（发酵工程专业论文）乳酸菌的苹果酸乳酸酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达.pdf

乳酸菌的苹果酸一乳酸酶基因的克隆和在大肠杆菌中 的表达 摘要 苹果酸一乳酸酶是乳酸菌中控制苹果酸一乳酸发酵的关键酶，利用基因工程 方法构建可降解苹果酸的酵母工程菌，试图由工程菌同步完成酒精发酵和苹果 酸乳酸发酵，这不仅提高葡萄酒的营养价值和感官质量，简化酿酒工序，降低 生产成本，提高酒的生物稳定性，而且克服乳酸菌添加给葡萄酒质量带来的各 种副效应；除此之外，构建工程菌的过程可深化对微生物降酸机理的理解，丰 富和发展酿造理论，经济有效的控制降酸过程。 本文提取乳酸乳球菌乳酸亚种( l a c t o c o c c u sl a c t i ss u b s p 1 a c t i s ) 1 1 8 、葡萄 酒明串珠菌化e u c o n o s t o co e n o s ) 6 0 5 7 、乳酸乳球菌乳脂亚种a c t o c o c c “sl a c t i s s u b s pc r e m o r i s ) 1 9 、嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 1 2 4 7 1 和德氏乳杆 菌保加利弧亚种犯a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s ) 1 1 4 8 0 的基因组 d n a ，通过p c r 方法从1 1 8 菌株和6 0 5 7 菌株中分离到m l e 基因，并克隆到 p g e m te a s y 载体，分别构建了p t - m l e l 1 8 和p t - m l e 6 0 5 7 克隆载体，测序结果 表明：1 1 8 菌株的m 跆( g e n b a n k 中注册号为d q 6 6 7 0 0 6 ) 含有1 6 2 3 个碱基的 完整阅读框， 6 0 5 7 菌株的m e ( o e n b a n k 中注册号为d q 6 6 7 0 0 4 ) 含有1 6 2 6 个 碱基的完整的阅读框。在n c b i 进行b l a s t 分析，1 1 8 菌株r o l e 序列与4 种 已注册的l a c t o c o c c u sl a c t i sm l e 基因序列比较，即与i l l 4 4 1 序列和i l l 4 0 3 序 列的同源性达9 9 1 与m g l 3 6 3 序列的同源性达9 6 8 。6 0 5 7 菌株r o l e 序列 与其中两种己注册的o e n o c o c c “so e n im l e 基因序列比较，即与 a y 7 8 6 1 7 6 ( g e n b a n k 序列号) 序列同源性达9 9 7 ，与a b 2 3 5 2 0 2 ( g e n b a n k 序 列号、序列同源性达9 9 3 。 将1 1 8 菌株m e 序列与1 9 7 6 年保存的一株乳酸乳球菌乳酸哑种 l a c t o c o c c u sl a c t i ss u b s p 1 a c t i s l 1 8 的m l e 序y l j ( g e n b a n k 注册号为d q 6 6 7 0 0 5 ) 进行比对，同源性达9 8 8 。有1 8 个碱基差异，主要是碱基a 和t 的变化， 其中5 5 5 的a 变成g ，8 0 的t 变成a 。编码1 0 个新的氨基酸，这些氨基 酸均在保守区之外。 用s a i 酶从p y - m l e l 1 8 载体上将m e 目的片段切下，克隆到大肠杆菌 p e t - 2 8 a 表达载体，构建了p e t - m l e 表达载体。用c a c l 2 转化法将p e t - m l e 质粒 导入大肠杆菌b l 2 1 。经酶切鉴定，s d s p a g e 电泳，大肠杆菌转化子表达了 6 0 k d 左右的目标蛋白。 关键词：乳酸乳球菌：葡萄酒明串珠菌；苹果酸一乳酸酶基冈；克隆和表达 t h ec l o n i n go fg e n ee n c o d i n gm a l o l a c t i ce n z y m ef r o m l a c t i ca c i db a c t e r i aa n di t se x p r e s s i o ni n e s c h e r i c h i ac o l i a b s t r a c t m a l o l a c t i c e n z y m e i st h e k e ye n z y m e t h a t p e r f o r m s t h em a l o l a c t i c f e r m e n t a t i o ni nl a c t i ca c i db a c t e r i a ，b ym e a n so f t h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gm e t h o d ，w e c o a lc o n s t r u c tay e a s te n g i n e e r i n gs t r a i nw h i c hc a nd e g r a d em a l i ca c i da n df i n i s h a l c o h o lf e r m e n t a t i o na tt h es a m et i m e ，i no r d e rt oi m p r o v eb o t hn u t r i t i v ev a l u eo f t h ew i n ea n dt h et a s t eo ft h ew i n e ，t os i m p l i f yt h ep r o c e s so f m a k i n gw i n e ，t or e d u c e t h ep r o d u c t i o nc o s t s ，r a i s et h eb i o l o g i c a ls t a b i l i t yo ft h ew i n e ，a n dt oo v e r c o m e v a r i o u sb a de f f e c t so nq u a l i t yo fw i n ed u et ot h ea d d i t i o no fl a c t i ca c i db a c t e r i a i n a d d i t i o n ，c o n s t r u c t i n ge n g i n e e r i n gs t r a i n c a l l d e e p e nt h eu n d e r s t a n d i n go ft h e m e c h a n i s mo f l o w e r i n ga c i d i t y , e n r i c h a n d d e v e l o p t h e t h e o r y o fw i n e - m a k i n g ，c o n t r o lt h ec o u r s eo f l o w e r i n ga c i d i t ye c o n o m i c a l l ya n de f f i c i e n t l y t h eg e n o m ed n aw e r ep r e p a r e df r o ml a c t o c o e c u sl a c t i ss u b s pl a c t i s1 18 l e u c o n o s t o co e n o s6 0 5 7 上a c t o c o c c u sl a c t i s s u b s p c r e m o r i s1 9 s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s 1 2 4 7 1 ，l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e e k i i s u b s p b u l g a r i c u s 1 1 4 8 0 m e e n c o d i n gm a l o l a c t i ce n z y m ew a si s o l a t e db yp c rf r o ml a c t o c o c c u sl a c t i s s u b s p 1 a c t 捃1 1 8a n dl e u c o n o s t o co e h o s6 0 5 7 ，t h e nw a sl i g a s e di n t ot h ep g e m - t e a s yv e c t o r p t - m l e l 18 a n d p t - m l e 6 0 5 7c l o n i n gv e c t o r sw e r eo b t a i n e d r e s p e c t i v e l y t h es e q u e n c i n gr e s u l ts h o w e dt h a tm l eo f1 18 ( g e n b a n ka c c e s s i o n d q 6 6 7 0 0 6 ) c o n t a i n st h ei n t a c tr e a d i n gf r a m e so f16 2 3n u c l e o t i d e sa n dm l eo f 6 0 5 7 ( g e n b a n ka c c e s s i o nd q 6 6 7 0 0 4 ) c o n t a i n st h ei n t a c to p e nr e a d i n gf r a m e so f 1 6 2 6n u c l e o t i d e s w i t hb l a s ta n a l y s i si nn c b i ，1 1 8m l e s e q u e n c ei sm o r e h o m o l o g o u st h a n9 9 1 w i t hi l l 4 4 1a n di l l 4 0 3s e q u e n c e s ，m o r et h a n9 6 8 w i t h m g l 6 0 3s e q u e n c e t h em l es e q u e n c eh o m o l o g ya n a l y s i so f6 0 5 7s t r a i n c o m p a r e d w i t l la y 7 8 6 17 6a n da b 2 3 5 2 0 2 ( a c c e s s i o nn u m b e r so ft w os t r a i n so fo e n o c o c c u s o e n ir e g i s t e r e di ng e n b a n k ) a r e9 9 7 a n d9 9 3 r e s p e c t i v e l y 1 1 8m l e s e q u e n c ei sc o m p a r e dw i t ha n o t h e rm l es e q u e n c ef g e n b a n k a c c e s s i o nd q 6 6 7 0 0 5 ) o fl a c t o c o c c u sl a c t i s s u b s p 1 a c t i s l 18 c o n s e r v e di n 1 9 7 6 ，w h i c hh o m o l o g yi sm o r et h a n9 8 8 1 8n u c l e o t i d e sh a v ec h a n g e d a n dm o s t c h a n g e sw e r ec a u s e db ya a n dtn u c l e o t i d e sm a i n l y 5 5 5 ah a v ec h a n g e di n t og a n d8 0 th a v e dc h a n g e di n t oa 1 1 e na n i m oa c i d sa r ed i f f e r e n t w h i c hi sn o tl o c a t e d i nc o n s e r v a t i v er e g i o n s 1 18r o l ea i mf r a g m e n t ，d i g e s t e dw i t hs a i ，w a sc l o n e di n t op e t - 2 8 ae x p r e s s i o n v e c t o ro fe s c h e r i c h i ac o l ib l 21 p e t - m l ee x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e d t h e n p e t - m l ee x p r e s s i o nv e c t o rw a st r a n s f o r m e di n t oe s c h e r i c h i ac o l ib l 21w i t hc a c l 2 m e t h o d t a r g e tp r o t e i n a b o u t6 0 k dw a ss h o w e d t h r o u g h s d s p a g e e l e c t r o p h o r e s i s k e yw o r d s ：l a c t o c o c c u sl a c t i ss u b s p 1 a c t i s ，l e u c o n o s t o co e n o s ，m a l o l a c t i c e n z y m eg e n e ，c l o n i n ga n de x p r e s s i o n 山东轻t 业学院硕士学能论文 简称 a c r a m p b i s e b e c o l f i p t g k a n m l e ，”f g m l f o r f o r l p c r s d s t e m e d 缩略语 a b b r e v i a t i o n 英文名 a c r y l a m i d e a m p i c i l l i n m e t h y l e n e b i s a c r y l a i e t h i d i u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l f i s o p r o p y l - b d t h i o g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n m a l o l a c t i ce n z y m e m a l o l a c t i ce n z y m eg e n e m a l o l a c t i cf e r m e n t a t i o n o p e nr e a d i n gf r a m e o r i g i n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e n ，n ，n ，n 一t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 中文名 丙烯酰胺 氨苄青霉索 甲又双丙烯酰胺 溴化乙锭 大肠杆菌 异丙基一b d 硫代半乳 糖苷 譬那霉素 苹果酸乳酸酶 苹果酸一乳酸酶基因 苹果酸乳酸发酵 开放读码框架 复制起点 聚合酶链式反应 十j 二烷基硫酸钠 n ，n ，n ，n 一网甲基乙二 胺 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。 文中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意 义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的 论文或成果，与我同工作的同志对木研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导f 所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻 工业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及 申请专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电了版，本人离校后发表或使用学位沦文或与该论文直接相关的学术论文或 成果时，署名单位仍然为l i j 东轻工业学院。 论文作者签名 导师签名 ：蔓垒 辩 f - i # 骊：尘正年月上生r 同期：2 丝! 一年丘月五二| i 山东轻t 业学院硕十学位论文 第一章绪论 1 1 葡萄酒苹果酸乳酸发酵概述 有机酸是葡萄酒的主要成分之一，对葡萄涌的感官特性起着重要的 作用。酒石酸和苹果酸是葡萄酒两大固定酸，其中苹果酸是一种酸感强 烈，带有刺激味的双羧基酸。当葡萄酒中的苹果酸含量较高刚，则葡萄 酒给人以尖酸和粗糙的感觉，并且这种有机酸大量存在易带米葡萄酒微 生物的不稳定性。因此，酒精发酵结束后进行的苹果酸乳酸发酵 ( m a l o l a c t i cf e r m e n t a t i o n ，m l f ) ，使原来尖锐的苹果酸转化为柔和的乳 酸，从而提高葡萄酒的感官质量和生物稳定性1 1 1 。 1 2 苹果酸乳酸发酵的生化机理 节果酸其生理代谢活跃，极易被乳酸菌分解利用。m l f 就是利用乳 酸菌将酒中的l 苹果酸转化为l 一乳酸并释放c 0 2 的过程。通常菌体密 度达1 0 6 c f u m l 时，苹果酸开始被分解，细菌细胞数达1 0 7 1 0 s c f u m l 时，苹果酸被大量分解1 2 1 。这也表明苹果酸的分解与乳酸菌的增殖并不 同步。葡萄酒中可能存在着抑制乳酸菌分解苹果酸的物质，抑制物质使 菌体的相关酶类处于不活跃或阻遏状态，只有通过早期生长除去这些物 质之后，才能使酶类被激活，从而开始分解苹果酸”j ，作者认为这种滞后 分解町能与苹果酸乳酸酶足诱导酶有关。 根据对微生物体内酶催化反应机制的研究，参与葡萄酒m l f 过程 的酶类可能有：苹果酸一乳酸酶( m l e ) 、苹果酸酶( e m ) 、苹果酸脱氢酶 ( m d h ) 、草酰乙酸脱羧酶( o a d c ) 、乳酸脱氢酶( l d h ) 、烟酰胺核苷酸转 氢酶( t h ) 等。 早期对m l f 代谢途径研究认为，葡萄酒中苹果酸向乳酸的转化途 径可能有三种，但某些种类的乳酸菌体内具有两种l d h 酶，既l l d h 和d l d h ，町将丙酮酸同时转化成为d 乳酸和l 乳酸。后来的研究证 实葡萄酒的m l f 过程中，乳酸菌只能分解l 苹果酸，而生成l 乳酸。 所以，m i f 是l 一苹果酸在乳酸菌m l e 催化下直接转变成l 乳酸的过程。 1 3 苹果酸乳酸酶的特性 苹果酸乳酸酶( m a l o l a c t i ce n z y m e ，m l e ) 是苹果酸乳酸发酵的关键 酶，已从数种乳酸菌中得到分离纯化，如干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s c a s e i ) 、肠膜明串珠菌( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s ) 、植物乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 干d 酒类酒球菌( o e n o c o c c u so e n i ) 4 1 5 1 。 m i e 在n a d + 和m n 2 + 参与下，将l 苹果酸转化成l 乳酸。n a d 为m l e 的辅酶，m n 2 + 为激活剂，= i = 果酸与酶结合数量随m n ”浓度的增 加而增加。动力学研究指出n a d + 和m n ”首先附着到酶蛋白上，节果酸 然后和酶一n a d + 一m n ”复合物结合。n a d + 和m n ”对酶促反应表现为卜向 协同催化反应特征。在p h 4 0 5 5 之问，酶对n a d + 亲和力最强，反应 最大速率与p h 值呈正相关。m l e 为诱导酶，只有当苹果酸和可发酵糖 存在时，乳酸菌才能合成m l e 。m l e 的单个亚基的分子量为6 0 7 0 k d ， 活性形式的m l e 是具有相同业基的二聚体和四聚体。 从l m e s e n t e r o i d e s 中分离纯化得到的m l e 的分子量为2 3 5k d ，是4 个分了量为5 9k d 的完全相同的亚基组成的多聚体。等电点p i 为4 - 3 5 ， 酶活最适p h 为5 7 5 。草酸铵盐、1 ，6 一二磷酸果糖、l 乳酸为该酶的非 竞争性抑制剂，琥珀酸、柠檬酸和酒石酸是其竞争性抑制剂。l c a s e i 、 lm e s e n t e r o i d e s 及0 o e n i 的m l e 的最适p h 值非常接近pj 。 m l e 编码基凼位于染色体卜，已在许多非致病的乳酸菌中得到证实 胪j ，通过使用高拷贝数的载体p i l 2 7 5 ，以ll a c t i sn g 6 0 缺陷型为受体， 克隆ll a c t i s 的一组基冈，分析完整的2 3 k b 的插入片段表明，m l e 基 因包括三个开放的阅读框架( o r f s ) ，分别编码2 2 0 ，2 9 1 和8 2 个氨基酸多 肽。o r f a ( 2 2 0 残摹) 在突变体n g 6 0 中不表现出互补性，由于插入到 h i n d l i l 位点的片段并不影响其互补性。编码o r f b ( 2 9 1 残基1 的d n a 片 段含有职f 1 1 和e c o r v 位点。o r f c ( 8 2 残基) 不是由特殊的启动子所 启动，由起始密码子推测上游序列也不含有s d 序列。通过o r f b 序列 分析，由a t g 起始密码子推测f 二游序列有7 个核苷酸。 针对以前所选择的h a t p 酶缺陷突变株o e n o c o c c u so e n i 1 ，最近 d e l p h i n eg a l l a n d 于2 0 0 3 年在分子水平上对苹果酸一乳酸酶活性的缺陷 型菌株进行了研究。w e s t e r n 印迹试验得到6 0 k d 的条带，这条带仅在出 发菌株中编码节果酸一乳酸酶。通过对该突变体的r t p c r 分析，并没有 发现编码m l e 的m l e a 的转录产物。这表明苹果酸一乳酸酶操纵子在a t p 酶缺陷的突变体中不被转录。一种l y s r 型调控蛋白，它包括在苹果酸一 乳酸酶基因的表达产物中，编码这种蛋白的m l e r 基因以前在0 o e n i 中 未见报道。对r u l e r 基冈的核菅酸序列分析，没有发现突变位点和苹果 酸一乳酸操纵予1 ，这表明m l e r 调节基因与r o l e 并不存在于同一操纵子 2 幽襄轻丁盈掌院赣学梅论文 中。 d e t p h i n eg a l t a n d 铁o o e n i 爨魏审提取i o p g 爨岛，透露s d s 聚纛爝 酰胺凝胶电泳。然后用抗o o e n im l e 的专一多克隆抗体进行免疫印迹。 m i ，e 编码6 0 k d 的蛋白弗且仅存亲株中发现。从i 一a t p 酶缺陷突变株 中提取虽自，没有褥到杂交信号。袭聪在突变株中m l e 不被仑成”1 。 1 , 4m l f 其仑相关酶及特性 毳酸菌苇果酸通透黪( m i e p ) ，也h q 节果酸转运爨皇，其作魁是受责将 l 葶采酸从匏矫囱您内豹运输罅】1 9 1 。此类酶耧予一些蛋自家族，翔 厶l a c t i s 的m i e p 和l m e s e n t e r o i d e s 的柠檬酸盐运载噩白c i t p 魁同源蛋白， 分别催化柠檬酸向乳酸及苹果酸向乳酸的转化【加l 【1o 但0o e n i 的m l e p 与其毽羧黢豹转运蛋自u 蒡无司源瞧，跫瘸子另一特臻静运载爱叁家族 1 1 引。0 o e n i 的m i e p 是一种膜结合转运蛋白，甫3 1 4 个氨基酸残基组成， 分子量为3 4k d 。m i e p 在膜外有l 苹果酸的结合位点。当l ，节果酸与 姆异性位点缝合后，黪发生跨膜构象燹诧，苹果黢被运j 久黢逡并释放到 细胞质中，m l e p 恢复原来构象，接蕾进行下轮的运输。 在酵母巾，栗酒裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 的苹果酸通透 酶m a e l 为含有4 3 8 个氨簇酸的蛋白，分子量为4 9k d ，其作蹦是运载 l 苹采酸整、琥瑶酸釜涎二酸。嚣酸蘩鹣苹采酸懑透酶帮蘩滔裂殖酵母 的苹果酸通邂酶相差1 2 4 个氨基酸，由此推测，乳酸菌的苹粜酸通透酶 湛冈在酵母菌中由于限制修饰作用，f 常发挥作用。苹果酸邋透酶起着 垮瓒m l f 瓣重要囊爨。骞磅究表骥，麦于酸溅黪母本身缺乏蕈采酸转 运蛋白，只转入苹集酸。乳酸酶基因的酿酒酵母重组菌株降解外源苹果酸 的效率不高【l 引。近些年来，国外对于浆酒裂殖酵母的苹果酸通遮酶m a e i 鲍克隆和表达有一些研究【h ”j ，翻悫刘延琳等将湮类酒球藏躲苹果酸 遁透酶基因转入酿滔酵簿中1 1 6 1 ，逛实际的降酸效聚并雨十分嘲显。如栗 使苹果酸通透酶与苹果酸，乳酸酶协同作用，将大大降低培养液中l 一节 聚酸的含量。因此本文克隆的两个苹果酸一乳酸酶旗因，为苹果酸通透酶 窝苹象酸嚣羧酶基因在戳活簿母中共表达戆磺究奠定了重要灏基稿。 1 9 9 9 年，r e n a u l t 等在ll a c t 括中发现了称为m i e r 的m l f 正向调节 酶，负责苹果酸一乳酸系统的激活l l ”。l a b a r r e 等在d o e n i 中也发现了与 l t a c t i s 熊m l e r 类 矬懿激逸。关于这类酶在m l f 过程中熬终惩穰制爨 不够清楚，箕对苹果酸乳酸活性驹谰节作用可熊鳓乳酸菌的种类和菌系 而有别9 1 。 第一章绪论 1 5m l f 中常见的乳酸菌 乳酸菌是有益丁人体健康的益生菌，主要存在于人体肠道，有助于 调整人体正常菌群，维持肠道微生态平衡。乳酸菌的代谢产物能降低肠 道内的p h 值，抑制肠道中腐败菌的生长，减弱腐败菌在肠道内的产毒 作用，并有帮助消化、防止便秘、减缓细胞衰老、降低胆固醇、抗肿瘤 以及调节人体生理机能等保健和医疗作用 博i 【旧j 。 从葡萄洒、苹果酒中分离得到的乳酸菌共有9 种，见表1 ，1 。 表1 - 1 葡萄酒和苹果酒中的乳酸菌 t a b l e1 - 1l a c t i cb a c t e r i as e p a r a t e df r o mw i n ea n dc i d e r 葡萄洒节果酒 乳酸菌名称 灰色明串珠菌( l e u c o n o s t o cg r a c i l e ) 葡萄酒明串珠菌( l e u c o n o s t o co e n o s ) 植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) 干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 链杆菌( s t r e p t o b a c t e r i u m ) 希氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sh i l g a r d i s ) 短乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb r e v i s ) 乳酸菌名称 肠膜明串珠菌( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d 葡萄酒明串珠菌( l e u c o n o s t o co e o s ) 植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) 干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 混淆乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc o l l i n o c i d e s ) 苹果乳车t 菌( l a c t o b a c i l l u sm a l i ) 这些乳酸菌可分为2 种不同的类型，一类可以正常地引发m l f ；一 类则可以使葡萄酒败坏，它们 要存低酸度条件下活动，分解糖的能力 比分解酒中其他成分的能力强，从而引起挥发酸显著升高2 叭。因此在酒 精发酵结束后接种乳酸菌发酵剂，这类发酵剂主要包含前一类型的乳酸 菌，可以有效地触发m l f ，避免细菌糖代谢引发的葡萄酒挥发酸的升高 9 1 。 1 6 大肠杆菌的遗传转化系统 随着生物化学和分子生物学技术的发展，使人们得以更深入地了解 蛋白质分子的一级和二级结构，有目的地改造、创建新的有价值的蛋白 质分子。因此各种不同的表达系统应运而生，如细菌【3 3j ，酵母l “】，昆 虫细胞f 35 1 ，哺乳动物细胞等表达系统。 大肠杆菌是用于表达重组蛋白的重要宿主菌。基于多种原囚，人们 选择大肠杆菌作为起始表达系统。主要优点是：易于生长和控制：用于 细菌培养的原料也比哺乳动物的低廉；目前有各种各样的大肠十t ：菌菌株 山东轻工业学院硕h 学位论文 及与之匹配的具有各种特性的质粒可供选择。在过去的2 0 多年内，人 们已经发展了多种原核、真核表达系统束生产外源重组蛋白。重组蛋白 除用于科研外，也直接用作诊断试剂和蛋白类药物。迄今为止，大肠柑： 菌以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低等优点依然是重组蛋向牛 产的首选体系。 1 7p e t 表达系统 对于全世界许多研究者，n o v a g e n 的p e t 系统己成为在人肠杆菌 中蛋白表达的酋选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不 为大肠杆菌r n a 聚合酶识别的t 7 肩动子之下，因此在加入t 7r n a 聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到p e t 载体的基因是暂时被关闭 的，不会由于产生蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移 到染色体上含有一拷贝由l a c u v 5 控制的t 7r n a 聚合酶基因的表达 宿主中，并通过加入i p t g 而诱导表达；也可通过1 c e 6 ( n o v a g e n 商品 名称1 感染原始克隆宿主菌柬提供t 7r n a 聚合酶。使用大肠杆菌启动 子系统( 如t a c 、1 a c 、t r c 、p l ) 有困难的许多基因已经在p e t 系统 中稳定克隆和表达。t 7r n a 聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞 都可用于其目标基因表达。诱导数小时后目标产物就可超过细胞总蛋白 的5 0 。新开发的t 7 驱动表达技术以p e t b l u et m 系统为代表。 p e t b l u e 载体包括了p e t 用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒 d n a 操作的方面则更为方便。 1 8 酿酒酵母的遗传工程 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是研究得最彻底的真核微生物， 它有助于我们对真核细胞生物学乃至人类生物学的研究。几千年来，酿 酒酵母己被用于食品和酒精饮料的生产，如今它也应用于制药工业中。 酿酒酵母因其非致病性而深受生产者和研究人员的欢迎。由于它在可消 耗，r 品生产中的长久应用历史，诸如酒精和烘焙面包，它已被称为g r a s 生物( g e n e r a l l yr e g a r d e da ss a f e ) 。另外，使用酿酒酵母在生物技术领域应 用的另一重要途径就是它对重组d n a 技术基因修饰的易感性，而1 9 9 6 年出版的酿酒酵母全基因组测序 36 i 的完成使其应用更为方便。 酿酒酵母菌株改良的传统方法包括：1 ) 诱变育种，即利用物理、化 学等诱变因素，诱发基因突变，然后根据育种目标，从随机突变株中筛 第一章绪论 选出具有某一优良性状的突变株；2 ) 采用杂交、转化和转导等遗传学方 法，使微生物发生基因重组以增加优良性状的组合，或导致多倍体的出 现。但是这些方法随机性大、费时、耗人工。然而，基于重组d n a 技 术的基因工程育种则町以弥补上述缺点，可以定向、直接地将有用的遗 传信息输入微牛物细胞，从而实现定向育种。微生物的基因工程育种一 般采用两种方式：1 ) 引入新的基因，使菌株获得新的性状；2 ) 定点诱变 ( s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s ) ，即在体外使基冈的特定区域定向发生突变，替 代受体菌该基因的野生型拷贝，从而实现达到改良菌种的某一性状。 1 8 1 酵母转化的筛选标记 自从1 9 7 8 年h i n n e n 建立了酵母转化方法【3 7 1 ，重组d n a 技术不仅用 _ = i 二实验酵母也用于工业酵母改良。酵母转化常用含有内源2 质粒复制 起点的高拷贝自主复制质粒【3 8 1i s 9 1 。染色体上的高频率的同源重组技术 40 1 、基因融合技术【4 1 1 4 2 1 、构建含中心粒功能和质粒a r s ( 自主复制1 序 列的环状微染色体【43 j 和构建含质粒d n a 序列的人工染色体等技术也被 用 二酵母转化。这些技术大大促进基因表达和染色体功能的研究，也为 传统菌株改良和外源蛋白生产的研究提供了技术支持。 筛选标记的选择主要是依据转化的宿主菌株的遗传稳定性而定。经 常采用的是必需的生物合成酶基因，并且与宿主的隐性缺失互补，如 l e u 2 、h i s 4 、t r p 。显性筛选标记可用于酵母本身的基因( c u p l ) 、或采用 非酵母的抗性基因( 如g 4 1 8 ) 。与单倍体试验酵母的转化不同，j 二业菌株 的转化并不基于带自养标记突变株的互补，凶为很难从多倍体工业株中 获突变体，并且诱变常常会干扰菌株的生化性状。选择标记中有些来源 于酵母，如s d i a s t a r i c u s 的d e x i ( 编码葡萄糖淀粉酶) 、s c e r e v i s i a e 的 m e l l ( 编码p 一半乳糖苷酶) 分别使转化子能在淀粉和蜜_ 二糖中生长。 零霉素( z e o c i n ) 在哺乳动物细胞、植物、酵母、原核生物中作为 筛选标记。在酵母p y d 培养基上， s a c c h a r o m y c e sc 8 r e v i j i 口p2 1 4 5 0 对 z e o c i n 的耐受力最强，是s c h i z o s a c e h a r o m y c e sp o m b e2 2 1 4 和 s c h i z o s a c c h a r o m ) ，c e sm a l i d e v o r a n s2 16 2l 的2 4 倍。 1 9m l e 基因克隆和测序 早在1 9 8 4 年，美国加州大学w i l l i a m s 就将德氏乳杆菌l a c t o b a c i l l u 5 d e l b r u e c m i 中的m l e 基因克隆到大肠杆菌和酿酒酵母中并使之表达f 44 1 。 l 山东轻工业学院硕士学位论文 他从l d e l b r u e c k i i 中提出染色体d n a ，1 ； j 内切酶s a li 切割，连tp b r 3 2 2 质粒t e t 基凶内的s a li 位点，转化大肠杆菌k 1 2 r r l ，对抗a m p 的红 霉素敏感转化子用b o c h n e r 镰霉酸法筛选。在4 0 0 0 个菌株中筛选得到了 两个相同的，可产生l 乳酸的大肠杆菌重组子r r l ( p s w l ) 和 r r i ( p s w 2 ) 。酶切分析指出，降酸菌株r r l 是由p b r 3 2 2 和5 k b 左右的 s a li 片段构成。v i r g i n i ea n s a n a y 用l 1 a c t i s 基因组d n a 构建) l g t t l 载 体义库，并用专性多克隆血清筛选。在7 5 0 0 0 个噬菌体中得到阳性克隆 再弧克隆到p u c l8 载体卜。经限制性酶切和s o u t h e r n 杂交，其中5 个 插入片段携有重叠区域的d n a 片段，随后又共同拼接限制性内切酶切 图谱显示了4 5 k b 的l l a c t i s 基因组d n a 。应用m l e 蛋白n 端序列设计 引物制备探针，进行插入片段的s o u t h e r n 杂交，获得5 个克隆的f 向信 息。对p 1 5 3 质粒的插入片段( 2 7 k b ) n 9 序，检测到两个丌放读框( o r f ) ， o r f l 为1 6 2 3 b p ，o r f 2 为5 8 2 b p 。在o r f l 的编码区内，a t g 上游有一 个s h i n e d a l g a r n o 序列( g g a g g ) ，1 0 ( t a t a g t ) 和3 5 ( t t g a c t ) 启动子被 l8 个核苷酸分丌，在o r f l37 端无终止结构。在m l e 终止密码子后第 l5 b p 处有o r f 2 的起始密码，在o r f 2 上游有一个象s h i n e d a l g a r n o 序 列( g g a g g l ，但无典型的启动子，表明这两个基因同属一个操纵子。通 过m l e 基因与其他物种基因序列比较，将m l e 归属于苹果酸酶( m e ) 系，ll a c t i sm l e 与大肠杆菌苹果酸酶同源性很高 4 2 ( n t ) ，4 7 ( a a ) ，与 玉米为3 8 ( n t ) 和4 8 ( a a l ，与人类为3 5 ( n t ) 和4 5 ( a a ) 。m l e 极强的 遗传保守区在其氨基酸序列的1 4 3 位和1 5 2 位，这一序列与n a d 结合 域完全匹配。在氨基酸2 9 0 - - 3 2 2 位是b o x i i 区，含有烟酰胺辅酶基本序 列。b o x i l i 序列( f n d d e q g t ) 被视为苹果酸酶指纹。本文中乳酸乳球菌 和葡萄酒明串珠菌在极强保守区1 4 3 位和1 5 2 位均未发生变化；在b o x i i 区有几个氨基酸发生变化：b o x l i i 序列均为f n d d e q g t ，高度保守。 v i r g i n i e 强调，虽然m l e 和m e 在核酸水平上同源性很高，但通过苹果 酸一乳酸酶基因探针试验，并未有s o u t h e r n 杂交结果出现，说明m e 和 m l e 蛋白没有真正的同源性。 m u r i e ld e n a y r o l l e s 利用m l e 的n 端2 0 个氨基酸序列设计简并引物 ( p 1 ：5 - a t g a g ( ao rg ) g c n c a ( t o rc ) g a ( ao rg ) a t - 3 p 2 ：5 - c a t n g t o rg ) a a n g c n g t - 3 ) ，从l o c t o c o c c u sl a c t i si l l 4 4 l 基因组d n a 中扩 增到m l e 基因的一部分，氏度6 0 b p ，以此为探针分离到两个邻接质粒， 将4 k b 的e c d r v 片段克隆入p k s + 质粒和p e m l 2 质粒。测序结果表明两 个插入片段已含盖了m l e 基因的完整序列。在所测1 9 k b d n a 片段中， 第一章绪硷 含有1 6 2 3 b p 丌放阅读框，编码5 4 0 个氨基酸，等电点4 4 6 ，与早期纯 化蛋白质分子量估计值6 0 k d ，p h 4 3 相符，进一步印证了v i r g i n i e 的结 论 4 5 1 。 c e c i l el a b a r r e 等用苹果酸酶基因序列保守区( b o xi 和b o x i i i ) 序列设 计引物f p l ：5 一a t h y t n g g n a t h g g n o a y t g g g g n 一3 ，p 2 ：57 一n g t n c c y t g d a t r t c r t t t r a a 37 1 ，从l e u e o n o s t o eo e n o s 中扩增了3 2 4 b p 的d n a 片段，以此为探针，从葡萄酒明串珠菌基因组文库中经杂交分离m7 个 重叠区的克隆子，对重组质粒p j 6 d 5 和p j 2 c 3 中两个插入片段测序，共 测定了3 4 5 3 b p 重番片段序列 4 6 】 8 1 。依末端序列结构推断包括有两个完 整的读框，分别为1 6 2 6 b p 和9 4 2 b p 。序列内有一个核糖体结合点 ( 5 一a g g a g 3 ) ，位于3 5 3 3 5 9 b p 之间。它与l e u e o n o s t o cm e s e n l e r o j f d e s 菌1 6 sr r n a5 c a c c t c c t t c 3 恰好互补1 4 7 1 。m l e 基因编码氨基酸 5 4 1 个，分子量5 9 1 18 d a ，等电点为4 5 5 ，与l a c t o c o c c u s l a c t i s 的m l e 相比有6