（制糖工程专业论文）杜氏藻的培养及其光生物反应器的研制.pdf

摘要 摘要 本论文对杜氏藻生长和卢一胡萝h 素的累积过程进行了研究，对比了商业化 生产常用的两个藻种d s a l i n a 和d b a r d a w i l 的生物量和p 胡萝卜素累积情况， 并对光照、盐度、碳源、氮源等胁迫因子对d s a l i n a 生长和p 一胡萝h 素累积的 影响进行了详细研究，优化了培养条件，随后探讨了培养密度和培养液老化对 藻体生长和卢胡萝h 素累积的影响。在三角瓶培养得出的优化模式下，设计了 1l 容积小型光生物反应器( p b r ) 并进行了培养试验，之后把反应器放大到 1 0l ，完成了批次和连续培养试验。 三角瓶培养试验表明：和普通微生物相类似，d s a l i n a 藻细胞在接种后要经 历延迟期、对数生长期和平筏期，而p 胡萝h 素的大量累积是从对数生长后期 开始的。 在确定培养藻种的试验中，比较了d s a l i n a 和d b a r d a w i l 的生物量和口胡 萝h 素累积量曲线，发现前者的生长速率高于后者，但后者的p 一胡萝h 素含量 大于前者，考虑到单位培养体积内口胡萝h 素产量仍以d s a l i n a 为高，所以 选择d s a l i n a 作为试验藻株。 通过正交试验和各单因素试验，得出了d s a l i n a 在各种胁迫条件下的生物 量和卢胡萝h 素累积量的优化培养条件：其最适细胞生长的光强为2 0 ，0 0 0 3 0 ，0 0 0 l x ，光照时间为1 2 小时，盐度为2 m o l l ，碳酸氢钠浓度为1 0 m m o l l ， 硝酸钾浓度为l m m o l l 最适口胡萝h 素累积的光强为5 0 ，0 0 0 6 0 ，0 0 0 l x ，光 照时间为1 6 小时，盐度为4m o l l 以上，碳酸氢钠浓度为1 0 1 5m m o l l ，硝 酸钾浓度为低于1m m o l l 。 在对培养密度和培养液老化对d s a l i n a 生长和p 一胡萝 素累积的研究中 发现，培养密度过高，藻细胞间存在遮挡效应，妨碍了藻细胞对光的吸收；长 时间培养使培养液中代谢产物浓度增大，抑制藻细胞生长，但这种不利条件却 能促进口胡萝h 素累积。为确定部分更新培养液对杜氏藻生长和p 胡萝h 素 累积的影响，设计了3 种稀释率进行试验，结果表明：0 1 的稀释率比较适合 杜氏藻的生长，而0 0 5 的稀释率比较适合口胡萝h 素累积，0 2 的稀释率过大， 既不适合生长也不适合芦胡萝h 素累积。 遵循光生物反应器( p b r ) 的设计原则试制了1l 容积的新型玻璃螺旋管 式小型p b r ，并与室外自然条件同体积培养进行了对照，结果表明，在培养末 期，小型螺旋管式p b r 生物量比对照高出5 0m g l ；芦一胡萝h 素产量高出l o m g l 。自行设计的螺旋管式光生物反应器具有较高的比表面积，达到了6 2 m 。 ，远高于开放池培养的不到1 0m 。 华南理工大学工学硕士学位论文 在小型螺旋管式p b r 基础上，对反应器进行了放大，使培养容积达到了 1 0 l ，螺旋管光照单元增加到1 6 个，光照比表面积增大为9 5m ，反应器外观 设计为三层框架式结构，缩小了占地面积。用此p b r 分别进行了批次和连续培 养试验，确定出批次培养的最佳接种量为o d 6 3 0 = 0 1 5 ，最佳藻液循环流量为 6 3 0m l h ，并对此p b r 批次培养的生长情况和卢胡萝h 素产量进行了数学曲 线拟合，生物量近似为一次曲线c x = 0 0 9 1 9 + 0 0 3 6 4 t 卢胡萝b 素产量近似为 抛物线c x = 0 3 8 4 8 t 2 - 1 1 6 9 3 t + 1 7 3 3 8 。在1 0l 容积p b r 的连续培养研究中，通 过逐渐增大稀释率的方法确定了p b r 连续培养重要操作参数采收量的适宜范 围在1 5l d 左右。 关键词：杜氏藻；盐生杜氏藻：巴尔杜氏藻；光生物反应器；培养；螺旋管 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eg r o w t ha n da c c u m u l a t i o np r o c e s so f0 - c a r o t e n eo fd u n a l i e l l a s a l i n a w e r es t u d i e di nt h i st h e s i s a n dt h eb i o m a s sa n da c c u m u l a t i o no f 口c a r o t e n e b e t w e e nt w o a l g a es t r a i n s ( d u n a l i e l l a s a l i n aa n dd u n a l i e l l a ，b a r d a w i l ) ，w h i c h a r e u s u a l l y u s e df o rc o m m e r c i a l p r o d u c t i o n ，w e r e c o n t r a s t e d a n dt h ee f f e c t so f i n t i m i d a t i n gf a c t o r ss u c ha sl i g h ti n t e n s i t y ，s a l tc o n c e n t r a t i o n ，c a r b o ns o u r c e ，a n d n i t r o g e n s o u r c eo nd s a l i n a s g r o w t h a n da c c u m u l a t i o no f 鼻一c a r o t e n ew e r e p a r t i c u l a r l ys t u d i e d s u c hs t u d i e sw e r ea p p l i e d t oo p t i m i z ec u l t u r ec o n d i t i o n s t h a t f o l l o w e dd i s c u s s e dt h ee f f e c t so fc e l ld e n s i t ya n da g e dm e d i u mo nt h eg r o w t ha n d a c c u m u l a t i o no f 卢一c a r o t e n e b a s e do nt h e p r e f e r a b l e m o d eo fc o n i c a lf l a s k c u l t i v a t i n g ，as m a l lp h o t o b i o r e a c t o r ( p b r ) w i t ht h ev o l u m eo f1 lw a s d e s i g n e da n d a p p l i e dt oc u l t i v a t ed s a l i n a ，t h e ni t w a sa m p l i f i e dt ot h ev o l u m eo f1 0la n d c o m p l e t e d b a t c ha n dc o n t i n u o u sc u l t i v a t i n g t h er e s u l t so fc o n i c a lf l a s kc u l t i v a t i n gs h o w e dt h a tt h eg r o w t hc u r v eo fd s a l i n ai sl i k et h a to fo r d i n a r ym i c r o b e ，t h eg r o w t hp r o c e s so fa l g a ec e l lw i l lf i n i s h t h ed e l a y e dp e r i o d t h ee x p o n e n t i a lp e r i o da n dt h ep o i s ep e r i o d w h i l et h em a s s i v e a c c u m u l a t i o no f 芦一c a r o t e n eb e g i n si nt h el a t eo ft h ee x p o n e n t i a lp e r i o d i nt h e e x p e r i m e n t s o fd e t e r m i n i n gc u l t i v a t i o n a l g a es t r a i n ，t h e c u r v e so f b i o m a s sa n da c c u m u l a t i o no f 芦一c a r o t e n ef r o md s a l i n aa n dd b a r d a w i lw e r e c o n t r a s t e d t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h eg r o w t hr a t eo fd s a l i n aw a sh i g h e r t h a nt h a to fd b a r d a w i l w h i l et h ec o n t e n to fp c a r o t e n ew a sl o w e rt h a nt h el a t t e r b e c a u s et h ep e rv o l u m eu n i ty i e l do fp c a r o t e n eo fd s a l i n aw a ss t i l lh i g h e rt h a n t h a to fd b a r d a w i l ，d s a l i n aw a sap r e f e r a b l es t r a i n f r o mt h eq u a d r a t u r et r i a l sa n ds i n g l ef a c t o rt r i a l s ，t h eo p t i m u mc u l t i v a t i n g c o n d i t i o n so fd s a l i n a sb i o m a s sa n da c c u m u l a t i o no f 芦c a r o t e n ew e r ef o u n d u n d e rm u l t i f a r i o u s i n t i m i d a t i n g f a c t o r s f o rt h em o s tb i o m a s s ，t h e o p t i m u m c u l t i v a t i n gc o n d i t i o n sl i s ta s ：2 0 ，0 0 0 3 0 ，0 0 0l xl i g h ti n t e n s i t y , 1 2h o u r sl i g h tt i m e ， 2m o l ls a l tc o n c e n t r a t i o n 1 0m m o l ln a i c 0 3c o n c e n t r a t i o na n d1m m o l l n a n 0 3c o n c e n t r a t i o n f o rt h em o s ta c c u m u l a t i o no f p c a r o t e n e t h eo p t i m u m c u l t i v a t i n gc o n d i t i o n sl i s ta s ：5 0 ，0 0 0 6 0 ，0 0 0l xl i g h ti n t e n s i t y ，1 6h o u r sl i g h tt i m e ， a b o v e4m o l ls a l tc o n c e n t r a t i o n 1 0 一1 5m m o l ln a h c 0 3c o n c e n t r a t i o na n du n d e r lm m o l ln a n 0 3c o n c e n t r a t i o n i nt h er e s e a r c ho ft h ee f f e c t so fc e l ld e n s i t ya n da g e dm e d i u mo nd s a l i n a s g r o w t ha n dt h ea c c u m u l a t i o no f 芦一c a r o t e n e i tw a sf o u n d t h a th i g hc e l ld e n s i t y l 华南理工大学工学硕士学位论文 p r e v e n t sa l g a ec e i l sf r o ma b s o r b i n gl i g h tb e c a u s eo fs h e l t e r i n gb e t w e e nc e l l s d u e t ot h ea c c u m u l a t i o no fm e t a b o l i s mp r o d u c t i o n si nt h ec u l t u r e g r o w t hw a sr e t a i n e d i nl o n g - t i m ec u l t i v a t i n g h o w e v e r ，t h i ss i t u a t i o ni s h e l p f u lt ot h ea c c u m u l a t i o no f 口一c a r o t e n e t h r e ek i n d so fd i l u t i o nr a t e sw e r e d e s i g n e d t om a k ec l e a rt h e i n f l u e n c e so fs e c t i o n a lr e n e w a lo ft h ec u l t u r eo nb i o m a s sa n da c c u m u l a t i o no f 口 c a r o t e n e a n di ti n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m u md i l u t i o nr a t ef o rb i o m a s sw a s0 1a n d o 0 5f o ra c c u m u l a t i o no fp c a r o t e n e w h e nt h ed i l u t i o nr a t er e a c h e d0 2 。i tw a s u n s a t i s f a c t o r yf o rt h eb o t h f o l l o w i n g t h e p r i n c i p l e s o fp b r ，an o v e ls m a l lh e l i x - t u b ep b rw i t ht h e v o l u m eo fllw a sd e s i g n e d a n dac o n t r a s tw a sc a r r i e do u tb e t w e e nt h ep b ra n d o u t d o o r sc o n d i t i o n sw i t ht h es a m ev o l u m e ，t h er e s u l ts h o w e dt h a ti nt h el a t eo ft h e c u l t i v a t i o n ，t h ed e s i g n e dr e a c t o rh a s5 0m g lm o r eb i o m a s sa n d1 0m g lm o r e 芦 c a r o t e n et h a nt h eo u t d o o r sc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s b e s i d e s ，t h es p e c i f i cs u r f a c e a r e ao ft h er e a c t o rr e a c h e dt o6 2 m ，m u c hm o r et h a n1 0 m 。1o ft h eo p e np o n d c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s o nt h eb a s i so fs m a l lh e l i x - t u b ep b r ，r e a c t o rw a sa m p l i f i e dt ot h ev o l u m eo f l ola n dt h ei l l u m i n a t i o nu n i t sw e r ei n c r e a s e dt o1 6 ，w h i c hb r o u g h tt ot h ea u g m e n t o fi l l u m i n a t i o ns p e c i f i cs u r f a c ea r e at o9 5 m i no r d e rt or e d u c es p a c e ，t h ef a c a d e o ft h er e a c t o rw a s d e s i g n e da st h r e e - l a y e rf r a m e t h r o u g ht h eb a t c ha n d c o n t i n u o u s c u l t i v a t i o nw i t ht h i sp b r ，t h eo p t i m u mi n o c u l u mv o l u m ew a sd e t e r m i n e da t o d 6 3 0 - - 0 t 5a n d t h eo p t i m u mc i r c u l a t i o nr a t ea t6 3 0m l l hi nb a t c hc u l t u r e ，w i t ht h e h e l po fm a t h e m a t i ct o o l ，t h eg r o w t ho f d s a l i n ai nb a t c hc u l t u r ec a nb es i m u l a t e d a sc u r v e e q u a t i o n c x = 0 0 9 1 9 + 0 0 3 6 4 t ，a n d t h e o u t p u t o f0 一c a r o t e n ea s c 。= 0 3 8 4 8 t 2 1 1 6 9 3 t + 1 7 3 3 8 i nt h er e s e a r c ho fc o n t i n u o u sc u l t i v a t i o ni np b r o f 1 0l t h ed a i l yg a t h e r i n gv o l u m e ，a ni m p o r t a n to p e r a t i o np a r a m e t e r ，w a so b t a i n e d b yg r a d u a l l yi n c r e a s i n gd i l u t i o nr a t e t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a t1 5 l dm o r eo rl e s s w a s p r e f e r a b l e k e y w o r d s ：d u n a l i e l l a ；d u n a l i e l l as a l i n a ；d u n a l i e l l ab a r d a w i l ；p h o t o b i o r e a c t o r ； c u l t i v a t i o n ；h e l i xt u b e 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进 行磷究繇取得的研究成果。除了文中特别抽以标注弓l 用的内容 外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作 晶。对本文的研究徽漱重要贡献酶个人和集体，均已在文中敬爱 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 菘痨目期：衅年占月罗网 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、馒用学位论文酶戴 定，同意学校保昭并向国家旨关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被落阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将 本学位论文鳇全部或部分内容编入有关数据麾进行检索，可以暴 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密舀，在年解密嚣适霜本授权书。 本学位论文属于 不保密留。 ( 请在以上相应方框内打“” 乍者签名： 导师签名： 荔痔 绷 基期：扣；年胄9 疆 日期：扣? 年6 月? 日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 杜氏藻 1 1 1 杜氏藻的生物学特性 杜氏藻( d u n a l i e l l a ) 是绿藻f ( c h l o r o p h y l a ) 、真绿藻纲( c h l o r o p t y c e a e ) 、团 藻目( v o l o c a l e s ) 、多毛藻科( p l o y b l e p h a r i d a c e a ) 的一个属，包含约30 个种，其 中最有代表性和应用最广的是杜氏盐藻( d s a l i n a ) ，常简称为盐藻。盐藻为单细 胞藻类，外包一层薄胶鞘，无细胞壁。个体形态多变，有球形、梨形、卵形、椭 圆形或纺锤形，大小为5 岫一2 0 岫，具2 条等长鞭毛，可自由游动。藻体内有一 杯状叶绿体，内含一淀粉核。藻体前端有一红色眼点。盐藻在正常情况下以细胞 纵裂方式进行无性繁殖，一般分为大小相等的两个子细胞，在适合条件下约3 7 小时分裂一次。在不良环境时也可以进行同配有性繁殖，即具有2 条等长鞭毛的 配子结合成为合子。盐藻生长于海水及咸水湖、盐湖等高盐环境下，是耐盐性最 强的单细胞藻类。 杜氏藻对环境条件的耐受能力很强。在自然水体藻类区系组成中杜氏藻个体 极少，而在高盐水体中杜氏藻常常成为优势种群，并可形成绿色或红色水华。因 此，杜氏藻通常是全球高盐湖泊和盐厂蒸发池中主要的第一生产者。在南极高盐 湖泊和法国、罗马尼亚、意大利的一些盐湖，美国加州、犹他州的盐湖，澳大利 亚南部的艾瑞湖( l a k ee y r e ) ，埃及的某些湖泊，克里米亚的盐湖，以及中国沿 海盐池及内陆盐湖等地区生长着许多杜氏藻。杜氏藻通常在盐度大于2 的水体 中占优势。 杜氏藻最大的经济价值在于它的细胞叶绿体的类囊体，在强光照、高盐度条 件下能积累比任何植物都丰富的芦胡萝h 素，最高可达干重的1 0 以上w 。因其 特殊的生理特性及富含具有重要医学与营养学价值的鼻胡萝h 素( 卢c a r o t e n e ) ， 对盐藻及其养殖的基础研究和应用研究方兴未艾。 1 1 2 杜氏藻的细胞组成 杜氏藻细胞中的各种生化组分在不同的品系和不同的生长条件下可产生大 的变化。正常条件下生长的绿色细胞中蛋白质含量占细胞干重的5 0 6 0 ， 碳水化合物占1 2 4 0 ，脂类占6 1 0 1 2 , 3 , 4 , 5 。但当氮缺乏时，蛋白质含量 可降低至原来的一半m 。与许多藻类不同的是，杜氏藻在缺氮时并不积累脂类， 而是大量地积累碳水化合物【7 “。表1 1 所列为大量积累胡萝h 素时d b a r d a w i l 华南理工大学工学硕士学位论文 的细胞主要成分。 表l l 大量积累胡萝h 素时d b a r d a w i l 的细胞主要成分 t a b l e1 - 1t h em a i nc e l lc o m p o n e n t so f d b a r d a w i lw h e n l a r g e l ya c c u m u l a t i n g 8 ，c a r o t e n e 细胞主要成分含量( 占细胞干重) 甘油 蛋白质 脂质 碳水化合物 p 胡萝b 素 叶绿素 3 0 2 9 1 8 l l 9 1 杜氏藻含有叶绿素a 和叶绿素b 、胡萝h 素及叶黄素类色素，其中芦胡萝h 素和叶黄素有多种立体异构体( 表l - - 2 ) 。 表l 一2d b a r d a w i l 中t 3 胡萝h 素立体异构体分析 t a b l e1 - 2a n a l y s i so fs t e r e oi s o m e r so f 口- c a r o t e n ei nd b a r d a w i l 异构体在鼻胡萝h 素中的质量分数( ) 1 5 顺口胡萝h 素 9 顺口胡萝h 素 全反式口胡萝h 素 2 种未确定异构体 1 0 4 l 4 2 6 1 1 3 杜氏藻生长所需的条件 1 1 3 1 光照 光是杜氏藻生长的重要限制因子。光不仅有光周期、光质和光强的不同，还 有明显的时、空( 纬度、水深) 的变化。在培养液中，光强随培养液的厚度呈指 数衰减，光谱组成也相应发生变化，最先被吸收的是红外线、紫外线和长波长的 红光，短波长的青色和蓝色光最后吸收。藻类的光合色素系统含有多种辅助色素， 即天然色素，其类型很多，某一类群的藻类需要某种或某几种辅助色素，不同辅 助色素吸收不同波长的光，这些辅助色素有协助叶绿素a 捕捉光能的作用。不同 微藻对光照度的要求有明显差异，在一定光照度范围内，光合作用率随光照度的 增加而增加。若光照度超过所要求的限度则产生抑制作用，光合作用率下降。 光照是培养杜氏藻生长口胡萝h 素最重要的环境因子，杜氏藻生长的光饱 和点在3 0 ，0 0 0l x 左右口1 ，超过此光强，藻细胞的生长会受到抑制，但卢胡萝h 2 第一牵绪论 素豹累积会大大增秘。 1 1 3 2 碳源 枝氏藻楚一耱必合垂莠生物，它霉要纛极碳佟楚碳源。然瑟褒裹盐豹海水中 无机碳含量怒很低的，盐度和温度越高，光机碳溶解量越低。在2 5 的盐度下， 无枫碳溶织攘仅巍一般海承( 约含3 n a c l ) 兹5 0 。对于在裹靛环境下生长的 d s a l i n a 丽吉，无机碳的供给可能是其生长的最大限制阂素。例如在2 5 、2 5 蚝盐发、p h 9 。0 豹条 孛下，9 9 。9 静无机碳楚班c 0 3 2 - 戆形式存在，其次是h c 0 3 1 ， 几乎无c 0 2 的存在 1 0 1 。因此，d s a l i n a 对低c 0 2 浓度有特异的适应性，其表观光 合搀援常数k m ( c 0 2 ) 为2 # m o l l 。藻细胞可将培养基中的无机碳浓缀2 0 接， 从而达到近4 0 um o l l ，这是r u b p 羧化酶化光会反应所需要的k m ( c 0 2 ) l ， 这种蹇积柞爝可能姻功于缨胞表露碳酸瞽酶的存在 1 2 1 3 1 。该酶在低c 0 2 浓度下表 现出较高的生物活性。ns a l i n a 中的碳酸背酶不同于衣藻中的碳酸苷酶，在高簸 浓度下仍可保持相巍高的满性。该酶的耐靛活性，使d + s a l i n a 在高盐条件下能 很好地吸收c 0 2 1 4 1 过去的研究都认为杜瓞藻是光舍自葬的。d p a r v a 虽然能吸收利用丙三醇和 葡萄糖，却不能以它们之中的任何种作为碳源进行异养培养，但有的d s a t i n a 品系和d t e r t i o l e c t a 品系完全可以在异养培养基上生长1 。 1 1 3 3 氮漾 硝酸盐是杜氏藻培养中最常使用的氮源，几乎所有的实验室培养中均以此为 氮源。m i l k o 和g r a n t 等入认兔，n a n 0 3 对于as a l i n a 和d t e r t i o l e c t a 楚最驽静 氮源”，。假藻细胞对硝酸盐和亚硝酸盐的吸收利用是需光照的 1 8 1 ，同时这一谶 程受到溶液缓渖髓力的影稍。铵态氮一般不髓被轻氏藻掰翻瑟”，。有磷究发瑶， 0 2 9 l 浓度的n t - h c l 便会使d s a l i n a 的嫩长产生明显抑制作用。但也有试验袋 鞠，低浓度绥蓥与辩酸盏耨琵爵键进叠t e r t i o l e c t a 翡生长。鸯糗氮滠磐稼素、 谷氨酰胺一般不如凭机氮肖效。 3 。4 磷漾 磷酸盐是杜氏藻生长最好的磷源，一般来说，0 0 2 o 0 5 9 l 的k h 2 p 0 4 为杜 氏藻生长最逶浓褒潮，。毫浓发魏磷戆逐速撵涮生长，低浓度羧潮生长逮波。接逐 0 0 2 9 l 的k h 2 p 0 4 浓度藻体内芦* 胡萝h 索累积髓最多。随着浓度升高，细胞内 箩胡萝卜豢含量醛低。k h 2 p 0 4 浓度还会影啕至l 藻俸孛箩一捐萝 、素竣装异构钵 含爨，在较低浓度下，顺式异构体的含量较高，全反式异构体随浓度的升高，累 积爨增热。 1 1 3 5 钙、镁及其他阳离子 在一般海痰强撬孛有怒够豹c a 2 + 、m 9 2 + 离子瑶供杜氏藻生长艨霉，越困等藏 盐环境下常具有较高的c a “、m 9 2 + 浓度。杜氏藻生长所需的最遁m g “、c a 2 + 浓 3 华南理工大学工学硕士学位论文 鹰分别蕊1 m m o l l 移0 1 m m o l l 1 ：l 。f e 离予是桂氏盐藻生长所必需鲍元索，终积 态豹铁懿柠檬酸铁蠢e d t a 缝合懿铁魄f e c l 3 霹f e s 0 4 要努。d s a l i n a 黧长鹁最 逡f e 离子浓度惫1 2 5 3 7 5 m g l ，麓离子浓度对萁生长存撩裁终爝。h 3 8 0 3 、 z n 、m 。c o 、c u 、m o 等微量元索也建校氏盐藻生长所必不可少的，憾现时对 它们的研究还很少。 1 1 3 6 硫酸根离子和氯离子 缺乏s 0 4 2 和c l 一时，d s a l i n a 的缴长会被大大抑制，s 0 4 2 被c l 取代会促进 0 胡萝b 索积累。d s a l i n a 生长的c 1 s 0 4 2 最佳比值是3 2 ，而最利于芦。胡萝h 索积累的比值是8 6 1 2 31 。通常认为，阳离子和阴离子对杜氏藻细胞生长w 能存在 棚飘作用关系。但这种关系尚未弄清楚。 1 。1 3 7 湿度及胡 程氏藻对温度骞缓宽豹适应蕊溺。投s a l i n a 霹藜受3 5 懿舔潼，农8 稳瀑 度f ，它仍霹送行走会痒弱。s a l i n a 豹最逶生长蘧度是2 4 0 。校氏藻藏 的其稳种类对温度的适应范围各不糊嗣。柱氏藻适宜生长豹p h 困穗磷辫，d ， s a l i n a 的最适p h 为9 左右，这一p h 对d b a r d a w i l 也是积累胡萝h 素的最德值 f 3 列 1 1 4 胁迫环境对杜氏藻的影晌 杜氏藻有很宽的盐度适应范围，d s a l i n a 可在1 3 5 的浓度范围内缴长， 是一种最耐盐的真核生物。当外界赫度发生改变时，其形态及生理代谢都发生相 殿的变化，戳适应环境的改变。 1 4 + 缨照形态静变纯 警整氏藻旋转囊毫渗或爨渗蓼壤中辩，其绠戆会逐速澎大或敢终，纛劐藏痰 辨渗透压达到平衡时，荬形态又侵幔恢复。将d 。s a l i n a 驭l 。7 1m o l l n 。c 1 巾转入 3 4 2m o l l n 。c i 中，细胞体积会减少1 3 ，细胞膜发生折叠，同时，核、时绿体、 线粒体的表面积均减少，这可能魑幽于膜系统与内质网进行了融合1 2 6 1 。而幽藻从 简放转至低盐条件下时，2 分钟内，细胞体积和表面积均增大5 0 。用电予自旋 麸振法和电子显微镜观察发现，其膜的扩张来源于胞内的囊胞膜，这一过襁与低 相对分子质量( 2 8 3 0 k d ) 的g t p 结合蚤白有关m 2 a l 。 1 4 2 甘油的合成和渗透调节 桂氏藻能耐受高盐是由于它们在细胞内积累大量的甘油作为渗透调节割 2 9 3 0 1 ，在鼹套己磷究过的桎氏藻中，脆内甘油的浓度都与培养液中溶震浓度蠢关。 瓷霜蔗糖鼗替n a c l 露，庭痰譬瀵豹浓度毽霾群呈线缝增援，嚣生长帮不受影漉 辨，。这一结果说明，积累曾漓遗行渗透调节对努赛溶震静要求是菲特舅羧静，丽 仪与外界承活度和渗透压有关。从细魏代谢反应的角度看，甘油是一释多元簿， 4 第一章绪论 它可以和水任意比例混合，没有任何一种溶质比它对代谢反应的影响更小m m ，。 甘油是一种易透过细胞膜的物质m 1 ，细胞中最终的甘油浓度是细胞合成甘油 和排出甘油达到平衡时的浓度，但在盐藻细胞中，胞内外的甘油浓度之比可高达 1 0 4 ：1 1 3 5 。杜氏藻细胞膜对水的通透性虽然与其它膜无差异，但对甘油的通透性 却比脂质囊泡和猪红细胞要低得多m ，。然而，当温度超过5 0 时，其通透性则会 发生改变，甘油流出细胞，细胞开始死亡。无论在有光还是暗条件下，在外界盐 度改变后约9 0r a i n ，胞内甘油浓度即可达到平衡，而由于细胞内水分的变化所导 致的细胞大小的改变，以及生长、游动的停止，却需要1 5 0 1 8 0m i n 才能得以 恢复。 甘油的合成与转化是一种维持正常生命活动的渗透调节功能，这一过程在光 和暗的条件下均在进行，是需a t p 参加的反应。细胞质膜上的a t p 酶可能是d s a l i n a 在高盐胁迫下渗透调节反应的引发因子 3 7 , 3 8 】。受到高盐胁迫时，杜氏藻的h + 排出受到抑制，造成了暂时的胞内酸化，从而激活了n 。+ ，h + 泵，继而启动了甘 油合成 3 9 4 0 1 ；n 。+ ，h + 泵对调节胞内外p h 起核心作用，它们是合成甘油一系列发应 的初始步骤m - 。除了甘油外，胞内的碳水化合物、无机离子以及游离氨基酸可能 也参与杜氏藻渗透调节作用，特别是在甘油积累量较低的低盐浓度下 4 2 , 4 3 ，。但也 有研究表明，杜氏藻在渗透调节过程中，胞内离子含量变化不明显，n 。+ 不是杜 氏藻的渗透调节物质。 1 1 4 3 类胡萝i 、素的积累 高盐胁迫可诱导杜氏藻合成类胡萝h 素。将d s a l i n a 从1 5 n 。c l 中移到2 5 n a c i 中，经过4 5 d ，细胞总胡萝h 素含量从小于1 0m g g 增加到2 6 0m g g 蛋白，其中主要是鼻胡萝h 素含量的增加，它在总胡萝h 素中的质量分数从5 0 增至9 0 ，其它类胡萝h 素的增加并不明显【4 4 1 。与甘油积累不同，当积累了口 胡萝h 素的细胞从高渗环境转回低渗环境时，胡萝 素含量的下降与高盐下的 快速积累相比是缓慢的。这一特性也不同于血球藻( h e a m a t o c o c c u s ) ，后者积累 的类胡萝h 素可迅速分解。 d s a l i n a 是卢胡萝b 素累积较高的藻。细胞中胡萝h 素含量与受到的光照强 度成正比。当光照度从1 0 ue ( m 2 s ) 增加到3 9 6 1 t e ( m 2 s ) 时，总胡萝h 素含 量可增加4 5 倍。 营养缺乏对藻类合成类胡萝t - 素有促进作用，尤其是缺乏氮时更明显“”。杜 氏藻在缺乏氮时其p 一胡萝h 素的积累增加m ，。硫酸盐的缺乏也会使细胞生长停 止并积累口胡萝h 素，但合成速度要比光诱导慢得多 4 7 1 。磷缺乏对细胞中口- 胡 萝h 素的含量并无显著影响。重金属c u 、p b 达到使d s a l i n a 半致死的浓度时， 也有促进口胡萝h 素积累的作用( 4 8 1 。一般来说，在生长速度较低的亚适生长条 件下，胡萝h 素累积量最大。 华南理工大学工学硕士学使论文 在受到高盐胁迫时，d s a l i n a 细胞中的a t p 含量明显下降，多聚磷酸盐链 延长，时绿体瘫磷酸激酶炎( p h o s p h o k i n a s e ) 的溪瞧增强，尤蔟是甲瓦龙毅激酶 ( p h o s p h o m c v a l o n a t ek i n a s e ) 积焦磷酸甲瓦龙酸脱羧酶( e y r o p h o s p h o m e v a l o n a t e d e c a r b o x y l a s e ) ，它们催化甲瓦龙酸( m e v a l o n i ca c i d ) 磷酸化，用以合成p 胡萝 b 素的前体物质异戊二烯，在强光诱母下，杜氏藻细胞的蛋白合成也发生了变化， 器些薪合成鹣蛋白霹戆楚来源予竞诱鼯麓萝t - 素会藏基霞豹表达。 积累芦胡萝t - 素的救氏藻有很强的抗强光伤害能力，胡萝h 素含量很高的 红色细胞光饱和点明显离于那些绿色细胞。大量积累的芦胡萝h 素浓缩于脂肪 球中，分散予时绿体鲍炎囊体阕* 9 1 。美予胡萝b 豢对光伤害腰弓l 起静防护佟鼹， 一般认为憝胡萝卜索瓣光过废激发时绿素雨产生的有害物瑷一一单态氧起的 瘁灭作用1 5 0 m 5 2 1 。杜氏藻巾的卢胡萝h 素主要有鼹种立体异构体，即全反式和9 一 顺式。有研究表明，顺式声胡萝卜索异构体可逸过其结构转变而成全反式瘁灭 三线态臻矮1 s 3 1 。然焉在较氏藻孛，多麓萝 素存在于类囊俸鲠豹虢矮球中，两 不是类囊体内。b e n a m o t z 等研究了纽、白、蓝三种不同光质的强度对d b a r d a w i l 光防护能力的影响，结粜晟示，无论低胡萝h 素食量还是高胡萝h 素含量的藻， 都不能抵镄强红光的伤裳，瑟在强蘸必下露，细熬霹被保护群，。鑫光分于二煮之 间。这一结莱说明大量积累在桂氏藻中的胡萝卜豢主要起过滤屏闭作用，窀吸收 过量的蓝光，防止光伤害作用的发生。研究还发现口胡萝h 索，特别是其中的 9 顺式异构体可优先叶绿索被光漂白( p h o t o b e a c h i n g ) ，从而使叶绿素免受强光 鹃漂自。 9 顺式和全反式p 。胡萝h 素立体异构体在杜氏藻中的含凝相近，光照对合 成9 顺式异构体是必需的，在高等植物中，未受剿光照的部分，如胡萝p 中仅含 全爱式胡萝卜素。光照强度与9 j 曛式舅穆接戆撵辩含量残纛魄。9 - 蹶式筘葫 萝卜素是来自其前体八氢番茄红素( p h y t o e n e ) 的9 顺式异构体，而不是由全顺 式p 胡萝b 索在光下转化而成。卢胡萝h 素的合成在d s a l i n a 中可能还舆有“碳 麾”的作用。在胁追条锌下，生长虽减缓或停止，但光合作用仍在进行，它必须 为+ 簿密系统、苗i 蜜会成系统等鏊确过程提供蹩够的麓量。先合作焉豹嗣产物 之一是3 磷酸甘油酸，这一物质在胞内贮存时，必须有一种对细胞功能不产生抑 制的有机碳化合物存在，芦胡萝t - 索是一种合适的“中性物质”，它不仅越光保 护终焉遣是一个“碳瘁”。这一缓设霹戮麓释整发、毙照帮营棼整疆翻辩麓萝 、 索积累的影响h m 。 当高等1 蠹物受到环境胁迫时，会积累植物激索脱落酸( a b s c i s i ca c i d ) 【5 7 l 。 墨桂氏藻受到胁遥时，其腿内的脱落羧含量也会增加一。在杜氏藻受到胁邋裙期， 细胞内大量积累脱落酸，其后脱落酸又会被大量辩出，并进入臻养基中渊。僵当 培养基中加入脱落酸时，无论在高盐还是低盐条件下，对杜氏藻的生长均黑显著 6 第一章绪论 影响。脱落酸在细胞内合成的场所是叶绿体，脱落酸的合成与胡萝h 素的合成密 切相关，它也可能是p 胡萝h 素的代谢产物m ，。 1 2 口一胡萝i 、素的研究进展 1 2 1 一胡萝i 、素的结构特点及理化性质 卢胡萝h 素是一种橙黄色色素，广泛分布于植物中，是类胡萝b 素的一种， 其化学结构为4 0 碳四萜类化合物，分子式为c 4 0 h 5 6 ，分子量5 3 6 8 8 ，其分子两 端分别有2 个类异戊二烯组成的六元环，中间为四个类异戊二烯构成的碳链。此 外它还有各种顺反异构体，如全反式、0 、3 、6 、1 5 、9 - 顺式异构体，其结构如 下： 卢胡萝h 素是具有光泽的斜六面体结晶或结晶性粉末，呈红紫色到暗红色。 其稀溶液呈橙黄色到黄色；无臭无味；对氧、光敏感，在弱碱情况下较稳定；不 溶于水、甘油、甲醇和乙醇，而溶于二硫化碳、石油醚、丙酮、乙烷、氯仿、植 物油；熔点为1 7 6 1 8 2 c ( 因不同来源口胡萝h 素组成不同) 6 1 1 。 k 1 1 一t r a n s0 一c a r o t e n e1 5 c i s 鼻一c a r o t e n e 9 1 3 - d i c i sb c a r o t e n e7 1 3 - d i c is $ 一c a r o t e n e 华南瑾工大学工学硕士学莰论文 1 2 2 p 一胡萝i 、索在自然界的分布 在蠡然器中，挺物耩诲多微生物都可合成鞠萝 素，动物汉不同静方式 弋滚 胡萝h 素而自身却不能合成胡萝h 素。在藻类中，除了隐藻所含的胡萝h 索主要 是q 一胡萝h 素，其他藻均以j 8 胡萝i 素为主。在许多