（发酵工程专业论文）β葡聚糖酶菌种选育及发酵条件优化研究.pdf

摘要 根据刚果红与谷物p - 葡聚糖紧密结合而显示红色的特征，采用“g c n 平 板法”和“改良琼脂块鉴定平板法”对本实验室保存的多株菌种进行初步筛选 和摇瓶发酵复筛，得到一株产酶活力高、发酵周期短的争葡聚糖酶生产菌株一 黑曲霉( a s p e r g i l l u xn i g e r ) q y w m l 。然后通过多次紫夕 诱变以及产酶驯化和 筛选，获得一株b 葡聚糖酶高产突变株黑曲霉q y w - 0 1 a 0 6 ，经过连续六次传 代并分别测定各代菌株的产酶性能，确定该菌株在产酶能力方面具有较好的稳 定性。黑曲霉q y w - 0 1 a 0 6 经摇瓶培养，发酵液酶活力可达1 2 5 u m l ，是出发 菌株q y w - 0 1 的2 6 倍。 采用单因素实验和正交实验对黑曲霉q y w - 0 1 a 0 6 摇瓶分批发酵生产b 葡聚糖酶的培养基和发酵条件进行了研究。得出其最佳培养基配方为( g 1 0 0 r a l ) ：大麦粉4 0 ，玉米浆1 0 ，( n i - h h s 0 4 0 ，3 ，n a n 0 30 2 ，f c s o 7 t h o 0 0 1 ，m g s 0 4 0 0 2 ，c a c 0 3 0 5 ；最佳发酵产酶条件为：发酵初始p h 值5 5 6 o 。 发酵温度3 l ，装液量为8 0 n 叫5 0 0 m l 三角瓶，摇床转速为2 0 0 r p m ，接种量 为2 0 x 1 0 5 个孢子，m l 发酵渡，发酵周期为3 0 小时，在最适产酶条件下进行摇 瓶分批发酵，发酵液酶活力达3 1 8 4 u m l ，是初始产酶条件的2 5 倍。在摇瓶 分批发酵的基础上进行摇瓶分批补料发酵实验。对补料材料、补料方式和补科 时间进行了研究。结果表明在发酵2 8 小时和3 0 小时分两次补加6 的淀粉溶 液和氮源溶液产酶效果比较好，虽然周期延长到了3 6 小时，但是发酵液酶活 力提高到了4 3 3 1 u m l ，是分批发酵的1 3 6 倍。 对1 0 l 发酵罐发酵产酶条件进行了初步研究，通过在不同种子培养基中 观察菌种的生长速度、菌丝形态以及接种后的产酶情况，确定最佳种子培养 基( g 1 0 0 m l ) ：葡萄糖1 0 ，大麦粉2 0 玉米浆1 0 ，( n 1 h h s 0 4 0 3 ，n a n 0 3 0 2 。 m g s 0 40 0 2 ，f e s 0 47 b o0 0 1 ，c a c 0 3 0 5 ；种子培养条件：初始p h 值5 j ， 温度3 1 c 。8 0 m l 培养基5 0 0 m l 三角瓶，转速2 0 0 r p m ；种龄1 6 - 2 0 小时；大 罐接种量1 0 ( v v ) 。结合摇瓶发酵条件确定了发酵罐发酵生产争葡聚糖酶 的基本工艺，并对间歇补料和连续补料分批发酵工艺作了初步探讨，发现在 发酵中后期连续补加1 5 的淀粉溶液和复合氮源，发酵液酶活力可达 3 8 5 2 u l m l 。 发酵液离心去除菌体后得到的粗酶液经硫酸铵分段沉淀。然后依次经 s e p h a d e x g 2 5 柱脱盐、s e p h a d e x g 7 5 柱和d e a e 纤维素柱线性洗脱层析分 离，得到纯化的酶，进行酶的部分性质测定。s d s p a g e 法和s e p h a d e x g 一 5 柱层析法测定该酶的分子量在3 2 。6 - 3 3 1 k d 之间。最适作用温度和p h 分别为 5 0 。c 和5 0 ，在5 0 以下、p h 3 0 - 5 5 该酶相对比较稳定。 关键词：争葡聚糖酶；黑曲霉：菌种选育；分批发酵；分批补科发酵；纯化； 性质。 a b s t r a c t t h es t r a i np r o d u c i n g g l u e a n a s eh i g h l yw a ss e l e c t e df i r s tu s i n gt h e g c n p l a t em e t h o d a n d a g a rl u m pa n di d e n t i f y i n gp l a t em e t h o d a c c o r d i n gt ot h e i n t e r a c t i o no f1 3 - g l u e a aa n dc o n g o - r e d as t r s i nw i t hh i 戤l e re n z y m ea c t i v i t ya n d s h o r t e rc u l t t t r oc y c l e ，a s p e r g i l l u sn i g e rq y w - o l 。w a ss e l o c t o df r o mt h es t r o l l s s t o r e di nt h i sl a bu s i n gt h ef u t h c l rs e l e c t i n gi ns h a k 髓f l a s k t h e nam u t a n t $ 1 1 i l i l l q y w - o l a 0 6w a so b t a i l l i mt h r o u g hl t - p e t i t i o u sm u t a t i o nw i t hu va n da c c l i m a t i o n t h e a c t i v i t yo f1 3 - g l u e a n a s ep r o d u c e db yq t w - 0 1 a 0 6i nc u l t u r ec a n r e a e l a1 2 5 u m l , b e i n ga b o u t2 6t i m e s 船m u c h 舔t h a to fq y w - 0 1 t i l es t n l i nw a ss t e a d yi n 曲峙 f l - g l u e a n a s ep r o d u c i n g 。 t h el i q u i d - c u l t u r ei i 地d i u n la n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n g 1 3 - g l u e a t 船w e r es t t u t i e db ys e p a r a t ef a c t o re x p e r i m e n ta n do a - t l a o g o n a le x p e r i m e n t f e r m e n t a t i o nw a sc o n d u c t e di n5 0 0 m lf l a s k 。e a c he o n t a i n i n g8 0 r a lo fo p t i m u m m e d i u mc o n s i s t e do f4 o b a r l e yp o w d e r , 1 o c o r l ls t 。印l i q u o r , 0 3 t l 帆) 2 s o , ， 0 2 n 玳0 3 ，0 0 1 f e s 0 47 h ：l o ，0 0 2 m g s o ( a n d0 5 c 蚯0 ，t h eo p t i m m c u l t u r ee o n d i d o n sw e 船b e l o w ：i n i t i a lp i - i5 0 6 0 ，t e m p e r a t u 坨3 1 ( 2 ，s h a k i n g 删2 0 0 r p m , i n o c u l a t i o nl o a d i n g2 o x l 0 5 e e l l m lf e r m e n t a t i o ne t t l t t t r e a n d c u l t i v a t i o nt i m e3 0h o u r s b e i n gt h eo p t i m u ml i l 烈l i u l na n df e r m e n t a t i o ne o n d i t i o m ， t h ea c t i v i t yo fp - g l u e a n a s ep r o d u c e db yq y w o i a 0 6c o u l dr e a e l a3 1 8 4 u m l , b e i n g a b o u t2 5t j l n e 8 硒m t t e h 鲢廿l a to ft h ei n i t i a ld e s i g n a n dt h e nf e d - b a t c hc u l t u r e w a si n v e s t i g a t e d b ye l a o o s i n g s u i t a b l ef e e d i n gm e d i u m , f e e d i n gm o d ea n d c o n t r o l l i n gt h et i m eo ff e e d i n gi l l l ：d i u r i ld u r i n gf e r m e n t a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a te n z y m ep r o d u c t i o nw a si a e l v , a s e db y 亿e d i n gs t t u c ha n dn i t r o g e n $ o u l o e c o m p o u n da t2 8 血h o u ra n d3 0 t hh o u rd u r i n gf e r m e n t a t i o n t h ee n z y m ea c t i v i t yi n f e d - b a t e l ae l t u r er e a c h e d4 3 3 1 u m lw h i c hw a s3 6 b i g l 蝴t h a nt l a a ti nb a t c h c u l t u r e t h ef e r m e n t a t i o ne o n d i t i o l l si nf e r m e n t o r 啊惴s t u d i e d a f t e ri n v e s t i g a t i n gt h e g r o w t hs p e e d ，t h em y e e l i u ms h a p ea n d t h ec n z y t l a ep r o c l u e t i o na f t e ri n o c u l u m s ，t h e o p t i m u ms e e dc u l t u r ec o n d i t i o n sw e 佗o b t a i n e dw h i e l aw e m 躺b e l o w ：8 0 r a l m e d i u mi n5 0 0 r a lf l a s kc o n s i s to f1 g l u e o s e 。2 o b a r l e yp o w d e r , 1 o c o i t i s t e e pl i q u o r , 0 3 ( n 珏波s o ，o 2 n a n 0 3 。0 0 1 r - e s 0 4 撇0 0 2 r d g s o ( a n d 0 5 c a c 0 3 i n i t i a lp h5 5 。t e m p e r a t u r e3 11 3 ，s h l l k i a gs p e e d2 0 0 r p m t h es e e da g e a n ds e e dv o l u m ew c l i i ：1 6 - 2 0 1 a o u r sa n dl o ( v v ) r e s p e c t i v e l y b a s e d0 1 1t h ep i i m a r y p a r a m e t e r so b t a i n e df r o mf l a k ec u l t m e ，t h eb a t c ha n d f e d - b a t e l ae t t l t u r ee o n d i t i o m m i nf e r m e n t o rw e r es t u d i e d ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep r o d u c t i o no fc o n t i n u o u s f e d - b a t c hc u l t u r ew a sh i g h e rt h a nt h a to fi n t e r m i t t e n tf e d - b a t c hc d m r e t h e p - g l u c a n a a c t i v i t yi nc o n t i n u o u sf e d - b a t c hc l l l t u r ec o u l dr e a c h3 8 5 ，2 u ，m l n es u p e m a t a n tc o n t a i n i n g6 - g l u c a n a s ew a so b t a i n e da f t e rc e n u i f u g a 虹o n s e p a r a t i o n 1 3 - a l u c a n a s ei nt h es u p e r n a t a n tw a sp u r i f i e db yu s i n ga m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ，s c p h a d e x g - 2 5 。 s e p h a d e x g 7 5 a n d d e a e - s e p h a c e l c h r o m a t o g r a p h y i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s3 2 6 3 3 1 k d a sd e t e r m i n e db y s d s - p a g ba n dg e lf i l t r a t i o nr e s p e c t i v e l y t h ei ，- g t u c a n a s ea t t i r e so p t i l _ n a l l ya t 5 0 a n d p l - 1 5 o a n d i s s t a b l e 越p i - 1 3 0 - 5 5 a n d b e l o w 5 0 k e y 础：l b - g l u c a n a s e ；a s p e r s i l l u sn i g e r ；, s t r a i ns c r e e n i n g ；b a t c hc u l t u r e ； f e d - b a t hc u l t a r e ；p u r i f i c a t i o n ；c b a r a c m r i z a t i o n i v 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业 学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：j 薹拯黛 导师签名：日期：丝竺年! 月生日 山东轻工业学院硕士学位论文 第章绪论 l i 谷物 葡聚糖的结构和特性 谷物多一葡聚糖是一种结构性非淀粉多糖，是自然合成的多聚耱含量较多 的糖类，主要存在于谷类( 特舜是麦类) 胚乳淀粉细胞壁中，是麦类籽粒半 纤维素的主要组分之一。麦类作物细胞蹙是一种双向结构，其纤维素的微纤 维形成坚硬的骨架，并嵌入到类似凝胶的基质中，而基质是由p 一葡聚糖为主 的多糖和糖蛋白组成的，而且聚合物之间存在着相当多的交联结构【埘。争 葡聚糖在各类作物中的含量受品种、自然环境、生长阶段和加工储存条件等 因素的影响，其含量如表1 i 所示唧。 衰1 1 各种作物中p - 葡聚糖的含量( g k g 于物质) t a b l ei it h e c o n t e n t o f p 掣u 啪i n 岫倒i 国 a 埘i 明 b - - 1 ，柏瞄键 8 一i ，蝴鞘键 图1 1p - 葡聚糖糖苷键的结构 f i g 1 1t h e 咖mo f 争垂u c 谷物8 葡聚糖是由右旋葡萄糖( d 型) 以混合的p - o ，3 ) ，争( 1 4 ) 糖苷 键随机排列的线性连接而成的葡萄糖聚合物，即通常所说的混合链争葡聚糖 【4 】。其糖苷键的结构单元如图1 1 所示 5 1 。大麦b 葡聚糖约含7 0 p ( 1 4 ) 糖 菅键和3 0 b 一( 1 3 ) 糖营键，它们的分子构型因大麦品种不恩而不同。嘴 聚糖一般分为水溶性( 占大多数) 和非水溶性两种，这主要受其结构中i s - ( 1 3 ) 糖苷键的含量和聚合度的影响。在水溶性p 一葡聚糖中，p _ ( 1 ，3 ) 糖苷键与p - ( 1 ，4 ) 糖苷键含量之比为1 ：2 5 2 6 ，而非水溶性p 葡聚糖中相应糖苷键之 比为1 ：4 2 嘲。b 一葡聚糖在水中溶解成为粘性溶液，浓度愈高牯度愈大网。大 第一章绪论 麦中的p 一葡聚糖在细胞壁中是不溶的，高浓度p 葡聚糖会形成网状结构，吸 收其周围的水分子，从而降低了周围环境的物理特性。在啤酒酿造过程中会 影响啤酒的质量，在饲料工业中是一种抗营养因子，因此在啤酒及饲料工业 中需添加一定量的3 - 葡聚糖酶。 1 2p 葡聚糖酶的来源及性质 p 一葡聚糖酶属于水解酶类，它主要包括四种酶，即内争l ，3 葡聚糖酶 ( e c 3 2 1 3 9 ) ，内一1 3 - 1 ，3 一l 小葡聚糖酶( e c 3 2 1 7 3 ) ，外 1 葡聚糖酶 ( e c 3 2 i 5 8 ) ，外一p 一1 , 4 一葡聚糖酶( e c 3 2 1 7 4 ) ，对水解谷物( 小麦、大麦、 黑麦、燕麦等麦类作物) 中的b 一葡聚糖具有重要的作用。大分子量葡聚糖先 由内切p 1 ，3 葡聚糖酶来破坏葡聚糖1 3 - 1 ，3 糖苷键，使之降解为小分子量的争 葡聚糖；随后内切、外切p l ，3 、p 一1 4 一葡聚糖酶再作用，使小分子嘲聚糖 分解为还原糖和b _ 葡聚糖残片【8 】。 大麦发芽过程中产生的p 葡聚糖酶，称之为内源性肛葡聚糖酶，它主要 存在于大麦的糊粉层和盾片，大麦只有在发芽时，胚乳淀粉层细胞受到胚上 皮细胞分泌的赤霉酸( g 刺激，逐步合成一系列的争葡聚糖酶，并随水分渗 透入胚乳细胞内，水解大麦胚乳细胞壁的b - 葡聚糖，同时也分解胚乳细胞间 的p 葡聚糖。这实际是自身产生的p - 葡聚糖酶的作用，称之为内源性酶的作 用。大麦发芽过程中p 葡聚糖分解程度由大麦品种的p - 葡聚糖酶的能力决定， 一般只能分解3 0 7 0 的p 葡聚糖：麦芽干燥时，外切p - 葡聚糖酶失活，内 切p 。葡聚糖酶活性可保留5 0 网。因此，内源性争葡聚糖酶较弱，无法使麦 芽汁中的b 一葡聚糖全部分解，造成糖化醪过滤时间长、麦汁混浊、原料浸出 物收率偏低、制成的啤酒易形成雾浊、保质期短、泡沫少。但无论纯品或是 籽粒组织提取液中的大麦b 葡聚糖酶对热敏赌，在高温下不稳定，萌发种子 6 0 以上的p 葡聚糖酶在干燥中失活，而存余的活性大多在粉碎中丧失。 目前，工业生产的8 - 葡聚糖酶主要来源于微生物发酵生产，主要由枯草 芽孢杆菌1 0 1 、瘤胃微生物 u , 1 2 1 及少数真菌产生。细菌和大麦阱前聚糖酶的分 子量约在1 0 - 3 0 k d 之间，其等电点在p h 5 6 左右【1 3 | 。由不同菌种生产的争葡 聚糖酶，其性质也不尽相同。表i 2 列举了大麦内源酶及部分微生物所产酶的 一些性质湖f 1 4 】冽。 1 3p - 葡聚糖酶的应用 1 3 1p - 葡聚糖胃陡啤酒工业中的应用 大麦为啤酒酿造原料，大麦中p - 嘈i i 聚糖的含量约为大麦质量的5 - 8 ， 2 第一章绪论 麦中的p - 葡聚糖在细胞壁中是不溶的，高浓度b 一葡聚糖会形成网状结构，吸 收其周围的水分子，从而降低了周围环境的物理特性。在啤酒酿造过程中会 影响啤酒的质量，在饲料工业中是一种抗营养因子，因此在啤酒及饲料工业 中需添加一定量的b 一葡聚糖酶。 1 2b 葡聚糖蘸的来濠及性质 p 葡聚糖酶属于水解酶类，它主要包括四种酶，即内p - i ，3 葡聚糖酶 ( e c 3 2 1 3 9 ) ，内一b i ，3 一1 年葡聚糖酶( e c 3 2 i 7 3 ) ，外廿1 葡聚糖酶 ( e c 3 2 1 5 8 ) ，外一口一1 ，4 葡聚糖酶( e c 3 2 1 _ 7 4 ) ，对水解谷物( 小麦、大麦、 黑麦、燕麦等麦类作物) 中的8 一葡聚糖具有重要的作用。大分子量葡聚糖先 由内切b l ，3 葡聚糖酶来破坏葡聚糖p - 1 ，3 糖苷键，使之降解为小分子量的p - 葡聚糖；随后内切、外切b 一1 ，3 、b l 4 一葡聚糖酶再作用，使小分子滞聚糖 分解为还原糖和b - 葡聚糖残片。 大麦发芽过程中产生的b 葡聚糖酶，称之为内源性 葡聚糖酶，它主要 存在于大麦的糊粉层和盾片，大麦只有在发芽时，胚乳淀粉层细胞受到胚上 皮细胞分泌的赤霉酸( g 刺激，逐步合成一系列的p 葡聚糖酶，并随水分渗 透入胚乳细胞内，水解大麦胚乳细胞壁的弘葡聚糖，同时也分解胚乳细胞问 的b 葡聚糖。这实际是自身产生的p _ 葡聚糖酶的作用，称之为内源性酶盼作 用。大麦发芽过程中p 葡聚糖分解程度由大麦品种的 葡聚糖酶的能力决定， 一般只能分解3 0 7 0 的b 一葡聚糖：麦芽干燥时，外切 葡聚糖酶失活，内 切b 。葡聚糖酶活性可保留5 0 嘲。因此，内源性争葡聚糖酶较弱，无法使麦 芽汁中的b 一葡聚糖全部分解，造成糖化醪过滤时间长、麦汁混浊、原料浸出 物收率偏低、制成的啤酒易形成雾浊、保质期短、泡沫少。但无论纯品或是 籽粒组织提取液中的大麦b 一葡聚糖酶对热敏寤，在高温下不稳定，萌发种子 6 0 以上的弘葡聚糖酶在干燥中失活，而存余的活性大多在粉碎中丧失。 目前，工业生产的8 埔聚糖酶主要来源于微生物发酵生产，主要由枯草 芽孢杆菌“o l 、瘤胃微生物，1 匀及少数真菌产生。细菌和大麦争葡聚糖酶的分 子量约在1 0 - 3 0 k d 之间，其等电点在p h 5 6 左右【“。由不同菌种生产的 葡 聚糖酶，其性质也不尽相同。表1 2 列举了大麦内源酶及部分锾生物所产酶的 一些性质嘲【1 4 1 刚。 1 0p - 葡聚糖醵的应用 1 3 1p - 奢l l 聚糖蘸在啤酒工业中的应用 大麦为啤酒酿造原料，大麦中p 葡聚糖的含量约为大麦质量的5 - 8 * 4 ， 大麦为啤酒酿造原料，大麦中p 葡聚糖的含量约为大麦质量的5 - 8 * 4 ， 2 山东轻工业学院硕士学位论文 衰1 2 大麦内擐赡瑟部分徽生翱所产i 的性质 t a b l e l 2 t h e p r o p e r t y o f p - # u e a t u t s e f r o m m a l t a n d m l c r o o r g 砌s m 最适作最适作 底物特 酶的来源热稳定性 p h 值稳定性 用温度 用p h 异性 对热敏感，易失 p i - 1 5 6 ，残余 大麦b - 葡 大麦内源酶 4 0 - 4 3 4 5 - t 8 活5 0 活性 聚糖 枯草芽孢杆5 5 c 以上2 0 m i n ， 5 0 6 5 7 0 菌5 0 1 4 酶活力迅速下降 细 p h b c e d ，最佳条件分别为a 3 8 2 c 2 d 1 也，即最适浓度 ( g ，1 0 0 m l ) 为大麦粉4 ，玉米浆l ，( n h 4 ) s 0 40 3 ，n a n o ，0 2 ，n a 2 h p 0 40 。按 此方案进行验证实验，产争葡聚糖酶活力3 1 5 3 6 u m l ，每毫升发酵液比1 0 号实验高出9 u 。n a 2 h p 0 4 用量为o 可能是因为玉米浆中的磷已满足菌体生长 和产酶的需要，不需要再另外添加，而且过量的磷对产酶还有负作用。正交 实验结果表明，黑曲霉在较高碳氮比的培养基上产生较高活性的争葡聚糖酶， 与郑毅等人1 7 8 1 所得出的实验结论相符。 为了更直观的进行综合分析，对各个指标随因素水平的变化情况用折线图 表示出来，见图3 a ( a ) 和图3 4 ( b ) 。 图3 a ( a ) 大麦粉、玉米浆、硫酸铵浓度对产酶的影响 t a b l e3 4 - ( a ) e f f e c to f b a r l e y , o ms t e e pl i q u o ra n d ( n i g h s 0 4 c o n o 朗叫i 删她c m t h ep - 9 1 凇p r o d u c t i o n 00 惦o 1o 1 50n2o 4m 6 确嘲c 辅( 吖1 0 0 吐) 硝l m ( g l o o , i ) 图3 a ( b ) t i t l l t _ 氢二钠、硝酸钠浓度对产酶的影响 t a b l e3 4 ( b ) e f f e c to f n a 2 i - i p 0 4a n dn a n o , c o n c e n t r a t i o n t h ep - g t u c a u s ep r o d u , c t i o n 笛弋n)草轷脏蕾 山东轻工业学院硕士学位论文 3 3 3 发酵条件的优化 ( 1 ) 发酵初始p h 值对产酶的影响 在一定的p h 值范围内，细胞才能正常生长、繁殖和维持正常的新陈代谢， 积累不同的产物对p h 值要求也不同。在不同初始p h 值条件下进行发酵产酶， 测定酶活力随发酵时间的变化，数据经o r i g i n e r 0 7 5 处理，由图3 5 结果可看 出初始口h 5 0 时起发比较快，初始p h 6 0 虽然起发稍慢，但最终酶活力与p h 5 0 相差无几，而初始p h 4 0 和p h 7 0 起发较慢，周期长，而且最终酶活力也不 高，故选择发酵初始p h 值5 o _ 6 0 。 名 j 2 0 0 藿姗 鬈m 怠5 0 o 一50 51 01 52 02 53 0 3 54 0 发酵时间( h ) 图3 5 不同初始p h 值对产酶的影响 f i g 3 5e f f e c t i o no fi n i t i a lp h o nt h eb g l u c a l m ep r o d u c t i o n ( 2 ) 发酵温度对产酶的影响 菌体生长繁殖和发酵产酶需要一定的温度条件，由图3 6 可知温度在 3 0 - 3 2 。c 之间对产酶的影响不大，故选择3 1 为最佳产酶温度。 2 8 3 03 13 23 43 6 温度( ) 图3 6 发酵温度对产酶的影响 f i g 3 6e f f e c t o f t e m p e r a t u r eo n t h eb - g l u c a n s ep r o d u c t i o n 目 。 蝰 溢 0 24681 0 接种量( 1 0 5 个孢子曩d 图3 7 接种量对产酶的影响 f i g 3 6 e f f e c t o f t h e i n o c u l u m m t h e9 - g | u c a n s ep r o d u c t i o n 渤 蓦| 董暑 鼍言 一1n一螺髓 第三章黑曲霉产b 一韫聚瞻酵播瓶分批发酵培养酶及发酵条件的优化 ( 3 ) 接种量对产酶的影响 将斜面孢子用生理盐水制成孢子悬液，按不同的量接入培养基发酵，测 定酶活。接种量的多少主要影响菌体的生长速度和细胞活性，接种量过大菌 体生长快。但易衰老：接种量过小贝n 菌体生长慢延长发酵周期。图3 7 表明， 当接种董2 , 0 x t 0 5 个孢子，m i 发酵液，发酵濠酶活力最高。 ( 4 ) 培养基装液量对产酶的影响 黑曲霉q y w - 0 1 a 0 6 是好氧菌，在摇瓶培养中，以装液量来控制溶氧， 由图3 8 可知，在2 0 0 r p m 时，装液量为8 0 m l 5 0 0 m l 三角瓶，酶活力壤高， 说明氧过摄或不足都影响酶活力。 ( 5 ) 发酵周期对产酶的影响 由图3 9 结果可知，发酵3 0 h 时酶活力最高，3 0 h 以后发酵液酶活力逐渐 降低。 曰 舶 研 装灌量缸。) 圈3 8 装液量对产酶的影响 f i g 3 8e f f e c to ft h ec u l t u r ea l n o u n t i nf l a s kc h lt h e - g l u c a n 。p 【o d u c f i o n 再籍 越骂辑 发酵时问( h ) 圈3 9 发酵周期对产酶的影响 f i g 3 。8e f f e c to f p e r i o d so nt h e 1 3 - g l u c a mp r o d u c l i o n ( 6 1 发酵条件正交实验及结果 在单因素实验的基础上，对装液量、接种量、初始p h 值和发酵周期进行 四因素三水平的正交实验。实验数据经s h a r e t o ps o f t w a r es t u d i o 公司开发的 l a t i n 正交软件处理，由正交试验结果分析表3 6 可以看出，四个因素对p 一葡 聚糖酶产量的影响的顺序为：装液量) 接种量) 初始p h 值) 发酵周期。最优 方案应为：b 2 c 2 d 2 ，按该方案进行验涯试验。发酵液酶活力荧3 1 8 3 6 a w , l ， 是初始设计培养基的2 5 倍。 一 一 一 一 一 、1j1r1j，11，1，上 蛳 绺 蛳 枷 啪 啪 沁 。 一d；一烬麓辩靛撼 山东轻工业学院硕士学位论文 衰3 6 发酵条件正交实验结果分析表 1 h b l e 3 6 r e s u l t a n d 踟i 蚰y s b o f t h e o r t h o g o n a l o n f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s 3 3 忸蒜曲霉q y w - 0 1 a 0 6 产b i 葡聚w i l t 发酵进程曲线的漶定 在最佳产酶条件下进行摇瓶发酵，从接种开始每隔2 - 4 h 取样测定发酵液 p h 值、酶活、残糖及生物量的变化，测定结果见图3 1 0 。由图3 1 0 可以看出， 发酵过程的前1 2 1 1 发酵液的各项理化指标都没有太大变化，菌体生长处于停 滞期。从1 2 h 起总糖开始减少，菌体开始生长，在发酵1 6 h 至2 8 h 之间，生 物量迅速增值，3 0 h 达到最大，此后由于营养物质的大量消耗，发酵液中营养 物质匮乏，随着菌体生长速度减慢和菌体的衰老自溶生物量略有减少。发酵 前2 0 h ，由于发酵液中淀粉多糖含量较大，发酵液中基本无争葡聚糖酶活力， 此后随着菌体生长耗糖，发酵液中总糖减少，d 一葡聚糖酶开始产生，并于3 0 h 达到最大酶活力3 1 8 3 6 u m l 。产酶期间p h 值一直维持在5 o _ 5 5 之间，发酵 3 0 h 以后，p h 值迅速下降，酶活力也开始损失，说明该菌株在中性偏酸的条 件下有利于b 葡聚糖酶的生产。菌体在1 6 h 至2 8 h 迅速增值，而p 葡聚糖酶 酶活从2 0 h 开始产生，2 4 h 至2 8 h 急剧上升。3 0 h 达到最高，菌体生长与b 葡聚糖酶的合成基本呈同步状态，产酶略微滞后于菌体生长。 堑章黑曲莓产b 一葡聚糖酶摇瓶分批发酵培养基及发酵条件的优化 u1 0田加棚 5 0 发酵时间 1 卜残总糖* 发酵潮p h ，一苗体干重 - - o r - 发酵液酶活 图3 1 0 摇瓶分批发酵进程曲线 r g 3 1 0t h ef e r m e n t a t i o nc u n r eo f b a t c hf c r m e n t a t l o ni nt h es h a k e rf l a s k 3 4 小结 ( 1 ) 通过对黑曲霉q y w - 0 1 a 0 6 产d 一葡聚糖酶培养基的研究，得出最佳培 养基为( g 1 0 0 m l ) ：大麦粉4 0 ，玉米浆1 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 40 3 ，n a n 0 30 2 ， m g s 0 4 0 0 2 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 ，c a c 0 30 5 。 ( 2 ) 黑曲霉q y w - 0 1 a 0 6 发酵产陟葡聚糖酶的最佳发酵条件为：发酵初始 p h 为5 o - 6 0 ，发酵温度为3 i c ，5 0 0 m l 三角瓶的装液量为8 0 m l ( 摇床转速 2 0 0r p m ) ，接种量为2 0 x i 0 5 个孢子m l 发酵液，发酵周期为3 0 h 。 ( 3 ) 在最佳培养基和最优发酵条件下，每毫升发酵液酶活力达3 1 8 4 u ，是 初始产酶条件的2 5 倍，是前人研究的了3 _ 5 倍，而且黑曲霉的酶系比较丰 富，有进一步深入研究进而实现工业化生产的潜力。 口n)饕鳆楚赫黯摁 渤 善| 罨瞢 枷 伽 御 o 一1叫叫训rr叫 一宕)舞蹲餐 山东轻工业学院硬士学位论文 第四章分批补料发酵提高b 一葡聚糖酶产量的研究 4 1 引言 分批发酵( b a t c h c t t l t u r c ) 是一种封疑式系统，种子接种到培养基后，除了 气体流通外，发酵液始终留在生物反应器内，即在此简单系统内所有液体的 流量等于零。它的优点是操作简单，周期短，染菌的机会少，生产过程和产 品的质量易掌握。缺点是分批发酵不适用于测定其过程动力学，因使用复合 培养基，不能简单的运用m o n o d 方程来描述；生长存在基质抑制问题，出现 二次生长现象( d i a u x i cg r o w t h ) 。如对基质浓度敏感的产物或次级代谢抗生素， 用分批发酵不合适，因其周期短，一般卜3 天，产率较低，这主要是由于养 分耗竭，发酵无法维持下去，据此发展了补料分批发酵。 补料一分批发酵( f e d - b a t c hc u l t u r e 或称f b c ) 口卅又称半连续培养或半 连续发酵，是在分批培养和连续培养之间的一种过渡培养方式，是在分批发 酵的过程中补入新鲜料液，以克服由于养分不足导致发酵过早结束的缺点， 是一种控制发酵的好办法。现已广泛用于发酵工业。同传统的分批培养相比， 它具有以下优点：可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解产物阻遏； 可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影 响，改善发酵液流变学的性质；可用作控制细胞质量的手段，以提高发芽 孢子的比例；可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供试验基 础。同连续培养相比，f b c 不需要严格的无菌条件，菌种也不会产生老化和 变异等问题，适用范围也比连续培养广泛。由于f b c 有这些优点，现已被广 泛用于微生物发酵生产和研究中，如已应用于酶类、抗生素类、激素药物类、 氨基酸和维生素等l o 余类几十种产品的工业生产中。本实验主要对分批补料 提高b 葡聚糖酶产量做初步研究。 4 2 材料与方法 4 2 1 蕾种 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) q y w - 0 1 a 0 6 ，本实验室保藏。 4 2 2 原料和试嗣 大麦粉( 过4 0 目筛) 济南啤酒厂 玉米浆 西王集团 标准大麦b 一葡聚糖美国s i g m a 公司产品 其它试剂均为分析纯化学试剂。 4 2 3 主要实验仪器和设备 同2 2 3 。 4 2 4 培养基及发酵条件 ( 1 ) 斜面培养基 p d a 培养基嘲。 ( 2 ) 发酵培养基 大麦粉4 0 9 ，玉米浆1 o g ，( n h 4 ) 2 5 0 40 3 9 ，n a n 0 3o 2 9 ，m g s 0 4 0 0 2 9 ， f e s 0 47 h 2 00 0 1 9 ，c a c 0 3 0 。5 9 ，蒸馏水1 0 0 m l , p h 值5 5 ，1 2 1 c 灭菌2 0 m i n 。 ( 3 ) 补料液培养基 碳源补料液 配方a ：大麦粉溶液8 0 9 1 0 0 m l ，p i - i 值6 0 ； 配方b ：淀粉溶液6 0 9 1 0 0 m l ，p h 值6 0 。 复合氮源补料液 ( n h 4 ) 2 s 0 41 2 9 ，玉米浆4 9 ，n a n 0 3 0 8 9 ，加水1 0 0 n i l ，p h 6 0 。 4 2 5 实验方法 ( 1 ) 发酵产酶条件 将斜面菌种制成孢子悬液，接种于8 0 m l 基本培养基( 5 0 0 m e 三角瓶) 中， 接种量为2 0 x 1 0 5 孢子纽l l 发酵液，3 0 1 2 摇s z 培养- t 2 t x x a , m ) 。 ( 2 ) 补料方案 方案1 ：发酵2 8 h 加入碳源补料液a 8 m l 和复合氮源2 m l ，继续培养。 方案2 ：发酵2 8 h 加入碳源补料液a 4 m l 和复合氮源l m l ，培养至3 0 h 再次加入碳源补料液a 4 m l 和复合氮源l m l 。 方案3 ：发酵2 8 h 加入碳源补料液b s m l 和复合氮源2 m l ，继续培养。 方案4 ：发酵2 8 h 加入碳源朴料液b 4 m l 和复合氨源l m l ，培养至3 0 h 再次加入碳源补料液b 4 m l 和复合氮源l m l 。 ( 3 ) b 一葡聚糖酶酶活力测定 取1 8 m l l 0 的b 一葡聚糖底物溶液，4 0 c 预热5 m i n 后，准确加入适当 稀释的酶液2 0 0 t t l ，在4 0 。c 水浴中准确反应2 0 r a i n ，立即用d n s 法测定还原 糖含量。 酶活力单位定义：在上述反应条件下，l m i n 从大麦争葡聚糖中产生1 l a m o l 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位( u ) 。 ( 4 ) 残总糖的测定口2 1 山东轻工业学院硕士学位论文 ( 5 ) 生物量的测定1 3 】 取2 0 m l 发酵液静心收集菌体，用水洗涤两次后涂布到表面皿上，8 5 c 烘至恒重，称重。 6 ) p h 值测定 采用h a n n a p h 2 1 1 型精密p h 计测定。 4 3 结果与讨论 4 3 1 分批发酵实验结果与讨论 为了确定合适的补料时机，首先对分批发酵过程中的菌体生长、菌体耗 糖和产酶规律进行初步研究。黑曲霉斜面菌种制成孢子悬液接入盛有8 0 m l 产酶培养基的5 0 0 m l 三角瓶中，在产酶条件下进行发酵培养，每隔2 - 4 h 取 样测定，分析发酵过程中b 一葡聚糖酶酶活力、菌体干重和发酵液残总糖随时 间的变化规律。 图4 1 是没有补料的分批发酵过程，黑曲霉菌体的生长过程经历了0 - 1 4 h 的停滞期，从1 4 h 开始进入指数生长期，到2 8 h 增值速度渐缓，3 0 h 菌体千重 达到最高值2 7 0 6 9 l ，此后进入稳定期。发酵液中的总糖浓度从第8 h 开始缓 慢下降，随着菌体的生长，在发酵1 6 - 3 0 h 期间总糖浓度快速降低，从2 1 4 5 9 l 降至1 3 1 2 9 r l 。在发酵开始的1 6 h 内，发酵液中几乎检测不到b 葡聚糖酶酶 活力，此后发酵液酶活力开始缓慢升高，发酵2 4 h 以后发酵液酶活力开始迅 速增长，到3 0 h 达到最高约3 2 4 u m l 发酵液，随后酶活力逐渐降低。发酵开 始时几乎不产b 葡聚糖酶，这可能是因为发酵液中含有大量的淀粉糖和葡萄 糖，而葡萄糖及其代谢产物对黑曲霉菌体产阻葡聚糖酶有抑制作用】，到了 2 4 h 菌体大量生长耗糖，发酵液中总糖降至1 7 6 5 9 l ，对菌体产酶的阻遏作用 减弱，