（发酵工程专业论文）l缬氨酸5l罐发酵条件研究.pdf

天津科技大学硕士学位论文 摘要 本论文根据代谢控制发酵和代谢流分析理论，研究了l 一缬氨酸高产菌5 l 罐的发酵条件。主要研究内容和结果如下： ( 1 ) 以已有的摇瓶分批发酵最优条件为基础，对菌株t v 2 5 6 4 进行了5 l 发 酵罐分批发酵试验。首先研究了不同碳氮比对缬氨酸发酵的影响，结果表明高 碳氮比或高浓度初糖不利于缬氨酸发酵。 ( 2 ) 根据5 l 发酵罐中溶氧变化情况及不同盥扫对缬氨酸发酵的影响，结合 缬氨酸发酵的生长与生产耦合性研究及发酵过程中代谢流分配的特点，得到了 两阶段供氧的控制方式。以5 l 罐分批发酵试验数据为依据，利用m a t l a b 工 具软件建立了菌体生长、产物形成和底物消耗的动力学模型，实验值与拟合值 接近，拟合情况较好。 ( 3 ) 构建l 缬氨酸生产菌t v 2 5 6 4 的代谢网络，依据代谢流分析原理，应 用m a t l a b 线性规划计算得到了l 一缬氨酸生产菌不同发酵时期的代谢流分配。 通过分析葡萄糖经e m p 、h m p 与t c a 循环以及关键性节点g l c 6 p 、p e p 和 p y r 的代谢流分配，为发酵过程控制提供理论指导。 ( 4 ) 以分批发酵最优条件为依据，对菌株t v 2 5 6 4 进行了5 l 罐补料分批发 酵研究。进一步研究了溶氧在补料发酵方式下的变化情况，寻找到适宜的供氧 方式，即根据菌体生长的四个不同阶段：延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡 期分别调节不同转速，以满足菌体生长和产物合成的溶氧需求。 ( 5 ) 确定了最佳发酵工艺，即初始低糖低铵，产酸期控制糖浓度在2 0 9 l 以下，发酵前期及后期补加少量玉米浆，自动流加氨水控制p h 值，发酵过程根 据菌体生长的四个阶段分别调节不同转速，以满足生长和产酸的溶氧需求，在 此工艺下，菌体生长良好，发酵后劲足，产酸期延长，到后期流加8 0 的浓糖， 发酵7 2 h 产l 一缬氨酸5 2 6 8 l 。 ( 6 ) 利用不锈钢膜过滤技术对缬氨酸发酵液进行前处理，去除菌体和蛋白 质，效果良好，去除蛋白率可达7 9 8 9 。并初步研究了缬氨酸的提取工艺。 关键词：l 缬氨酸，黄色短杆菌，代谢流，分批发酵，补料分批发酵，发酵 动力学，膜过滤。 a b s t r a c t a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h et h e o r yo fm e t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t i o na n dm e t a b o l i cf l u x a n a l y s i s ，t h e d i s s e r t a t i o nf o c u s 6 so nt h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so fl - v a l i n e h i g h y i e l d i n g s t r a i n t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) b a s e do nt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so ff l a s k ，f e r m e n t a t i o ni n5 l f e r m e n t e r o fl - v a l i n eb yt v 2 5 6 4h a sp r o c e e d e d t h ee f f e c to fd i f f e r e n tc no nf e r m e n t a t i o n w a s s t u d i e d ，a n dt h er e s u l t ss h o wh i g hc no rh i g hc o n c e n t r a t i o no fi n i t i a lg l u c o s ei s a d v e r s et of e r m e n t a t i o no fv a l i n e ( 2 ) a c c o r d i n gt ot h ec h a n g eo fd o i n5 lf e r m e n t e r , w i t hd y n a m i c sa n a l y s i s d u r i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s ，t w os t a g e so x y g e ns u p p l yw a sp r o v i d e d t h el - v a l i n e b a t c hf e r m e n t a t i o nk i n e t i c sw a ss t u d i e db ym a t l a bt o o lb a s e do nt h ee x p e r i m e n t a l d a t af r o m5 - l i t e r f e r m e n t e r sb a t c hf e r m e n t a t i o n t h r e ek i n e t i cm o d e l sw e r e c o n s t r u c t e dw h i c hc o u l dr e f l e c tt h e r e g u l a r i t yo fg r o w t h ，p r o d u c tf o r m a t i o na n d s u b s t r a t ec o n s u m p t i o ni nt h ep r o c e s so f b a t c hf e r m e n t a t i o n ( 3 ) t h em e t a b o l i cn e t w o r kw a sp r o p o s e df o rl - v a l i n ep r o d u c i n gs t r a i n t h e m e t a b o l i cf l u xd i s t r i b u t i o n so fb r e v i b a c t e r i u m1 l a v u mt v 2 5 6 4d u r i n gt h ed i f f e r e n t f e r m e n t a t i o n p e r i o d w e r ec a l c u l a t e d b y l i n e a r p r o g r a m o fm a t l a bs o f t w a r e a c c o r d i n gt om e t a b o l i cf l u xa n a l y s i st h e o r y ，t h em e t a b o l i cf l u xd i s t r i b u t i o n so fe m p h m p , t c ac y c l ea n dt h ek e yp r i n c i p l en o d e so fg l c 6 p , p e pa n dp y rw e r e a n a l y z e d a tt h es a m et i m ei t c a nb ei n d i c a t e dt o p r o v i d et h e o r yg u i d e f o rt h e f e r m e n t a t i o np r o c e s s ( 4 ) f e d b a t c hf e r m e n t a t i o nw a ss t u d i e dw i t ht v 2 5 6 4 a c c o r d i n g t ot h eo p t i m u m c o n d i t i o no fb a t c h f e r m e n t a t i o n a c c o r d i n g t ot h e c h a n g e o fd oi nf e d b a t c h f e r m e n t a t i o n ，t h eo p t i m i z e do x y g e ns u p p l yw a sp r o v i d e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s w a so b t a i n e d ，w h i c hw e r et h et e c h n o l o g yo fl o wg l u c o s ea n da m i n o ，f e e d i n gc o r n s y r u pl i q u i di nt h ef o r m e ra n dl a t e rp h a s eo ff e r m e n t a t i o n ，c o n t r o l i n gp h b yf e e d i n g a m i n ol i q u i d ，f e e d i n g8 0 g l u c o s ei nl a t e rp h a s e p r o d u c t i o no fl - v a l i n er e a c h e d 5 2 6 8 9 la f t e rf e r m e n t a t i o nf o r7 2h o u r su n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ( 5 ) b ym e m b r a n ef i l t r a t i o n ，t h ec e l l sa n dp r o t e i nw e r el e a c h e d t h er e s u l t sa r e p e r f e c t ，a n dt h er e m o v a lr a t eo fp r o t e i ni s7 9 8 9 k e y w o r d s ：l - v a l i n e ，b r e v i b a c t e r i u mf l a v u m ，m e t a b o l i c f l u x ，b a t c h f e r m e n t a t i o n ，f e d b a t c h f e r m e n t a t i o n ，f e r m e n t a t i o nk i n e t i c s ，m e m b r a n e f i l t r a t i o n n 天津科技人学顶士学位论文 1 前言 1 1l - 缬氨酸的理化性质 l 瑚4 氨酸( l 。v a l i n e ) 于1 9 0 i 年从酪朊蛋白中发现，化学名称为l - 一氨 基异戊酸，分子式为c 5 h n o z ，相对分子质量为1 1 7 1 5 。其结构式与立体结 构式分剐见图1 1 和图1 - 2 。 图1 - 1l 缬氨酸钓结构式图1 - 2l 缬氮酸的立体结构图 f i g l 一1t h es t r u c t u r eo f l - v a l i n ef i g1 - 2t h ec u b i cs t r u c t u r eo fl - v a l i n e 呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度：0 9 c 为8 3 a g m ， 2 5 为8 8 5 9 l ，5 0 。c 为9 6 2 9 l ，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮f c = l - - 2 9 m e , 在5 m o l lh c i 中) 。等电点p i 值为5 9 6 ，比旋光度 【d 瑶= 2 8 3 。( 5 n h c i ，c = i ) ，熔点3 1 5 。c 。 1 2l 缬氨酸的用途 l 厂缬氨酸属于分支链氨基酸( b r a n c h e dc h a i na m i n oa c i d ，b c a a ) ，足人 体八种必需氨基酸之一，具有多种生理功能，广泛应用于医药、食品及调味 刺、动物饲料和化妆品的制造，尤其是在医学研究和治疗中的作用，开益受 到重视。 1 2 1 在医药上的应用 缬氨酸是必需氪基酸之一，具有多种生理功能，人体不能自身合成，只 能从外界摄取。当缺乏缬氨酸时，人体机能发生各种紊乱。实验表明缬氨酸 不足时，大鼠中枢神经系统功能会发生紊乱，共济失调而出现四肢震颤。通 过解剖切片脑组织，发现有红核细胞变性现象。在医药t 缬氨酸常用于制造 复合氨基酸输液和氨基酸注射液以治疗各种疾病，如m 脑屏障、肝昏迷、慢 性肝硬化以及肾功能衰竭，败血症及术后糖尿瘸，另外也可用于先天性代谢 缺陷病的膳食治疗，加快外科创伤愈合和儿申瘸患者的营养支持等f 2 。晚期肝 硬化病人囡肝功能损害，易形成高肤岛素血症，致使血中支链氮基酸溅少， ho0 2 c h hn ( ct l t fc 飓 强 吁 1 前言 支链氨基酸和芳香族氨基酸的比值由正常人的3 0 3 5 降至1 0 1 5 ，故常用 缬氨酸等支链氨基酸的注射液治疗肝功能衰竭等疾病。 最近，人们发现l 缬氨酸是合成多肽药物缬氨霉素( 环肽类化合物，环 孢菌素) 的前体物。缬氨霉素被认为是生物体内钾离子穿过生物膜的载体之 一，其与钾离子配位可形成c 3 的对称构象，在生物体的生命活动中扮演着重 要的角色。i 广缬氨酸作为氨基酸原料药中用量最大的品种之一，具有非常广 泛的应用前景。 1 2 2 在食品上的应用 l 广缬氨酸在食品工业上可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。米 制糕饼中添加l 一缬氨酸( 1 9 k g ) ，产品有芝麻香，用于面包办能改善风味。 添加有缬氨酸的一种美容食品氨基酸埃丝肽，能有效改善现代女性睡眠不足， 皮肤粗糙，解除疲劳，增强精力。老年人服用，还能使血清白蛋白值上升， 肝功能提高，提高整体免疫能力。l - 缬氨酸也可用作氨基酸能量饮料与运动 员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。 1 2 3 在饲料上的应用 研究发现，将l 广缬氨酸用于猪饲料中，对母猪乳腺组织分泌乳汁有重要 的促进作用。将其用于雏鸡饲料中，可提高雏鸡对鸡新城疫病毒的免疫能力。 1 3 l 缬氨酸的生产方法 目前，l 一缬氨酸的生产方法有提取法f 扪、合成法队发酵法 5 瞎。 1 3 1 提取法 从动物血粉和蚕蛹及毛发水解液中，应用离子交换技术从混合氨基酸中 分离l - 缬氨酸。工艺过程如下： 猪m 粉笃水解液捌坚垡骘亮氨酸，缬氨酸尘旦l 缬氨酸 此方法分离的效率高，提取操作简化，生产周期短，但是成本高，己成 为氨基酸生产的关键技术而被普遍应用，但能直接用于生产的详细介绍并不 多。猪血粉中提取l _ 缬氨酸的回收率为1 4 7 ；蚕蛹水解液中分离l - 缬氨酸， 回收率为2 3 6 8 。 1 3 2 化学合成法 化学合成法很多，一种以异丁醛为原料，与氨及氰氢酸作用生成胺腈， 再水所牟得d l - 缬氨酸，经化学法或酶法拆分得l 缬氨酸。化学反应式如下： 天津科技人学硕士学位论文 ( c r + c h c h on i - 1 3n a c n ( c h 3 ) 2 c h 年h c n ( 胺腈) 一d l 一( c h 3 ) 2 c h f h c o o h l 一( c h 3 ) z c h c h c o o h i f n h 2n h zn h z 此方法的得率为3 6 4 0 。合成法所得产物为无旋光性的消旋物，须 经外消旋拆开。因此化学合成法生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多 副产物。 1 3 3 微生物发酵法 利用微生物发酵法生产。缬氨酸，具有原料成本低，反应条件温和及易 实现大规模生产等优点，是一种非常经济且目前广泛采用的生产方法。直接 发酵法是利用某种能够合成所需氨基酸的微生物，通过对其诱变处理，选育 出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑 制和反馈阻遏作用，从而使其过量积累所需氨基酸。技术路线如下： 野生菌种堡墼营养缺陷型及抗性突变株种子培养条件优化_ 卜生产菌种发酵条件优化大量l 广缬氨酸 目前，世界上l - 缬氨酸均采用直接发酵法生产。微生物转化法即在发酵 过程中添加特异的前体物质经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸，山于 其前体物质稀少或价格昂贵，增加了生产成本，目前已很少采用此法。因此， 以微生物发酵法生产l 缬氨酸的研究具有重要的意义。 1 4l 缬氨酸的测定方法 l 缬氨酸的定性和定量测定方法有生物圳9 定法、交流示波极谱滴定法、 层析法、氨基酸自动分析仪测定法等【6 j 。 生物测定法是用l - 缬氨酸菌作指示菌，用添加有除l 广缬氨酸以外的氨基 酸的基本培养基与指示菌混匀倾注平板。在该平板上点种待测菌或在滤纸片 上滴加离心过的发酵液。培养后，依据指示菌生长罔的有无及大小，与标准 样对照比较，从而定性和估测产酸多少。 交流示波极谱滴定法可以测定三种等电点相近的氨基酸，即l _ 亮氨酸、 l - 异亮氨酸、l 缬氨酸混合液中每种氨基酸的含量，效果好，终点直观，操 1 前言 作简便，结果准确，目设备简单，成本低。 氨基酸自动分析仪是自动化程度高的仪器，测定结果准确，但仪器价格 昂贵，测定成本高。 层析法即色层分析法( c h r o m a t o g r a p h y ) ，利用各种氨基酸成分的分配系数 之间的差异分离混合物。目前使用较广的包括柱层析、滤纸层析和薄层层析、 离子交换柱层析以及气相色谱和高效液相色谱。 滤纸层析常用展丌剂为：正丁醇：冰醋酸：水= 4 ：1 ：2 ；显色剂为5 9 l 茚 三酮丙酮溶液：显色温度1 0 0 。c ，根据色斑r f 值定性。将色斑洗脱后测吸光 度，根据标准曲线的回归方程可计算样品的l 广缬氨酸含量。此方法测定精确 度不高。 气相色谱法( g a sc h r o m a t o g r a p h y ) 具有微量快速的优点，但它要求样品 能气化和热稳定性高。氨基酸以以由于含有各种极性基团，气化十分困难， 因此必需将其转化成易挥发的化合物才能进行气相层析。高效液相色潜( h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yh p l c ) 是一项快速、灵敏、高效的分离技 术。已在许多实验室部分或全部地代替了氨基酸自动分析仪，广泛应用于多 种生物样品内氨基酸的检测【7 】。l 缬氨酸本身不能发射荧光，又不具有紫外吸 收的特性，需制成某种形式的衍生物后才能检测。衍生方式可分为两种，即 柱前衍生及柱后衍生【8 】o 迄今报道的柱前衍生试剂很多 9 1 ，主要有邻苯一：甲醛 ( o p a ) 、异硫氰酸苯( p i t c ) 、月酰氯( d n s c l ) 、磺酰氯二钾胺偶氮 苯( d a b s c l ) 、氧甲酸芴甲酯( f m o c ) 、2 、4 - 二硝基苯( f d n b ) 等。与 氨基酸分析的自动分析不同，h p l c 适用性极广，测定结果准确性好，但设 备昂贵，测样成本高。 1 5l 缬氨酸高产菌的选育 1 5 1l 缬氨酸的生物合成途径 l 瑚氨酸的生物合成途径如图1 3 所示。由图1 3 可知，丙酮酸是形成缬 氨酸的直接前体物，从丙酮酸形成l - 缬氨酸是l 缬氨酸生物合成途径的关键 途径。丙酮酸在乙酰乳酸合成酶的催化下形成a 一乙酰乳酸，a 一乙酰乳酸在二 羧酸还原异构酶的催化下发生甲基自动移位，形成a ，b 一二羟基异戊酸。该 产物经二羟基脱水酶催化脱水后形成a 一乙酰异戊酸，u 乙酰异戊酸在转氨酶 的作用下形成l 厂缬氨酸。 4 天津科技人学硕士学位论文 厂一天挚酸 高譬氨酸草一乙酸 葡萄i 糖 jf 图1 3l 厂缬氨酸生物合成途径 f i g1 - 3b i o s y n t h e s i sp a t h w a y o fl - v a l i n e 1 5 2 代谢调节机制 由上图可知，催化丙酮酸生成a 一乙酰异戊酸的酶系，与催化。酮基丁酸生 成d 酮基一0 甲基戊酸的酶系是相同的。此外，l ，亮氨酸、l _ 异亮氨酸和l 缬 氨酸生物合成途径中的最后一步转氨反应都是由同一种转氨酶催化完成的。这 些酶的合成均受到三种分支链氨基酸的协同阻遏。其中a 乙酰乳酸合成酶是 l 缬氨酸生物合成途径中的关键酶，受到l 一缬氨酸的反馈抑制。高j l 一缬氨酸 就要解除l 厂缬氨酸本身对关键酶的反馈抑制，以及解除三种氨基酸对其合成酶 系的各个酶生成的多价阻遏。 编码3 个分支链氨基酸合成酶系的基因组成两个主要的操纵子，即洳和 彪“操纵子，如图1 。4 所示。1 1 v 操纵子包括了i l v g 、i l v e 、i l v d 、i l v a 、i l v c 和i l v b 基因，其中f f v6 1 比) c b ，基因编码了合成l 异亮氨酸和l _ 缬氨酸途径共 用的4 种同工酶，即乙酰乳酸合成酶、l 缬氨酸转氨酶、二羟基脱水酶、乙酰 乳酸异构还原酶，i l v a 基因编码的苏氨酸脱氨酶。在i l v g e d a c b 操纵子巾，转 录叫g e d a 产生一条m r n a ，c 和日则不和它一起转录。操纵子i m 、h 编码 乙酰乳酸合成酶同：卜酶i i i ，其中i l v l 编码大亚基( 催化亚基) ，i l v h 编码小亚基 ( 控制亚基) ，都受该途径终产物的阻遏。此外，所有的结构基因产物都可能受 到多价阻遏。 1 前言 图1 - 4 大肠杆菌l e u 、l l v 操纵子的组织结构 f i 9 1 4t h eg e n es t r u c t u r eo fo p e r o ni ne c o l i l 5 。3l 氆氨酸高产菌的选育 根据l - 缬氨酸的生物合成途径及其代谢调节机制( 如图l 一5 所示) ，l - 缬 氨酸工业发酵高产菌株的选育方法如下： 幽1 5l 缬氨酸生物合成的代谢调节机制 f i g1 - 5m e t a b o l i cr e g u l a t i o nm e c h a n i s m o fl v a l i n eb i o s y n t h e s i s 6 天津科技大学硕+ 学位论文 1 5 3 1 出发菌株的选择 目前，吐界上利用发酵法生产l 缬氨酸的出发菌株有北京棒杆菌【1 1 ( c o r y n e b a c t e r i u m p e k i n e i s e ) ，谷氨酸棒杆菌1 1 2 j ( c o r y n e b a c t e r i u m g l u t a c i u m ) ， 乳糖发酵短杆菌【”i ( b r e v i b a c t e r i u ml a c t o f e r m e n t u m ) ，大肠车t 菌 1 4 l ( e s c h e r i c h i a c o l i ) ，黄色短杆菌i “】( b r e v i b a c t e r i u m 肋v u m ) ，粘质赛氏杆菌 1 6 1 ( s e r r a t i a m a f c e s c e h 5 ) ，芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 1 7 】和埃希氏菌属( e s c h e r i c h i a ) 的菌株等， 这些菌株均可以作为选育l 缬氨酸生产菌的出发菌株。 1 5 3 2 选育营养缺陷型突变株 由图1 5 可以看出，l 缬氨酸和l 广异亮氨酸的生物合成途径是平行进行的， l 一缬氨酸、l 异亮氨酸与l ，亮氨酸的生物合成途径中共用了三种酶：即乙酰乳 酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和转氨酶。选育l - 亮氨酸、l 异亮氨酸营养缺 陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的共用酶系完全用于i 厂缬氨酸的生物 合成，且解除了菌体生成l 缬氨酸酶系的反馈抑制和多价阻遏。同时n 一酮基 异戊酸是合成l _ 缬氨酸和l 亮氨酸的共同前体物。切断l 一亮氨酸的合成途径 可以节省碳源。k a t a s u r a d a ”j 等人以北京棒杆菌和谷氨酸棒杆菌为出发菌株， 通过选育l - 异亮氨酸与l - 亮氨酸缺陷型突变株使l 缬氨酸的产量达1 9 2 8 l 。 1 ，5 3 3 选育营养缺陷型回复突变株 选育n 乙酰乳酸合成酶缺陷突变株的回复突变株可以解除l - 缬氨酸的反 馈抑制以及l ，亮氨酸、l 异亮氨酸和l ，缬氨酸引起的多价阻遏。这是因为当某 一结构基因发生突变后，结构基因所编码的酶就因结构的改变而失活。而经过 回复突变后，该酶的活性中心结构就可以复原，而调节部位结构常常没有恢复， 导致酶活性恢复，但是反馈抑制却已解除或程度较轻。 1 5 。3 4 选育结构类似物突变株 由图1 5 分析可知，菌体存在自身的反馈调节，即l _ 缬氨酸合成中的第一 个限速酶一乙酰乳酸合成酶受l - 缬氨酸的反馈抑制，同时l 缬氨酸和l - 异亮 氨酸的合成酶系受三个末端：即l 厂缬氨酸、l 异亮氨酸和l j 亮氨酸的多价阻遏。 使其不能大量积累l 缬氨酸。可选育l - 缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除 i 厂缴氨酸的反馈调节。常用的l 一缬氨酸结构类似物有2 一噻唑丙氨酸( 2 1 a ) 、 a 氨基丁酸( a a b ) 、氟亮氨酸、正l 缬氨酸等。徐旭东| l9 j 等人以乳糖发酵 短杆菌x t 4 为出发菌株，采用亚硝基胍( n t g ) 诱变处理，获得一株积祟l 缬氨酸的高产菌a 1 5 ，此菌株具有2 一噻哗丙氨酸( 2 - t a ) 和c t 一氨基丁酸( a ，a b ) 抗性，摇瓶产酸达3 3 珂l 。 t 前言 c h 3 - c h 2 - m i c h - c o o h 、- 芦c - - c h 2 - c h 。- c o o h 掣一。刚篇n h 2h 吖 2 h 2 n o 刚麓 图1 - 6 几种氨基酸类似物的结构式 f i g1 - 6m o l e c u l a r s t r u c t u r eo fs e v e r a la m i n oa c i da n a l o g u e s 1 5 3 5 增加前体物质的合成 由图1 5 可以看出l - 缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸，增加前体物质 的积累可有效提高l _ 缬氨酸的产量。据此可以选育以琥珀酸为唯一碳源生长 慢、丙氨酸缺陷型以及氟丙酮敏感突变株来达到目的。也可选育组合型突变株， 如营养缺陷型突变株和抗性结构类似物双重突变株，以提高目的产物的产量。 1 5 3 6 切断进一步代谢途径 在获得大量l 一缬氨酸后，需切断或减弱其向下进行的代谢途径，使积累的 l 一缬氨酸不再消耗。可选育不能以i 厂缬氨酸为唯一碳源生长，即丧失l 缬氨酸 分解能力的突变株。 1 5 3 7 利用基因工程技术构建l 缬氨酸工程菌 操纵子i l v l 、h 编码乙酰乳酸合成酶同工酶i ，受i 广缬氨酸的抑制。通过获 得i l v h 编码的小亚基( 控制亚基) 的突变体，即具有一个或几个氨基酸d n a 的取代、缺失、插入、添加或倒位，它能够与大基起显示乙酰羟酸合成酶 活性但已不受。缬氨酸的反馈抑制，可用于构建高产l 广缬氨酸的工程菌。 i l v a 基因编码的苏氨酸脱氨酶是异亮氨酸合成的关键酶，因此若获得不表 达苏氨酸脱氨酶活性的操纵子，就可以减弱苏氨酸脱氨酶的活性，使得代谢途 径中的4 种同工酶完全用于l - 缬氨酸的合成。可通过诱变野生型的i l v g m e d a 操纵子或通过基因重组技术修饰将i l v a 操纵子失活或将i l v a 基因从i 中敞除。 据报道，埃希氏菌属的微生物因其生长快、遗传分析研究清楚，常用作l 缬氨 酸工程菌的宿主【2 0 。经选育得到一乖 t 突变株，其不利用柠檬酸，以葡萄糖为唯 一碳源，生长需硫辛酸且具有h + a t p 酶缺失。将i l v g m e d a 操纵子的苏氨酸 脱氨酶失活，得到解除型操纵子i l v g m e d a ( a 4 代表缺失i l v a 基因或i l v a 编 码失活的苏氨酸脱氨酶) ，将此d n a 片段引入上述突变株可得到高产l 一缬氨酸 的基因工程菌。 i 2 饱基因主要编码l - 缬氢酸转氨基酶，h o e c h s t 2 1 和m a r q u a r d t t 2 2 1 等将来源 于大肠市l = 菌a t c c l l 3 0 3 的i h , e 基因片段克隆到p b r 3 2 2 质粒中，将重组质粒转 化到犬肠杆菌d g 3 0 中，所构建的工程菌株可以高产l - 缬氨酸。 8 天津科技大学硕士学位论文 1 5 3 8 国内菌种选育工作进展 在六七十年代国外对l - 缬氨酸优良生产菌的诱变育种和代谢调控作了一 些研究，n a k a y a m a 2 3 】等人于1 9 6 1 年选育了具有氨基酸缺陷的l - 缬氨酸生产菌； k i s u m i 2 4 l 于1 9 7 1 年选育g 一氨基丁酸抗性突变株，产l _ 缬氨酸均在3 0 l 左右。 国内菌株产酸水平不高，我国l 广缬氨酸高产菌选育进展如下： 1 9 7 5 年中国科学院微生物研究所氨基酸组【2 5 j 使用北京棒状杆菌a s i 2 9 9 经硫酸二乙酯( d e s ) 诱变处理后，获得一株突变株a s l 5 8 6 ，可积累大量的 l 缬氨酸。在5 0 0 l 发酵罐放大试验中，优化条件一i - 发酵4 3 h ，l - 缬氨酸产量达 2 6 。8 9 l 。 1 9 8 6 年中科院微生物研究所唐任天等【2 6 】利用钝齿棒杆菌a s l 5 4 2 诱变获 得l 一缬氨酸产生菌a s l 0 0 1 ，此菌株带有a h v 、i l e 一标记，在适宜的条件下， 【广缬氨酸积累可达到3 6 州l 。 1 9 8 9 年沈阳药学院黄海华等【2 7 j 以棒状杆菌t 6 1 3 野生菌为出发菌株，经紫 外线和n t g 多次诱变，获得一株新型的l 缬氨酸生产菌1 0 4 ( 2 - t a 。+ a h v + s h l r ) ，其l - 缬氨酸产量可达1 0 9 l 。 1 9 9 4 年刁新民等【28 j 以北京棒杆菌多重抗性突变株1 2 5 为出发菌株，经多次 提取精制条件试验，获得了最佳发酵培养基配方和较佳的生产工艺条件，提取 精制得率达9 5 以上。 1 9 9 5 年江南大学的张伟国等 2 9 j 以d e s 诱变处理黄色短杆菌x q 5 1 2 2 ，得到 突变株v 3 3 6 ( l e u 一+ d a b + a h v ) ，在1 0 葡萄糖培养基中可积累l 缬氨酸 2 3 9 l 。以n t g 诱变v 4 1 5 3 ，得到一株突变株( l e u 一+ a b + a h v 7 + 2 一t a ) ，再 进行单菌溶分离，得到突变株z q ，2 ，能在培养基中积累l 广缬氨酸4 ( ) 州l 。 1 9 9 6 年沈阳药科大学药物所来彩霞【3 0 】等以天津短杆菌为出发菌株，采用硫 酸z - 乙酯诱变处理，筛选出一株可以产1 2 8 珂ll 一缬氨酸的突变株，经过培养 基配方优化试验，该菌株摇瓶发酵产l _ 缬氨酸达2 8 6 9 l 。 1 9 9 9 年中国药科大学微生物教研室的徐旭东【”l ，以乳糖发酵短杆菌 ( b r e v i b a c t e r i u ml a c t o f e r m e n t u m ) x t 一4 为出发菌株，采用n t g 诱变处理，获得了 一抹积累l - 缬氨酸的突变菌株a 1 5 ( a t a a a b 。) ，浚菌株摇瓶产酸2 6 4 2 叠l ， 条件优化后，可以达到3 3 1 9 l 。 2 0 0 2 年江苏华昌集团有限公司的王平i3 1 】以产l - 谷氨酸菌乳糖发酵短杆菌 ( b r e v i b a c t e r i u ml a c t o f e r m e n t u r n ) a t c c l 3 0 5 8 为出发菌株，经过n t g 和d e s 多 次诱变处理，获得一株产l 一缬氨酸突变菌株，其遗传标已为 l e u 一+ i l e 。+ m e t 一+ a h v + 2 一t a r ，在1 0 的葡萄糖培养基巾产酸达2 8 l 3 0 l ， 在含1 4 葡萄糖培养基上产酸达3 5 “l 。 2 0 0 2 年天津科技大学代谢控制发酵研究室 = ；2 】以黄色短杆菌( b r e v i b a c t e r i u m 1 前言 f a k u m ) t v l 0 为出发菌株，经原生质体紫外诱变、d e s 和u v 多次诱变处理， 获得了一株l - 缬氨酸高产菌t v 2 5 6 4 ( i i e 一+ l e u 一+ s g + d a b + 2 一t a r ) ，5 l 罐补料 分批发酵产酸达5 0 9 l 。 1 6l 缬氨酸发酵工艺及发酵液预处理 1 6 1l 缬氨酸发酵方式 发酵方式可分为分批发酵、连续发酵、流加发酵。所谓流加发酵即补料分 批发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法【3 3 1 。 流加发酵介于分批发酵和连续发酵之间，兼有两者的优点，同时又克服了 两者的缺点。三种方式的比较见表1 - 1 。与传统的分批发酵相比，流加发酵可 以解除底物抑制、葡萄糖效应和分解代谢物阻遏等，与连续发酵相比，流加发 酵具有染菌可能性小、菌种不易老化变异等优点。迄今，流加发酵的应用范围 已相当广泛，包括单细胞蛋白、氨基酸、生长激素、抗生索、维生素、酶制剂、 有机酸、高聚物等的生产，几乎遍及整个发酵行业。 表1 - 1 分批、连续和补料分批发酵方式的比较 优点缺点 分一般投资较小阏灭值、放罐等原因，非生产时间欧 批易转产、生产灵活经常灭曲会降低仪表探头的寿命 发在某一阶段司获得较高转化率种子平前培养的花费火 酵发酵周期较短需较多的操佧人员或较多的自动控制系统 菌种退化的几率小操作人员接触病原菌和有毒品的可能性火 可实现全臼动操作操作不灵活 连反应器体积小、i 生产时间短因操作条件不易改变，原料质量必须稳定 续产品质量稳定连续灭菌系统、自动控制系统等投资较火 发操作人员少必须不断地排除一些不溶性同形物 酵测量仪表探头寿命长易染凶 操作人员接触有毒品的可能性小卣种易退化 补一般投资较小非生产时间k 料易转产、生产灵活经常灭菌会降低仪表探头的寿命 分可获得较高的转化率种子平前培养的花赞火 批发酵周期短需较多的操作人员 发曲种退化的儿率小较复杂的臼动控制系统 酵对发酵过群可实现优化控制操作人员接触病原菌牙| j 有毒品的可能性入 1 0 天津科技大学硕j ：学位论文 l 一缬氨酸生产工业上多采用分批发酵方式【3 4 】，但高浓度初糖会抑制菌体生 长及产酸能力，同时使糖酸转化率下降，而补料分批培养则能较好解决这一问 题。屈明波等通过研究得到了l ，缬氨酸发酵的一个较优化的控制模式，即“低 供氧和恒速补糖分批发酵”，l - 缬氨酸的产量及糖酸转化比率均有一定的提高。 1 6 2 代谢流分析 发酵生产中为了提高发酵的生产水平人们往往考虑的是最佳工艺控制点的 选择，采用人工经验为主的静态操作1 3 5 】，在方法上基本是以正交实验为基础， 而忽略了在生物反应器中的发酵同时存在有分子水平的遗传特性、细胞水平的 代谢调节和工程水平的传递特性三方面的协同调节，但发酵过程优化的本质应 该是代谢流分布的优化。生物反应器中的发酵过程是在分子水平的遗传特性、 细胞水平的代谢调节和工程水平的传递特性三个水平同时发生并相互作用的， 只要某一水平环节上产生瓶颈问题就会产生全局性影响。虽然这三个水平是不 同研究领域的基础性研究内容，但对于反应器中的细胞个体( 或群体) ，这三 方面又是一个统一体，必然存在现象与本质上的联系，这些都会直接或间接地 反映在直接参数、间接参数和实验室手工参数上。通过多参数的相关分析进行 动态优化，最终形成对发酵代谢流动态调控的理论，用于指导发酵过程优化和 放大，将具有重大的理论意义和实践指导意义。 代谢流分析( m e t a b o l i cf l u xa n a n l y s i s ，m f a ) 口“圳是目前代谢工程中应用 最广泛的用以指导遗传操作和代【身 过程控制的重要_ 作和代谢网络分析的基本 方法。m f a 的最大优点是不需要知道代谢途径中各种酶的动力学特征就可以得 到关于微生物代谢的许多重要信息。m f a 围绕胞内代谢反应，使用物料衡算方 法，剥所有主要的胞内反应建立一个基于化学计量的代谢流平衡模型( m f b ) 3 8 1 ， 然后根据中间代谢物的拟稳念( p s e u d o s t e a d ys t a t e ) 假设，得到一组线性方程 组。线性方程组的自由度f ，等于未知速率( 反应速率+ 净转化速率) 减去方 程的总数。一旦测定了系统的f 个速率，就可以得到代谢网路的全部代谢通量 分布。 1 6 3 发酵液预处理及提取 发酵法生产缬氨酸是一个很复杂的生物化学反应过程。整个发酵液呈深黄 色浆状，表面有少许泡沫。p h 一般为6 7 7 之间。在该发酵液中主要成分有 培养基的残留物、代谢产物和菌体。其主要成分如下：( i ) 发酵液中主含量为l 一缬氨酸；( 2 ) 发酵液中含有大量残糖、色素；( 3 ) 发酵液中还有大量菌体、蛋白 质等尉形物；( 4 ) 发酵液中含有大量无机盐离子如c a 2 。、m g ”、n h 4 + 、n a + 、k + 、 s 0 4 。、p 0 4 3 。、c 0 3 、c i 一等；( 5 ) 发酵液中有一砦微量副产物如有机酸和其它杂 质氨基酸；( 6 ) 发酵液中还有一些核苷酸及其降解物。发酵工业中“丰产小丰收” 是一个突出的矛盾，因此，如何高效率目高纯度地分离目的产物便成了提取工 1 前言 艺需要解决的首要问题，研究提取工艺、寻求高效率低成本的提取方法，其意 义非常重大。 缬氨酸发酵液中存在着大量菌体和杂蛋白，这些物质对缬氨酸的后提取带 来很大困难。因此，在进行缬氨酸分离前必须现将其除去。常见的菌体分离方 法主要有离心方法和过滤方法。采用离心的方法使固液两相分离非常困难。并 且，由于发酵液粘度大，细胞很小而难以沉降，若用离心法造成能耗高。絮凝 技术是近年来发展起来的一种比较简单、经济的生物产品分离技术得到广泛应 用。 本论文采用一种新的膜过滤技术一不锈钢膜过滤系统。不锈钢膜是由多组 表面具有小孔的不锈钢管组成，这些烧结不锈钢横向流动膜在化学容许度、压 力和温度宽范围内具有出众的分离性能。发酵液在钢管中横向流动，在压力的 作用下，液体从小孔渗出，而菌体及一些蛋白留在管中被截住。此技术具有操 作简单，易于控制，分离时间短，效果好的特点。主要控制参数为流速、压差 和温度。 l 一缬氨酸的分离提纯，主要是应用它的物理化学性质，如两性电解质的特 性，缬氨酸的溶解度，分子大小，分配系数及与吸附剂吸附特性等。提取的分 离原则为：提取收率高、产品纯度高；同时满足工艺简单，操作方便，使用的 原材料、药品廉价易获得，并尽量减少环境污染等方面综合考虑。 1 7 论文立题背景及主要研究内容 1 7 1 立题背景 由于在各个领域尤其是医药方面的广泛应用，l 缬氨酸的需求量明显增大。 现在世界l - 缬氨酸年产量已达到1 0 0 0 吨以上，其中丌本是主要生产国。而国 内目前大批量生产厂家极少，年产量仅为几百吨，相当于日本1 9 6 9 年的水平， 仅配制氨基酸输液就需进口几百吨。因此研究微生物发酵法生产l _ 缬氨酸，对 于国内l 缬氨酸产业化，促进医药行业的发展有重要的意义。 1 7 2 主要研究内容 【1 】以已有的摇瓶分批发酵最优条件为基础，进行5 l 罐分批发酵试验，首 先研究不同碳氮比对缬氨酸发酵的影响，确定最佳碳氮比。根据动力学分析， 通过对缬氨酸生长与生产耦合性以及溶氧对发酵的影响的研究，得到分阶段控 氧是比较好的供氧方式。以5 l 罐分批旋酵数据为基础，利用m a t l a b 工具软 件建立缬氨酸分批发酵动力学模型。 f 2 1 以摇瓶和5 l 罐分批发酵最优条件为基础，进行补料分批发酵实验，进 步研究溶氧在新的发酵方式下的变化，寻找出最优供氧控制方案。并研究确 立了最佳补料工艺，并实现在5 l 全自动控制发酵罐补料分批发酵产l 缬氨酸 5 0 l 以上的目标。 天津科技大学硕士学位论文 【3 】构建l _ 缬氨酸生物合成的代谢网络，建立黄色短杆菌发酵生成l 一缬氨 酸的代谢流平衡模型，基于此模型利用m a t l a b 软件计算发酵过程的代谢流 量分布。分析了不同溶氧水平下代谢流量的变化，为缬氨酸发酵条件控制提供 理论依据。 【4 】4 利用不锈钢膜过滤技术对缬氨酸发酵液进行前处理，确定了不锈钢膜 系统的最佳操作参数，与絮凝剂除蛋白法进行比较。并进行了缬氨酸提取的初 步研究。 1 8 论文符号说明 【1 】本论文在表达某种成份的浓度时，参照g b ( 3 1 2 0 8 9 3 ) 的有关规定。溶 液浓度用m o l l ，质量浓度用l 或m 玑或u l ，质量分数用g ，体积分 数用m u l 或l l 或m i m l 。 2 本论文涉及发酵液中l 一缬氨酸的产量、糖酸转化率的意义是： 发酵液中l 缬氨酸的产量( l ) ：指每升发酵液中含有l 。缬氨酸的质 量多少克。 糖酸转化率c ，5 覆诱翥薹萎嚣美 专譬要鬟磊曩t 。 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1