 可辅助细菌逸出初级吞噬体，而细菌在细胞与细胞之间的扩散过程中，p c p l c 贝t j 表现 出一定的活性作用【2 5 1 。a n g e l i k ag r u n d l i n g 等通过利用诱导p c p l c 表达系统证明，缺乏 l l o 的l m ，p c p l c 的活性不仅对在人类上皮细胞中初级吞噬体的溶解是必需的，而且 对细胞与细胞之间的扩散也是必需的【2 6 1 。 7 第一章文献综述 1 3 1 4p 6 0 蛋白 p 6 0 蛋白是一种胞壁质水解酶，由却基因编码。通常p 6 0 蛋白于细胞表面产生，并 大量分泌到生长介质中，对于细胞的分裂是必不可少的。分析p 6 0 蛋白编码基因的突变 体显示，对于l m 的吞噬细胞溶解作用以及对机体的感染过程，p 6 0 蛋白是一个重要的因 素【2 7 ，2 羽。 1 3 1 5p r f 蛋白 系f 1 3 p r f a 基因编码，是一种转录因子，是李斯特菌所有基因簇( 包括p r f a 本身) 转录激 活所必需，是迄今鉴定出的李斯特菌的唯一毒力调节蛋白f 2 2 】；在感染宿主细胞的过程中， 对于许多毒力因子的等位表达起到了关键调控因子的作用f 2 9 】。 1 3 1 6 内化素 内化素( i n t e m l i s ) 是l m 通过吞噬作用进入宿主细胞体内，有些细胞如巨噬细胞是“专 职”吞噬细胞，通常吞噬细菌并将其杀灭；而其它的上皮细胞、内皮细胞则为非“专职” 吞噬细胞，但可经诱导产生吞噬细胞的能力。i n l a 是被认定的第一个l m 表面蛋白，对 于l m 穿入非吞噬细胞如上皮细胞来说是必需的，i n l b 在对肝细胞的侵袭过程中起着重要 的作用，即i l d a 和i n l b 是l m 被非吞噬细胞内化所必需。另外，小的分泌性亚族在体内对 传染过程有明显影响，实验证明，l m 的砌，c 缺失后，对小鼠的l d 5 0 明显增加瞄，3 1 1 。 1 3 1 7 表面蛋白p 1 0 4 除了内化素以外，l m 另一种表面蛋白p 1 0 4 也已被证实对于肠道细胞的粘附非常重 要【3 2 1 。 l m 的生长条件如温度、p h 以及铁的获取可以影响其某些毒力因子的表达。研究发 现，0 ) l m 虽可在较低的温度( 4 2 5 ) 下生长繁殖，但l l o 的产生减少甚或不产生，然 而将l m 放置在3 7 下仅需2 h ，其l l o 的表达水平既可恢复正常；当温度提高至5 6 2 0 m i n 时，l l o 的活性减弱，l m 对鼠的致病性也随之降低；尽管l m 可生长在较高的温 度下( 4 2 ) 增加粘附蛋白的表达，但这与l m 毒力的增强并不完全一致，因为，对于l m 的粘附和感染宿主细胞来说，所需的粘附分子相对很少【3 3 1 。当l m 在p h 4 5 4 9 的环 境中，其l l o 的产生减少，对c a c o 2 培养细胞的侵袭性也会减弱，酸适应的l m l e t 酸 刺激的l m 更能感染c a c o 2 细胞和巨噬细胞样细胞，并在其中生长繁殖；培养l m 于p h 3 5 下，可以获得耐酸的l m ，它对鼠有较强的毒力，降低小鼠游离的嗜中性粒细胞和巨噬 细胞的免疫作用【3 4 】。在富含铁的介质中，l m 可通过增加内化素基因的表达来增强对 8 第一章文献综述 c a c o 2 细胞的侵袭性；此外铁的获取也可影响a c t a 蛋白的表达【3 5 1 。 1 3 2 对理化因素的抵抗力 单增李斯特菌对热的抵抗力是比较弱的，6 0 1 0 m i n ，菌数明显地减少，6 0 3 0 r a i n 或8 0 l o m i n 且p 可全部灭活。对低温有比较强的耐受性，4 士2 条件下仍能生长繁殖， 2 0 ( 2 低温仍可部分存活，并可抵抗反复冷冻【3 6 】。f e r n a n d e zg a r a y z a b a l 等t 3 7 】( 1 9 8 7 ) 研 究发现接种单增李斯特菌的生奶，经过6 9 - 7 3 处理后立即检测未能检测出，但是在冷 藏温度下放置一段时间后，有4 6 6 的样品仍能检测出该菌，但是7 3 处理的样品均没 检测出。酸碱对该菌具有比较强的抑制作用，p h 4 o 以下，p h 9 0 以上都不能生长，不同 菌株在不同食品、不同p h 、不同温度下，对n a c i 的耐受力不同，如在4 、3 0 5 n a c i 中能存活1 0 0 天；而在3 7 时只能存活5 天【3 8 l 。对化学杀菌剂以及紫外线照射比较敏感， 7 5 酒精5 m i n 、1 9 6 0 新洁尔灭溶液3 0 m i n ，紫外线照射1 5 r a i n ，都可以杀灭该菌m 】。在不 同介质中对丫射线的抵抗力不同，胡金惠( 1 9 9 6 ) 等【3 9 】研究发现，丫射线杀灭培养基、牛 奶、牛肉粉末中单增李斯特菌的d 1 0 值分别是0 5 5 、o 7 5 、1 0 3 、1 1l k g y 。有文献报道， 不同温度条件下培养的单增李斯特菌对温度的耐受性有差异【删，对其他理化因素的抵抗 力是否有差异不明。 1 4 流行病学 1 4 1 自然界分布 李斯特菌在自然界中分布极为广泛，野生动物、家畜、家禽、健康人群均为可携带 者，目前已经从4 2 中不同的哺乳动物和2 2 中禽类分离到单增李斯特菌，另外鱼类、蜱 类、蝇类及甲壳类动物中也分离出该菌【9 j ，实际上动物起到携带、繁殖、排放该菌的作 用。在含有水分高的物品如土壤、地面水、牛奶以及奶制品、肉制品、水产品、冰箱内 和洗碗布中也常能检测出该菌，根据对食品加工场所检测发现，地板、墙壁、排水管道、 传送装置、清洗材料和设备表面等潮湿处容易被污染【4 0 ，4 。张秀丽等1 4 2 ( 2 0 0 1 ) 从河 水、屠宰场污水、新鲜猪粪便、新鲜人粪便、庄稼地土壤、菜地土壤、生肉、熟肉，新 鲜牛奶、乳制品、蔬菜、活虾中均检测出该菌。 9 第一章文献综述 1 4 2 食品污染 单增李斯特菌是一种重要的食源性致病菌，从世界各地爆发的李斯特菌病来看，主 要病因是食用了被污染的农畜产品以及水产品。我国虽然没有暴发性流行，但是食品受 到单增李斯特菌污染的报告也是屡见不鲜的。 奶及奶制品：奶及奶制品中检出率较高，1 9 8 8 年加拿大安大略省鲜奶的单增李斯 特菌的检出率高达4 5 - 3 ，1 9 9 5 年1 0 月到1 9 9 6 年5 月进行的调查中检出率为2 7 3 t 4 3 1 。 英国b u r d e n 等 卅调查了不同奶站的3 0 0 0 个巴氏消毒奶样品，其中有3 份检测到了单增 李斯特菌，检出率为0 1 。我国在对1 2 个省的七类食品调查中发现，乳的污染率为 0 7 2 ，乳制品的污染率为0 5 2 t 4 5 1 。g a y a 等【4 3 】研究发现，山羊奶污染李斯特菌与季 节有关，秋冬两季比春夏两季污染率高。m c l a u c h l i n 等1 4 6 ( 1 9 9 0 ) 调查发现，刚生产的 奶酪样品中单增李斯特菌的含量比较低( 1 0 c f u g ，但零售样品含量比较高1 0 5 1 0 7 c f u g ) ，证实单增李斯特菌在工厂污染食品，并在4 增殖。希腊的p a p a g e o r g i o u 等【4 7 】研究发现，冷冻条件下( 1 8 3 8 ) 保存，该菌能存活7 5 个月，他们认为奶 酪的高p h 和乳中丰富的蛋白质、脂肪可能支持了单增李斯特菌的生长。 肉及肉制品：1 9 9 2 - 1 9 9 5 年，对法国和比利时禽屠宰场的产品进行单增李斯特菌 污染的调查发现：鸡胴体、鸡分割肉以及禽类熟制品的单增李斯特菌的污染率从1 9 9 2 年的3 2 1 下降到1 9 9 5 年的9 2 ，分割肉中鸡腿和鸡翅的污染率最高，应当注意的是 煮过的样品污染率最高，达到5 0 t 4 s l 。英国一次单增李斯特菌污染率的调查显示，生 鸡肉为4 9 、生猪肉灌肠为9 2 ，熟鸡肉制品为1 6 ，即食性牛肉干为3 0 1 4 9 1 。1 9 9 9 年底，法国以生产肉酱和冷盘肉为主的加工生产的部分肉酱和猪舌肉被李斯特菌污染， 造成9 人发病，2 人死亡。我国十二省七类食品的单增李斯特菌的污染率调查显示，生 肉制品为1 5 3 ，熟肉制品为0 4 7 t 5 0 1 ，河南的调查显示，生肉单增李斯特菌的污染率 为5 8 ，熟肉为3 3 i m j 。 水产品：1 9 8 6 年，l e n n o r t 4 0 】发现2 2 例产期感染与食用被污染的生鱼或贝类呈弱相 关，1 9 8 8 年瑞士爆发一起热熏鱼引起的李斯特菌病例，热熏鱼的污染率为8 9 t 5 2 】。1 9 9 3 年，新西兰发生因为食用被污染的熏制贝类引起的李斯特菌病【4 3 】。k r a d o l f e r 和d o u s s e 对8 1 0 份热熏鱼进行了单增李斯特菌污染率调查，检出率为7 1 【5 2 】；h e i n i t z 等【5 3 j 从 1 9 9 1 - 1 9 9 5 年一直对熏制的带鳍鱼类和熏制贝类产品进行单增李斯特菌等微生物污染 指标的分析。发现冷熏制品比热熏制品单增李斯特菌污染率高。m c o a r t h y | ”j 对即食性鳌 虾单增李斯特菌污染情况进行调查发现，煮过的全虾只有3 被污染，而冷冻真空包装 l o 第一章文献综述 未经过充分加热的鳌虾肉有1 7 被污染。英国的一次调查中，冻海产品的检出率为 2 6 4 9 1 。e 1 s h e n a w y 等对埃及亚历山大东港水域调查发现，其水表面的单增李斯特菌检 出率为3 6 6 ，深水检出率为1 8 2 ，新鲜鱼检出率为2 1 4 ，新鲜贝类检出率为 5 0 1 4 3 1 。结果提示，水产品除了加工、运输、储存等因素引起的污染，原材料的污染也 是值得注意的问题。 蔬菜：除了动物产品，蔬菜也是单增李斯特菌的主要污染对象，张秀丽等f 5 1 1 ( 1 9 9 7 ) 调查了河南省5 个地区的6 类食品单增李斯特菌的污染情况，其中蔬菜的污染率是 5 5 。蔬菜的污染除了与运输、储存过程有关外与菜地施用未经过腐熟的农家肥以及 灌溉水的污染也有关系。c a r l i n 报道该菌在4 种粗加工的蔬菜中有不同程度存活和繁殖， 蔬菜叶质的品种对该菌的繁殖和存活影响较大【5 5 1 。 1 4 3 易感人群 新生儿、孕妇、老年人、体弱者、免疫功能低下以及接受免疫抑制治疗的人群，发 生李斯特菌事物中毒的机会比较多，孕妇发病率为非孕妇成年人的2 0 倍，艾滋病者发 病率为免疫正常者的3 0 0 倍1 5 6 1 。德黑兰一份儿童血清学调查显示，l 1 1 的儿童单增 李斯特菌特异性抗体阳性【5 7 】。1 9 8 1 年，加拿大首次报道了食用甘蓝色拉引起的李斯特 菌食物中毒，4 l 例病例中有3 4 例为产妇，其中9 例为死胎，2 5 例为活胎中死亡7 例【5 引。 1 9 8 3 年美国马萨诸塞州有4 9 人因为食用一种巴氏消毒奶引起李斯特菌感染，其中7 例 为新生儿、婴儿，4 2 例为患有免疫缺损的成人，1 4 人死亡【5 9 1 。1 9 9 5 年1 1 月，德国汉 堡爱芬多夫大学附属医院对1 1 名有单增李斯特菌引起的败血症病人做了回顾性调查。 通过血清学分型和脉冲凝胶电泳显示，6 株细菌完全相同或有遗传学上的联系，其中4 株是从肾脏移植接受者身上分离到的 6 0 1 。1 9 9 5 年，瑞士西部爆发了一起由于食用被李 斯特菌污染的奶酪引起的中毒事件，5 7 例病例中有4 2 为体弱者，5 4 大于6 5 岁，总 死亡率在3 2 l 6 1 1 。 1 5 临床表现 李氏菌有嗜神经性质，所以患者表现以神经症状最为明显。其中以李氏菌性脑膜炎， 神经系统性李氏菌病、败血症、脓毒血症最为凶狠，表现为起病急剧。发热( 3 9