（环境科学专业论文）环境水样中24种抗生素残留的同时分析方法及其应用研究.pdf

摘要 检测限为2 0 0n g l 外，其余抗生素的方法检测限均可达到1 0n g l 甚至更低。 结合替代物质控方法的使用，方法可以满足水中痕量( p p t 级) 抗生素残留 的检测要求。 ( 3 ) 九龙江口及厦门近岸海域表层水中2 4 种抗生素的残留状况研究 分别于2 0 0 6 年1 2 月和2 0 0 7 年4 月两次采集九龙江口及厦门近岸海域 2 8 个站位的表层水样，运用建立的固相萃取一超高压液相色谱串联质谱 ( s p e u p l c m s m s ) 法进行了2 4 种抗生素残留的分析。结果显示，氟甲 砜霉素( 2 1 - 2 3 0n g l ) 、磺胺嘧啶( 1 8 - - - - 1 6 2 7n g l ) 、磺胺二甲基嘧啶( 1 7 1 5 3 3n g l ) 、磺胺间甲氧嘧啶( 1 5 - - - 5 0 2n g l ) 和磺胺甲恶唑( 4 2 - 4 0 8n g l ) 在调查区域的全部2 8 个站位中均被检出；氯霉素( 0 5 - 5 9n g l ) 和磺胺对 甲氧嘧啶( 1 2 - 1 1 3n g l ) 在大部分站位被检出；甲砜霉素( 1 0 - - 2 6 n g l ) 和磺胺吡啶( o 3 - - 2 0n g l ) 只在九龙江口附近的站位中被检出；氧氟沙星 ( 0 9 - 5 8n g l ) 只在厦门近岸海域的站位中被检出。与国外一些研究只在 河流的局部区域检出少数抗生素的结果相比，九龙江口流域和厦门近岸海域 的抗生素污染值得关注。 关键词：抗生素；固相萃取；超高压液相色谱串联质谱( u p l c m s m s ) ；九龙 江流域：厦门近岸海域：河水；海水。 a b s t r a e t a b s t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fl i v e s t o c ka g r i c u l t u r ea n da q u i c u l t u r e ，t h et y p e s a n dd o s a g eo fa n t i b i o t i c sa r ek e e p i n go ni n c r e a s i n g t h ea n t i b i o t i cr e s i d u e si na n i m a l p r o d u c t sh a v en o to n l yc a u s e df o o ds a f e t yp r o b l e m s ，b u ta l s oi m p o s e dp r e s s u r e so n e n v i r o n m e n t a lh e a l t ha n de c o s y s t e ms e c u r i t y ，a sc o n s i d e r a b l ea m o u n to ft h e mb e i n g r e l e a s e di n t ow a t e re n v i r o n m e n tt h r o u g ht h ed i s p o s a lo fa n i m a lf e c e s ，m e d i c a lw a s t e s a n dd i r e c tf e e d i n gj e t t i s o n i nt h i sw o r k ，am e t h o df o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f 2 4c o m m o n l yu s e da n t i b i o t i c si nr i v e ra n ds e aw a t e rs a m p l e su s i n gs o l i dp h a s e e x t r a c t i o na n du l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dw i t he l e c t r o s p r a y t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ( s p e u p l c - m s m s ) h a s b e e n d e v e l o p e d a n d s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt os u r v e yt h ed i s t r i b u t i o no ft a g e ta n t i b i o t i cr e s i d u e si nj i u l o n g r i v e re s t u a r ya n dx i a m e nc o a s t a la r e a t h er e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea st h e f o l l o w i n g s ： ( 1 ) e s t a b l i s h m e n to fs i m u t a n e o u sd e t e c t i o nm e t h o df o r2 4a n t i b i o t i c su s i n gu l t r a p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dw i t he l e c t r o s p r a yt a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ah i g hs e n s i t i v e ，a c c u r a t ea n de f f e c t i v em e t h o df o rt h es i m u l t a n e o u s d e t e c t i o no f2 4a n t i b i o t i c su s i n gu l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw i t h e l e c t r o s p r a yt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( u p l c - m s m s ) u n d e rm u l t i p l er e a c t i o n m o n i t o r i n gm o d e ( m r m ) w a sd e v e l o p e d t h ee f f e c t so fc o m p o s i t i o na n dg r a d i e n t e l u t i o np r o g r a mo ft h em o b i l ep h a s eo nt h es e p a r a t i o na n dm sp a r a m e t e r s ，s u c ha s c a p i l l a r yv o l t a g e ，c o n ev o l t a g ea n dc o l l i s i o n e n e r g yw e r ei n v e s t i g a t e da n d o p t i m i z e d u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ed e t e c t i o nl i m i t so fa n t i b i o t i c sa l l r e a c h e d0 5 增几，e x c e p tt e t r a c y c l i n e sa t10 腭几t h el i n e a r i t yr a n g e so f c h l o r a m p h e n i c o l s ，t e t r a c y c li n e s ，q u i n o l o n e sa n ds u l f o n a m i d e sw e r e0 5t o10 0 0 0 叫l ，l ot o10 0 0 0 嵋几a n d0 2t o10 0 0 0 甥几，r e s p e c t i v e l y t h ec o 盯e l a t i o n c o e f f i c i e n t sw e r ea l lb e t w e e n0 9 9 8 2a n d0 9 9 9 9 t h em e t h o di sh i g hs e n s i t i v e ， r e p r o d u c i b l e ，s i m p l ea n df a s t ( 2 4t a r g e ta n t i b i o t i c sw e r ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s i l l a b s t r a c t a n dt h ee n t i r ed e t e c t i o np r o c e s sc o u l db ea c c o m p l i s h e dw i t h i n1h ) ( 2 ) d e v e l o p m e n to fs o l i dp h a s ee x t r a c t i o nm e t h o df o rs i m u t a n e o u se x t r a c t i o no f 2 4a n t i b i o t i c sf r o mr i v e ra n ds e aw a t e rs a m p l e s a s i m p l ea n de n r i c h m e n t c l e a n u p e f f e c t i v es o l i dp h a s ee x t r a c t i o nm e t h o df o r t h es i m u l t a n e o u se x t r a c t i o no f2 4a n t i b i o t i c si nr i v e ra n ds e aw a t e rs a m p l e su s i n g h l b c a r t r i d g ew a sd e v e l o p e d t h ee n r i c h m e n ta n dc l e a n u pe f f e c t so f5d i f f e r e n t t y p e so fs p ec a r t r i d g e sw e r ec o m p a r e d ，a n dv a r i o u si n f l u e n t i a lf a c t o r ss u c ha sp h a n ds a l i n i t yo fw a t e rs a m p l e s ，b r e a k t h r o u g hv o l u m e ，f l o wr a t ea n dt h ee l u t i o n s o l v e n ta n dv o l u m e ，w e r ei n v e s t i g a t e d u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，r e c o v e r i e s a n dr e l m i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s ( r s d ，n = 4 ) a t5 0n g l ，2 0 0n g la n d10 0 0 n g ls p i k i n gl e v e l sw e r e5 0 1 9 4 7 ，1 6 9 7 f o rr i v e rw a t e rm a t r i x ， 4 6 7 - - 81 2 4 8 - 9 4 f o rs e a w a t e rm a t r i x , r e s p e c t i v e l y t h em e t h o d d e t e c t i o nl i m i t so ft a r g e ta n t i b i o t i c sc o u l dr e a c h1 0n g r c ，e v e nl o w e rw i t ht h e e x c e p t i o no ft e t r a c y c l i n e sa t2 0n g l u s i n gs u r r o g a t e sa sq u a l i t yc o n t r o lm e t h o d ， t h ep r o p o s e dm e t h o dc o u l dm e e tt h er e q u i r e m e n tf o rd e t e c t i n gt r a c ea n t i b i o t i c r e s i d u e si na q u a t i ce n v i r o n m e n t s ( 3 ) d i s t r i b u t i o ns u r v e yo f2 4a n t i b i o t i c si nj i u l o n gr i v e re s t u a r ya n dx i a m e n c o a s t a la r e as u r f a c ew a t e r t h ee x i s t e n c ea n dd i s t r i b u t i o no f 2 4a n t i b i o t i c si nj i u l o n gr i v e re s t u a r ya n d x i a m e nc o a s t a la r e as u r f a c ew a t e rw e r es u r v e y e di nd e c e m b e r2 0 0 6a n da p r i l 2 0 0 7u s i n ge s t a b l i s h e ds p e - u p l c - m s - m sm e t h o d r e s u l t si n d i c a t e dt h a t f l o r f e n i c o l ( 2 1 - - 2 3 0n g l ) ，s u l f a d i a z i n e ( 1 8 16 2 7r i g l ) ，s u l f a m e t h a z i n e ( 1 7 1 5 3 3n g l ) ，s u l f a m o n o m e t h o x i n e ( 1 5 5 0 2n g l ) a n ds u i f a m e t h o x a z o l e ( 4 2 - - 4 0 8n g l ) w e r ed e t e c t e di na l lo f t h e2 8s a m p l i n gs t a t i o n s ，c h l o r a m p h e n i c o l ( o 5 5 9n g l ) a n ds u l f a m e t e r ( i 2 11 3n g l ) w e r ed e t e c t e di nm o s ts a m p l i n g s t a t i o n s ，t h i a m p h e n i c o l ( 1 0 2 6n g l ) a n ds u l f a p y r i d i n e ( o 3 2 0n g l ) w e r e f o u n do n l yi ns a m p l i n gs t a t i o n sn e a rj i u l o n gr i v e re s t u r a r y , a n do f l o x a c i n ( 0 9 - - 5 8 n g 几) w a sf o u n do n l y i n s a m p l i n gs t a t i o n sn e a rx i a m e nc o a s t a la r e a i v a b s t r a c t c o m p a r e dw i t ht h er e s e a r c hr e s u l t sf r o mf o r e i g nc o u n t r i e s ，t h es t a t u so fa n t i b i o t i c p o l l u t i o ni nj i u l o n gr i v e re s t u a r ya n dx i a m e nc o a s t a la r e as h o u l db eo fg r e a t c o n c e m k e y w o r d s ：a n t i b i o t i c ；s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) ；u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dw i t ht a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( u p l c m s m s ) ；j i u l o n g r i v e re s t u a r y , x i a m e nc o a s t a la r e a ；r i v e rw a t e r ；s e aw a t e r 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明 确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：荀御为文 彦年e 月7 e l 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( “ ( 请在以上相应括号内打搿刀) 作者签名：易砰银日期： 导师签名泸弓多日期- 乙o o 髟年 月 7 日 俾6 月p 夕日 第1 章绪论 第1 章绪论 与化学肥料、农药、多氯联苯、p o p s 等化学品所引起的环境问题受到的长 期、广泛关注相比，抗生素作为人们日常生活接触最为频繁、用量最大的一类化 学品，其环境行为和效应直到1 9 9 0 年代后期才受到关注i l 】。这类药物通常具有 与许多有害的外源性物质( x e n o b i o t i c s ) 相似的结构和理化行为，如能够穿过细 胞膜的亲脂性基团；较高的稳定性以避免在产生治疗效应前失活；易于产生生物 累积等。其通过多种途径进入环境后，可能抑制环境中有益微生物的活性、刺激 病原菌产生抗药性，从而对陆生或水生生态系统产生负面效应【l 硎。 1 1 主要抗生素类药物及其使用状况 1 1 1 主要的抗生素类药物 抗生素( a n t i b i o t i c s ) 是生物，包括微生物、植物和动物在内，在其生命活 动过程中所产生的( 或由其他方法获得的) ，能在低微浓度下有选择地抑制或影 响它种生物功能的有机物质【3 一钉。自1 9 4 0 年青霉素应用于临床以来，人类开始广 泛使用抗生素，目前临床上常用的即达数百种【5 】。抗生素在细菌性疾病的治疗中 发挥了极其重要的作用，目前主要类型如下： ( 1 ) 氯霉素类抗生素：一种由委内瑞拉链霉菌中分离提取的广谱抗生素。对许 多需氧革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、厌氧的拟杆菌、立克次氏体、衣原体 及菌质体都有抑制作用，尤其对沙门氏菌属、流感杆菌和拟杆菌属等有良好的抗 菌能力。氯霉素使用不当可致新生儿血液循环障碍、呼吸功能不全、发绀、腹胀 ( 即“灰婴综合症”) 。如在妊娠末期大量使用，可引起新生儿血小板减少症、再 生障碍性贫血或胎儿死亡。甲砜霉素和氟甲砜霉素免疫抑制作用比氯霉素强且具 有一定的繁殖毒性。 ( 2 ) 四环素类抗生素：具有共同的基本母核氢化并四苯，仅取代基有所不同的 一类化合物。它们是两性物质，通常在碱性水溶液中易降解，酸性水溶液中较稳 定，故临床一般用其盐酸盐。常用的有四环素、土霉素、金霉素和强力霉素等。 该类药物使用不当可致牙釉质形成不全，引起“四环素牙”，骨骼、心脏畸形，先 第1 章绪论 天性白内障，肢体短小或缺损，新生儿溶血性黄疸，最严重者可出现脑核性黄疸 甚至死亡： ( 3 ) 喹诺酮类抗生素：是人工合成的含有4 喹酮母核的一类抗菌药物，按发明 先后及其抗菌性能的不同分为四代，常用的有嗯喹酸、氧氟沙星、恩诺沙星、环 丙沙星等。这类药能永久性损伤幼年动物承重关节部位的软组织，产生承重关节 及其它关节病。 ( 4 ) 磺胺类药物：为氨苯磺胺( 简称磺胺) 的衍生物。磺胺的分子中含有一个 苯环，一个对位氨基和一个磺酰胺基，不同的化学基团取代磺酰胺基上的氢原子 即产生了大量有效的衍生品种。临床常用的有磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑和甲氧苄啶 等。滥用该类药物可能导致高胆红素血症、脑核性黄疸，损害肾功能，甚至新生 儿畸形。 ( 5 ) 大环内酯类抗生素：以大环内酯为母体、通过羟基以苷键和1 3 个糖分子 相连的抗生素，临床常用的有红霉素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素和麦迪霉素等。 长期大量应用该类药物可引起胆汁郁积，肝酶升高等，并对中枢神经系统有副作 用，如产生幻觉、烦躁、焦虑、头晕、失眠、恶梦或意识模糊等。 ( 6 ) b 内酰胺类抗生素：化学结构中具有p 内酰胺环的、使用量最大的一类抗 生素。临床常用的有阿莫西林、安苄西林、青霉素和头孢氨苄等。该类药物本身 具有一定的刺激性，能引起部分人群的过敏性反应。 1 1 2 抗生素的使用状况 抗生素既用于治疗人体疾病，也用于治疗和预防畜禽、水产品的细菌性病害。 人用抗生素方面，据不完全统计，在欧美等发达国家，抗生素的使用量大致 占所有药品的l o 左右。瑞士人每年服用的抗生素约3 4t ，并由1 9 9 2 年开始维 持这个数量，其中p 内酰胺类抗生素( 包括青霉素类和头孢菌素类) 所占比例最 大，接近1 8t 年，其次分别是磺胺类5 5t 年、大环内酯类4 3t 年和氟喹诺酮类 3 9t 年【6 1 ；1 9 8 8 到1 9 9 3 年间，瑞典的抗生素用量保持在3 5t 年 7 1 ；1 9 9 5 年，丹 麦有5 2 万人共计使用了3 7 7t 抗生素 2 1 。在我国人用抗生素的用量估计占到所 有药品使用量的3 0 左右，基层医院甚至高达5 0 i 引。 水产和畜禽养殖中使用抗生素治疗和预防细菌性病害始于2 0 世纪5 0 年代， 2 第1 章绪论 随着畜牧业和水产养殖业的迅速发展，抗生素作为兽药的使用范围和用量日益增 大。据统计，我国每年大约有7 5 0 1 0 0 0t 金霉素、5 0 0 - 7 0 0t 土霉素、4 0 0t 诺 氟沙星、1 0 0t 环丙沙星、1 5t 氧氟沙星用于动物的饲料添加剂。2 0 0 3 年，我国 甲砜霉素、氟甲砜霉素的兽药使用量大约为4 0 0t ；而磺胺类抗生素的总产量突 破2 0 0 0 0t ，其中大约有4 5 0 0t 作为兽药在中国境内使用【9 1 2 1 。 在美国，每年生产的抗生素中有4 5 用于动物【i 引，1 9 9 7 - - 1 9 9 8 年的数字表 明有8 0 的青霉素和四环素被用作动物的饲料添加剂：欧洲有5 0 的抗生素用 于动物【1 4 1 。1 9 9 5 年丹麦有4 9 6 8 7t 用于家禽的生长素，另外2 4 9 1t 作为家禽的 食物添加剂【2 】，每年都有总数超过l1 0t 抗生素用作家禽生长素和鱼饲料添加剂。 研究结果表明渔场中使用的抗生素7 0 , - - - 8 0 最终进入水环境，且渔场底部沉积 物已具有一定的抗生素浓度和抗菌活性1 1 5 l 。 目前，越来越多的国家已经意识到滥用抗生素对人类和环境的危害，开始立 法限制抗生素在家禽中的使用。1 9 8 4 年，瑞典有3 0t 抗生素加入饲料中，1 9 8 6 年瑞典政府立法规定抗生素只作为治疗家禽疾病之用，禁止加入饲料，到1 9 9 5 年，用于家禽养殖的抗生素用量降至3t 【7 】。至今为止，人们关心的首要问题是抗 生素在低浓度下是否会对不同地理区域的生态系统构成影响，以及它们在自然环 境中是稳定存在还是易于被微生物降解。欧盟在1 9 9 8 年1 月已经开始执行一项 技术指导，评估家禽用抗生素对环境的危害，并且起草了评估人类抗生素危害性 的技术指导草案。美国食品及药物管理局( f d a ) 也在出版的环境评估技术手 册中明确要求新药开发时必须评估其对环境的危害性。 1 2 抗生素进入水环境的途径及其环境效应 1 2 1 抗生素进入水环境的途径 人和动物服食的抗生素在进入环境之前有两种药理学归宿：( 一) 相当数量 的抗生素会以原药的形式随着粪便和尿液排出体外，进入污水和肥料。有文献研 究了在6 天常规服用抗生素期间人类粪便中几种抗生素的浓度，其中甲氧苄氨嘧 啶和强力霉素浓度范围在3 - - 4 0m g k g 之间，红霉素的浓度范围在2 0 0 - 3 0 0 m g k g 之间【旧，也有文献报道了在养殖场的家禽排泄物中检测到了四环素类及 第1 章绪论 磺胺类药物【7 1 。( 二) 经肝脏代谢产生大量的抗生素代谢物。代谢物通常分为两 类，第一类代谢物是抗生素经过氧化、还原、水解等反应生成的物质，较原药性 质活泼，毒性有时比原药更大；第二类代谢物由抗生素通过与极性的内源性小分 子发生共轭反应而形成，性质较不活泼。由于代谢反应总是使代谢物水溶性增强， 抗生素的代谢物在环境中的迁移能力相对增强，从毒性和对环境的影响范围上都 可能大于抗生素本身。因此，抗生素本体及其代谢产物都应成为环境危害的评估 对象。 抗生素进入环境的途径见图1 1 。抗生素被人体代谢后会以原形或者代谢物 的形式随粪便和尿液排入下水道，进入污水处理厂，最后排入江河湖泊；过期的、 未使用的抗生素被丢弃或者经垃圾填埋进入土壤，经过雨水冲刷和地表径流，土 壤中的一部分抗生素可能进入地下水或者直接被带入江河湖泊。畜禽养殖中使用 的抗生素经动物体代谢后同样一部分进入土壤，另一部分则进入水体；水产养殖 中使用的抗生素则有很大一部分未被生物吸收而直接以原形形式进入养殖水体 7 j ，由此可见，水体是抗生素的一个汇。鉴于水资源和水生生态系统的重要性， 非常有必要对水体中抗生素的行为和效应进行研究。 未使用药品 用于动物用于人类 及 盒 图1 1 抗生素类药物进入环境中的途径 、河水、海水) f i g 1 - 1p a t h w a y so fa n t i b i o t i c si n t oe n v i r o n m e n t s 4 厂理 一她 水 第1 章绪论 1 2 2 水环境中抗生素可能的危害效应 首先，抗生素对水生生物可能存在一定的急性毒性效应和慢性毒性效应，在 抑制或杀灭病原微生物的同时，也可能会抑制环境中有益微生物的活性，干扰甚 至阻断生态系统的物质循环和能量流动。目前抗生素对水生生物的效应方面研究 较少，b a c k h a u s 等【1 8 】通过费氏弧茵的长期生物发光抑制试验对5 大类常用抗生 素进行了研究，结果表明，干扰蛋白质合成以及干扰d n a r n a 合成的抗生素对 该细菌具有强毒性，它们的e c 5 0 大都小于lm g l ；h a n s e n 等1 1 9 】发现在沉积物中 加入1 0 0 - - 4 0 0m g l ( g 的土霉素、恶喹酸和氟甲喹，7 0 天后，硫酸盐还原速率下 降至1 0 以下，微生物密度和活性的抑制与抗生素残留浓度有很强的相关性： w o l l e n b e r g e r 掣2 0 j 研究了集约化渔场中常用的9 种抗生素对淡水甲壳动物大型蚤 的急、慢性毒性效应，发现急性毒性实验中各抗生素的4 8 he c 5 0 多为几百m g l ， 而慢性毒性实验中的e c 5 0 大都下降了一个数量级；h o l l i n g s o r e n s e n 和h o l t e n 等 【2 1 ，捌分别进行了集约化渔场中四环素类药物对藻类的毒性试验，发现该类药物对 铜绿微囊藻的e c s o 为0 0 5 - - 0 2m g l ，而对绿藻的e c s o 则为2 2 - - 4 5m g l ，相 差两个数量级，h o l l i n g s o r e n s e n 对此的解释是，铜绿微囊藻是淡水蓝细菌的一 种，属于原核生物，抗生素能够比较容易地抑制其蛋白质的合成：而绿藻属于真 核生物，抗生素对其抑制需要较高的浓度。 其次，微量抗生素在环境中长期存在可刺激病原菌产生抗药性。曾经有效的 抗生素在低剂量、长期使用后，会出现药效减弱甚至完全消失的现象，这是因为 病原生物对抗生素产生了抗药性，即产生了抗药菌株。传染理论中对抗生素的耐 药性可以从非致病细菌传到致病细菌的耐药性可传递特点已在实验室得到了证 实。尽管抗生素在环境中的含量极微( 通常在p p t 或p p b 级) ，远未达到可以抑 制细菌生长的最小浓度( m i c ) ，但细菌能在此环境中重新恢复并开始增长，并 产生耐药性 2 3 1 。许多研究发现从养殖场沉积物中分离的鱼类病原菌具有不同程度 的抗药性1 2 纯7 1 。h e r w i g 等口8 1 通过加入人工海水改进的培养基来培养网箱鲑鱼养 殖场表层沉积物中的细菌，结果发现从抗生素使用量最大的养殖场沉积物中分离 的细菌产生抗药性的比例最大。n y g a a r d 等【2 7 】把分别用土霉素和奥利索酸处理过 的底泥放置于海底，2 种药物的质量浓度分别为5 0m g k g 和1 0m g k g ，1 年后 检测发现土霉素耐药菌的发生率为1 6 ，而对照的基底值为5 ，并在2 种底泥 第1 章绪论 中都检测到对2 种药物具有交叉耐药性的细菌。在法国，1 9 8 4 - - 1 9 9 3 年间肺炎 克雷伯氏菌对培氟沙星的耐药率由7 5 上升到4 4 4 ；德国n o r b e r t 等【2 9 1 报道， 临床分离的大肠埃希氏菌对氟喹诺酮类的耐药率1 9 9 2 年为1 ，1 9 9 4 年达到 2 4 ；江苏省无锡市某医院在治疗感染人群时发现，对普通青霉素的耐药性高达 8 0 ，对头孢喹啉的耐药性高达4 3 ；中山医大附属医院调查发现，1 9 9 3 1 9 9 5 年大肠埃希氏菌对氧氟沙星的耐药率由2 7 4 上升到4 4 5 ；华西医大调查发现， 1 9 9 3 - - 1 9 9 4 年分离的革兰氏阴性菌对氧氟沙星的耐药率为9 2 6 8 ；雷连成等【2 9 】 1 9 9 9 年检测，吉林省鸡、猪源性大肠埃希氏菌对四环素、红霉素、氨苄西林的 耐药率为7 5 9 6 8 7 。 另外，抗生素在生物体内的残留对人体健康具有潜在的危害。已有研究发现 在使用药物的养殖场附近，野生鱼类及野生贝类体内能够检测到抗生素残0 0 , 3 1j ，在距离施用抗生素渔场8 0m 的位置，从蓝蚌中仍能检测到土霉素。一些研 究表明在鲑鱼养殖场中断使用抗生素l 2 周后，养殖网箱附近的野生鱼类及贝 类体内仍然能够检测到恶喹酸残留【3 2 1 。药物残留对人类健康的危害作用，一般不 表现为急性毒性作用，但是长期摄入含低剂量抗生素类药物的食物，则可能由于 蓄积而导致各器官病变。 有限的研究表明抗生素类药物在环境中的浓度在p p t - - p p m 级，远低于有效 作用浓度，但是p o p s 的研究结果提示我们，简单外推化合物在高浓度下的急性 毒理特征，无法说明其在低浓度下的生物效应【1 1 ，化学品的低剂量、长周期暴露 也可以在个体或生态层次中起负面效应【3 3 ，蚓。 1 3 水环境中抗生素残留的研究进展 食品中抗生素残留的分析方法研究得非常多，但是水环境中抗生素的分析方 法及其相关研究鲜有报道。本部分围绕抗生素残留的仪器分析方法、水环境中抗 生素残留分析的预处理方法以及水环境中抗生素的残留状况研究等方面介绍水 环境中抗生素残留的研究进展。 1 3 1 环境样品中抗生素残留的仪器分析方法 用于抗生素检测的仪器分析方法主要有气相色谱一质谱联用法( g c m s ) 、 6 第1 章绪论 高效液相色谱法和高效液相色谱一质谱联用法( h p l c m s ) 。由于食品和环境介 质中的抗生素残留种类繁多、含量较低( p p t - p p m 级) 并且基体复杂，因此，要 求分析仪器不仅检测范围宽，灵敏度高，还要具备较强的抗干扰能力。表l l 对 上述几种常用的抗生素检测方法进了比较。 表1 - 1 几种常用的抗生素检测方法的比较 t a b 1 - 1t h ec o m p a r i s o no fs e v e r a ld e t e c t i o nm e t h o d sf o ra n t i b i o t i c s 抗生素是水溶性较强、挥发性较差的一类化合物，使用气相色谱一质谱联用 进行分析时必须进行复杂的衍生化反应，反应过程的不可控性对分析结果的重现 性影响较大，目前已不多用，液相色谱方法成为抗生素检测的主流技术。 液相色谱一紫外检测法( l c u v ) 和液相色谱一荧光检测法( l c f l d ) 在 早期的抗生素分析中使用较多【4 5 瑚】，通常只能用于少量几种抗生素的检测，适用 范围较窄，而且灵敏度相对较低。在环境样品的分析应用方面，胡冠九等【4 7 】应用 液相色谱紫外检测法分析了环境水样中的5 种四环素，水样浓缩1 0 0 0 倍的条 7 第1 章绪论 件下方法检测限为0 0 5 一0 1 4 “g l ；p r a t 等【4 8 】应用液相色谱一荧光检测法分析了 水样中的1 0 种喹诺酮类抗生素，水样浓缩5 0 0 倍时的方法检测限为0 1 2 0 n g l 。近十年来，随着质谱技术和l c m s 联用接口技术的发展，尤其电喷雾( e s i ) 和大气压化学电离( a p c i ) 等常压电离方式的日益成熟和推广，大大扩宽了 l c m s 的应用领域【4 9 1 ，不仅检测范围宽，灵敏度高，还具备较强的抗干扰能力， 成为当前抗生素残留检测的权威技术。h i r s c h 等【5 0 j 应用h p l c e s i m s m s 技术， 成功地同时检测了河水中包括大环内脂、磺胺、四环素和3 - 内酰胺在内的四类 1 8 种抗生素，检测限低至n 叽级；m c a r d e l l 等【6 j 同样应用该技术，成功地检测 了污水处理厂进水口和出水口水中的大环内脂类抗生素残留，5 0 0 0 倍浓缩时， 方法检测限为2 0 3 5 0n g l ；r e v e r t e 等【5 1 】应用h p l c m s 检测了污水处理厂进 水口和出水口水中的四环素类及喹诺酮类抗生素残留，1 0 0 0 倍浓缩时，方法检 测限为4 0 - - - , 6 0n e , l ；z h u 等【5 2 】应用同样的技术检测了地下水和养殖场污水中的 四环素类抗生素残留，5 0 0 倍浓缩时，方法检测限为0 3 - 3 8p g l ；l i n d s e y 等【5 3 】 应用h p l c e s i ( + ) a p c i ( + ) m s 技术，检测了地下水和地表水中的四环素类和磺 胺类抗生素残留，l 0 0 0 倍浓缩时，方法检测限为0 0 5 - - 一5 0n g l 。 1 3 2 水环境中抗生素残留分析的预处理方法 目前，抗生素分析预处理方法分研究主要集中在药物、奶、肉等生物制品以 及饲料等方面，适用的抗生素种类简单、含量通常在p g l ( p p b ) 级甚至更高， 而且基底相对单一。对于通过各种途径进入水环境中的抗生素，不仅种类繁多， 同时存在，结构和性质差异较大，而且稀释作用使其多以n g l ( p p t ) 级甚至更 低的浓度存在【5 4 ，强】，加之不同水体的干扰物质状况不同，因此，水样中抗生素 的预处理方法不仅适用的抗生素范围宽，而且还要富集倍数高、净化效果好：因 而成为水环境中抗生素分析的技术难点。 溶剂萃取 5 0 , 5 6 1 ( 包括液液萃取、固液萃取和加速溶剂萃取【5 7 , 5 8 1 ) 、冷冻浓缩 方法即冻q ：法t s o , 5 9 】和固相萃取【6 0 6 i 】是环境样品中抗生素分离富集常常采用的方 法。 溶剂萃取是用萃取剂从液体或固体中提取其中某种组分的操作，快速溶剂萃 取【5 2 l 是在较高的温度( 5 0 0 c - - - 2 0 0 c ) 和压力( 1 0 0 0 - - 3 0 0 0p s i 或1 0 3 一2 0 6m p a ) 8 第1 章绪论 下对固体或半固体样品进行溶剂萃取的方法，温度的增加和压力的提高可以提高 被分析物的溶解能力、降低样品基质对被分析物的作用，或减弱基质与被分析物 间的作用力、加快被分析物从基质中进入溶剂、降低溶剂粘度有利于溶剂分子向 基质中扩散，从而大大提高萃取效率。l o f t i e r 掣6 2 】使用超声波萃取加固相萃取法 富集河水底泥中的抗生素，对大环内脂类抗生素回收率在9 2 1 0 3 之间，对 磺胺类抗生素回收率在1 0 0 1 0 8 之间。 冻干法是指在真空状态下，将冷冻样品中的水分等溶剂通过升华的方式除 去，从而使目标物得以富集，广泛用于生物制品、酶、药和微生物等方面【6 3 】。 h i r s c h 等5 0 , 5 9 1 使用冻干法预处理水样品，该方法对大多数大环内脂类、磺胺类和 b 内酰胺类抗生素的回收率在8 0 以上。 固相萃取法将高选择性的固相萃取剂装填成小柱，一定体积的样品溶液通过 时样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附，然后以合适溶剂将被吸附的组分 洗脱下来。该技术可以在目标组分得到浓缩的同时有效除去干扰物质，目前广泛 用于色谱、质谱、红外光谱、核磁共振等各种分析方法的样品预处理。s a c h e r 等畔】使用固相萃取法对磺胺类抗生素的回收率仅为ll 5 0 ，对罗红霉素、克 拉霉素及氯霉素的回收率在8 2 1 0 3 之间：r e v e r t e 等i ”】使用h l b 固相萃取 法富集了污水厂进水和出水中的抗生素，同时与2 0 0m gi s o l u t ee n v + ( i n t e r n a t i o n a ls o r b c n tt e c h n o l o g y ，m i d g l a m o r g a n ，u k ) s p e 小柱的效果进行 了对比，发现h l b 固相萃取柱对四环素类和喹诺酮类抗生素的回收率在8 6 以 上，而e n v + 固相萃取柱对1 0 0m l 小体积水样的回收率在7 8 以上，对5 0 0m l 的大体积水样的回收率则低至1 8 - 7 1 之间：h l b 固相萃取柱对大体积水样 中四环素类和喹诺酮类抗生素的萃取效率远高于e n v + 固相萃取小柱；z h u 等【5 2 j 使用2 0 0m go a s i sh l b 小柱( w a t e r s ，m i l f o r d ，m a ，u s a ) 和lgc 1 8 小柱 ( e n v i r o n m e n t a ls e p - p a k ) 对地下水中的四环素类抗生素进行富集处理，发现两 者对水样中四环素类抗生素的萃取效率大都在9 0 以上；l i n d s c y 等【5 3 】使用6 0 m gh l b 小柱萃取了地下水和地表水中的四环素和磺胺类抗生素，回收率在8 3 8 1 0 9 之间，并与5 0 0m gc 1 8 ( w a t e r s ) 小柱和1 5 0m ge n v + ( j o n e s c h r o m a t o g r a p h y ) 小柱的萃取效果进行了比较，发现5 0 0n a gc 1 8 小柱( w a t e r s ) 对四环素和磺胺类抗生素的回收率在8 8 以上，但对磺胺噻唑及四环素类抗生 9 第1 章绪论 素的回收率较差，而1 5 0m ge n v + 小柱( j o n e s ch r o m a t o g r a p h y ) 对磺胺类抗生 素回收率达7 9 以上，对四环素类抗生素则无富集效果。 从文献资料看，对于水环境中抗生素药物残留的富集预处理多采用固相萃取 法来实现，采用不同的固相萃取小柱，针对某一类结构和性质相似的抗生素进行 分离富集，因此简单、快速并可用于不同类型抗生素的同时固相萃取方法一直是 国内外相关研究关注的前沿技术之一。 1 3 3 不同水环境中抗