（制糖工程专业论文）雪莲果低聚果糖提取及资源化利用的初步研究.pdf

广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 1 1 11 1 1i i i i1 1 11 111 1u l 17 3 7 8 5 5 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成 果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已 经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文 的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：定皿垂a 口加年莎月2 眇 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务： 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： ， 囱即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 敝储馘彻茬刷程轹芦劾田裤b 一 雪莲果低聚果糖提取及资源化利用的初步研究 摘要 采用超声辅助水提的方法提取雪莲果中的低聚果糖，以不同的料 液比、提取温度、提取时间、超声波作用时间为考察对象，采用单因 素实验和正交实验得到提取的最佳工艺条件为：提取时间3 h ，提取温 度8 5 ，超声时间5 m i n ，料液比1 ：1 0 ；提取率为4 2 5 7 。 提取得到的低聚果糖溶液采用了活性炭进行脱色，以活性炭用 量、脱色p h 值、脱色温度和脱色时间为考察对象，通过单因素实验 和正交实验得到脱色工艺条件为：活性炭添加量2 ，脱色温度8 0 ， 脱色时间5 0 m i n ，脱色p h 值3 5 。在此条件下所得脱色液的透光率为 9 7 8 6 。 脱色后的溶液经过中空纤维膜进一步纯化后提高了透光率的同 时还除掉了部分蛋白质。处理液经过高效液相色谱仪，图谱显示所得 提取液中含有蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。 采用超滤膜澄清工艺制取雪莲果果汁，由单因素实验确定热烫温 度为10 0 。c ，热烫时间为1 5 m i n 。柠檬酸添加量为0 0 3 可满足护色 要求。通过超滤膜后的果汁澄清，透明，呈淡黄色，具有雪莲果的固 有香气，果汁性状稳定。糖酸比为1 3 ：1 到1 5 1 之间具有较好的口 感。8 0 。c 热水杀菌3 0 m i n 可以满足产品杀菌需求。 以雪莲果渣为原料添加糖蜜发酵饲料的最佳工艺参数为：发酵时 t 间2 0 h ，糖蜜添加量为8 ，酵母菌接种量为1 5 。在最佳发酵条件下， 所得发酵产物的灰分为9 4 6 ，脂肪含量为1 0 9 ，蛋白质含量为 5 5 1 。所得产物有一种特殊的发酵和糖的芳香气味。 以雪莲果渣为原料添加麦麸，接种酵母菌发酵蛋白饲料。麦麸添 加量为2 0 ，发酵时间4 8 h ，水分含量6 0 ，接种量1 0 。在此发酵条 件下，所得发酵产物蛋白质含量2 3 2 1 ，可以达到蛋白质饲料要求。 关键词：雪莲果低聚果糖果汁饲料 p r e l i m i n a r ys t u d yo ny a c o ne x t r a c t f o sa n du t i l i z a t i o n a b s t r a c t t h eu l t r a s o n i c a s s i s t e de x t r a c t i o no ff r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e sf r o m y a c o nw a ss t u d i e d t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o no b t a i n e dt h r o u g h s i n g l ee f f e c tf a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t sw a sf o l l o w i n g ：e x t r a c t i o n t i m eo f3 h ，e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ea t8 5 。c ，u l t r a s o n i ct i m eo f5 m i n ， m a t e r i a l w a t e rr a t i oa s1 ：10k g k g t h ee x t r a c t i o nr a t i oo fp o l y s a c c h a r i d e u n d e ra b o v ec o n d i t i o nw a s4 2 57 t h eo p t i m u md e c o l o r i z a t i o nc o n d i t i o nt h r o u g hs i n g l ee f f e c tf a c t o r a n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t sw a sf o l l o w i n g ：a c t i v a t e dc a r b o nd o s a g eo f 2 ，t e m p e r a t u r ea t8 0 。( 2 ，t i m eo f5 0m i n ，p ho f3 5 t h et r a n s m i t t a n c e u n d e r a b o v ec o n d i t i o nw a s9 7 8 6 a f t e rp u r i f i c a t i o nb yt h ef i b e rm e m b r a n e ，t h et r a n s m i t t a n c eo ft h e d e c o l o r e ds o l u t i o nw a si n c r e a s e da n ds o m ep r o t e i n sw e r ea l s oe l i m i n a t e d m e a n w h i l e ，t h er e s u l t so fh p l cs h o w e dt h a tt h e r ew e r eg f 3 ，g f 4a n d g f 5 t h ey a c o nj u i c e ，p u r i f i e d b ym e m b r a n et r e a t m e n t ，w a sc l e a r ， t r a n s p a r e n ta n dw i t ht h ec o l o ro fl i g h ty e l l o w i th a dag o o dt a s t ea tt h e i n s u g a r - a c i dr a t i ob e t w e e n13 ：1 a n d15 ：1 a n dt h es t e r i l i z a t i o no ft h e p u r i f i e dj u i c ea t8 0 。c f o r3 0m i nc o u l dc o m eu pt ot h ed e m a n do ft h e c o m m e r c i a ls t e r i l i z a t i o n t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o nf r o my a c o np o m a c ea n d m o l a s s e sw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w e d ：f e r m e n t a t i o nt i m e2 0 h ，m o l a s s e s 8 ，i n c u l u m15 u n d e rt h e s eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ec o n t e n to ft h e p r o d u c t sw a s ，a s h9 4 6 ，f a t1 0 9 a n dp r o t e i n5 51 t h ep r o d u c t s w e r et oh a v eas p e c i a la r o m ao ff e r m e n t a t i o na n d s u g a r t h em e t h o df o rp r o t e i nf e e df r o my a c o np o m a n c ea n db r a na s m a t e r i a lt h r o u g hf e r m e n t a t i o nw i t hy e a s tw a ss t u d i e d t h ec o n d i t i o n so f f e r m e n t a t i o nw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w e d ：b r a n2 0 ，f e r m e n t a t i o nt i m e 4 8 h ，w a t e r6 0 ，i n o c u l u m 10 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n st h ep r o t e i n c o n t e n to fp r o d u c tw a s2 3 21 p r o t e i nf e e d r e q u i r e m e n t sc a nb e a c h i e v e d k e y w o r d s ：y a c o n ；f o s ；j u i c e ；f e e d i v 目录 摘! 耍i 第一章绪论1 1 1 雪莲果开发利用现状。1 1 2 低聚果糖的生理功能及生产应用。l 1 2 1 低聚果糖的生理功能2 1 2 2 低聚果糖的生产应用2 1 3 低聚果糖的纯化及检测方法一3 1 4 多糖提取分离纯化及分析鉴定。4 1 4 1 多糖的提取4 1 4 2 多糖的分离纯化4 1 4 3 多糖的分析鉴定5 1 5 果汁生产检测技术，生产现状及发展趋势。5 1 5 1 果汁的生产检测技术5 1 5 2 果汁业的现状及发展趋势6 1 6 饲料生产现状及发展趋势6 1 6 1 饲料业生产现状及发展趋势6 1 6 2 微生物发酵饲料现状2 5 1 6 1 7 本课题的主要研究内容与研究目的。7 1 7 1 研究内容7 1 7 2 研究目的：7 第二章雪莲果中低聚果糖提取工艺及其纯化的研究9 2 1 原料与方法。9 2 1 1 材料与试剂9 2 1 2 仪器与设备9 2 1 3 实验内容方法一l0 2 2 结果与讨论1 2 2 2 1 硫酸苯酚法测定总糖的标准曲线1 2 2 2 2 考马斯亮蓝测蛋白质标注曲线1 2 v 2 2 3 低聚果糖提取实验结果与分析1 3 2 2 4 提取液脱色实验结果与分析1 7 2 2 5 提取液的膜处理实验结果与分析一2 1 2 2 6 处理液的高效液相色谱仪实验结果与分析刚2 2 2 3 小结2 5 第三章雪莲果果汁生产工艺2 6 3 1 原料与方法2 6 3 1 1 材料与试剂2 6 3 1 2 仪器与设备2 6 3 1 3 实验方法2 7 3 2 结果与讨论2 8 3 2 1 热烫2 8 3 2 2 护色一2 9 3 2 3 超滤膜澄清3 0 3 2 4 果汁的包裹3 0 3 2 5 果汁调配31 3 2 6 杀菌一31 3 2 7 果汁质量评价3 2 3 3 小结3 2 第四章雪莲果果渣与甘蔗废糖蜜混合发酵饲料3 3 4 1 原料与方法3 4 4 1 1 材料与试剂3 4 4 1 2 仪器与设备3 4 4 1 3 实验方法3 4 4 2 结果与讨论3 5 4 2 1 糖蜜添加量对发酵效果的影响3 5 4 2 2 接种量对发酵效果的影响3 6 4 2 3 发酵时间对发酵效果的影响3 7 4 2 4 发酵的正交实验结果与分析3 7 4 2 5 发酵产物质量评价3 9 4 3 小结3 9 第五章雪莲果渣发酵蛋白饲料4 0 5 1 原料与方法4 0 5 1 1 材料与试剂4 0 5 1 2 仪器与设备4 0 5 1 3 实验方法4 l 5 2 结果与讨论4 2 5 2 1 麦麸添加量对发酵的影响4 2 5 2 2 发酵时间对发酵的影响4 2 5 2 3 水分含量对发酵的影响4 3 5 2 4 接种量对发酵的影响4 4 5 2 4 发酵的正交实验4 4 5 3 小结4 6 第六章结论与展望4 8 6 1 结论4 8 6 2 创新点4 9 6 3 研究展望4 9 参考文献51 霉贮谢5 4 攻读学位期间的研究成果5 5 i 广西大学蛹匮士掌位论文田蓬果顶u 墨果糖提取及资温i 化耳口用的初步研究 第一章绪论 雪莲果( s m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u s ) 又称亚贡原产于南美洲安第斯山，是土著印 第安人传统的根茎类食品。于2 0 0 4 年首次引入我国云南试种，现已在云南、福 建、海南、贵州、湖南、湖北、山东、河南、河北等地引种栽培成功n 1 。 雪莲果的根茎在食品、保健品、能源开发等方面具有广泛的用途。其含有丰 富的果寡糖、大量水溶性植物纤维、二十多种人体必需的氨基酸以及钙、铁、镁、 锌等矿质元素。其不含淀粉，属低热食品。能有效降低血糖和血脂，清理肠胃， 也具有清肝解毒，养颜美容的功效 2 - 4 1 。 1 1 雪莲果开发利用现状 目前雪莲果的开发利用还处于初级阶段，由于雪莲果水分含量大，不易贮藏、 运输，目前主要以鲜食为主。日本、美国和台湾等地把雪莲果的块茎加工成腌制 品、风干片、罐头、果冻、果糕和糖果等。 目前雪莲果的研究主要集中在栽培技术方面，近两年关于雪莲果中有效成分 提取的报道逐渐增加。加工工艺方面主要是做成果汁、混合果汁、果醋等饮料。 而雪莲果的综合利用方面的报道几乎没有。但是雪莲果因其特殊的功能特性受到 越来越广泛的重视，在食品、医药等领域具有广泛的用途。 雪莲果中的糖类主要是低聚果糖、蔗糖、果糖和葡萄糖等。含糖量占果实干 基的9 0 以上。低聚果糖含量是已知所有蔬菜水果中含量最高的，被成为“低聚 果糖之王 i s ) ，其含量占其果实干基的4 5 , 6 5 t 6 1 。 m c a z e t t a 等【7 】人发现采用雪莲果做为底物加入酵母，摇床培养后可以得到 高酶活的菊粉酶，这是非常具有前景的，可以提高雪莲果的经济价值。日本学者 正在研究从雪莲果中提取果糖，利用剩余残渣发酵生产乙醇。 1 2 低聚果糖的生理功能及生产应用 低聚果糖( f o s ) 又叫蔗果低聚糖，它是由蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖 广西大曹明甄士掌位美譬啊莲果低聚j l t - 糖提取刀门冬瀛刊绳i 用的初步习曙巴 组成的混合物。是由单糖经糖苷键连接而成的聚合糖，属于功能性多糖。被认为 是一种新一代的微生态保健食品，广泛应用于食品。 1 2 1 低聚果糖的生理功能 低聚果糖被称为双歧杆菌的增殖因子，是因为在人的胃和小肠内低聚果糖不 被消化而在大肠内被体内的双歧杆菌利用。 低聚果糖的生理功能主要有【8 - 9 ：( 1 ) 改善肠道内菌群平衡；可以促进人体 内双歧杆菌增殖，抑制有害菌和病源菌生长繁殖，缓解便秘和腹泻，维持肠道菌 群平衡，促进肠道内毒废物的排除。( 2 ) 提高机体免疫力，预防肿瘤，减少患 癌症的风险。( 3 ) 降低血液胆固醇和血脂浓度，有利于心脑血管疾病的防治。 ( 4 ) 促进食物中矿物质元素尤其是钙的吸收。( 5 ) 防龋齿；造成龋齿的链球菌 不能利用高纯低聚糖，且口腔酶液也不能分解高纯低聚糖。( 6 ) 低热量：低聚 糖在人体内很难或不被人体消化吸收。( 7 ) 合成维生素；双歧杆菌在肠道内能 够合成多种人体必需的维生素，例如维生素b 1 、维生素b 2 等。 1 2 2 低聚果糖的生产应用 1 2 2 1 低聚果糖的生产 目前低聚果糖大部分是用酶法合成的，天然提取的居少数。在工业上，低聚 果糖主要是通过微生物发酵产生的b 果糖基转移酶或b 呋喃果糖苷酶作用于 3 0 0 0 , , - 6 0 蔗糖溶液，进行分子内果糖苷转移反应生成的。还有一种方法是用菊 粉经菊粉酶部分水解作用生成。 蔗糖为原料生产的低聚果糖其组成大多是5 5 - 6 0 的低聚果糖，3 0 - - 3 5 的葡萄糖和1 0 - - 1 5 的剩余蔗糖，经过进一步加工处理可以得到含量大于 9 5 的液体糖浆，还可以制成颗粒和粉末。 1 2 2 2 低聚果糖的应用【1 0 1 1 】 低聚果糖已被欧盟批准为食品配料。功能性低聚糖是近二十年开始引起重视 并得到迅速发展的新型保健食品，在保健食品工业中稳定增长。在饲料、医药、 植保等方面也有很好的应用前景。目前主要应用如下：( 1 ) 乳制品：奶粉，冰 淇淋，酸奶等。可以促进营养物质吸收，调节肠胃，增强产品口感。( 2 ) 保健 2 叠f 囊；果顶订睦果糖提取反资i l r 黼j 用的初步研究 品：可以作为配料运用于补血，排毒养颜，润肠通便，减肥美容，调节血脂及糖 尿病等保健品中用来提升产品功效。( 3 ) 婴幼儿及中老年食品：可以缓解老年 人骨质疏松，延缓衰老，降低老年人得病机率；改善婴幼儿腹泻，促进营养物质 吸收。( 4 ) 饮料，功能性饮料及葡萄酒，果酒，作为配料添加到减肥茶，果汁 等饮料中。添加到酒中可以调节酒的口感；还可以作为饮料的甜味剂。( 5 ) 饲 料：添加到动物饲料中可以提高饲料转化率，促进动物生产性能和提高动物健康 水平。 1 3 低聚果糖的纯化及检测方法 目前低聚果糖分离纯化的方法主要有膜分离法，色谱分离法和微生物法三种 方法【1 2 - 1 6 1 。( 1 ) 膜分离法：这是目前国内生产高纯度低聚果糖的主要方法。主 要是采用纳滤膜，超滤提取低聚果糖也已见报道。( 2 ) 色谱分离法：利用某种 特性吸附载体可以将含量为5 5 的低聚果糖纯化到9 5 ，但是生产成本比较高。 目前以离子交换树脂为填料的色谱柱已成功用于工业化分离纯化。树脂流动床处 理设备也可以纯化出含量9 5 的低聚果糖，浪费少，可实现大规模连续化生产。 ( 3 ) 微生物法：发酵法和酶法。发酵法，利用筛选出的酵母分解低聚果糖中的 葡萄糖，再利用果糖转移酶分解剩余蔗糖，可以得到纯度较高的低聚果糖。酶法， 利用酶制剂除去部分某些组分来纯化低聚糖。因为酶价格高，提高了低聚糖分离 纯化的成本。发酵法，投资小成本相对低廉，具有发展前途。 目前低聚果糖的检测方法【1 7 - 1 9 1 主要有色谱法，物理法和化学法。( 1 ) 色谱 法：色谱法又包括高效液相色谱，气相色谱，离子色谱，薄层色谱和纸色谱。最 常规的分析法是高效液相色谱，它更为简单，快速准确。气相色谱，分析过程费 时，定量也比较困难。离子色谱，样品用量少，可以实现自动化但是分析时间长。 纸色谱和薄层色谱，精密度差，不能准确定量，分析时间长。( 2 ) 物理方法：密 度法，折光法和旋光法等( 3 ) 化学法：这是目前应用最广泛的一种常规方法， 有还原法和碘量法等。 3 雪莲果低聚果糖提取刀謦滠喇涮用的初步研究 1 4 多糖提取分离纯化及分析鉴定 目前低聚果糖大部分为微生物发酵得到，本实验采用提取的方法得到低聚果 糖，主要参考了多糖的提取分离纯化分析鉴定方法。 1 4 1 多糖的提取 目前多糖的提取方法有溶剂提取法，酶解法和物理强化提取方法。( 1 ) 溶 剂提取法：溶剂提取法又包括水提醇沉，酸提法，碱提法和超临界流体萃取法。 水提醇沉是目前多醣提取最常用的一种方法，生产工艺简单，成本低，安全适合 工业化大生产：但是提取率不高，提取比较费时，且容易把蛋白质等水溶物提取 出来，给以后的分离提纯带来困难。酸提法，可以得到纯度相对较高的提取物， 但是强酸易造成多糖中糖苷键断裂，所以一般采用稀酸提取且提取时间宜短温度 不超过5 0 ，研究证明羊栖菜多糖采用稀酸提取效果较佳【2 0 】。碱提法适合于提 取含有糖醛酸的多糖，不适合提取含硫酸基的酸性多糖；多用于粘多糖的提取 阱】；可以提高多糖收率，缩短提取时间但是提取液粘度较大，不利于分离纯化。 超临界流体萃取法也属于溶剂萃取，是近年来发展起来的一种新的提取分离技 术，最常用的萃取剂是二氧化碳，但是该法设备复杂，成本高，提取范围有限。 ( 2 ) 酶解法：酶解法又分为单一酶解法和复合酶解法；酶是生物催化剂，酶促 反应能降低反应体系的活化能，加速多糖的提取；最常用的酶有，蛋白酶，纤维 素酶和果胶酶等。( 3 ) 物理强化提取方法：物理强化提取方法有超滤法，超声 法，微波法和高压脉冲法；这些方法可以提高多糖的提取率，缩短提取时间，是 很好的多糖提取的方法。 1 4 2 多糖的分离纯化 传统的蛋白质的除去方法有s e v a g e 法，三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法。新 方法有酶法，z t c l + i 天然澄清剂法，还有反复冻融法。色素的除去方法有吸附 法，离子交换法，氧化法和金属络合物法等。小分子物质主要是通过透析法除去。 多糖的分离方法有分级沉淀法，色谱分离法和膜分离法等。( 1 ) 分级沉淀 法：利用多糖聚合度不同在乙醇中溶解度不同，用不同浓度的乙醇把不同聚合度 4 雪莲果低聚果糖提取及资滠化利用的初步研究 的多糖分级沉淀下来。( 2 ) 色谱分离法：色谱分离法主要有凝胶色谱和离子交 换色谱。凝胶色谱，方法简单快速但分辨率低，载样量少。离子交换色谱是根据 多糖上电荷的差异达到分离目的的。( 3 ) 膜分离法：超滤膜广泛应用于多糖的 分离，浓缩，纯化等研究中，微滤膜主要用于多糖液体的澄清和精制。 1 4 3 多糖的分析鉴定 经典的多糖含量测定的方法是硫酸苯酚法和硫酸葸酮法，还有一些其他的 含量测定的方法如电泳法，比色定量法，高效液相色谱法，离子交换色谱法等。 多糖组分测定的方法有高效液相色谱法，气相色谱法，薄层色谱法和高效毛 细管电泳法。多糖结构的测定方法有紫外光谱分析法，红外光谱分析法和核磁共 振分析法。 1 5 果汁生产检测技术，生产现状及发展趋势 1 5 1 果汁的生产检测技术 目前国内饮料主要有果汁果肉饮料，碳酸饮料，茶饮料和瓶装饮用水等几类。 一般生产果汁饮料的流程图为：原料分选，清洗一破碎取汁一混合调配一均质脱 气一预热一过滤一杀菌一灌装。由于新技术的采用，目前我国果汁生产技术得到 了很大的发展，主要体现在破碎，压榨，分离和过滤等设备的精细化 2 2 1 。 随着科学技术的发展果汁饮料检测技术出现了日新月异的变化。( 1 ) 果汁 含量的检测：目前国际上没有统一的果汁含量的检测方法，我国的国标中采用可 溶性固形物含量、氨基酸态氮含量等六项指标作为特征指标。目前检测果汁含量 的新型方法有 2 3 1 高效液相色谱法，气相色谱法，毛细管等速电泳法，超声波， 电子舌等。( 2 ) 糖：常见的检测方法有高锰酸钾滴定法，费林试剂法，折光法 和比重法。( 3 ) 酸：果汁中的酸分为无机酸和有机酸，总酸度一般采用碱滴定 的方法。( 4 ) 维生素：主要用滴定法，分光光度法，比色法及荧光法。( 5 ) 芳 香物质：主要用高效液相色谱，气相色谱和质谱法分析。( 6 ) 色素：主要用比 色法测定。 5 广西大掣墒页士擘啦论，文 雪莲果佃。睫果糖提取乃门棼源1 匕利用的初步研究 1 5 2 果汁业的现状及发展趋势 我国的果汁制品大体上被划分为果汁，浓缩果汁，果汁饮料，果浆，浓缩果 浆，果肉饮料，果粒果汁饮料，水果饮料和水果饮料浓浆等九类。 目前我国果汁饮料的现状是品牌众多，竞争激烈，新品与老品竞争，市场尚 待完善，上升空间较大。果汁产量持续快速增长，投资设备有较大提升，但加工 技术和产品标准相对落后，消费市场不够成熟。 我国果汁饮料市场将会呈现向纯天然和高果汁含量的方向发展。复合果汁及 复合果蔬汁市场空间比较大，功能型果汁饮料也将成为未来果汁饮料发展的亮 点，果汁奶饮料的发展潜力巨大。 1 6 饲料生产现状及发展趋势 1 6 1 饲料业生产现状及发展趋势 近几年我国饲料产量快速增长，质量稳步提高，饲料添加剂工业取得了长足 发展，饲料企业不断成长壮大。但是饲料谷物资源缺乏、能量饲料供应不足、蛋 白质饲料原料严重匮乏、技术开发落后、低质资源开发利用不多、能量饲料资源 开发不足等，是目前我国饲料资源开发存在的问题。 我国饲料行业将向着理想蛋白质饲料，环保饲料，无抗生素饲料的方向研究 和发展。充分利用现有饲料资源，加强开发非粮型饲料资源，开启新的饲料资源， 实现饲料资源的工业化生产是我国饲料工业可持续发展的必要措施幽】。 1 6 2 微生物发酵饲料现状口5 】 目前用于发酵饲料的微生物主要有酵母菌、细菌、担子菌和部分单细胞藻类。 生产的饲料种类有固态发酵饲料，蛋白饲料，饲用氨基酸、酶制剂、维生素等， 微生态制剂、益生素等。 目前微生物发酵饲料存在的主要问题有：菌种保存，产品标准，效果不稳定， 安全性等。但是微生物种类多开发潜力巨大，通过微生物发酵还可以减少环境污 染变废为宝，并且得到价格低廉的饲料产品。随着畜牧业的快速发展，人畜共粮 6 翻噶e 果低聚果糖提取及资源喇俑i 用的初步研究 的矛盾日益突出，随着研究的深入微生物发酵饲料在饲料工业中必将受到更大重 视。 1 7 本课题的主要研究内容与研究目的 1 7 1 研究内容 本课题主要研究雪莲果的综合利用问题，研究内容包括： ( 1 ) 雪莲果中低聚果糖提取纯化研究：用超声波辅助、用水作提取剂提取 雪莲果中的低聚果糖。以提取时间、提取料液比、超声时间、提取温度，四个因 素做单因素实验，在单因素实验确定的操作条件下应用正交实验确定了最佳提取 工艺条件。提取液采用活性炭脱色，以活性炭用量、脱色时间、脱色温度、脱色 p h 值四个因素做单因素实验，在单因素实验的操作条件下做正交实验，确定了 脱色的工艺条件。脱色后超滤膜过滤，用高效液相色谱仪检测所得低聚糖。 ( 2 ) 雪莲果果汁生产的工艺条件研究：实验采用热烫处理，研究了热烫时 间和热烫温度。添加柠檬酸护色，实验确定了柠檬酸用量。果汁采用超滤膜过滤 澄清。澄清后用b 环糊精包裹不良气味。包裹后调配，确定果汁的糖酸比。实 验确定了杀菌时间和杀菌温度。 ( 3 ) 雪莲果废渣与废糖蜜混合发酵生产饲料的工艺条件研究：用雪莲果的 废渣和蔗糖废蜜混合发酵生产饲料。以废糖蜜添加量、接种量、发酵时间三个因 素，通过单因素实验和正交实验确定发酵条件。 ( 4 ) 雪莲果渣与麦麸混合发酵生产蛋白饲料工艺条件研究：以麦麸添加量、 发酵时间、水分含量、接种量四个因素，通过单因素实验和正交实验确定发酵的 工艺条件。 1 7 2 研究目的 本课题主要是研究雪莲果的资源化利用问题，通过实验确定雪莲果资源化利 用所需的工艺参数，为雪莲果资源的充分利用提供理论依据。 ( 1 ) 通过实验确定雪莲果中低聚果糖的提取，脱色工艺条件。 ( 2 ) 确定雪莲果果汁的生产工艺条件。 7 雪莲果佃。民- ，r - m 提取及资蔼“匕利用的初步研究 ( 3 ) 确定雪莲果果渣和甘蔗废糖蜜混合发酵饲料的发酵工艺条件。 ( 4 ) 确定雪莲果渣发酵蛋白饲料的工艺条件。 3 霉莲果低聚果糖提取及资溺【啊绳i 用的初步研究 第二章雪莲果中低聚果糖提取工艺及其纯化的研究 多糖的提取方法有溶剂法、生物法和强化提取方法。溶剂法最常用的溶剂是 水，水安全、无毒、成本相对低廉，适合工业化大生产，低聚果糖在水中有很好 的溶解性，因此本实验采用水作为提取溶剂。 提取最常用的物理强化方法有超声波法和微波法。超声波技术是利用超声波 的机械效应、空化效应和热效应。超声波作用于植物细胞壁，能有效地打破细胞 边界层，使扩散速度增加，促进固体物料中有效成分的溶出，可显著地提高提取 效率1 2 6 - 2 7 1 。由于超声波的热效应是瞬间的所以可以使被提取成分的生物活性尽量 保持不变。微波技术是利用微波能使细胞内部温度快速上升，由于温度上升而使 压力增大，从而使细胞破裂，内部有效成分流出。但是利用微波有时会造成提取 物的组分更加复杂，分离困难。 本研究采用超声波辅助提取法对雪莲果中低聚果糖进行提取，通过单因素和 正交实验分析确定了雪莲果中低聚果糖超声波辅助提取法的较佳工艺条件，并 且，采用活性炭脱色和膜过滤纯化雪莲果多糖，采用高效液相色谱法检验所得提 取液。 2 1 原料与方法 2 1 1 材料与试剂 雪莲果购于南宁水果批发市场： 乙腈( 色谱纯，f i s h e r 公司) ，考马斯亮蓝( 生化试剂，国药集团化学试 剂有限公司) ，硫酸、苯酚和活性炭等均为分析纯试剂：蔗果三糖、蔗果四糖、蔗 果五糖为标准品。 2 1 2 仪器与设备 w a t e r s 6 0 0 高效液相色谱仪( 美国) ，中空纤维膜( 美国通用电气公司) ， 9 童莲果低聚果糖期l 取及资源喇绳i 用的初步研究 b 3 5 0 0 s 。m t 超声波清洗仪( 必能信超声有限公司) ，u v 2 0 5 1 p c 紫外可见分光 光度计( 日本岛津公司) ，电子天平( 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司) ， 5 0 1 a 型超级恒温器( i - - 海实验仪器厂有限公司) 及p h 计( 上海精密科学仪器 有限公司) 2 1 3 实验内容方法 2 1 3 1 实验流程 超声波辅助提取流程：新鲜的雪莲果去皮一打汁一按料液比称重一超声辅助 提取一保温提取一离心分离一收集上清液( 测定多糖含量，从而确定提取工艺条 件) 一脱色一过滤一收集滤液( 测定透光率，从而确定脱色条件) 一中空纤维膜 一高效液相色谱仪。 传统提取流程：新鲜的雪莲果去皮一打汁一按料液比称重一保温提取一离心 分离一收集上清液( 测定多糖含量) 。 在超声波辅助提取单因素实验确定的基础操作条件下比较超声波辅助提取 法和传统提取方法，以多糖提取率为考察对象。 2 1 3 2 硫酸苯酚法测总糖标准曲线绘制 精确称取1 0 5 c 下干燥至恒重的标准葡萄糖5 0 m g ，用蒸馏水定容至5 0 0 m l ， 得浓度为1 0 0m g m l 的葡萄糖标准溶液。分别吸取o 、0 2 、0 4 、0 6 、1 0 、1 4 、 1 8 m l 葡萄糖标准溶液，补加蒸馏水至2 0 m l ，加入6 的苯酚溶液l m l ，混合 后迅速加入5 m l 浓硫酸混匀，室温静置2 0 m i n ，在波长4 9 0 n m 处测定吸光度。 空白以蒸馏水代替糖液。以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2 1 3 3 蛋白质测定标准曲线绘制 染色液的配制：精确称取1 0 0 m g 考马斯亮蓝g 2 5 0 溶于5 0 m l 浓度为9 5 的 乙醇溶液中，加入8 5 的磷酸溶液1 0 0 m l ，然后用超纯水定容至1 0 0 0 m l 。 分别吸取0 、0 2 、0 4 、0 6 、0 8 、1 0 m l 标准蛋白溶液( 准确称取牛血清蛋白 5 0 0 0 m g ，用超纯水溶解，定容至5 0 m l ) ，补加超纯水至1 0 0 m l ，加入5 m l 染 色液，立即混匀，室温放置2 m i n ，在波长5 9 5 n m 处测定吸光度。以蛋白质含量 为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2 1 3 4 低聚果糖的提取 1 0 雪莲果低聚果糖提取及资源化利用的初步研究 应用超声波辅助水提的方法，采用单因素实验和正交实验，考察提取时间、 料液比、超声时间、提取温度对多糖提取的影响。用苯酚硫酸比色法田1 测定提 取液中多糖含量，计算多糖提取率作为选取最优提取条件的依据。 单因素实验的基础操作条件为：提取时间2 h ，料液比1 ：1 0 k g k g ，超声时 间1 0 m i n ，提取温度8 0 ( 2 。在其他三个条件不变的情况下，改变其中一个条件进 行单因素实验研究。 在单因素实验的基础操作条件下，做三次平行实验比较传统方法与超声辅助 提取方法。以多糖含量为考察目标。 2 1 3 5 低聚果糖的纯化 由于所得提取液中蛋白质含量很低，且其它杂质较少，故纯化实验中只考虑 了提取液的脱色和超滤膜纯化。 2 1 3 5 1 提取液的脱色 选用活性炭作为脱色剂，采用单因素实验和正交实验，考察活性炭用量、脱 色时间、脱色温度、p h 值对多糖脱色效果的影响。用紫外分光光度计测透光率 作为选取最优脱色方法的依据。 低聚果糖在高温和低p h 值条件下容易分解，因此，单因素试验的基础操作 条件为：活性炭用量2 ，脱色时间4 0 m i n ，脱色温度2 50 c ，p h 值5 0 。在其他 三个条件不变的情况下，改变其中一个条件进行单因素实验研究。 2 1 3 5 2 提取液的膜处理 根据实验条件提取液通过分子量为5 0 0 0 的中空纤维膜，考察膜通量和膜两 端的压力。测定糖含量、透光率。 2 1 3 6 高效液相色谱分析【2 9 】 色谱柱：h y p e r s i ln h 2 分析柱( 4 6 m m x 2 5 0 m m ，5 i n n ) ；流动相：乙腈：水= 7 5 ：2 5 ；流速：l 此r a i n ；柱温为室温；进样量：1 0 9 l ；e l s d 的漂移管温度：1 0 0 ；氮气作载气，流速2 5l m i n 。检测器：蒸发光散射检测器( e l s d 2 0 0 0 ，美国 砧l t e c h 公司) 。用标准色谱图与提取液色谱图相比较，以及加标确认实验初步 判定提取液中的低聚果糖成分。由标准品峰面积与浓度的线性回归标准曲线，精 密度实验，确定提取液中低聚果糖占多糖的比例。 雪莲果低聚果糖提取及资灞t 喇缌i 用的初步习阻宅 2 2 结果与讨论 2 2 1 硫酸苯酚法测定总糖的标准曲线 o1 02 03 04 06 06 0 7 08 09 01 0 0 c o n c e n to f g l u c o s e m z m l 图2 1 硫酸苯酚法测总糖标准曲线 f k2 - 1s t a n d a r dc u ef o rp h e n o ls u l f u r i ca c i dt e s tt o t a ls u g s t r 硫酸苯酚法测定总糖标准曲线如图2 一l 所示，根据实验结果计算回归方程。 得回归方程为：y = 0 0 1 5 9 x + 0 0 1 5 7 ( r 2 = 0 9 9 8 2 ) 。其中葡萄糖含量y ，吸光度x 。 2 2 2 考马斯亮蓝测蛋白质标注曲线 图2 - 2 蛋白质标准曲线 f i g2 - 2 s t a n d a r dc u r ef o rd e t e r m i n a t i o no f p r o t e i n 如图2 2 所示，根据实验结果计算得到回归方程为：y = 0 0 0 4 3 x + 0 0 2 3 5 。相 关系数r 2 ：o 9 9 9 4 ，其中y 为蛋白质含量，x 为5 9 5 n m 波长下的吸光度值。 1 2 广西大掌硕士掌位黉叼起曩f 蓬果砸订露果糖提取及资嗣e 喇豫i 用的初步习柏；巴 2 2 3 低聚果糖提取实验结果与分析 2 2 3 1 提取时间对提取率的影响 提取时间对提取率的影响如图2 3 所示。可以看出，随着提取时间的增加， 提取率呈现增加的趋势。2 h 到3 h 之间提取率增加趋势减缓，从经济方面考虑选 取提取时间为3 h 。 4 1 4 4 述3 9 5 萎 3 9 g 3 8 5 趸 3 8 丑 圣3 衢 3 7 3 6 5 3 6 uu al 1 az z 4jj a t i m e h 图2 - 3 提取时间对提取的影响 f i g2 - 3 e f f e c t so fe x t r a c t i o nt i m eo ne x t r a c t i o nr a t e 2 2 3 2 料液比对提取率的影响 对提取率的影响如图2 4 所示。可以看出，随着料液比的增大，提取率呈增 加趋势。料液比1 ：1 2 后增加幅度减小，这是因为料液比1 ：1 2 时大部分的糖已 经能溶出。故从提取效果，减少溶剂用量和降低浓缩负荷等方面综合考虑，用量 不宜过大，选取料液比为l ：1 2 较合适。 l i q u i dr a t i o 图2 - 4 料液比对提取的影响 f i g2 - 4e f f e c t so ff l u i d sm a t e r i a l sr a t i o no i le x t r a c t i o nr a t e 1 3 述鲁霜尝葺互宣日函 雪莲果低聚果糖提取及资萄e 化利用的初步研究 2 2 3 3 超声时间对提取率的影响 超声时间对提取率的影响如图2 5 所示。可以看出，超声时间在5 1 0 m i n 之 间，随着时间的逐渐增加，提取率是逐渐增大的，这是由于随着时间的增加，对 细胞壁的破碎作用逐渐增强，因而有利于多糖的溶出。l o m i n 后，随着时间的增 加，多糖提取率逐渐减少，主要是由于杂质的大量溶出，阻碍了多糖分子向溶剂 中的扩散。因此选l o m i n 作为提取时间为宜。 图2 - 5 超声时间对提取的影响 f i g2 - 5 e f f e c t so fu l t r a s o n i ct i m e0 1 1e x t r a c t i o nr a t e 2 2 3 4 提取温度对提取率的影响 提取温度对提取率的影响如图2 - 6 所示。可以看出，在8 0 c 之前随着温度的 提高提取率是逐渐增大的，温度超过8 0 c 以后，提取率是下降的，这主要是因 为温度太高而引起多糖分解造成的。同时，温度过高增加能耗。综合各方面因素 考虑，提取温度以8 0 左右为宜。