（发酵工程专业论文）产琥珀酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能研究.pdf

1 ，1 摘要 摘要 琥珀酸是一种重要的化工产品，广泛应用于食品、农业、医药及精细化工等领域， 市场前景巨大。相比于传统的化学生产法，微生物发酵法生产琥珀酸具有无可比拟的优 点和潜力，引起了国内外众多研究机构的高度关注。其中运用基因工程手段构建高产琥 珀酸的重组大肠杆菌是近年来的研究热点，由于野生大肠杆菌厌氧发酵产物中琥珀酸含 量低，且有大量副产物。要达到高产琥珀酸的目的，就必须为其进行代谢途径的改造， 阻断代谢支路，引导碳流更快更多的流向目标产物。 本文利用x e r d f 重组酶系统，对一株野生大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l ic i c i mb 0 0 1 3 开展了代谢途径的调控研究。首先为了消除发酵过程中产生的杂酸等副产物，本文敲除 了ec o l ic i c i mb 0 0 1 3 琥珀酸代谢竞争途径中包括乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶基因 ( a c k a - p t a ) 、乳酸脱氢酶基因( 1 d h a ) ，丙酮酸甲酸裂解酶基因，乙醇脱氢酶基因( a d h e ) 在内的关键酶基因，所得到的重组菌株ec o l ib 0 0 1 3 1 0 4 0 具备厌氧条件下高效转化葡 萄糖生成琥珀酸的能力，发酵液中无乙酸，甲酸等副产物生成。 其次本文在琥珀酸代谢支路已被阻断的大肠杆菌菌株基础上又进行了葡萄糖吸收 方式的调整研究。为关闭其葡萄糖磷酸转移酶系统( p t s ) ，敲除了该系统中关键酶i ic b o l 。 的编码基因p t s g ，促使半乳糖协同运输系统成为大肠杆菌葡萄糖运输的主要途径。这项 改变大大增加了琥珀酸的合成前体p e p ，得到的重组菌株ec o l ib 0 0 1 3 1 0 5 0 经发酵实 验结果显示产琥珀酸能力得到了大幅度提升。厌氧转化3 6h 琥珀酸产量达到3 0 5g l ， 生产强度为0 8 5g l h ，葡萄糖琥珀酸糖酸转化率为6 5 2 ，发酵液经h p l c 未检测到 乙酸等杂酸。另外，p t s g 基因的缺失也解除了葡萄糖代谢产物对菌体的抑制，使大肠杆 菌可以同时利用葡萄糖以外的多种碳源，很大程度上拓宽了琥珀酸发酵的底物谱，为降 低生产成本，大规模工业化生产打下了基础。 为加强琥珀酸合成途径，引导代谢流更多的流向草酰乙酸这一关键节点，本文强化 表达了p e p 羧化酶。通过将大肠杆菌内源p p c 基因与不同拷贝数质粒的连接，导入重组 茵，从而使实现对p p c 基因在宿主体内表达剂量的控制。研究发现在琥珀酸生产过程中， p e p 羧化酶的表达剂量并非越高越好，而是需要控制在一个合理的水平才能有效促进琥 珀酸的积累。实验中得到的重组菌ec o l ib 0 01 3 1 0 5 0 ( p t h - p p c ) 是所有重组菌中生产能 力最强的一株，厌氧转化葡萄糖3 6h 琥珀酸产量达到3 6 2g l ，生产强度为1 0 l 趴l ”， 葡萄糖琥珀酸转化率为6 4 3 ，在已公开的同类文献中处于先进水平。 最后本文还对构建大肠杆菌厌氧发酵产琥珀酸的乙醛酸循环的可行性进行了探讨 和研究。 关键词：琥珀酸；重组大肠杆菌；代谢调控；基因敲除；x e r d f 重组酶系统 a b s t r a c t a b s t r a c t s u c c i n i ca c i di sa l li m p o r t a n tc h e m i c a lp r o d u c t ，w i d e l yu s e di nf o o d ，a g r i c u l t u r e ， m e d i c i n ea n df i n ec h e m i c a li n d u s t r y , a n dh a sah u g em a r k e tp r o s p e c t c o m p a r e dw i t ht h e t r a d i t i o n a lp r o d u c t i o nm e t h o di nc h e m i c a lw a y , m i c r o b i a lp r o d u c t i o no fs u c c i n i ca c i db y f e r m e n t a t i o nh a sal o to fa d v a n t a g e sa n dh l l g ep o t e n t i a l m a n yr e s e a r c hi n s t i t u t e sa l lo v e rt h e w o r l da r ep a y i n gg r e a tc o n c e r no ni t sp r o g r e s s c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac o l i w i t l lh i g h e ry i e l ds u c c i n a t ep r o d u c t i o nb yg e n e t i ce n g i n e e r i n gm e t h o di so n eo fh o t e s tt o p i c s i nr e c e n ty e a r sr e s e a r c h t h e r ea r eal a r g en u m b e ro fb y - p r o d u c t sb e s i d e ss u c c i n i ca c i di n t h e c o m p o n e n to fw i d et y p ee s c h e r i c h i ac o l ia n a e r o b i cf e r m e n t a t i o np r o d u c t i o n i no r d e rt o a c h i e v eah i g h e rs u c c i n a t ep r o d u c t i o n ，m e t a b o l i cr e g u l a t i o nm u s tb ec a r r y e do u to n as t r a i no f ec o l i ，b l o c k i n gt h em e t a b o l i cb y p a s sa n dl e a d i n gc a r b o nf l o wt ot h et a r g e tp r o d u c ta sm u c h a sp o s s i b l e i nt h i sp a p e r , m e t a b o l i cp a t h w a yr e g u l a t i o nw a sp e r f o r m e do naw i l dt y p es t r a i no f e s c h e r i c h i ac o l ic i c i mb 0 013b yu s i n gx e r d fr e e o m b i n a s es y s t e m i no r d e rt oe l i m i n a t e t h eb y - p r o d u c t so ft h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，w ec o n s t r u c t e dar e c o m b i n a n tec o l is t r a i n b 0 0 1 3 - 1 0 4 0 ，o fw h i c ht h eg e n ea c k a - p t a ，l d h a ，p f l b , a d h ew e r ed e l e t e df r o mc h r o m o s o m e t h i ss t r a i nc a np r o d u c es u c c i n a t ea st h em a j o rp r o d u c ti na n a e r o b i cf e r m e n t a i o n s e c o n d l y , w ec a r r y e do u tar e s e a r c ha b o u tt h er e g u l a t i o no fg l u c o s eu p t a k i n gp a t h w a y i ne c o l l t os h u td o w nt h eg l u c o s ep h o s p h o t r a n s f e r a s es y s t e m ( p t s ) ，p t s gw h i c he n c o d i n g p r o t e i ne i i c b 9 1 6o ft h ep h o s p h o t r a n s f e r a s es y s t e mw a sd e l e t e da n dm a d et h eg a l a c t o s e c o l l a b o r a t i v et r a n s p o r t a t i o ns y s t e r mt ob et h em a i np a t h w a yf o rg l u c o s eu p t a k i n gi na r e c o m b i n a n ts t r a i no fe c o l ib 0 013 - 10 5 0 t h i sc h a n g eh a sg r e a t l yi n c r e a s e dt h es u c c i n i ca c i d b i o s y n t h e s i sp r e c u r s o rp e et h ef e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t ss h o w e d t h es u c c i n a t ep r o d u c t i o no f ec o l ib 0 0 1 3 - 1 0 5 0h a sb e e ni m p r o v e ds i g n i f i c a n t l y ah i g h e rp r o d u c t i o no f3 0 5g l s u c c i n a t ew a sa c h i e v e di n3 6ha n a e r o b i cf e r m e n t a t i o n ，t h ep r o d u c t i v i t ya n dy i e l dw a s e n h a n c e dt o0 8 5g l ha n d6 5 2 ，r e s p e c t i v e l y a d d i t i o n a l l yt h e r ew a sn ol a c t a t e ，a c e t a t e ， f o r m a t ea n de t h a n o ld e t e c t e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) i nt h e f e r m e n t a t i o n p r o d u c t i o n t h ep t s g m u t a n ta l s os h o w e dad i s a p p e a r a n c eo fg l u c o s e m e t a b o l i t e si n h i b i t i o nt oc e l l s ，a n di tc a nu s eav a r i e t yo fc a r b o ns o u r c e sa ss u b s t r a t e ，t h i sc a n h e l pu st or e d u c et h ep r o d u c t i o nc o s t sa n dm a k e c o n t r i b u t i o nt oi n d u s t r i a la p p l i c a t i o n i no r d e rt os t r e n g t h e nt h es u c c i n a t es y n t h e s i sp a t h w a ya n dg u i d em o r ec a r b o nf l o wt o o x a l o a c e t a t ew h i c hi sv e r yi m p o r t a n tt os u c c i n a t ep r o d u c t i n w ee n h a n c e dt h ee x p r e s s i o no f p e pc a r b o x y l a s eb yc l o n et h ep p cg e n et op l a s m i d sw i t hd i f f e r e n tc o p yn u m b e r sa n dt h e n t r a n s f o r i l lt h e mi n t ot h er e c o m b i n a n ts t r a i nec o l ib 0 013 10 5 0 t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e e x p r e s s i o nl e v e lo fp e pc a r b o x y l a s ei ns u c c i n a t ep r o d u c t i o np r o c e s si sn o tt h eh i g h e rt h e b e t t e r i tr e q u i r e sar e a s o n a b l el e v e lf o re f f e c t i v e l yp r o m o t i n gt h ea c c u m u l a t i o no fs u c c i n a t e t h er e c o m b i n a n tec o l ib 0 013 10 5 0 ( p t h - p p c ) h a sah i g h e s tp r o d u c t i o ni na l ls t r a i n s c o n s t r u c t e d i tc a np r o d u c ea sm u c ha s3 6 2g ls u c c i n a t ei n3 6h o u r sa n a e r o b i cf e r m e n t a t i o n , a n dt h ep r o d u c t i v i t ya n dy i e l dw a se n h a n c e dt o1 0 1g l ha n d6 4 3 ，r e s p e c t i v e l y f i n a l l y , t h ec o n s t r u c t i o no fg l y o x y l a t e c y c l ei nec o l ia n a e r o b i cf e r m e n t a t i o nf o r a b s t r a c t p r o d u c i n gs u e c i n i ca c i dw a sd i s c u s s e di nt h i sp a p e r k e y w o r d s ：s u c e i n i ea c i d ；r e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac o l i ；m e t a b o l i cr e g u l a t i o n ；g e n e k n o c k o u t ；x e r d f r e c o m b i n a s es y s t e m i i i 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章前言1 1 1 琥珀酸的理化性质1 1 2 琥珀酸的功能用途与市场分析j 1 1 3 琥珀酸的生产方法2 1 3 1 化学合成法2 1 3 2 生物转化法3 1 3 3 微生物发酵法3 1 4 发酵法产琥珀酸的研究现状及国内外最新进展3 1 4 1 产琥珀酸厌氧螺菌的研究进展。4 1 4 2 产琥珀酸放线杆菌的研究进展。5 1 4 3 大肠杆菌产琥珀酸的研究进展5 1 5 代谢工程与基因敲除技术。8 1 6 本论文的研究意义与研究内容9 第二章材料与方法1 0 2 1 材料1 0 2 1 1 菌株与质粒1 0 2 1 2 工具酶和试剂1 0 2 1 3 引物l o 2 1 4 染色体与质粒提取试剂1 1 2 1 5 培养基和培养条件1 1 2 1 6 主要仪器和设备_ 1 1 2 2 方：法1 2 2 2 1 大肠杆菌质粒d n a 的提取1 2 2 2 2 大肠杆菌j m l 0 9 感受态细胞的制备及转化1 2 2 2 3 目标基因的删除1 3 2 2 4 重组大肠杆菌在发酵罐中发酵实验13 2 2 5 发酵产物检测13 2 2 6 其他细胞培养及分子操作。1 3 第三章结果与讨论1 4 3 1ec o l ic i c i mb 0 0 1 3 琥珀酸合成途径竞争途径的阻断1 4 3 1 1 乳酸脱氢酶基n ( t c t h a ) 的敲除1 4 3 1 2 丙酮酸甲酸裂解酶基因劬晒) 的敲除1 5 3 1 3 乙醇脱氢酶基因( a a h e ) 的敲除。1 6 目录 3 1 4 重组菌ec o l ib 0 0 1 3 1 0 4 0 的生理特性研究1 7 3 1 5 重组菌ec o l ib 0 0 1 3 1 0 4 0 的发酵特性研究1 8 3 2 大肠杆菌磷酸转移酶系统( p t s ) 的改造1 9 3 2 1p t s g 基因的敲除2 0 3 2 2 重组菌ec o i lb 0 0 1 3 1 0 5 0 的生理特性研究2 3 3 2 3 重组菌ec o l ib 0 0 1 3 1 0 5 0 的发酵特性研究。2 4 3 3 琥珀酸合成途径的强化2 5 3 3 1 重组质粒p u c l 9 - p p c 的构建2 5 3 3 2 重组质粒p b r 3 2 2 - p p c 的构建2 6 3 3 3 重组质粒p t h - p p c 的构建2 7 3 3 4 带有不同拷贝数质粒重组菌株的生理特性和发酵性能研究2 8 3 4 构建大肠杆菌厌氧发酵产琥珀酸的乙醛酸循环2 9 3 4 1 f c 腿基因的敲除3 0 3 4 2 重组菌ec o l ib 0 0 1 3 1 0 6 0 ( p t h - p p c ) 的发酵特性研究3 2 论文结论与展望3 4 致谢3 6 参考文献3 7 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文4 1 h 第一章前言 第一章前言 琥珀酸( s u c c i n i ca c i d ) ，学名又称作丁二酸( 1 ，4 b u t a n e d i o i ca c i d ) ，其首次制备是通 过蒸馏琥珀获得，因而得名。琥珀酸是一种常见的天然有机酸，作为三羧酸循环的中间 产物广泛存在于人体、动物、植物和微生物中，其分子式为c 4 h 6 0 4 ，分子量为1 1 8 0 9 ， 结构式如下【1 _ 3 】： 1 1 琥珀酸的理化性质 纯净的琥珀酸为无色至白色单斜晶体，无臭，有特殊酸味，低毒，可燃。比重 d 4 v 2 5 】1 5 7 2 ，熔点1 8 0 - 1 8 7 ，沸点2 3 5 ( 分解) 。在水中的溶解度为6 8g ( 2 5 ) ，几 乎不溶于苯、二硫化碳、四氯化碳和乙醚1 4 】。 琥珀酸是二元羧酸，1 3 4 8 时两个羧基可脱去一个水分子生成琥珀酸酐( s u c c i n i c a n h y d r i d e ) 。琥珀酸在水溶液中可解离为质子和琥珀酸根阴离子，其解离常数( 2 5 ) k l = 6 5 2 - - , 6 6 5x1 0 一，k e _ 2 2 2 7 x1 0 8 ，0 1m o l l 水溶液的p h 值为2 7 。琥珀酸可参与多 种化学反应，如氧化反应、还原反应、酯化反应、卤代反应、f r i e d e l c a r a f t 反应等【5 】。 1 2 琥珀酸的功能用途与市场分析 琥珀酸作为一种重要的有机化工原料及中间体，广泛应用于食品、农业、医药及精 细化工等领域。 在食品行业中，琥珀酸的主要用途是作为食品的调味剂、酸化剂、中和剂、p h 改 良剂、风味物质和抗菌剂1 6 ，7 1 。因其具有贝类的鲜味，被广泛应用于清酒、黄酒等酒类 和发酵食品及调味料中。琥珀酸的钠盐可改善豆酱、酱油及炼乳制品的质量，可以作为 火腿、香肠、咸菜、肉罐头等的风味增强剂，还可用作奶粉、饼干的强化剂，促进生长 发育。同时，琥珀酸也是一种新型的乳化剂。 在农业生产上，琥珀酸可用于处理种子以提高发芽率，促进作物生长，作为植物的 助长剂；可以用来处理大麦黑穗病，作为除草剂的添加剂使用；赖氨酸残基的琥珀酸酰 化能提高食品中大豆蛋白的物理和功能属性；琥珀酸酰化淀粉可作为增稠剂等1 3 ，9 1 。琥 珀酸盐还可以用做反刍动物和单胃动物( 如猪) 的饲料添加剂【5 】。 在医药行业中，琥珀酸可以用来合成解毒剂、利尿剂、镇静剂、止血药、合成抗生 素以及维生素a 、维生素b 等，还可以用做防腐剂，p h 值调节剂，助溶剂。 在化学工业中，琥珀酸的主要作为离子螯和剂，用于在电镀行业防止金属的溶蚀和 点蚀。同时琥珀酸也是一种良好的表面活性剂，是肥皂、破乳剂和去垢剂的组分；可用 于生产清洗剂、脱毛剂、牙膏、润滑剂、弹性体中；在纺织品加工中可用于上浆防收缩， 改进染色性，改进己内酰胺黏度与防火性等。 江南大学硕士学位论文 另外，琥珀酸作为重要的四碳平台化合物，可以作为很多重要的化工中间产物和专 业化学制品，用以取代诸多基于苯和石化中间产物的商品。这就可以减少在超过2 5 0 种 苯基化学制品的生产和消费过程中所产生的污染，图1 1 列出了以琥珀酸为基础的化学 衍生产品分布图。它可以转化为包括l ，4 丁二醇( b o d ) 、四氢呋喃( t h f ) 、丫- 丁内酯 ( g b l ) 、富马酸等一系列重要的工业化学品。 图1 - 1 琥珀酸衍生产品分布图0 0 1 f i g 1 - 1m a po fm u t e st os u c c i n i ca c i d - b a s e dp r o d u c t s 近年来，全世界琥珀酸的市场需求量一直处于快速增长状态。由于琥珀酸广泛的用 途，使得它被认为是继柠檬酸之后最具市场潜力的发酵有机酸产品。据z e i k u s 等【l l j 报 道，琥珀酸可为价值1 5 0 亿美元的化学品提供中间原料。全球琥珀酸及其衍生物的潜在 市场总量达到2 7 万吨年【1 2 】。然而琥珀酸传统生产方法是以不可再生的石化资源为原料， 成本高，且生产过程环境污染严重，无法达到可持续发展的要求。微生物发酵法生产琥 珀酸由于其利用可再生资源糖，原料来源广泛，价格低廉，且在发酵过程中可吸收固定 温室气体c 0 2 ，具有很好的应用前景。 1 3 琥珀酸的生产方法 目前琥珀酸的生产方法主要有以下三种：化学合成法、生物转化法和微生物发酵法。 1 3 1 化学合成法 目前由化学途径生产琥珀酸有多种方法，采用何种手段取决于原料的来源、生产费 用和能耗情况。常用的方法有石蜡氧化法、氯乙酸甲酯的氰化水解法、马来酸电解还原 法以及催化加氢法等，其中催化加氢法是目前化学合成法制备琥珀酸的主要方法。 一般采用丁烷为原料生成顺丁烯二酸或反丁烯二酸，然后在催化剂( 镍以及其他一些贵 金属) 作用下进行加氢反应，生成琥珀酸，反应温度约为1 3 0 1 4 0 。c 。 2 第一章前言 + h 2 叫( c h 2 c o o h ) 2 1 3 2 生物转化法 生物转化法主要是指以富马酸为底物，通过富马酸还原酶的催化作用转化生成琥珀 酸。其反应式如下： n a d h - - - - - - 这一方法为琥珀酸生产开拓了一条新的途径。但是由于需要使用大量底物富马酸， 而富马酸的获得多是通过化学合成法，所以其生产的经济性还有待深入研究。 1 3 3 微生物发酵法 微生物发酵法生产琥珀酸是指以淀粉，葡萄糖等糖类或其他微生物能利用的可再生 资源为原料，通过微生物菌种发酵积累琥珀酸。此方法不仅可以得到安全的食品医药级 产品，同时还能促进农产品转化为高附加值产品。这是一个新兴的、有很大发展潜力的 绿色工艺，是琥珀酸的工业化生产新途径。与化学合成法等传统工艺比较，利用微生物 发酵法生产琥珀酸有以下优势： ( 1 ) 原料成本低廉，并可再生。发酵法生产琥珀酸的主要原料来源是淀粉类原料，糖 蜜及废木料水解液等，价格低廉，无污染，可再生。 ( 2 ) 微生物发酵生产琥珀酸过程中吸收温室气体二氧化碳，绿色环保。研究表明，每 生产l 埏琥珀酸，将会有o 3 7k g 的二氧化碳被固定。如果能够将发酵产琥珀酸的工艺和 产乙醇的生产过程相连承接，这将非常有利于对乙醇发酵产生的副产物二氧化碳的综合 利用，大大减少温室气体的排放。 ( 3 ) 运用生物发酵法生产琥珀酸可以节约大量的石化资源。根据美国能源部的估算， 如果通过发酵法生产琥珀酸每年大约能够节约1 0 3 4 x1 0 1 6j 的能源，大大减少了石化等 不可再生能源的浪费。 1 4 发酵法产琥珀酸的研究现状及国内外最新进展 琥珀酸三羧酸循环的中间产物和厌氧代谢的最终产物之一，自然界中存在多种厌氧 和兼性厌氧微生物能够代谢分泌琥珀酸。如丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细 菌等，表1 1 列出其中的一部分。但由于天然菌株具有产琥珀酸能力非常低，发酵产物 复杂多样，对糖或琥珀酸的耐受性差等诸多缺点而使其基本不具有应用价值。要实现高 产琥珀酸的目的，就必须对现有的微生物进行菌种改造。目前国内外的研究主要集中在 以下三类微生物：分别为产琥珀酸厌氧螺菌( a n a e r o b i o s p i r i l l u ms u c c i n i p r o d u c e n s ) 、产琥 珀酸放线杆菌( a c t i n o b a c i l l u ss u c c i n o g e n e s ) 和重组大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l o 。 3 江南大学硕士学位论文 a n a e r o b i o s p o r i l l u ms u c c i n i c i p r o d u c e n s 峨c c2 9 3 0 5 a c t i n o b a c i l l u ss u c c i n o g e n e sa t c c5 5 6l8 e s c h e r i c h i ac o l i b a c t e r o i d e s f r a g i l i sh 17 c y t o p h a g a s u c c i n i c a n sd s m 撑4 0 0 2 c l o s t r i d i u mt h e r m o s u c c i n o g e n e sd s m5 8 0 9 r u m i n o c o c c u s f l a v e f a c i e na t c c1 9 2 0 8 f i b r o b a c t e rs u c c i n o g e n e m a n n h e i m i as p 5 5 e b a c t e r o i d e ss u c c i n o g e n e s $ 8 5 b a c t e r o i d e sa m y o p h i l u sa t c c2 9 7 4 4 s u c c i n i v i b r i od e x t r i n o s o l v e n sa t c c1 9 7 1 6 e n t e r o c o c c u s f a e c a l i sd s m2 0 4 7 8 琥珀酸、乙酸 厌氧 琥珀酸、乙酸、乳酸兼性厌氧 琥珀咚士咚0 0 酸、 兼性厌氧 甲酸、乙醇 1 “一一 琥珀酸、乙酸、乳酸厌氧 琥珀酸、乙酸、甲酸兼性厌氧 琥珀酸、乙酸、乳酸、 乐玺f 甲酸、乙醇 从飘 琥珀酸、乙酸，甲酸厌氧 琥珀酸、乙酸，甲酸厌氧 琥珀酸、乙酸，甲酸厌氧 琥珀酸、乙酸厌氧 琥珀酸、乙酸厌氧 琥珀酸、乙酸、乳酸、甲酸厌氧 琥珀咚j 哆0 0 酸、 兼性厌氧 甲酸、乙醇 1 “一一 1 4 i 产琥珀酸厌氧螺茵的研究进展 产琥珀酸厌氧螺菌是一种革兰氏阴性严格厌氧菌，能够发酵葡萄糖、乳糖等碳源产 生琥珀酸和乙酸，同时生成少量的甲酸、乙醇、乳酸【1 4 1 。其琥珀酸产生途径是先通过e m p 途径生成磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) ，再通过羧化途径最终生成琥珀酸。该途径中主要的 酶包括p e p 羧化激酶、苹果酸脱氢酶、富马酸酶和富马酸脱氢酶。c 0 2 浓度对产琥珀酸 厌氧螺菌发酵的产物有重要影响。在c 0 2 浓度较低时( 0 1 1t o o lc o j m o l 葡萄糖) ，发酵产 物中以乳酸为主；而在高c 0 2 浓度下( 1m o lc o z m o l 葡萄糖) ，胞内p e p 羧化激酶的表达得 到有效加强，p e p 更多的流向还原臂，琥珀酸成为主要发酵产物。 z e i k u s 课题组对彳s u c c i n i c i p r o d u c e n sa t c c5 3 4 8 8 菌株产琥珀酸进行了条件优化【1 5 1 ， 分批发酵琥珀酸产量最高达到5 0g l ，转化率8 5 9 0 ( w w ) ，生产强度1 5 2 o 趴l h ) ， 主要副产物为甲酸和乙酸。n h u a n 等人【1 6 ，l7 】研究的结果表明：菌椭s u c c i n i c i p r o d u c e n s a t c c5 3 4 8 8 的最优发酵p h 值为6 0 ，产琥珀酸所用的c 0 2 可以由浓度1 5m o l ln a 2 c 0 3 溶液提供，此时通入c 0 2 对产琥珀酸有负作用，对副产物乙酸的生成没有影响。 l e e 等人【1 8 1 9 】针对菌椭s u c c i n i c i p r o d u c e n sa t c c2 9 3 0 5 开展了相关研究，结果显 示，外源c 0 2 对琥珀酸发酵的影响与发酵液p h 值有关，通入h 2 有利于琥珀酸的生成，对 其它副产物产生没有影响。g u e t t l e r 等人1 2 0 j 以彳s u c c i n i c i p r o d u c e r l sa t c c2 9 0 3 5 为出发菌， 通过一系列筛选得到了比出发菌株更耐氟乙酸钠的自发突变株f a - 1 0 。该菌株的发酵产 物中琥珀酸作为主产物的比例大大提高，琥珀酸乙酸的比例由4 ：1 提高到8 0 ：1 。s a m u e l o v 等人f 2 1 】的研究结果显示，产琥珀酸厌氧螺菌在最适条件下的琥珀酸产率可以达至i j l 2 0 m o f l 0 0m o l 葡萄糖，产物最高浓度为6 5g l 。 4 卯 强 强 剪铊” ” 第一章前言 1 4 2 产琥珀酸放线杆菌的研究进展 产琥珀酸放线杆菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧瘤胃细菌，可利用碳源的种类多样， 并且可以在高浓度的琥珀酸溶液条件下生长1 2 2 j 。产琥珀酸放线杆菌与产琥珀酸厌氧螺菌 的琥珀酸代谢途经相同，也是通过e m p 途径生成p e p ，再经过羧化途径最终生成琥珀酸。 z e i k u s 等从奶牛瘤胃中筛选出一株a c t i n o b a c i l l u ss u c c i n o g e n e s1 3 0 z ( a t c c 5 5 6 1 8 ) 吲，以葡萄糖为碳源分批发酵产6 9 8 0g l 琥珀酸，转化率8 0 ( g g ) 左右，主要副 产物为丙酮酸、乙酸、甲酸。密西根生物技术研究中心( m b i ) 的g u e t t l e r 等人阱之6 】啪 s u c c i n o g e n e s1 3 0 z 为出发菌株，筛选出了抗氟乙酸的变异株f z 5 3 ，此菌株发酵产物中的 琥珀酸乙酸比例高达8 5 ：1 ；琥珀酸甲酸比例高达1 6 0 ：1 。实验结果显示，该菌株可在高 达1 5 0g l 浓度的葡萄糖培养基中生长，其最适生长和产酸p h 值为6 8 ，酵母膏、玉米浆 对菌体的生长和产酸有利，氧气对菌体无毒害作用。如在空气中提高c 0 2 分压，将有利 于菌体生长和产酸。最适条件下，此抗性株的琥珀酸产量可以达到8 0 1 1 0g l ，发酵时 间4 8h ，得率高达9 7 。此菌株是迄今为止报道的耐高糖和高盐的菌种，已经具备初步 工业化生产的能力。 1 4 3 大肠杆茵产琥珀酸的研究进展 野生型琥珀酸产生菌发酵液中含有大量乙酸、甲酸等副产物影响后续分离，且培养 条件复杂，不利于工业化大规模生产。大肠杆菌幔c o l 0 由于遗传背景清楚、易进行代谢 调控，操作简便等优点，成为近年来的研究热点口7 1 。 大肠杆菌在氧气缺乏的情况下，能够发酵糖或其衍生物生成甲酸、乙酸、乳酸、琥 珀酸、乙醇等产物，这就是通常所说的混合酸发酵【2 8 】。野生型大肠杆菌不会过量合成琥 珀酸，其得率不超过0 2m o l m o l 葡萄糖f l o l 。图1 2 为大肠杆菌混合酸发酵的主要代谢 途径。琥珀酸的形成是由葡萄糖经糖酵解生成磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) ，之后在p e p 羧 化酶( p p c ) 的催化作用下固定c 0 2 ，生成草酰乙酸( o a a ) 。o a a 再经过苹果酸脱氢酶和 富马酸还原酶的作用，最终形成琥珀酸。在此合成途径中，每生成1m o l 琥珀酸需要固 定lm o l 的c 0 2 ，同时消耗2m o ln a d h 2 9 , 3 0 】。 5 江南大学硕士学位论文 图l 一2 野生大肠杆茵厌氧混合酸发酵途径 f i g 1 - 2 m a t a b o l i cp a t h w a yo fa n a e r o b i cm i x e da c i df e r m e n t a t i o ni nw i d e - t y p eec o l i g l c k ：g l u c o k i n a s e ；p t s g ：p h o s p h o t r a n s f e r a s es y s t e m ；m d h ：m a l a t ed e h y d r o g e n a s e ；f u m ：f u m a r a s e ；f i d ： f u m a r a t er e d u c t a s e ；p p c ：p e pc a r b o x y l a s e ；l d h a ：l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ；p f l b ：p y r u v a t e - f o r m a t el y a s e ； a d h e ：a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ；p t a ：p h o s p h a t ea c e t y l t r a n s f e r a s e ；a c k a ：a c e t a t ek i n a s e 美国i n g r a m 课题组对大肠杆菌代谢工程进行了深入研刭3 1 。3 3 】，利用f l p f r t 重组 酶系统删除ec o l ic ( a t c c8 7 3 9 ) - 孚l 酸脱氢酶基因( 肠m ) ，乙酸激酶基因c 翩) ，乙醇脱 氢酶基因( a d h e ) ，丙酮酸甲酸裂解酶基因( p f l b ) 和甲酸转运基因( f o c a ) 后获得e c o l i k j 0 3 2 ，发酵5 0g l 葡萄糖产生2 5 0 2g l 琥珀酸，发酵液中除2 8g l 乙酸外，无 其他副产物，是公开文献中基于基因敲除策略构建产琥珀酸重组大肠杆菌的成功先例。 i n g r a i n 等在基因敲除基础上又进行多次代谢进化育种，获得一株产琥珀酸能力最强的菌 株k j 0 6 0 ，在最佳条件下能转化底物生成8 6 5g l 琥珀酸，糖酸转化率达9 2 ( w w ) ，具 备很好的应用前景。 c l a r k 等人【3 4 】以野生型大肠杆菌w 1 4 8 5 为出发菌株，在其染色体中整合插入抗性基因 片段，从而构建丙酮酸甲酸裂解酶( p f l ) 和乳酸脱氢酶( l d h a ) 双基因失活菌株ec o l i n z n l l l ( f - p f l a ：c a m ；l d h a ：k a n ) 。n z n l l l 不能利用葡萄糖进行生长，但可以发酵乳糖、 果糖、甘露糖和海藻糖等生成琥珀酸、乙酸和乙醇。s t o l s 等人 3 5 , 3 6 1 发现，在大肠杆菌突 变株n z n l l l 中表j j s _ a s c a r i ss “删苹果酸酶基因能够使菌株恢复利用葡萄糖进行生长的 能力，同时琥珀酸得率也提高至0 3 9m o l m o l 葡萄糖，并成为主要发酵产物。 c h a r t e r j e e 等【3 7 对n z n l l l 在含有卡那霉素的琼脂平板上筛选到了能够重新发酵葡萄 糖的突变株ec o l ia f p l11 ，该菌株的p 绍g 基因自发突变，发酵结果显示琥珀酸终浓度可 达3 6g l ，收率6 7 ，无乳酸，甲酸积累，乙酸产量很低。v e m u r i 等人【3 8 】对突变株a f p l l l 6 第一章前言 进行了进一步的研究，通过在其中表达r h i z o b i u me t l i 的丙酮酸羧化酶基因( p y c ) ，构建所 得的重组菌株ec o l i a f p l l l ( p t r c 9 9 a - p y c ) , 经i p t g 诱导表达后，琥珀酸产量得到了进一步 提高。通过对a f p l11 p t r c 9 9 a 。p y c 发酵条件的深入研究，发现在两步法培养( 先好氧生长 再厌氧产酸) 中转换时间的选择对其产酸具有至关重要的作用。该课题组研究人员发现 了最适的转换条件为溶氧浓度开始下降，但仍为9 0 时。此时如进行两阶段的转换，琥 珀酸发酵终浓度可达到9 9 2g l ，得率为1 1 0 ，生产能力为1 3 9 ( l h ) t j ，是目前已报 道的生物