（制糖工程专业论文）双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究.pdf

双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 摘要 本文以广西横县双孢蘑菇为原料，对双孢蘑菇多糖、多酚的提取、分离 纯化、以及消臭活性等方面进行了研究，得到如下结论： 1 采用热水浸提鲜双孢蘑菇的水溶性多糖，最佳条件为：温度1 0 0 、 时间4 h 、加水量5 倍，得糖率3 1 8 。 2 多糖经过乙醇醇析、脱蛋白、脱色素后上d e a e s e p h a d e xa - 5 0 ( c i - ) ， 凝胶柱用1 m 0 1 l 。的n a c i 在0 5 m l m i n 4 流速下洗脱得洗脱峰p e a k l 、p e a k 2 。 p e a k 2 上葡聚糖凝胶s e p h a d e xg - 1 0 0 柱，以去离子水0 5 m l m i n 1 的流速洗 脱得单一正态峰的纯品，且测得分子量约为9 7 5 4 4 。 3 采用7 0 丙酮提取、正丁醇萃取、h p - 2 0 柱层析，得7 0 乙醇洗脱的 多酚纯度为6 3 6 9 。 4 纯度为7 8 3 的多糖及纯度为6 4 ，1 的多酚对龈卟啉单孢菌、中间 普雷沃菌、具核梭杆菌的m l c 分别为6 0 、3 0 、2 0 m g m l ；2 5 、3 5 、2m g m l ， 但抑菌效果不如合成药物。 5 多糖、多酚对鸡肝腐败氨氮在1 2 h 内消除作用不显著，2 4 h 后消除作 用显著增强；在相同浓度下多酚消除氨氯的效果强于多糖的消除效果；随 着浓度的增加消除效果增强，温度的升高消除效果降低。 6 多糖对氨气、三甲胺、吲哚具有吸附作用，随着浓度增加，消臭速率 i 加快，而温度的增加却不利于吸附；多酚对氨气、三甲胺、吲哚具有消除 作用，且其消臭是多酚中的- o h 与臭味物质发生了化学反应。 关键词：双孢蘑菇多糖多酚抑菌消臭 d e o d o rlz e se f f e c tiv ec o m p o n e n to fa g a rfc u sbis p o r u s e x t r a c tio n 、s e p a r a tio na n dd e o d o riz a tio nr e s e a r c h a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nw a ss t u d i e do na g a r i c u sb i s p o r u ss o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e s a n dp o l y p h e n o l s ，w h i c he x t r a c t e da n di s o l a t e df r o ma g a r i c u sb i s p o r u s t h e d e o d o r i z a t i o nc t i v i t i e so f t h ep o l y s a c c h a r i d ea n dp o l y p h e n o li nv i t r ow a ss t u d i e d t h er e s u l ta sf o l l o w i n g ： 1 s o l u b l ep o l y s a c e h a r i d e so f a g a r i c u sb i s p o r u sw e r ee x t r a c t e db yh o tw a t e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r e ：t h et e m p e r a t u r e1 0 0 。c ，e x t r a c t i o nt i m e4h o u r s ， a d d i n g5t i m e so f w a t e r , t h ey i e l dw a s3 1 8 2 t h ep o l y s a c c h a r i d ew a ss e p a r a t e dw i t hd e a e s e p h a d e xa 一5 0 ( c 1 。) a f t e r e x t r a c t e db ye t h a n o l ，d o f f e dp r o t e i na n dd o f f e dp i g m e n t ，w h i l eu s e dl m 0 1 l 1 n a c lw a s h i n gu n d e r0 5 m l m i n 1v e l o c i t yo ff l o w t h er e s o u l ts h o w e dt h a tt w o p e a k sc o u l db eo b t a i n e d ：p e a k l 、p e a k 2 p e a k 2w a ss e p a r a t e dw i t hs e p h a d e x g 1 0 0 ，w h i l eu s e dn o n h y d r o n i u mw a t e rw a s h i n gu n d e r0 5 m l m i n 1v e l o c i t yo f f l o w , g o tap u r es a m p l ew i t ha l ls i n g l en o r m a lp e a k ，a n dm e a s u r e di t sm o l e c u l a r w e i g h tw a sa b o u t9 7 5 4 4 3 a g a f i c u sb i s p o r u s w e r ee x t r a c t e d b y 7 0 a c e t o n en - b u t a n o l 、 c h r o m a t o g r a p h y e db yh p 一2 0 p o l y p h e n o lp u r i t y w a s6 3 6 9 ，w h i c hw a s h e d i l l b y7 0 e t h a n 0 1 4 t h em i co f t h ep o l y s a c c h a r i d ew h o s ep u r i t yw a s7 8 3 a n dt h ep o l y p h e n o l w h o s ep u r i t yw a s6 4 1 t op g i n g i v a l i s 、p i n t e r m e d i a 、f n e c l e a t u mw e r e 6 0 、 3 0 、2 0m g m l a n d2 5 、3 5 、2m g m l 一b u tt h ea n t i b a c t e r i a la c t i o n i sw e r en o t a sg o o da sp a t e n tm e d i c i n e 5 t h ee l i m i n a t i n ga c t i o no fp o l y s a c c h a r i d ea n dp o l y p h e n o lt oc h i c k e nl i v e r c o r r u p t i o nw a si n c o n s p i c u o u si n1 2 h ，a n de n h a n c e dr e m a r k a b l ya f t e r2 4 h ；i nt h e s s n ec o n c e n t r a t i o n ，t h ed i m i n a t i o ne f f e c to f p o l y p h e n o lw a ss t r o n g e rt h a nt h e p o l y s a c c h a r i d e ；t h e e l i m i n a t i o ne f f e c te n h a n c e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n i n c r e a s i n ga n dd e p r e s s e dw i t ht h et e m p e r a t u r er i s i n g 6 t h ep o l y s a c c h a r i d ec o u l da d s o r b s n h 3 ，t m aa n di n d o l e ，w h e nt h e c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d ，t h ev e l o c i t yo fr e m o v i n go d o re x p e d i t e d ，w h e r e a st h e i n c r e a s i n go ft h e r m a lw a sa d v e r s et oa d s o r p t i o n ；t h ep o l y p h e n o lp o s s e s s e d e l i m i n a t i o nt on h 3 ，t m aa n di n d o l e ，e v e nt h ea c t i o no f r e m o v i n go d o rw a st h e - o hi nt h ep o l y p h e n o lo c c u r r i n gc h e m i c a lr e a c t i o nw i t ht h es m e l ts u b s t a n c e k e y w o r d s ：a g a f i c u sb i s p o r u s ，p o l y s a c c h a r i d e ，p o l y p h e n o l ，a n t i b a c t e r i a l ， i v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：zu 、新 学位论文使用授权说明 缸咬年6 其b 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 一略、3 、善p 躲译。严多月；日 广西大学硕士学位论文双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 第一章绪论 多糖又称多聚糖( p o l y s a c c h a r i d e ) ，由单糖聚合而成，是聚合度大于1 0 的极性复杂 大分子，分子量一般为数万，数十万到数百万，也有报道甚至达上千万，是构成生命活 动的4 大基本物质之一，并与维持生命所需的多种生理功能密切相关。研究发现糖类化 合物特别是糖复合物上的糖链参与了各种生命现象的调节，如细胞识别、粘连与融合、 信号传达、免疫与应答、细胞转化和分化都离不开糖链的参与。由于糖复合物的种种功 效，其研究也成为生命科学研究领域的新前沿。 多酚又称为单宁或鞣质，是由没食子酸( 或其聚合物) 的葡萄糖( 及其多元醇) 酯， 黄烷醇及其衍生物的聚合物以及两者的混合共同组成的多元酚。在日本有人将其称之为 继第六营养素膳食纤维之后的第七营养素。多酚具有抗氧化、消除自由基、抑菌作用等 多种活性，随着天然产物开发利用的逐渐兴起，多酚作为一种源于绿色植物的生物质材 料逐渐成为研究的热点，并在相关领域应用中发挥着不可替代的作用。 1 1 双孢蘑菇的组成及其活性研究概述 1 i 1 双孢蘑菇资源 双孢蘑菇( a g a r i c u sb i s p o r u s ) 别名蘑菇、洋蘑菇、白蘑菇，在分类上隶属担子菌 纲、伞菌目、伞菌科、伞菌属。欧美各国生产经营者常称之为普通栽培蘑菇( c o n l n o n c u l t i v a t e dm u s h r o o m ) 或纽扣蘑菇( b u t t o nm u s h r o o m ) ，日本人称之为 5 肛厶或西 洋松茸。它是目前全球唯一栽培的食用菌，其产量占实用菌总产量的5 0 。 双孢蘑菇营养丰富，味道鲜美，色白质嫩，子实体含多糖，高蛋白质，氨基酸。其 性良，味甘苦，又开胃理气、解毒化淤、止吐、止泻、清神护肝等功效，常食可增食欲、 防止感冒、清热生津、和中润肠、食一种受世界各国人民喜爱的“健康食品”，具有很 好的保健功能“1 。 双孢蘑菇广泛分布于欧洲、北美、亚洲的温带双孢蘑菇广泛分布于欧洲、北美、亚 洲的温带地区，中国的华南、华东、华中、东北、西北等地均有分布。双孢蘑菇依菌盖 广西大学硕士学位论文 双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 颜色可分为白色种( 又称夏威夷种) 、奶油色种( 又称哥伦比亚种) 和棕色种( 又称波希米 亚种) 。三者在栽培习性、生产性能、产品品质上均有不同，其中以白色种栽培最为广 泛。 双孢蘑菇喜生长在粪草发酵料上，栽培始于法国。1 6 0 5 年法国农学家坎坦西( l a o u i n t i n i c ) 在草堆上栽培出了白蘑菇。1 9 世纪初叶，又有人在地窖和洞穴种菇成功。1 9 0 2 年达格尔( b m d u g g a r ) 用组织培养法制作纯菌种获得成功，使双孢蘑菇的生产进入了人 工栽培的新阶段。中国的双孢蘑菇栽培，1 9 3 5 年始于上海，以后陆续推广到江苏、浙江、 福建等地。台湾省在5 0 年代初开始试验性栽培。6 0 年代发展成为世界主要产地之一。 第二次世界大战以后，双孢蘑菇的生产发展十分迅速，1 9 6 0 年世界年产量为1 3 6 万吨， 1 9 8 6 年已逾1 2 0 万吨。主要生产国有美国、中国、法国、英国、荷兰等，其中中国发展 迅速，8 0 年代中期的年产量( 不包括台湾省) 已逾1 5 万吨，2 0 0 5 年我国双孢蘑菇出口总 量占食用菌的4 0 ，出口超过2 亿美元。 1 1 2 双孢菇的组成及药理活性 表卜1 双孢蘑菇营养成分跚( 1 0 0 9 干重中所含克黝 垡! ：! 邕型塑! ! 受i 堕! ! 垒型! ! ! 监竺 项目蛋白质脂肪糖膳食纤维 v b ：v b 。钙c a铁f e锌z n 含量 5 5 31 31 5 81 9 73 5 5 4 2 10 0 9 7o 2 6 80 0 2 8 注：v b 2 、v 为1 0 0 9 干重中所含克数的毫克数 双孢蘑菇的主要营养成分如表卜1 ，此外还含有1 7 中氨基酸( 其中8 种氨基酸为人 体必须) 、核苷酸、维生素b 1 、烟酸、维生素c 、维生素p p 、维生素d 等多种维生素及 酶类。 1 9 6 7 年阿克兰对双孢蘑菇抗病毒物质进行了研究，首次发现这是一种能被核糖核酸 酶解体的双链核糖核酸，能刺激机体产生干扰素，抑制流感病毒的增殖。1 ：常海兰等报 道双孢蘑菇多糖具有抗氧化、增强免疫力等功效“1 ；双孢蘑菇多糖还具有具有抗癌、抑 制肿瘤细胞、降低胆固醇、医治迁延性肝炎慢性肝炎、肝肿大、早期肝硬变均有显著疗 效”。此外，双孢蘑菇所含的酪氨酶有明显降低血压作用。 2 广西大学硕士学位论文双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 1 2 真菌多糖及植物多酚的研究概述 1 2 1 蕾类多糖的概述 目前已从天然产物中分离3 0 0 0 余种多糖类化合物，具有一定功能性的天然多糖按 照来源可以大致分为五类，见表1 2 ： 表卜2 多糖资源的分类嘲 t a b1 - 2c l a s s i f i c a t i o no f p o l y s a cc h a r i t i e sr e s o u r s e s 多糖分类概况 植物多糖同重要的研发相结合，目前主要再亚洲国家研究较多，如南瓜多糖、茶 叶多糖、西洋生多糖、大枣多糖等。 藻类多糖研究应用较深入的藻类多糖主要有海藻胶( 主要包括褐藻胶、琼胶、卡 拉胶) 、螺旋藻多糖、褐藻多糖硫酸脂，海带多糖，紫菜多糖等。 真菌多糖真菌多糖是我国天然药物资源和中草药的一个极为重要的组成部分，日 本已有数种多糖应用于临床，我国研究比较清楚的有香菇多糖、灵芝多 糖等少数几种。 动物多糖主要来源于多种哺乳动物的多糖，主要具有抗凝血生物活性，已经应用 于临床。 细菌多糖肺炎球菌荚膜多糖、脑膜炎球菌荚膜多糖、流感杆菌荚膜多糖等，这一 类多糖主要是作为疫苗研究。 菌物中子实体大型的一类真菌泛指广义上的m u s h r o o m 或m a c r o f u n g i ，即蘑菇或蕈 菌，这是长期以来国内外在资源应用方面十分感兴趣的一类菌物。从“目”来讲，大型 真菌主要集中于担子菌类伞菌目( a g a r i c a l e s ) ，占总数的7 0 以上，其次是非褶菌目， 其他为木耳目、银耳目、花耳目、鬼笔目等。中国目前已知的各类大型真菌估计有3 8 0 0 以上，其中伞菌类1 6 0 0 种，多孔类1 3 0 0 种，腹菌类3 0 0 种，木耳和银耳胶质菌类1 0 0 余种， 大型子囊菌类4 0 0 多种。 很多真菌不仅含有丰富的蛋白质、维生素、氨基酸、矿物质等，还含有化学结构 新颖、生物活性独特的化学成分。目前，真菌除被大量用作工业原料、肥料和饲料之外， 它的保健价值和药用价值越来越引起人们的关注。研究结果表明，不少食用真菌具有防 治胆结石、便秘，肠胃病等，以及防癌抗癌、增强人体免疫力，降低血脂、预防动脉 广西大学硕士学位论文 双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 硬化和血栓的形成、降低血糖等药用功效。多糖在真菌中含量丰富，约占干重5 0 以上， 是真菌多糖药物开发的重要资源。2 0 世纪6 0 年代以后，人们又逐渐发现真菌多糖具有多 方面的生物活性，如抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、活血化癖、抗衰老、保护机体细胞 等，且多数无毒，在开发真菌药物方面有较大的潜力。 我国现己开发利用的经济真菌主要有香菇、灵芝、云芝、木耳、银耳、金耳、草菇、 金针菇、猴头菌、竹荪、茯苓、雷丸、紫芝、虫草等。 1 2 2 檀物多酚的研究概述 植物多酚( p l a n tp o l y p h e n o l s ) 是一大类广泛存在于植物体内的复杂多元酚类化合 物。狭义地看，可以认为植物多酚指的是单宁( t a n n i n s ) 或蹂质，其分子5 0 0 3 0 0 0 之间； 广义地看，它还包括了小分子酚类化合物，如花青素、儿茶素、栋精、没食子酸、靴花 酸、熊果昔等天然酚类。 许多植物、水果及真菌如茶叶、葡萄、苹果、柑橘、樱桃、桃、李、杏、醋栗、双 孢蘑菇等都含有一定量的多酚物质( b r a v e ，1 9 9 8 ) 。这些多酚物质大体上可分为简单酚 类、酚酸类、经基肉桂酸类和黄酮类化合物等。其中，简单酚类物质含量较少，主要包 括儿茶酚、对苯二酚、间苯二酚等。 植物多酚的技术发展与栲胶的生产发展具有相同的历史早期的植物多酚发展史就 是栲胶的发展史，远古时代人们将之应用于鞣革、治病和染色等方面，近代则大量用于医 药、食品、日用化工等行业。此外，在石油开采、木材加工，采矿，水处理、金属防腐 等方面也进行了大量的研究和充分的利用。 f r e u d e n b e r g 按单宁的化学结构特征将其分为水解单宁( h y d r o l y s a b l et a n n i n s ) 和 缩合单宁( c o n d e n s e dt a n n i n s ) 两大类睁”1 。水解单宁主要是聚酸酯类多酚，即酸及其 衍生物与多元醇以酯键连接而成，可细分为酸单宁和鞣花单宁两类；缩合单宁主要是聚 黄烷醇类多酚或原花色素，即羟基黄烷醇类单体的组合物，单体间以c c 键相连。 4 广西大学硕士学位论文双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 黄烷醇类酸酯类 石碧“”等通过对近3 0 年来c a 相关文献资料的统计，结果得出多酚研究论文数量呈线 性增长的趋势。其提取技术由传统的溶剂法、沉淀法逐渐转向运用更高效、更安全的新 的仪器法、色谱、超l 临界流体萃取等。应用的方向从传统的制革工业领域扩展到了食品、 药理、营养、生化、日化、植保、功能高分子材料等多个领域。目前，植物多酚的研究 方向也有明显改变。以前人们研究多酚化学主要以结构测定为主，多酚生理活性方面的 研究很少。如今，关于植物多酚生理活性方面的研究己大大增加，且多酚化学的研究也 转为以性质研究为主。 目前开发利用的植物多酚有茶多酚、苹果多酚、柿单宁、谷物丹宁、海藻多酚、蘑 菇酪氨酸等。 1 3 真菌多糖及植物多酚的相关活性研究进展 1 3 i 真菌多糖的相关活性研究进展 ( 1 ) 抗病毒作用 多糖通过增强宿主免疫机制可以抵抗细菌、病毒、寄生虫的侵袭，因而具有广泛的 免疫调节作用。香菇多糖对泡状口炎病毒感染引起的小鼠脑膜炎有显著疗效和预防作 用，对阿伯耳氏病毒和十二腺型病毒感染也有效；带肽残基的云芝硫酸酯化多糖抗h i v ， 其活性与s o 。基的量成明显比例关系；香菇多糖、灵芝多糖等对抗慢性肝炎也有显著疗 效“”；杏鲍菇多糖对i 型单纯疱疹病毒具有很强的抑制活性“。 ( 2 ) 抗肿瘤作用 从细菌、真菌、酵母、地衣和高等植物、海洋植物中提取的多糖均具有抗肿瘤活性。 徐朝晖“”等证实双孢蘑菇多糖不仅能抑制小鼠s - 1 8 0 实体肿瘤的生长而且能干挠体外培 广西大学硕士学位论文 双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 养的人干癌s 删c 一7 2 2 1 细胞的增值，具有较好的抗肿瘤活性；从茯苓菌核中提取的b 一 茯苓聚糖经化学转化成羧甲基茯苓多糖可提高小鼠单核巨噬细胞功能，可促进n k 细胞 的免疫活性和抑制肿瘤疗效“”。 ( 3 ) 抗氧化延缓衰老作用 体内m d a 、l p f 的多少，体现了氧自由基对机体脂质氧化的过程o ”。田金强“7 1 等证 实灌喂阿魏菇多糖能提高小鼠体内g s h - p x 和s o d 活性，从而可以清楚过量的自由基， 降低m d a 含量，起到延缓衰老的作用；h u i - n az h a n g “”发现灵芝多糖、b u mc h u nl e e “” 证实灰树花多糖、f l i u u 0 1 证实六种多糖具有清除自由基的作用。 ( 4 ) 免疫调节作用 已发现许多真菌多糖具有清除自由基，提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的活 性，起到保护生物膜和延缓衰老的作用。从长白山野生云芝中提取的彩云多糖，给予荷 瘤或受y 射线全身照射的小鼠，能使多种脏器和细胞内s o d 活力升高，脂质过氧化水平 下降。“；e s r 研究表明，彩云多糖在黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶体系具有直接清楚r o s 的作用。 从另一种来源的真菌云芝得到的连接蛋白的多糖对巨噬细胞氧化修饰后g s h p x 活力降 低和l p o 生成增多有很好的抑制作用，能使这些指标恢复到接近正常“。 ( 5 ) 降血糖血脂作用 现已发现发现具有降血糖的真菌多糖有灵芝多糖、虫草多糖、云芝多糖、银耳多糖、 毛木耳多糖、猴头菌多糖和木耳多糖。h i k i n o ”等发现从灵芝子实体中分离得到两种具 有降血糖的活性多糖g a n o d e r a na 和g a n o d e r a nb ，对正常小鼠及四氧嘧啶诱发的高血 糖小鼠都具有明显降糖活性。拟肝素能促进脂蛋白脂肪酶的释放，使血液中的大分子释 放脂质分解成小分子，故对因血脂过多引起的血清混浊有澄清作用，也能明显降低胆固 醇。研究发现，银耳可降低高胆固醇血症小鼠血清含量，并随计量加大而增强。香菇多 糖可促进胆固醇代谢而降低其在血清中的含量。 ( 6 ) 真菌多糖的其它作用 真菌多糖除了以上生物活性，还具有抗辐射、抗毒物损伤、抗水肿、抗疲劳、祛痰 镇核、促进核酸和蛋白质的生物合成，修复损伤的组织细胞等多种功效嘲。杨明。”研究 发现树舌多糖对大鼠胃溃疡有明显保护作用。高雁”1 等证实灵芝一松茸功能饮料具有增 强机体耐缺氧，抗疲劳的作用与真菌多糖含量有关。 6 广西大学硕士学位论文 双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 1 3 2 檀物多酚的相关活性研究进展 ( 1 ) 抗动脉硬化，心血管病及消炎、抗过敏和抗病毒作用 k n e k tp 跏等报道说多酚物质能抑制血小板的聚集和粘连，具有抑制脂新陈代谢中 的酶作用，而且能诱导血管等的血管舒张，从而可以防止中风、抗血栓病、治疗糖尿病 及动脉粥状硬化等。s h o e n f e l d 等报道通过摄人多酚类物质可加强免疫细胞功能，起 到消炎作用，从而降低心血管疾病的危险：h e r t o g 啪3 等也曾报道植物多酚能预防冠心病 和心血管疾病；c h e n j i a n gy i n g 利用w e s t e r nb l o t 法对牛颈动脉内皮细胞进行体外 实验，发现茶多酚能有效抑制内皮细胞功能紊乱，并能有效抑制心血管疾病的发展； b t a t s u m o t o 等报道植物多酚具有有益于健康的低甾酵血效应，可预防心血管疾病，有效 治疗冠心病，同时又有调节血压，降低血脂等作用。此外， r o s sr 等也有报道植物多 酚的消炎作用。天然药物化学也记载多酚类物质有抗病毒作用。“。 ( 2 ) 抗癌作用 a v i r a m m 发现多酚类物质在哺乳动物细胞中有广泛的生物效应。s e e m aj a v e dnk 。4 利用小鼠皮肤模型发现红茶多酚对肿瘤发生有化学预防作用。亚硝基化合物具有致癌 性，w uy o n g - n i n g ”3 等发现植物多酚中的茶多酚对亚硝基化合物具有抑制作用，从而达 到抗癌作用。 ( 3 ) 抗氧化作用 现代医学研究证明，很多疾病如组织器官老化等都与过剩的自由基有关，多酚具有 清除自由基的作用，且对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用。a v i r a m m 1 等报 道多酚类物质能抑制低密度脂蛋白的氧化性；h o l i m a n 等也报道过多酚类物质的抗氧化 作用；f uy c a i “1 等也曾报道茶多酚在大鼠的细胞生长中有抗氧化作用，是大鼠的细胞 凋亡抑制；g u o - - r o n gh e 等报道茶多酚对肝酒精中毒有净化作用；z d u n c z y k a ”也曾报 道多酚类中的5 ，6 ，7 三羟基黄酮对丙醛有净化作用，能降低小鼠肝脏中的丙醛含量。 ( 4 ) 抗老化和防晒作用 植物多酚具有较强的紫外吸收特性，在2 0 0 3 5 0 n m 问有较强的吸收蜂。特别是对能 量高、破坏力大的远紫外区有更强的吸收，因此植物多酚可以作为抗老化剂和防晒剂的 有效成分叫1 。例如，多酚类物质可以与酪氨酸转化酶结合，从而阻止黑色素的生成，防 止皮肤变黑或出现雀斑、褐斑等，如金缕梅多酚和单宁酸被用于美自护肤品的配制等。 ( 5 ) 抑菌防腐作用 7 广西大学硕士学位论文双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 植物多酚在中性或弱酸性条件p n 下对大多数微生物具有普遍抑制能力，这一性质 对中性或酸性食品防腐非常有利。苹果多酚对细菌抑制的作用较强，对芽孢杆菌、大肠 杆菌、假单孢菌等供试菌的最低抑制浓度为0 1 ，具有很好的热稳定性，在p h 5 6 及 低于o 3 t 0 0 1 l 1 的无机盐环境下抑制效果最佳啪1 ；袁宝刚等从橄榄中提取了没食子酸 及黄酮类物质发现它们对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母、土星汉逊 酵母黑曲霉、娄地青酶、桔青酶、黑根酶、黄曲霉等细菌、酵母菌、霉菌等食品生产加 工和贮藏中常见的腐败菌种均有一定的抑制作用；茶多酚能有效的抑制常见致病菌的生 长，最低抑制浓度为0 0 8 0 1 1 。 ( 6 ) 消臭作用 植物多酚能有效去除肉类、粮油及其他食品的异味，如茶多酚能有效的去除大豆制 品的豆腥味、小麦粉的异味及肉制品释放出的甲硫醇、乙硫醇等异味，是一种抗菌消毒除 臭的去臭剂1 ：儿茶素用于消除口臭m 1 、食品除臭保鲜、空气清新剂1 及纺织品除臭1 。 ( 7 ) 其它作用 除了以上生物活性，植物多酚还具有保护视网膜、抗视力下降的作用。如h u ix i a n g f “1 等报道了茶多酚能缓解人的晶状体球蛋白的氧化压力，从而起到保护作用。 1 4 真菌多糖及植物多酚的提取分离方法 1 4 1 真蕾多糖的提取分离方法 1 多糖的提取 将鲜蘑菇子实体或干燥蘑菇子实体粉碎，加入一定比例乙醇水浴回流，除蘑菇表面 脂肪、色素及部分小分子杂质。然后将预处理过的蘑菇加入一定量的溶剂加热浸提。溶 剂一般为水或者酸、碱溶液。由于酸、碱提取会引起海藻多糖不同程度的降解，一般以 自然p h 的水做溶剂提取。多糖在有机溶剂中的溶解度极小， 所以可以用有机溶剂沉淀 浸提液得到多糖，一般采用乙醇。经沉淀得到的租多糖通常含有较多的蛋白质，为了提 高多糖纯度必须除去蛋白质。常用的脱蛋白方法有s e v a g e 法、三氯乙酸法及蛋白酶水解 法。 ( 1 ) s e v a g e 法根w 1 ：据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，按多糖水溶液1 3 l 4 体积s h 入s e v a g e 试剂，混合震荡3 0 m i n , 离心分去水层与溶剂交界处的变性蛋白质。 广西大学硕士学位论文双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 ( 2 ) t c a 法：此法较为剧烈，对于含有吠喃环残基的多糖由于连接键不稳定， 容易破坏此类多糖；而且非常容易造成硫酸多糖的硫酸基团脱落。 ( 3 ) 酶法：蛋白酶可以除去与多糖结合在一起的蛋白质。一般先用蛋白酶使蛋 白质部分水解解离后，再结合s e v a g e 法效果更好。 2 多糖的分离 提取得到的粗多糖是分散性广的混合物，需要进一步分离纯化才能得到纯的多糖 样品。纯化方法一般有以下几种： ( 1 ) 分部沉淀法：根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性 质，待分离多糖的相对分子质量越小，沉淀多糖的乙醇浓度越高。不同浓度的乙醇可 以使多糖的不同组分先后沉淀，因而起到分步沉淀的效果。这种方法适宜于分离各种溶 解度相差较大的多糖。 ( 2 ) 离子交换柱层析：在纤维素或葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，适合于分 离各种酸性、中性多糖和粘多糖。真菌多糖一般采用d e a e 柱层析，可根据多糖酸性基 团量不同而分离。多糖在交换柱上的吸附力与多糖结构有关。吸附力一般随多糖分子中 酸性基团的增加而增加。通常洗脱方法可以是阶段式或梯度式。 ( 3 ) 凝胶柱层析：它是根据多糖分子的大小和性状不同而达到分离目的。常用的 凝胶有葡聚糖凝胶( s e p h a d e x ) 及琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 。洗脱剂为各种浓度的盐溶液及缓 冲液。凝胶柱层析也是多糖分离中常用的一种方法；另外凝胶柱层析也可代替透析除去 多糖中小分子。多糖的纯化还有其他方法如制备性高效液相色谱、制备性区带电泳、超 滤和亲和层析等等。真菌多糖分离纯化的方法不同则得到的组分可能不一样。 3 多糖分子量的测定 多糖分子量是研究多糖性质的一项较为重要的工作。多糖溶液的粘度、溶解度以及 生理活性往往与它的分子量有关。上面己说过，多糖的分子量只代表相似链长的平均分 布。即使是同一多糖，其重均分子量( m w ) 和数均分子量( m n ) 也会相差很大。通常文献 中所报道的多糖分子量为量均分子量。多糖分子量的测定方法很多，实验室中最简便 可用的是凝胶过滤法咖1 。它是根据在凝胶柱上不同分子量的多糖在凝胶柱上的洗脱体积 与分子量的对数成线形关系。先用各种己知分子量的多糖制成标准曲 线，然后由样品的洗脱体积从曲线中求得分子量。这种方法简便价廉，已被广泛用于 糖类化合物、蛋白质和寡肽的分子量的测定。 9 广西大学硕士学位论文 双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 1 4 2 檀物多酚的提取分鼻方法 多酚类化合物提取分离的方法有有机溶剂浸提、离子沉淀、柱分离、现代提取新方 法5 1 “。 ( 1 ) 有机溶剂萃取法 由于多酚物质在结构中都含有羟基，具有一定极性，所以水、低碳醇、乙酸乙酯、丙酮都 是可被选择的溶剂，通常可按以下原则分提：按主体酚类的含量、调节溶液的p h 值、根 据酚类分子量。 ( 2 ) 离子沉淀法 冷却沉淀其原理是根据植物多酚在热水中溶解，大分子量多酚在低温下产生沉淀的 性质而达到粗分离的目的；金属离子沉淀法根据金属离子如a 1 ”、z n ”、c 矿、m 9 2 + 各自在 一定的p h 条件下可使水溶液中单宁发生沉淀而得以分级，然后沉淀物再经酸处理使多酚 溶出。 ( 3 ) 柱吸附分离法 根据植物提取物中不同物质包括多酚类物质的不同分子量，不同的脂溶性、水溶性， 可利用层析法对其进行提取分离根据载体的不同可具体分为，硅胶柱层析、聚酰胺柱层 析、葡聚糖凝胶柱层析等进行分离。 ( 4 ) 现代提取新方法 随着仪器分析的快速发展，仪器在植物多酚类的提取分离方面也发挥着越来越重要 的作用。与传统方法相比，这些新兴技术具有得率和含量高、速度快、条件温和有利于有 效成分的保护、物耗能耗少等特点。因此，受到了越来越多的关注。 利用超临界流体萃取( s c f ) n t 得到高纯度的植物多酚，并保持其原有的化学特征， 具有较高的经济效益。利用高效液相色谱( h p l c ) 可对植物多酚进行较好的分离及鉴定 等。采用超滤技术可对植物多酚进行很好的分离，可保证成品的透明度而不影响营养成 分。 1 5 除臭的研究进展 1 5 1 臭味物质的来源 长期以来，口臭、体臭以及环境中的一些恶臭给生活带来的诸多不适越来越引起人 1 0 广西大学硕士学位论文双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 们的关注。口臭的病因学研究表明：口臭是口腔微生物( 主要是革兰氏阴性厌氧菌) 腐败 蛋白质产生挥发性硫化物、氨和有机酸等物质引起的一3 。体臭则是由汗以及皮脂为细 胞分解所致。它的恶臭成分随部位不同而异，颈部为皮脂的分解产物，如低级脂肪酸、 醛类等，而腋部则为汗的分解产物，如挥发性固醇化合物o “。肠内毒素使由于体内常 驻厌氧菌数量减少，致病菌数量增加，即肠道内有害比例增加或有益菌比例减少时引起 肠内毒素的增加，产生恶臭的同时损害人体健康”。 臭味物质可分为三类，第一类是含硫化合物，如硫化氢、硫醇、硫醚；第二类是含 氮化合物，主要是三甲胺、氨、尿素、烟碱等；第三类是酸、醇。口臭主要与硫化物关 系密切，而蛋白腐败的臭味主要为三甲胺。 1 5 2 消臭的研究进晨疑消臭方法 目前的研究表明多种天然植物的提取物具有消臭作用，如茶叶提取物以2 - 苯基苯并 吡喃为结构的衍生物黄酮类物质、柿单宁、贯仲叶中提取的单宁与类黄酮、大豆谷类提 取物多糖、氨基酸、竹叶中的有机酸、酚、多糖、叶绿素、纤维素、食用伞菌的提取物、 乙酰壳多糖、各种天然产物提取的酚类1 。 消臭的方法分为四类，第一类是以感官为主的消臭，即用香料去臭，对臭味物质起 到掩蔽作用；第二类是物理方法，即用活性碳等吸附剂吸附臭味物质；第三类是生物学 方法，即用抑菌剂、抗菌剂抑制微生物的繁殖；第四类是化学法，即利用活性物质与臭 味物质发生中和、加成、缩和等化学反应消臭。而化学除臭的机理又有以下几种形式”“： ( 1 ) 单宁和类黄酮分子中的酚羟基船 - 臭味分子中氨基( - n h 2 ) 结合。 瞳 ( 2 ) 类黄酮分子中的基团c 一，与臭味分子中琉基( s h ) 、亚氨基( - n h ) 产生聚合 及加成反应。 ( 3 ) 氨基酸( 如谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸与臭味分子的琉基( s h ) 、亚氨基( - n h - ) 产 生中和反应。 ( 4 ) 有机酸( 如苹果酸、唬拍酸、没食子酸等) 与臭分子中的氨基( - n h ) 发生中和反应。 ( 5 ) 糖类物质( 如蔗糖、果糖等) 可以吸收、吸附并溶解臭味分子。 ( 6 ) 单宁类物质可以同臭味分子发生脂化或醋交换反应等复合作用。 广西大学硕士学位论文 双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 1 6 立项背景及主要研究内容 1 6 1 立项背景 双孢蘑菇是目前唯一全球性栽培的食用菌，不仅是一种味道鲜美营养齐全的菇类蔬 菜，而且是具保健作用的健康食品。国1 8 # l 对双孢蘑菇的植物学特性、栽培特性及基本 组分己有广泛的研究。蘑菇罐头、干制品、蘑菇腌制品等都已经实现产业化，对双孢蘑 菇的功效成分研究主要集中在多糖抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇、降血压、增强免疫力 等方面。1 9 8 9 日本r i c o m 株式会社对使用伞菌进行开发研究，发现从食用伞菌提取的 c h a m p e x 含有许多矿物质和某些人体内缺乏的氨基酸，如核营酸、甘露醇、半纤维素等， 这些物质是提高免疫力的生理催化剂，具有其他除臭剂所不具备的功效，它通过消除肠 道内聚集的臭味成分，达到消除口臭和体臭的目的，随后开发出一系列产品，如口臭、体 臭、便臭、肠内腐败物抑制食品等。 目前市场上生产销售的一些合成化学除臭剂含有过渡金属螯合剂或烯醇类化合物， 或多或少对人体有一定的毒副作用，而现已证实的很多天然产提取具有很强的消臭功 效，且对人体无损伤，结合食用菌的药效价值及对食用伞菌消臭的开发，进一步开发双 孢蘑菇的药用价值。 本文通过对双孢蘑菇多糖提取工艺研究、分离及多酚的提取、分离和体外抗菌、消 臭的活性研究，为深度开发利用真菌资源，提高双孢蘑菇的附加价值，进一步研究开发 真菌多糖以及酚类的生物学活性，为多糖、多酚药物开发提供新的理论依据和技术方法， 对实现双孢蘑菇的深度开发利用，开辟食用菌生物制药新领域都具有重要意义。 1 6 2 研究内窖 ( 1 ) 双孢蘑菇多糖提取工艺的研究，主要探讨提取温度、提取时间、料液比等因素 对多糖得率的影响，采用正交实验对工艺条件进行了优化，并研究了不同提取剂处理对 多糖得率的影响。 ( 2 ) 利用葡聚糖凝胶对多糖进行分离纯化，并测定其纯度；利用大孔树脂h p - 2 0 对提 取的多酚进行纯化，并测定其纯度。 ( 3 ) 对口腔厌氧菌( 牙龈卟啉单孢菌、中间普氏菌、具核梭杆菌) 的培养，研究多糖、 多酚对口腔厌氧菌的抗菌活性。 广西大学硕士学位论文 双孢蘑菇泊臭有效成分的提取、分离及消臭研究 ( 4 ) 研究多糖、多酚对鸡肝腐败氨氮的消除，以及温度对多糖、多酚消臭的影响。 ( 5 ) 利用顶空气相色谱仪研究多糖、多酚的消臭活性。测定多糖对氨水、三甲胺、 吲哚的吸附，以及温度对多糖吸附能力的影响；多酚对臭昧物质的去除能力等。 广西大学硕士学位论文 双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 第二章双孢蘑菇多糖、多酚的提取、分离 提取多糖的常用溶剂一般有水、酸、碱和盐溶液等，水浸提条件相对温和，对多糖 的结构组成以及生理活性破坏小，而影响多糖浸提得率的因素有很多，如提取温度、提 取时间、料液比等；提取多酚传统方法都用溶剂萃取。多糖、多酚的纯化是化学结构和 生物活性研究的基础，也是工业化生产的必需步骤。 本章通过正交实验确定双孢蘑菇多糖热水提取最佳工艺条件；不同提取剂对多糖得 率的影响；多糖的脱蛋白以及柱层析纯化：多酚的提取及纯化。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 1 1 1 原料 双孢蘑菇a g a r i c u sb i s p o r u s 葡聚糖凝胶d e a e s e p h a d e xa 一5 0 葡聚糖凝胶s e p h a d e xg 1 0 0 大孔树脂l i p 2 0 2 1 1 2 主要仪器 f c 2 0 4 电子天平 电子分析天平 g s y - i i 恒温水浴箱 r e 5 2 a 旋转蒸发仪 s h b i i i 循环多用真空泵 u v - 1 6 0 1 紫外可见光分光光度计 1 0 1 2 型干燥箱 低速离心机 恒温振荡培养箱 m o d e i ，7 7 5 0 0f r e e z ed r ys y s t e 1 4 购于市场 p h a r m a c i a 公司 p h a r m a c i a 公司 三菱化学 上海第二天平仪器厂 m e t t e r t o l e d og r o u p 北京长源试验设备厂 上海金荣仪器设备厂 郑州长城科工贸有限公司 日本岛津 上海实验仪器总厂 上海安亭科学仪器厂 广东韶关科力实验公司 m a d e i n i ，s a 广西大学硕士学位论文 双孢蘑菇消臭有效成分的提取、分离及消臭研究 b s z 一1 0 0 部分自动收集器 层析柱( 2 6 锄x3 0 锄) 层析柱( 2 2 锄1 0 0 ) 层析柱( 5 5 x l o o c m ) 2 1 1 3 主要试剂 上海沪西分析仪器厂 上海华美实验仪器厂 上海实验仪器厂 上海实验仪器厂 苯酚、硫酸、氢氧化钠、草酸铵、醋酸、浓盐酸、磷酸、无水乙醇、丙酮、正丁醇、 葡萄糖、没食子酸、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、h 2 0 ：均为分析级：胃蛋白酶、果胶酶为 s i g m a 公司产品 2 1 2 方法 2 1 2 1 多糖的提取工艺 鲜蘑菇一捣碎- - 7 5 乙醇抽提除脂肪一过滤一滤渣热水抽提一过滤一浓缩一h ：0 z 除 色素一乙醇醇析一粗多糖 2 1 2 2 多糖的测定方法( 改良苯酚一硫酸法) m 1 1 苯酚溶液的制备 苯酚( 纯苯酚为针状无色结晶) ，水浴加热后溶解，蒸馏收集1 8 2 c 的馏分；8 0 苯酚：8 0 9 苯酚) 3 n 2 0 9 水使之溶解，可置冰箱中避光长期保存；5 苯酚：临用前以8 0 苯 酚配制。 2 标准溶液的配制 称取适量