（环境科学专业论文）生化药物的毛细管电泳分离与富集.pdf

西南大学硕士论文 论文摘要 ( 2 ) 生物大分子的毛细管电泳在线富集方法的探讨。 将几种常见的毛细管电泳在线堆积技术，简单场放大样品堆积，增强场放大样品堆积， 整管进样以及在此技术之上发展起来的扫拂富集技术应用于胰岛素的分析中，可以获得胰 岛索检测信号的增强，在不同的优化条件下，它们的富集效率可达到1 5 1 0 1 倍。但是，由 于胰岛素分子的性质决定，相对于其他小分子物质的富集效果而言，不能获得很高的富集效 率。如何增大胰岛素分子的表面电荷以及如何使胰岛素分子结构更为紧凑利于聚集，便成 为提高其富集效率的关键因素。新提出的扫拂富集技术操作简单，并可获得与整管进样接近 的富集效率，有望成为一种具有发展潜力的在线样品富集技术。 鉴于目前d n a 在线富集技术的开发和应用相对较少，建立在线富集技术对d l q a 进行 分析又是十分必需的。本文在大体积进样的基础之上，利用阳离子表面活性剂对d 1 q a 分子 的聚集作用，运用改进后的扫拂聚焦富集技术，对2 0 个碱基以下的短链d n a 及长链f s d n a 进行富集。富集效率可达到1 5 - 3 0 倍。当在缓冲溶液中添加经过处理后的酸性碳纳米管，在 不影响富集效率的同时，可以完成几个碱基链的分离。以6 a ，1 5 t 及f s d n a 为分析样品考 察该富集技术的重现性及线性，能够达到允许的范围。 关键词：毛细管胶束电动色谱毛细管在线富集技术抗生素胰岛紊核酸 堕壹查兰堡主堡茎一j 笪! ：i ! 里 s e p a r a t i o na n d o n l i n ec o n c e n t r a t i o no f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s i nb i o m e d i c a l a n dp h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s m a j o r ：e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e m a s t e rc a n d i d a t e ：z h e n gy a n s u p e r v i s o r ：p r o f c h e n g z h ih u a n g a b s t r a c t t h em i s u s eo f p h 姗a c e u t i c a l sm a k ei tp o s s i b l ef o rb a c t e r i at oa d a p ta n db e c o m e r e s i s t a n t ，a i l dt h e yh a v eb e c o m en e wt y p i c a le n v i r o n m e n t a ip o l l u 伽t s w 1 1 i c ha r e d a n e t o u st oh u m a nh e a l t ha n de n v i r o n m e n t t h e r e f or e ，m o r ea t t e n t i o ns h o u l db e p a i df o r t h er a p i da i l de 伍c i e n ta n a l y s i sa n dc o n t r o lo fp h 蝴a c e u t i c a l s c 印i 1 1 a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) h a se v o l v e di n t oap o w e r 血lt e c h n i q u ef o r b i o m e d i c a la 1 1 d p h 锄a c e u t i c a la i l a l y s i s ，e s p e c i a l l yf o rt h ed e t e n i n a t i o no f t h ec o m p l i c a t e ds a m p l e s 1 1 1 e r ea r et 、v om a i np o i n t si nt l l et i l e s i s o n ep o i n ti st h es e p a r a t i o no fs e v e r a l a n t i b i o t i c sb ym i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc 印i l l a r yc h o m a t o g r a p h y ( m e c c ) 1 ko t l l e r p o i n t i st h eo n - l i n ec o n c e n t r a t i o n t e c l l i l i q u e s o fc a p i l l a r y e l c c t r o p h o r c s i s i n b i o r r l a c r o m o l e c u l e s ， t h ep r i n c i p l e ，s e p a r a t i o nm e t h o d s ，d e t e c t i o nm e m o d s ，o n - l i n ec o n c e n t r a t i o n t e c l l i l i q u e so fc 印i l l a r ye l e c t r o p h o r c s i sa 1 1 da p p l i c a t i o no fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si n b i o m e d i c a la n dp h 帅a c e u t i c a la i l a l y s i sw e r ei n t r o d u c e d s u r f a c t a l l t sw e r ea l s o d c s c “b e di nd e t a i la b o u ti t si m p o r t a n tu s ei nc e w ee m p l o ys u r f a c t a n t sa st h em a i n c l u ei ni h et h e s i s ( 1 )s e p a r a t i o na n dd e t e m i n a t i o no fa n t i b i o t i c sb y m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i c c a p i l l a r yc l l r o m a t o g r a p h i c 西南大学硕士论文 论文摘要 t h em i c e l l a re l e c t m l 【i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o f a p l l i cs e p a r a t i o no f 锄o x i c i l l i n ， c l o x a c i l l i n ，c e f a l e x i n ，c e f o t a ) ( i m ea 1 1 dc e f 缸o l i n b y w i md i o d ea m yd e t c c t i o n 愠s i n v e s t 蟾a t e da i l dm e i rs i m u l t a r l c o u sd e t e c t i o no f m e a n t i b i o t i c si nu r i i l ew a sp e r f o m e d e l e c 仃o p h o r e s i sw a sp e r f 0 玎n e da t l8k vw i t hab o r a t eb u 肺r ( 2 0m m ，p h8 9 ) c o n t a i l l i n gs o d i u md o d e c y ls u l f a t e ( s d s ，10 0m m ) a n dt h ed c t e c t i o n 、v a sc a r r i e do u t a t2 5 4r m t h e s ef i v ea 吡i b i o t i c sc o u l db eb a s e i i n e s e p a i a t e dl e s st h a n9m i n l i n e a r i t yi no 1 2 5 0 “m lc o u l db ec o n s t m c t e d 、v i t ht h ec o r r e l a t i o nc o e 伍c i e mo f 0 9 9 7 6 - 0 9 9 9 4 ，a n d 血el i m i t so fd e t e c t i o nr a n g ew e r ef b mo 0 1t o0 13p m la ta s i g n a l t o n o i s er a t i oo f3 t h em e 廿1 0 d 、v a ss u c c e s s f u l l yu s e df o rs i m u l t a i l e o u s l y d e t e n i n a t i o no f l em i x t u r eo f 也r e ec o m m e r c i a ld 兀l gs 锄p l e s t h er e s u l t so f d e t e c t i o nw e r ea c h i c v e dw i 血ap e m c ts 印a r a t i o na 1 1 dt h er s d so f1 5 1 2 8 6 f o r i n t r a - d a ya s s a ya 1 1 dr s d so f3 9 5 - 8 1 2 f o ri n t e r d a ya s s a y i tw a sw o r t hn o t i n gt h a t t h em i 鲈a t i o nt i m eo fm ep r a c t i c a ls 锄p l e s 、a s 、i t l lr s d so fo 0 3 2 0 2 9 5 f o r i n t m - d a ya s s a ya i l dr s d so f0 4 7 一1 1 1 f o ri m e r d a ya s s a y w 1 ”n 印p l i e dt od i l u t e d u r i n es a m p l ed e t e c t i o n ，r e c o v e r y 硒m9 0 t o1 10 ，a n dr s d so fo 6 6 - 7 6 5 f o r i n t m - d a ya s s a ya t l dl - 3 1 6 0 7 f o ri n t c r d a ya s s a yc o u l db eo b t a i n e d ，r e s p e c t i v e l y t h ee x p l a i l a d o na b o u tm e i rm i g r a t i o nb e h a v i o rr e l a t e dt om es e p a r a t ec o n d i t i o n si s a l s os t a t e d ( 2 )d i f t b r e n tk i n d s o fs 锄p l e ss t a c k i n g t e c h n i q u e s i nb i o m a c r o m o l e c u l e s a i l a l y s i s b a s e do nt h ec o m p a r i s o no ft 1 1 ec o n c e i 血a t i o ne f r e c to fi n s u l i ni nc eu s i n g s e v e r a lo n l i n es t a c k i n gm e t h o d si n c l u d i n gf i e l d 一锄p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g ( f a s s ) a n dl a r g ev o l u m es a m p l es t a c k i n g ( l v s s ) ，h e r e i nw ep r o p o s e dan e wt e c h m q u e c a l l e ds w e e p i n gf o c u s i n g e n h a l l c e ds i g n a l sc a i lb eo b s e r v e df o re a c hs t a c k i n g t e c t u l i q u e ，t h ec o n c e n t r a t i o ne 塌c i e n c yv a r i e d 疔o m i 5t o1 0 1u n d e rd i 脏r e m o p t i m i z a 晡o nc o n d i t i o n s h o w e v e r ，d e t c l i n e db yt l l en a t u r eo ft h ei n s u l i nm o l e c u l e ， v e r yh i 曲c o n c e n t r a t i o ne f 右c i e n c yc a nn o tb eo b i a i n e dc o m p a r e dw i t l lo t h e rs m a l l m o l e c u l em a t e r i a l h o wt oi n c r e a s et h es u r f a c ee l e c t r i cc h a r g eo fm ei n s u l i nm o l e c u l e a n dh o wt om a k ei n s u l i nm o l e c u l a rs p a c es t m c t u r eb e n e f i tt oa s s e m b i i n gb e c a m et h e k e yf a c t o r f o rt h ei m p r o v e m e n to fc o n c e m r a t i o ne m c i e n c y t h en e wp r o p o s e d j v 堕塑查兰堕主堡塞 笙苎塑垩 s w c 印i n gf o c u s i n gm e t h o dw a se a s ya n ds 蚰p l et oo p e r a t ea n dh a dc o m p 删i v e l y h i g he m c i e n c yc o n c e n t r a t i o nw i t hl v s s i tc o u l db ee x p e c t e dt ob e c o m ean e w p o t e n t i a la 1 1 da t 仃a c t i v eo n _ 1 i n cc o n c e n 昀t i o nt c c l l i l i q u e a l s oi tm a y b eh e l p f u lf o rt h e s t u d yo f p a c “n g a 1 1 dc o n d e n s a t i o no f b i o m a c r o m o l e c u l e ss u c ha sp r o t e i na n dd n ai n c e t h eo n l i n ec o r l c e m r a t i o no fd n ai nc a p i l l a r ye l e c 仃o p h o r e s i sw a ss t u d i e d b a s e do nt h e1 a r g ev 0 1 u m ei n j e c t i o n ，u s i n gt h ei n t e r a c t i o no f 血ec a t i o n i cs u r f a c t a l l t s a n dd n a ，d n aw a sc o n c e n t r a t e db yt h en e wd e v e l o p e ds w e 印i n gf o c u s i n gt e c h n j q u e t h ec o n c e n t t a t i o ne 蚯c i e n c ya r e15 3 0f o rs h o t ts i n g l e s t r a n d e dd n a s e p a r a t i o no f s e v e m lb a s e sc o u l db ec o m p l e t e dw i t h o u ti n d u c i n gt 1 1 ec o n c e m r a t i o ne m c i e n c yw h e n a c i d i cc a r b o nn a i l 酏u b e ma d d e di n 址l eb u f f e r t h ea s s a yo fr e p “t i o na n dl i n c a r v 耐e di nm ea l i o w a b l er a n g et 出n gs h o r ts i n g l e s t m d e dd n aa n df i s hs p e 咖d n a a ss a m 口l e s k e y w o r d s ： m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p m a r yc l l r o m a t o g r a p h y ，o m l i n ec o n c e n t r a t i o n t e c l l l l i q u eo f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a n t i b i o t i c s ， i n s u l i n ， d n a 独创性声明 学位论文题目：生丝药物的垂细簋电速盆离曼宣基 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者： 忘i 彳正 签字日期： 阳口f 年争月二罗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作 签字日期： 学位论文作 工作单位： 通讯地址： 荔舄巍嚣鬣：彰誓彳9 日w 口g 年争月上7 日签字日期：，。年哆月，9 日 者毕业后去向： f “ 电话： 邮编： 西南大学硕士论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 药物滥用是全球性的问题，它给人类及环境的健康发展带来的危害正愈演愈 烈，并已衍生成为新的环境污染物。该类污染物给人类及环境带来的潜在危害需 引起高度警惕。为此，关注药物在各种环境条件下的分解，转化，迁移，富集等 行为是刻不容缓的。许多国家已经开始注意到这一问题，纷纷加强了这一方面的 监控和分析。 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c 仃0 p h o r e s i s ，c e ) 技术，是近年来迅速发展起来的 一项兼有电泳和色谱技术的新型分离分析技术。它以毛细管柱为分离通道，以高 压直流电为分离动力对大分子及小分子等物质进行高效分离和检测。凭借高效、 快速、微量、多模式、高自动化、运行成本低等优点，c e 在分析化学、生物化 学、分子生物学、药物化学、食品化学、环境化学、医学等诸多分析领域有着广 阔的应用前景。 1 9 8 1 年，j o 唱e n s o n 和l u k a c s 用试验和理论证明m 】，柱效与电场强度成正 比，与分子扩散系数成反比。这就为诸如蛋白质等扩散系数小的生物大分子在高 电场条件下获得高分离效率创造了优越的条件。二十世纪八十年代末期，c e 被 引叭d n a 的分析】，现已广泛应用于诸如测序，p c r 产物鉴定，基因突变，临 床诊断等d n a 研究的众多方面。九十年代初期，c e 就已广泛应用于药物质量 分析【5 。3 9 】。在药物分析的药物开发早期过程的生物分析研究【4 0 4 刚、蛋白质药物 分析h 7 。5 1 】、以及药物开发和上市药物的日常质量控制方面 5 2 啦! 等方面，c e 已得 到成功应用，并已逐渐发展成为一种常规分析手段。有可能和高效液相色谱 ( h p l c ) 一样能广泛应用【6 3 1 。 表面活性剂作为缓冲溶液的一种重要的添加剂，在c e 中起着不可忽视的作 用。阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂，非离子表面 活性剂以及一些特殊表面活性剂在c e 中的使用极大地拓展了毛细管电泳在离 子、中性分子、手性药物、多肽、蛋白质等分析方面的应用范围，增强了c e 的 分离能力，使一些难用常规方法进行分离的物质得以分离【6 4 j 。 西南大学硕士论文 第一章绪论 1 2 毛细管电泳的原理及研究进展 1 2 1 毛细管电泳的基本原理 毛细管电泳，顾名思义，即在毛细管中进行的电泳【6 5 。6 7 1 。是指系列以内径 通常在1 0 2 0 0 m 的毛细管柱为分离通道，以高压直流电为分离动力对大分子和 小分子等进行高效分离和检测的有关技术的统称。细的毛细管柱可减小电流，使 热量的产生减少；同时又增大了散热面积，提高散热效率，大大降低了管中心与 管壁间的温差，减少了柱子径向上分离速度的梯度差，因而可引入高电场，保证 高效分离。简而言之，毛细管电泳的基本原理就是电泳和色谱，也即利用在高压 电场作用下离子淌度和分配行为上的差异而对组分进行分离和分析。 1 图1 1毛细管电泳基本仪器结构示意图 1 高压电塬；2 毛细管；3 检测器；4 铂电极；5 缓冲溶液池。 图1 1 给出了毛细管电泳基本仪器结构示意图。从图中不难发现，c e 的一 个主要特点是仪器的整体结构简单。一个高压电源，一根毛细管，两根铂电极， 两个缓冲溶液池，再外加一个检测器，便可以开始毛细管电泳实验的研究。实验 开始，先将一根内径很细的弹性石英毛细管的两端置于两个缓冲溶液池中，并使 池内溶液与毛细管内溶液保持致。在两个缓冲溶液瓶中各放置一个屯极，浚电 极的作用是使高压电源和毛细管之间产生电接触。样品引入到毛细管里是通过用 一个样品瓶替换一个缓冲液瓶，并施加电场或者外部压力而实现的。重新使毛细 管更换回缓冲溶液池后，施加高压电场，分离便开始进行。此时，处在毛细管中 西南大学硕士论文第一章绪论 的荷电物质便朝着与其电荷极性相反的方向运动。由于样品组分间的淌度不同， 它们的迁移速度不同，因此，经过一段时间后，各组分将按其淌度大小顺序，依 次通过靠近样品出口端的检测器，检测器将获得的光信号或电信号通过数据采集 系统进行处理，于是就得到按照时间分布的电泳谱图。 电泳的分离是以电场中溶质的速度差异为基础的。一种离子( 球形粒子) 的迁 移速度可用下式表示： v = 。e 6 n 其中： v 离子迁移速度；e ，介质的介电常数；。z e t a 电势： q ，介质粘度；e ，电场强度 由此可见，带电粒予在电泳中的迁移速度，除了与电场强度和介质的性质有 关外，还与粒子的有效电荷，大小和形状有关。所以，粒子的大小与形状，以及 其有效电荷的差异，就构成了电泳分离的基础【6 8 1 。 由于电泳速度与外加电场相关，所以，在电泳中常用淌度( m o b i l i 母，) 而 不是迁移速度来描述带电物质的电泳行为。所谓淌度，即单位场强下荷电粒子的 电泳速度。 毛细管电泳操作中一个基本的组成部分是电渗流( e l e c t r o o s m o t i cn o w ， e o f ) 。电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体朝一个方向的整体流 动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。电渗流通过对溶质淌度叠加一个 体相流速来控制溶质在毛细管内停留的时间。 电渗流可以使几乎所有粒子，不论其电荷性质如何，都向同一方向运动。在 一般情况下( 带负电的毛细管表面) ，电渗流的方向是由正极到负极。由于电渗 流可以比阴离子的淌度大一个数量级，它可以将阴离子推向阴极。所以，阴离子， 中性物质以及阳离子可以向同一方向“迁移”而在一次分析中得到电泳分离。其 中，阳离子迁移最快是因为其迁移与电渗流同向，中性物质也可以随电渗流迁移 但彼此不能分离，而阴离子则因为其迁移与电渗流反向而速度最慢。 1 2 2 毛细管电泳的分离模式 毛细管电泳有多种类型的分离模式，最常见的分离模式有如下几种： ( 1 ) 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 毛细管区带电泳是最简单，最常见的一种方式。c z e 的应用范围很宽，包 西南大学硕士论文 第一章绪论 括氨基酸分析、多肽分析、蛋白质分析、离子分析、广泛的对映体分析和很多其 它离子态物质的分析。c z e 的分离原理如图1 2 所示，在毛细管中，所有样品 在电渗流的作用下，统一朝一个方向泳动，在电迁移过程中，根据物质的荷，质比 ( c h a r 譬e m a s s 比值) 差异来进行分离，比值愈大，跑得愈快( 如图中的a ) ，最 先通过检测窗口，在电泳图上首先出蜂。带正电的物质由于其电泳方向与电渗流 方向一致，故其迁移速度最大，跑在最前方( 如图中的a 与b ) 。带负电的物质 由于电泳方向与电渗流方向相反，故其迁移速度晟小，落在最后方( 如图中的d ) 。 中性物质的迁移速度与电渗流的速度一致，位于中间位置( 如图中的c ) 。 萨 卜_ _ 一。 j i 图1 2 毛细管区带电泳原理示意图 a ：带有两个正电荷的阳离子b ：带有一个正电荷的阳离子c ：中性粒子d ：负离子 ( 2 ) 胶束电动色谱( m i c e l l a re l e c t r o l 【i n e t j cc h r o m a t o g r 印h y ，m e k c ) 在电解质中加入超过临界胶束浓度的表面活性剂( 如s d s ) ，表面活性剂分 子问的疏水基团聚集在一起形成胶束( m i c e l l e ) ，样品根据其疏水性 ( h y d r o p h o b i c i t y ) 强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同，来进行分 离，样品疏水性愈强，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度 会变慢，因此疏水性愈强的物质则愈慢出来。该分离模式的显著特点是：1 根据 分子之疏水性及亲水性的强弱差异进行分离；2 可分离不带电荷之物质，疏水性 强的物质或电荷质量比值相近之物质。因此，胶束电动毛细管色涪是毛细管电 泳技术与色谱技术巧妙结合的成果。它是以电渗流驱动的，以胶束为假固定相的 一种色潜技术1 6 9 7 ，应用于药物分析、环境污染物分析及其他小分子物质的分离 分析。 4 西南大学硕士论文第一章绪论 ( 3 ) 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r ) rg e le l e c t m p h o r e s i s ，c g e ) 在毛细管内先填充凝胶( 例如p o l y a c r y l a i l l i d e 或c e l l u l o s e ) ，此时凝胶会在毛 钿管内形成分子筛，样品依分子量的大小在毛细管内移动速度不同而进行分离。 ( 4 ) 毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，a e f ) 电解质中混合凝胶及a m p h o l i t e ( 两性电解质) ，通电后，两性电解质会先形成 p h 梯度，样品会各自向其等电点移动，直到不带电荷( 等电点) 时则停止移动， 利用气压压力将已等电聚焦的样品推动，经过检测器进行检测。 ( 5 ) 毛细管等速电泳( c a p i l l a i ) ，j s o t a c h o p h o r e s i s ，c i t p ) 毛细管等速电泳是一种“移动界面”电泳技术，在c i t p 中，使用两种缓冲 体系造成所有被分离的区带等速迁移的状态。被分离区带象夹心面包一样，被夹 在前导电解质和尾随电解质之间。一次c i t p 实验可同时分离正离子和负离子。 ( 6 ) 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h m m a t o g r a p h y ，c e c ) 该技术将高效液相色谱众多的固定相微粒填充到毛细管中，用电场力( 不是 液压) 作动力推动流动相通过填充的毛细管柱，以样品与固定相间的相互作用为 分离机制。用小内径的填充柱得到最高效的分离效果。 ( 7 ) 亲和毛细管电泳( a m n 时c 叩m a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e ) 在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子受体和其配体间，发生特异 性相互作用形成受体一配体复合物。通过研究受体或配体在发生亲和作用前后的 电泳谱图变化，可获得有关受体一配体亲和力大小、结构变化、作用产物等多方 面的信息。 ( 8 ) 非水相毛细管电泳( n o n a q u e o u sc a p a r ye i e c t r o p h o r e s i s ，n a c e ) n a c e 是指分析物在有机溶剂中进行电泳的分离模式，有机溶剂的粘度和 介电常数影响样品离子迁移和电渗流水平。使用非水相介质可增加方法的选择 性。 1 2 3 毛细管电泳的检测方法 常用的毛细管电泳的检测方法有紫外检测( u v v i s ) ，二极管阵列检测 ( u v i sd a d ) 激光诱导荧光检测( l i f ) ，电化学检测，质谱检测( c e m s ，m s ) 以及化学发光检测。 在上述检测方法中，二极管阵列检测和紫外检测简单易行，是目前应用最广 西南大学硕士论文 第一章绪论 法也可以获得较高的灵敏度，但其检测范围局限在那些容易氧化或还原的物质。 化学发光检测与电化学检测类似，虽可获得较好的灵敏度，但同样受分析物质和 反应条件的限制。质谱检测灵敏度高，专属性强，是c e 非常理想的一种检测器， 但受到m s 与c e 接口性能不完善的限制，该方法尚未得到推广。 1 2 4 毛细管电泳的在线富集技术 c e 发展依始，j o r g e n s o n 曾指出，高灵敏度与多模式检测器的发展是c e 技 术的广泛应用和深入发展所面临的主要挑战【7 l j 。由于毛细管光路太短，非高灵 敏度的检测器难以测出样品峰。正如本文在毛细管电泳的检测方法一节中的介绍 所述，正是因为现有的各种检测方法存在着或是检测灵敏度不高，或是检测仪器 价格昂贵，或是受分析样品和试验条件的局限，这些种种不利因素的限制，寻找 行之有效的毛细管电泳的在线富集方法，就为解决上述问题提供了一条出路。 最早为人们所熟知的毛细管电泳的在线富集技术是等速电泳( i t p ) 【7 2 7 7 1 ， 在i t p 中，低浓度样品为适应前导离子的浓度水平而产生浓缩效应，使得痕量样 品得到富集，从而提高了检测灵敏度。柱上固相萃取方法是不同于i t p 富集原理 的基于分析物物理性质的富集技术陋80 1 。近年来，样品堆积( s a m p l es t a c l ( i n g ) 这一名词在越来越多的毛细管电泳在线富集技术研究报告中出现。s a r n p l e s t a c k i n g 最早被o m s t e i n 【8 j j 使用，用来描述样品分子由于淌度减慢而产生逐个堆 叠起来的现象，现在，它通常用来形容电动聚集等富集现象中样品区带变窄效应 峭”。h a g l u n d 和t i s e l i u s 首次介绍了利用低电导率的背景缓冲溶液完成样品富集 的堆积方法，他们还指出，这一堆积方法简单，行之有效，并具有普遍性8 3 】。 样品堆积的产生是由分析物在分离路径中速度的改变而引起的。如果样品塞 的前端比样品塞本身迁移速度慢，或是样品塞的尾部比样品塞本身迁移速度快， 均可以引起样品区带的变窄。堆积就发生在由物理或化学因素导致速度发生变化 的界面处。 堆积通常归为两种机理：电动聚焦和吸附。在电动聚焦中，由电导率和荷电 粒子的浓度掌控的电泳过程是产生堆积的原因。它们遵循几种基本的物理法则： 电中性，化学平衡，质量平衡以及欧姆定律。在堆积过程中，所有粒子的电泳淌 度通常被假定为不变化的。运行电场强度的改变或是区带间速度的改变都能引起 堆积的产生。由色谱或物理性质带来的吸附作用同样能够引起堆积。与电动聚焦 西南大学硕士论文 第一章绪论 不同的是，吸附引起的堆积由于分析物自身物理性质的不同而带有选择性【”】。 各种各样基于样品堆积的毛细管电泳在线富集技术蓬勃发展，诸如：场放大 样品堆积( 6 e 1 “m 】啦n e d 唧1 es l a 出n 吕f a s s ) 陋8 ”，大体积样品堆积( 1 a r g e v o l u m e s 锄p l es t a c k i n g ，l ，v s s ) 【8 8 ，8 9 1 ，p h 堆积0 h m e d i a t e d 咖c k i n 曲阮9 “，在m e k c 模式中 引入样品堆积【9 2 _ 9 4 1 ，以及可以极大提高灵敏度的被称为阳离子一阴离子一选择 性进样扫拂胶束电动色谱( c a d o n - a n da 1 1 i o n 剥e c t | v ee ) d 】a l 碰v c e 嘶0 n 删i 母m 波a r d e c 缸d l d r 枷cc h 舢a t 0 留【a p h y ，c s e i - ，a s 椰毋印i n 酣c ) 【9 5 9 8 1 等等。 a c o “e t o i 1 1 l e t o i r 】1 吐 一i 田， t 日 b o s o ， l o wc o n d u c 6 v 姆h 曲c o n d u c 嘶t y e o u n c t o o u h e t e o u d c t 图1 _ 3f a s s 的基本原理图 场放大样品堆积技术f a s s 的基本原理如图1 3 所示，它是所有富集技术中 最简单的一种方式。在该技术中，只需将样品溶解于低电导率的介质中，如水或 者低于背景缓冲溶液浓度l 1 0 0 1 1 0 0 0 的缓冲溶液中。先将毛细管充满具有相对 高电导率的背景缓冲溶液，然后进样，紧接着在毛细管两端施加正向电压( 图中 a 所示) 。由于样品区带的电导率低，也即样品区带承担了绝大部分的电压，因 此，在高电压的作用下，区带中的样品迅速迁移，阴离子向着阳极移动，阳离子 向阴极移动。一但荷电离子到达样品区带与背景缓冲溶液区带的交界处，电场强 度突然下降，导致荷电离子的迁移速度下降，于是，样品就逐渐堆积于交界处附 近( 图中b 所示) 。由于电渗流的淌度通常大于所有样品粒子的淌度，所以，全 部的样品都会在e o f 的作用下泳向阴极，并按照速度大小依次通过检测窗口被 检测( 图中c 所示) 。样品的进样长度的控制是成功运用该技术的关键，因为样 品区带过短，就会损失浓缩效率，而样品区带过长，又会带来富集的不完全。已 西南大学硕士论文 第一章绪论 有报道将该技术运用o p i o i d s 眇】，生物碱1 唧，吗啡代谢物1 ，砷的各种形态样 品f l o 孙，药物样品【o 孙，铅、汞、硒复合物懈) ，甲福明二甲双胍l m 】的研究中，获 得的浓缩效率从l o 1 0 0 0 0 倍不等。 _ 棚 o 图1 4l v s s 的基本原理图 大体积样品堆积l s s 的基本原理如图1 4 所示。在i s s 中，样品的配置 类似于f a s s ，即将样品溶解于水或低浓度的缓冲溶液中，与f a s s 不同的是， 为了获得反向的e o f ，电极需要置换。先将毛细管充满具有相对高电导率的背 景缓冲溶液，然后进样，紧接着在毛细管两端施加反向电压( 图中a 所示) 。此 时，e o f 流向阴极，阳离子泳向进口端，阴离子泳向出口端( 图中b 所示) ，并 堆积在样品区带与背景缓冲溶液区带的交界处附近，同时，阳离子和中性粒子向 进口端迁移，并相继流出毛细管。观察电渗流的变化情况，直至其到达初始电流 值的9 5 9 9 时，迅速改变电极方向( 图中c 所示) ，以免阴离子样品的损失( 在 电渗流的作用下，样品能流出毛细管) 。最后，样品中不同的粒子按照速度大小 的不同依次通过检测窗口被检测( 图中d 所示) 。与f a s s 相比，该技术能够在 不损失分离效率的前提下获得更好的富集效果。为了获得好的重线性，监测电流 的变化情况从而准确及时的变换电极方向是至关重要的。值得注意的是，该技术 不能同时分离阴离子和阳离子，且对于淌度小的物质也没有明显的富集效果。该 技术已被用来分析砷、硒粒子1 1 0 6 】，卡那徽索1 0 ”，n 即h t h a l e n e s u l f o n a t e 【l ，金属 硫因1 0 计，酚及其同系物叭，食品添加剂】，阴离子1 12 1 ，肽3 1 ，铁复合物”， 西南大学硕士论文 第一章绪论 阴离子1 1 15 1 ，溴化物1 1 16 1 。 图1 5s w e e p i n gm e k c 的基本原理图7 】 s 忙印i n gm e k c 的富集原理如图1 5 所示”。首先，在毛细管中充满含有 表面活性剂胶束( 这里以带负电的s d s 为例) 的背景缓冲溶液( 为了抑制电渗 流，需要在低酸度条件下) ，并进样品( 样品溶解于水中或者不含有胶束的低浓 度缓冲溶液中。如图中a 所示) ：然后加反向分离电压，在电场的作用下，阴离 子泳向出口端，阳离子泳向进口端，背景缓冲溶液中的表面活性剂胶束也进入毛 细管，不断对样品进行扫拂( 图中b 和c 所示) 。扫拂结束后，样品就会在m e k c 的模式下得以分离( 图d 所示) 。该富集技术已经运用于芳香胺8 1 ，除草剂9 1 ， 激素1 2 0 1 ，利血平1 2 1 1 等物质的分析中。 各种富集技术多用于小分子物质的研究中。对于大分子物质，d n a 和蛋白 的报道相对较少。c e 凭借快速和高通量的操作分析优势成为当今d n a 研究中 最强有力的分析工具之一，灵敏度较低这一略势可以通过选用合适的在线浓缩方 法克服。c e m s 对于蛋白组学的研究十分有潜力，但是，灵敏度不高同样是阻 碍该技术发展的一个很重要的因素。因此，对于在线富集技术的研究和拓展是十 西南大学硕士论文 第一章绪论 分必要的【坦2 。1 2 3 1 。几种基于电动现象的富集技术已实现含有高盐浓度下d n a 和 蛋白的纯化和富集，更多的富集技术将会在日后得到更大的发展。 1 25 毛细管电泳在生化及药物分析中的应用 1 2 5 1 蛋白质分析 毛细管电泳在蛋白质和多肽分析中的应用十分广泛，包括肽、蛋白和糖蛋白 的鉴别，结构分析，纯度检测，非均一性、多样性研究，稳定性研究，结合和动 力学研究，定量测定，等电点测定，蛋白质和多肽的质量控制以及微量制备等。 蛋白质组学研究的快速发展要求毛细管电泳在蛋白质的分离和测定方面具有快 速的发展，l o c k e 等报道了用区带电泳进行样品的浓缩、分离和检测，蛋白质的 测定浓度范围从每微升皮克级到近飞克级，为蛋白质组学的研究奠定了良好的基 础【1 2 4 1 。总之，c e 的应用已经深入到蛋白领域的各个分支并正得到进步的发展。 12 5 2 核酸分析 人类基因组d n a 全序列测定的提前完成，与毛细管电泳的迅猛发展离不开 1 2 卯。c e 除了在d n a 测序方面发挥着重要的作用，它还在核酸、基因疫苗的质 量控制，碱基、核苷和核苷酸的分析，纯度检测、片段收集和微量制备，p c r 产物分析和d s d n a 分析，蛋白质一d n a 相互作用测定，基因突变测定，基因表 达测定等方面发挥着独特的作用 1 2 6 m 9 1 。 1 2 5 3 药物分析 自1 9 8 7 年c e 首次被应用于药物分析1 3 0 t 1 3 2 】以来，c e 在药物分析中的应用日 益广泛。主要包括由主成分的定量测定，痕量杂质检测，中药材成分分析手旨纹 图谱，中药复方制剂中化学成分测定，药物计量离子配比测定，药物代谢产物测 定，药物与蛋白质的相互作用研究，滥用药物测定以及药厂质控等方面。 1 3 表面活性剂在毛细管电泳中的应用 表面活性剂是一类能显著降低水的表面张力的物质3 m 。它可分为阴离子型、 阳离子型、两性离子型、非离子型等不同种类。从分子结构上看，所有表面活性 剂有一共同特点，即它们的分