（发酵工程专业论文）产几丁质酶菌株的筛选.pdf

摘要 几丁质酶是一种专一性降解几丁质的水解酶。在工业上，几丁质酶可用 于制备功能性甲壳低聚糖；在农业上可作为生物控制剂，提高植物的抗病能力： 在生物技术方面，可以用几丁质酶并辅以其它手段制备真菌原生质体，为细胞 分子生物学提供工具酶。研究发现高等植物、鸟类、昆虫等动物及微生物都能 够分泌几丁质酶类，但只有微生物几丁质酶具有开发应用的价值。本论文致力 于从自然界中获得一株产几丁质酶菌株，从采集土样开始，进行了以下几个方 面的研究： 1 用以几丁质为唯一碳氮源的平板培养基，从5 5 份土样中共筛选到4 2 8 株能产透明圈的菌株，再以透明圈与菌落直径比值的大小作为参考，结合摇瓶 复筛，最终选取菌株l 0 n 为进一步实验菌株，其酶活力达o 7 5 u m l ；采用纸 层析和离子色谱法对菌株l o ，2 产几丁质酶的酶解产物进行分析，初步确定产物 中有氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖、以及聚合度小于l o 的寡糖。 2 通过对l m 菌落形态、菌丝体形态的观察，细胞壁氨基酸成分、全细胞糖 成分盼分析以及对其部分生理生化性质的考察，初步判断其属于类诺卡氏菌属。 3 通过对培养基组分的单因素实验和正交试验，确定了菌株l o l 2 的最佳产 酶培养基( g ，l ) ：细粉几丁质1 0 ，淀粉3 ，玉米浆3 ，n a n 0 31 0 ，k 2 h p 0 41 0 5 ， k h 2 p 0 40 4 5 ，n a c l0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 00 3 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 3 ，p a7 o ；通过 对发酵起始p h ，培养温度，溶氧量，产酶时程，接种种龄以及接种量等培养 条件的考察，确定了菌株l 0 1 2 的最佳发酵产酶条件：起始p h ：7 0 ，培养温度： 3 04 c ，发酵时程：4 8 h ，种龄：2 4 h ，摇瓶装液量：3 0 m l ，转速：1 8 0 r m i n ， 接种量：1 0 ；条件优化后l 0 1 2 菌株的产酶活力从原来的o 7 5 u m l 提高到 2 3 1 u m l 。 4 论文对菌株k 1 2 粗酶性质进行了系统的研究，结果表明：菌株l o l 2 所 产几丁质酶在4 。c 储存时稳定性好，三个月后依然保存有9 4 的酶活性；最适 作用温度在4 5 左右，在5 0 以下热稳定性较好，超过6 5 易失活：最适作 用p h6 5 ，p h 6 肌7 5 范围内稳定性好，酸性环境下非常易失活，碱性条件下 相对稳定；该酶可以耐受1 5 m m o l l 的离子强度；a g + ，f e 2 + ，c u 2 + ，m n 2 + 对 该酶有比较明显的激活作用，h g + 对酶活力有明显的抑制作用，c a 2 + 和m 9 2 + 有轻微的抑制作用，n h 4 + 对该酶活性有较强的抑制作用；表观米氏常数k m 为1 5 6 x1 0 一m o l l ，v m a x 为2 8 8 7u m l 。 关键词：几丁质酶，几丁质，几丁寡糖，筛选，放线菌 a b s t r a c t c h i t i n a s e sw h i c hc a t a l y z et h eh y d r o l y t i cd e g r a d a t i o no fc h i t i nh a v eb e e nu s e d f o rp r e p a r a t i o no ff u n c t i o n a lc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s t h e yh a v ea l s ob e e nu s e da s b i o l o g i c a lc o n t r o la g e n ti na g r i c u l t u r et oi m p r o v ep l a n ta n t i d i s e a s ea b i l i t i e s i n t e r m so fb i o e n g i n e e r i n g ，c h i t i n a s e sh a v e b e e n u s e df o r g e n e r a t i o n o ff u n g a l p r o t o p l a s t sa l o n gw i t ho t h e rm e a n s ，p r o v i d i n ge n z y m et o o li n c e l lm o l e c u l a r b i o l o g y m a n yp l a n t 、 a n i m a l 、 m i c r o o r g a n i s m c a l l e x c r e t e c h i t i n a s e ，b u t m i c r o o r g a n i s mc h i t i n a s ea r et h em o s tv a l u a b l ei na p p l i e df i e l d t h em a i np a r t so f t h i sr e s e a r c hw o r ka n dr e s u l t sa r ep r e s e n t e db e l o w ： 1 b yas c r e e n i n gm e t h o dw i mc h i t i na st h eo n l yc a r b o na n dn i t r o g e nr e s o u r c e , 4 2 8s t r a i n sp r o d u c i n gc l e a rz o n ew e r ei s o l a t e df r o m5 5s a m p l e so f s o i l a c c o r d i n g t or a t i ob e t w e e nc l e a rz o n ea n dc o l o n yd i a m e t e rc o m b i n e dw i t l ls h a k e f l a s k s c r e e n i n g ，l o l 2 w a si s o l a t e da st h ea i ms t r a i n i t s e n z y m ea c t i v i t y w a s 0 7 5 u m l , j u d g e db ym e a n so fd n sm e t h o d h y d r o l y s i sp r o d u c t so fs t r a i nl 0 1 2 w e r ea n a l y z e db yp a p e rl a m i n a ra n a l y s i sa n di o nc h r o m a t o g r a p h ya s s a y r e s u l t s s h o w e dt h a th y d r o l y s i sp r o d u c t so fs t r a i nl 0 1 2w e r ef r o mn - a c e t y l g l u c o s a m i n e 、 g l u c o s a m i n et oc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s 2 i nt h i sp a p e r , t h ec o l o n i a lm o r p h o l o g ya n dh y p h o s t r o m am o r p h o l o g yo fl 0 1 2 w e r eo b s e r v e d ；t h ec e l lw a l la m i n oa c i d sa n dw h o l ec e l ls u g a rp a t t e r n so fl o l 2w e r e a n a l y z e d ；a n d a l s ot h e p h y s i o l o g y a n d b i o c h e m i s t r yq u a l i t y o fl 0 1 2w e r e i n v e s t i g a t e d b a s e do nt h e s ec h a r a c t e r i s t i c ，l 0 j 2w a si d e n f i f i c a t e dt ob en o c a r d i a i n i t i a l 3 s i n g l e - f a c t o rd e s i n a n dm u l f i l ef a c t o rd e s i nw e r eu s e df o ro p t i m i z i n g c u l t u r a lc o n d i t i o n so f c h i t i n a s ep r o d u c t i o nf r o ml o t 2s t r a i n t h eo p t i m a lm e d i u mf o r e n z y m e p r o d u c t i o n w e r ea s f o l l o w s ：c h i t i n p o w d e r1 0 ，s t a r c h3 ，c o ms t e e p l i q u o r 3 ， n a n 0 31 0 ，k 2 h p 0 41 0 5 ，k h 2 p 0 4o 4 5 。n a c lo 1 ，m g s 0 4 。7 h 2 00 3 ，f e s 0 4 。7 h 2 00 0 3 ，p h7 0 ；t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r e a sf o l l o w s ：i n i t i a l p h ：7 0 ，t e m p e r a t u r e ：3 0 * c ，t h eo p t i m a lf e r m e n t i n gt i m e ：4 8 h ，s e e da g e ：2 4 h ，t h eo p t i m a l q u a n t i t y o fi n o c u l a t i o n ：l o ：t h ec h i t i n a s e a c t i v i t y w a se n h a n c e d f r o m 0 7 5 u m l t o2 3 1 u ，m lb yo p t i m i z i n gt h ec o n d i t i o n s 4 s t u d i e so nc h a r a c t e r i z a t i o no fc h i t i n a s es h o w e d ：am a x i m u ma c t i v i t yo ft h i s e n z y m ea t4 5 。c ，p h ：6 0 ，a n d1 5 m m o l l n a c l t h ee n z y m ew a ss t a b l eb e l o w5 0 v a n dp h 6 o 7 5 ：t h ec h i t i n a s ea c t i v i t yw a ss t r o n g l ya c t i v t i e db yc u b + a n dm n 2 + ； a l s om a r k e d l ya c t i v t i e db ya g + a n df e 2 + ；b u ts l i g h t l yi n h i b i t e db yh 9 2 + ，c a 2 + 和m 矿 i l l t h er e a c t i o no ft h ee n z y m ec o r r o b o r a t e dm i c h a e l i s m e n t e ne q u a t i o n k ma n d v m a xw a s1 5 6 10 5 m o l l a n d2 8 8 7u m l r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：c h i t i n a s e ，c n t m ，c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，s c r e e n i n g ，a c t i n o m y c e t e s 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业 学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 山东轻工业学院硕士学位论文 第一章绪论 1 1 几丁质酶的发现和命名 1 1 1 几丁质的结构和性质 几丁质是n 乙酰d 葡萄糖胺以b 1 ，4 糖苷键连接起来的直链多聚物， 又称甲壳质或甲壳素【i l o 几丁质在自然界的储量位居第二，仅次于纤维素。 无论是天然存在的几丁质还是人工制各的几丁质，并不是每个糖基上都有n 一 乙酰基，通常，n 乙酰度低于5 5 称为壳聚糖，n 乙酰度大于5 5 称为几丁 质。几丁质是白色或灰白色无定型、半透明固体，不溶于水、稀酸、稀碱、 浓碱和一般有机溶剂，可溶于浓盐酸、硫酸、磷酸和无水甲酸 舶。 c o o h 图1 1 几丁质的重复结构单位 c h 2 0 h c i q z o l t 图1 2 脱乙酰几 质的重复结构单位 1 1 2 几丁质酶的发现 1 9 0 5 年，b e n e c k e 3 1 发现溶几丁质芽孢杆菌( b a c i l l u sc h i t i n o v r o u s ) 能利 用几丁质作为营养物；1 9 2 1 年，f o l p m e r s 发现利用几丁质的细菌和真菌可以 在几丁质平板上形成透明圈，证明了几丁质酶的存在州；2 9 2 9 年k a r r e r 和 h o f m 鲫”谰蜗牛肠酶使8 5 几丁质转化成n 乙酰氨基葡萄糖，从而促进了几 丁质结构单位的研究；1 9 3 1 年g r a s m a n 和r u b e n b a n e r 发现，一种曲霉的提取 物能把几丁质水解成碘可检测出来的还原物质 6 1 ；1 9 3 8 年z o b e l l 和r i r e n b e r g l 7 1 对海洋里的分解几丁质的细菌进行实验，结果表明，几丁质的分解是由于糖 苷键的断裂或氨基基团的脱落造成的；1 9 5 0 、1 9 5 1 年，j e u n i a u x 等【8 】发现了 蜗牛肠道中的细菌和放线菌能产生胞外几丁质酶。之后，科学家们相继从多 种微生物中分离几丁质酶。 随后的研究发现，高等植物中也普遍存在着几丁质酶系，并且与植物防 第一章绪论 卫反应的诱导有关。1 9 6 1 年，j e u n i a u x c 首次报道了动物几丁质酶的研究成 果嘲。 1 1 3 几丁质酶的命名 研究发现，几丁质酶的作用底物专一性不强，不仅能够催化水解乙酰氨 基葡萄糖与乙酰氨基葡萄糖形成的b 1 ，4 糖苷健，还能够催化水解乙酰氨基葡 萄糖与氨基葡萄糖以及氨基葡萄糖与乙酰氨基葡萄糖形成的d 1 ，4 糖苷健，所 以几丁质酶更确切地定义是：能够催化水解至少含有一个乙酰氨基葡萄糖残 基的底物的一类酶，酶解作用示意图如图1 3 。在1 9 8 4 年国际酶学命名会议 上，几丁质酶被系统命名( c h i t i n a s e ) ( e c 3 2 1 1 4 ) 0 0 1 。 嘲g l c n a c ：o g l c n 图1 3 酶解作用示意图 1 2 几丁质酶的应用 1 2 1 几丁质酶的生物防治作用 ( 1 ) 抗虫作用 由于几丁质是许多昆虫的基本结构成分，几丁质酶在植物病虫害防治中 具有重要作用。如淡紫拟青霉( p a e c i l o m y c e s b l a c i n u s ) 寄生植物线虫卵，产生 的几丁质酶可以破坏线虫卵壳上的几丁质层( r e i d 和o g r y d z i a k ，1 9 8 1 ) ，对根 结线虫、孢囊线虫等均有较好的杀伤效果1 1 ”。 几丁质酶对苏云金芽孢杆菌制剂有增效作用。其机理是围食膜是昆虫防 止病原细菌或病毒传染的一道天然屏障，微量几丁质酶水解幼虫中肠的几丁 质，有助于苏云金芽孢杆菌制剂侵染害虫幼虫，从而加速幼虫罹病进程，提 高幼虫死亡率。 也有人把几丁质施入土壤，刺激土壤几丁质分解菌的生长，诱导植物分 泌几丁质酶，从而增强植物抵抗病原菌感染和害虫侵害的能力【l ”。 ( 2 ) 抗真菌作用 几丁质酶抗真菌作用首先是在微生物实验中发现的 1 3 1 14 1 。1 9 5 9 年 h o r i k o s h i 发现环状芽孢杆菌能裂解黄曲霉菌，加入几丁质酶后，裂解效率提 高。1 9 6 1 年m i t c h e l l 发现所有能裂解真菌的细菌都含有几丁质酶，这些细菌 能在仅以几丁质为碳源的培养基上生长。1 9 8 8 年l e i f s u n d h e i m 从粘质沙雷氏 杆菌( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) 的基因库中克隆了两个具有几丁质酶活性的e c o r l 片段，用来转化假单孢菌属的荧光菌，发现转化后的菌株对尖孢镰孢霉属的 山东轻工业学院硕士学位论文 菌丝体生长有明显的抑制作用 1 ”。因此可以说几丁质酶在裂解真菌、抑制真 菌生长的过程中起重要作用。近几年来的实验结果更直接地证明植物几丁质 酶可能参与植物抗真菌病害的过程。1 9 8 6 年s e h l u m b a u m 用提纯的蚕豆几丁 质酶在体外检验其对绿色木霉生长的影响，证明纯化的几丁质酶能充分抑制 绿色木霉的生长，抑制程度与酶浓度有关，有效抑制绿色木霉生长所需纯化 的几丁质酶浓度和经病原菌处理后的蚕豆叶片组织中的几丁质酶浓度相似【1 6 1 。 关于几丁质酶抑制真菌生长的机制，1 9 8 8 年b r o e k a e r t 曾观察到几丁质酶 裂解真菌菌丝体，并放出胞溶物。几丁质酶使真菌顶端细胞壁变薄，继而发 生球状突起，最后原生质膜破裂。几丁质酶通过降解菌丝生长端区域新合成 的几丁质，破坏菌丝端部的生长，达到抑制效果【”。b r o e k a e r t 等用纯化的几 丁质酶处理木霉( t r i c h o d e r m a h a m a t u m ) 、藻类菌( p h y c o m y e e sb l a k e s l e e a n u s ) 、 灰质葡萄孢菌( b o t r y t i sc i n e r e a ) 的孢子悬浮液，结果表明，几丁质酶可以抑 制孢予的萌发，但对不同的真菌影响不同，几丁质酶的浓度为1 6 m g l ，即可 导致t h a m a t u m 孢子萌发率显著下降；其浓度达到1 2 8 m g l 时，才能使 p b l a k e s l e e a n u s 孢予萌发率显著下降：而即使其浓度高达2 5 0 m g l 时，仍不 能影响b c i n e r e a 的孢子萌发率1 1 8 1 。 在国内，1 9 9 4 年陈三风、李季伦等【1 9 1 将分离和已报道的1 5 种微生物在 几丁质平板上比较产生几丁质酶情况，并进一步研究了几丁质酶对病原真菌 抑制作用。结果表明，真菌、细菌的几丁质酶活性普遍高于放线菌的几丁质 酶活性，但是在对真菌生长的抑制作用方面，细菌的作用最强，其次是放线 菌。1 9 9 7 年杨文博1 2 0 】等研究发现，纯化后的链霉菌s 0 1 菌株几丁质酶用环柱 法在p d a 平板上对几种病原真菌的生长具有明显的抑制作用，在6 株植物病 原真菌的液体培养物中加入几丁质酶后，菌丝出现扭曲变形，细胞质聚集、 外溢等异常现象。1 9 9 9 年刘爱新、董汉松1 2 1 等对烟草几丁质酶的功能进行了 测定，结果表明，几丁质酶对赤星菌的菌落生长有抑制作用并可抑制其孢予 的萌发。 ( 3 ) 几丁质酶的转基因应用 利用分子生物学的手段将带有强启动子的几丁质酶基因转入某些作物， 转化植株组成型超量表达几丁质酶，可有效增强其抗病性，这方面的研究近 年来已取得显著进展。 美国e ld up o r td en e m o u r sa n dc o 实验室主要研究在致病生物侵袭过程 中几丁质酶的作用。研究中发现，菜豆胞内几丁质酶在转基因烟草和油菜中 的组成型表达，增加了植物对立桔丝核菌( r h i z o c t o n i a s o l a n i ) 的抗性。日本 农林水产省的科研人员将从水稻中分离出的几了质酶基因导入易感染白粉病 第一章绪论 的烟草品种 x a n t h in n ”，获得的转基因植株能阻碍病原菌的吸附器和吸器的 伸氏，显示出对白粉病的抗性。荷兰植物生物技术公司的研究人员获得了表 达烟草几丁质酶基因和b 1 ，3 - 葡聚糖酶基因的番茄品种m o n e y m a k e r 的转基 因植株。用枯萎病菌接种植物3 4 周后，转基因植株只出现萎蔫症状，随即 恢复正常，而非转化植株和只携有一种外源基因的转基因植株死亡【。 j a c h 等人将粘质沙雷氏菌( s m a r c e s c e n s ) 的几丁质酶基因c h i a 用来构 建植物表达载体并转化烟草。在烟草叶、茎及根中检测到此基因的表达，与 未转基因的幼苗相比，转基因的烟草幼苗对立枯丝核菌具有更明显的抗性。 1 9 9 0 年b r o g l i e 2 3 j 首次将组成型表达的菜豆类碱性几丁质酶基因导入烟草，获 得的转基因植株对立枯丝核菌具有较高抗性。t o y o d a 从灰色链霉菌 ( s t r e p t o m y c e s g r i s e u s ) 中纯化出几丁质酶并用其处理离体大麦胚芽鞘以观察 对白粉菌( e r y s i p h e g r a m i n i s f s p h o r d e i ) 的作用，结果发现在2 小时内，病菌 细胞被完全消解，而当用该酶注射活体大麦胚芽鞘时则出现两种结果：对正 在发育中的病菌细胞可完全消解，而对己成熟的病菌细胞并未引起其形状的 改变，但菌丝体的伸长受到抑制【2 4 j 。 利用基因工程手段，已获得了多种转几丁质酶基因植物，包括烟草、大 豆、棉花、水稻、玉米、番茄、马铃薯、油菜、莴苣、甜菜等作物，在抗真 菌病害方面显示出了良好的效果。 1 2 2 几丁质的酶解产物的应用 几丁质经几丁质酶降解后所产生的n 乙酰几丁寡糖和壳聚几丁寡糖具有 多种生理功能，在抗癌药物、诊断试剂、食品、化妆品等领域得到广泛应用。 ( 1 ) 几丁寡糖和壳寡糖的抗肿瘤作用 几丁寡糖具有抗癌和活化机体免疫功能的作用【2 ”，诱使胰脏淋巴t 细胞 产生白细胞间素( i n t e r l e u k i n ) ，且对生物体无毒性或低毒性。1 9 8 5 年，s u z u k i 等【2 6 1 就几丁六糖和壳六糖的抗肿瘤作用作了报道。他们在移植了s 1 8 0 的d d y 鼠上分别静脉注射几丁六糖和壳六糖，七天后发现两种寡糖对肿瘤细胞均产 生明显的抑制作用：采用1 0 0 m g k g d ，连续3 次，抑制率分别为8 5 和9 3 ： 增加注射次数至5 次时，则能完全抑制肿瘤生长。 ( 2 ) 几丁寡糖和壳寡糖的抗感染作用 几丁寡糖和壳寡糖的抗感染作用已被许多学者证实，对其杀伤机理也陆 续有所报道。s u z u k i 等用聚合度为4 - 6 的几丁寡糖以5 0 m g k g 腹腔注射于 b a l b c 鼠，结果发现提高了p e c ( 腹膜腔渗出细胞) 活性氧的生成和杀菌 能力，其中以几丁六糖为最强【堋。h o f f m a n 等的研究表明，几丁寡糖和壳寡 糖在体外能刺激大西洋鲑的白细胞产生超氧化阴离子而增强抗感染能力。因 4 山东轻t 业学院硕士学位论文 此，这些寡糖可作为疫苗辅助试剂而进行开发。尤其对那些自身免疫系统尚 不发达的幼畜，一般的疫苗不能注射，而这些寡糖无免疫原性，可以安全使 用【2 ”。另外，这些寡糖还可作为饲料添加剂而应用于畜牧业和渔业，以加强 鱼畜的防病抗病能力，提高肉质。 ( 3 ) 凡丁寡糖和壳寡糖在食品、化妆品领域的应用 几丁寡糖和壳寡糖具有清爽的甜味，吸湿性和保湿性好，在水中溶解度 比单糖低，有助于调整食品的水活性，增进保水性，兼具调味和改良食品质 构的功能。另外，n 一乙酰几丁寡糖可促进肠道内有益菌( b i f i d u s ) 的增殖，并 抑制大肠杆菌及肠道内病原菌的生长，是一种良好的双歧杆菌增殖因子f 2 8 - 3 0 。 利用几丁寡糖和壳寡糖的保湿性质还可将它们作为保湿乳液、化妆水的 原材料，几丁寡糖和壳寡糖具有紫外吸收性，用于发胶中可有效防止紫外光 对头发的破坏。 1 3 几丁质酶的分布 几丁质酶广泛存在于自然界。现已发现很多动物、植物及微生物都可产 生几丁质酶。 1 3 1 植物几丁质酶 目前己在多种植物中分离到各种类型的几丁质酶，植物不含几丁质，但 几丁质酶却广泛存在于高等植物中。几丁质酶在高等植物中主要分布于植物 的茎、叶、种子及愈伤组织中 3 1 “3 4 】。几丁质酶在植物中的存在通常与植物对 真菌的抗性有关，受病原物及其激发子、乙烯、水杨酸等的诱导。其分子量 在2 5 3 5 k d a 之间，酶分子以单体形式存在，具有酸性或碱性等电点。大多数 几丁质酶对热稳定，抗蛋白酶水解。 1 3 2 动物几丁质酶 动物几丁质酶的研究工作只限于产生酶的动物种类、酶的基本性质及作 用机理等方面。产几丁质酶的动物种类主要有两栖类、鸟类及昆虫等【3 “。研 究表明，几丁质酶主要分布在动物消化液、腺体、胃和肠粘膜等部位，它的 存在还与食物有关，这是因为几丁质酶普遍为诱导型酶，所以不同的食物种 类影响动物体内几丁质酶的有无。 1 3 3 微生物几丁质酶 自b e n e c k e 【3 】首次报道了溶几丁质芽孢杆菌能够产生几丁质酶以来，发现 产几丁质酶的微生物种类比较广泛：包括细菌、放线菌、真菌等。又因为微 生物可以产生并大量分泌几丁质酶，所以关于微生物几丁质酶的研究比较活 跃。 第一章绪论 1 4 微生物几丁质酶的国内外研究概况 自从b e n e c k 发现了一株芽孢杆菌能够产生几丁质酶，以后人们相继发现 多种微生物能够产生几丁质酶，研究主要集中在产酶菌种的分离，产酶种类、 产酶性质及产酶条件等方面。 1 4 1 产几丁质酶微生物分布及特点 ( 1 ) 分布 产生几丁质酶的微生物分布广泛。海洋、河湾、土壤中分布大量几丁质 酶产生菌，其中海滩、海水、盐碱地、盐场、温泉是碱性几丁质酶产生菌的 理想场所。目前研究较多的微生物菌种如表1 1 【3 6 1 。 表1 1 产几丁质酶菌株 t a b l e l 1t h es t r a i n sp r o d u c i n ge h i t i n a s e 微生物菌类举例 粘质沙雷氏菌( s e r r a t i am a r e e s c e m ) 环状芽孢菌( b a c i l l u sc i r c u l a n s ) 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 斯氏假单菌( p s e u d o m o n a ss t r u t r e r i ) 液化沙雷氏菌( s e r r a t i at i q u e f a c i e n s ) 细菌 液化肠杆菌( 砌把6 “怊r 均w 加耙 s ) 巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i ) 嗜水气单孢菌( a e r o m o n a s h y d r o p h i l a ) 一些未定种的梭菌( c l o s t r i d u m l m s p ) 孤菌( v i br h ) s p ) 灰色链霉菌( s t r e p t o m y c es p l i c a t u s ) 放线菌 真菌 红色链霉菌( s t r e p t o m y c es o l i v a c e o v i r i d i s ) 未定种的链霉菌( s t r e p t o m y c e s s p s 一8 4 ) 溜曲霉( a s p e r g i l l u s t a m a r i i ) 球孢自僵菌( b e a u v e r i ab u s s i a n a ) 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 木霉( t r i c h o d e ，m a h a r z i a n u m ) ( 2 ) 特点 产几丁质酶的微生物一般具有以下特点： 诱导性 多数微生物只在含有几丁质等诱导物的培养基中才能产生几丁质酶p “。 除几丁单糖外，几丁质、脱乙酰几丁质、部分水解的几丁质均可以诱导几丁 质酶的产生。各种诱导物对不同微生物的诱导作用亦有所不同，而且几丁质 山东轻工业学院硕上学位论文 酶的诱导可被过量的可溶性代谢物所阻遏。 分泌性 微生物所产的几丁质酶多是分泌型的，即在诱导物存在的条件下，微生 物可以产生并向胞外分泌几丁质酶1 3 ”。该酶先在微生物的体外将几丁质分解， 生成几丁单糖( n a g ) 或寡糖，然后这些糖再被微生物吸收和利用。 1 4 2 产几丁质酶微生物筛选 利用几丁质酶对不溶性几丁质的降解性，观察产酶菌株在平板上产生的 透明圈大小并测定其产生酶的酶解还原糖量，从而在自然界中获得产几丁质 酶菌株1 4 “。 目前已经在自然界筛选到多种产酶菌株。檀建新等 4 8 1 从北京地区的土样、 砂样和水样中分离并纯化了产生几丁质酶的环状芽孢杆菌( b a c i l l u s c i r c u l c l n s ) ；杨文博等1 4 9 从土壤中分离筛选到一株产几丁质酶的链霉菌；顾真 荣等【5 0 】从1 0 3 份采自中国各地的土样中分离得到了3 株产几丁质酶菌株g l 、 g 2 、g 3 ，经鉴定，g l 为短芽孢杆菌( b a c i l l u sb r e v i s ) ：g 2 为地衣芽孢专丁菌 ( b a c i l l u sl f c h e n i f o r m i s ) ；g 3 为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u sj “6 盯，括) ；陈亚成等 筛选到产碱性几丁质酶的菌种，初步鉴定为链霉菌；夏国庆和董志扬 5 2 】从采 自河南的3 1 份土样中分离出株产几丁质酶的曲霉；郑志成等【53 】筛选到一株 产几丁质酶的海洋链球菌。 1 4 3 产酶条件 不同菌株产几丁质酶的最佳条件不同。 目前报道比较多的产酶培养基中常用的碳源有：几丁质、淀粉、土豆； 常用的氮源有蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、n i - h n 0 3 、( n 弛) 2 s 0 4 ；产 酶菌株的培养温度一般在2 8 - 3 0 ，p h 在5 0 9 0 之间；几丁质物质( 包括 磷酸膨化几丁质、脱矿物几丁质，甚至可以直接加入蚕蛹粉、虾壳粉等) 对 产酶有诱导作用，质量分数一般为1 5 2 o ，而葡萄糖、n a g 对产酶有阻 遏作用；当培养基中加入c a 2 + 、c u 2 + 、c d + 时，可提高酶活力，而m 9 2 + 、m n 2 + 、 f e 2 + 、n h 4 + 等则对其有抑制作用( 对不同菌株也有差异) 。 杨文博等【4 9 1 发现不同碳氮源及诱导物对链霉菌s 0 1 产几丁质酶有不同的 影响，以酵母粉对产酶的促进作用最为明显，比对照提高了7 5 2 ，2 8 。c ， 1 5 0 r m i n 振荡培养7 d 达产酶高峰；邱立友掣5 4 】对链霉菌a 0 4 8 ( s t r e p t o m y c e s 印_ a 0 4 8 ) 进行产酶条件优化，确定了其培养基碳源为几丁质，氮源为n h 4 n 0 3 ， 培养温度3 0 。c ，培养基p h 7 + o o 5 ，体积溶氧系数k d 值为 1 5 6 1 0 一m o l ( m l r a i n a t m ) 振荡培养1 2 0 h ，产酶从1 8 4 提高到2 5 1 u m l 。 m y r o t h e c u m l mv e r u c a r i a 在以几丁质为唯一碳源的培养基中，2 8 ， 第一章绪论 2 0 0 r m i n 培养7 d ，几丁质酶活性最高【5 5 1 。其培养基成分为( 玑) ：几丁质5 0 ， 酵母膏o 5 ，蛋白胨o 5 ，m g s 0 4 7 1 4 2 00 7 ，k h 2 p 0 43 0 ，k 2 h p 0 41 0 ， ( n h 4 ) 2 s 0 41 4 ，n a c lo 5 ，c a c l 20 5 ，p h 值5 , 0 。增加o 0 3 的尿素使几丁质 酶活性提高4 倍。t w e d d l l 等【5 6 j 在包含不同碳源的矿物培养基中培养 s t a c h y b o t y se l e g a n s ，产酶结果发现，培养基中碳源为几丁质时产生的酶活性 高于其它碳源上产生的酶，生长在几丁质、细胞壁、昆布多糖上产生的几丁 质酶分别为3 3 u m l 、1 1 u m l 、1 2 u m l ；而生长在葡萄糖、蔗糖、n 乙酰 葡萄糖胺上的菌株不产生几丁质酶。在p h 5 0 ，2 4 。c 下几丁质酶产量最高， 几丁质最佳浓度1 l 。酸性p h 和硝酸钠促进几丁质酶的产生，而硝酸铵、 酒石酸铵、天冬酰胺作为氮源，几丁质酶产量减少了3 倍。k a p a t 等1 5 7 1 对 t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m 几丁质酶产生的环境因子、微生物学参数、最佳培养 基组成进行统计研究。几丁质浓度为1 2 5 k g m 3 ，硫酸铵为4 2 k g m 3 为几丁 质酶产生的最佳浓度；初始p h 为5 6 ，培养温度为2 8 是几丁质酶产生的最 稳定的条件；不加尿素和蛋白胨促进几丁质酶的合成。优化培养后和优化培 养前相比，几丁质酶活性由0 0 5 4 u 提高到o 1 9 7 u 。这一观察结果与u l h o a 和p e b e r d y ( 1 9 9 1 ) 以及v y a s 和d e s p h a n d e ( 1 9 8 9 ) 的结果不一致。 1 4 4 微生物几丁质酶的提取与纯化 目前分离纯化几丁质酶和壳聚糖酶的步骤一般是：首先通过( n h 0 2 s 0 4 沉淀，再经d e a e 纤维素柱层析、s e p h a d e x g 1 0 0 柱层析从发酵液上清液中 分离纯化几丁质酶，再经s d s - 聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶进行分析。利用这些 分离纯化手段可以分离得到纯化酶。 杨文博等1 5 8 由链霉菌( s c r e p t o m y c e ss p ) s 0 1 菌株产生的几丁质酶 ( c h i t i n a s e ) 经硫酸铵盐析、d e a e 纤维素柱层析、s e p h a d e x g 1 0 0 柱层析分离 纯化后，得到s d s p a g e 均一样品。 杨革等f 5 9 1 由绿僵菌几丁质酶经硫酸铵盐析、d e a e 纤维素柱层析、 p h e n y l s e p h a r o s e 。o m 6f a s tf l o w 疏水柱层析等方法得到电泳纯的几丁质酶。 彭仁旺，黄秀梨等 6 0 1 将球孢白僵菌( b e a u v e r i ab a 护i a n a ) 的突变株 c h 1 3 1 6 细胞裂解液经硫酸铵沉淀，d e a e 纤维素层析及凝胶过滤，分离出 一种几丁质酶，该酶的分子量为3 2 k d 。 1 4 5 微生物几丁质酶的性质 ( 1 ) 酶的作用类型 根据酶的作用部位和酶解产物的不同，几丁质酶可分为两种：外切型几 丁质酶( e x o c h i t i n a s e ) ，从几丁质链的非还原性末端依次切下几丁二糖：内切 型几丁质酶( e n d o c h i t i n a s e ) ，可在几丁质链的任一部位进行随机切割，产生 8 山东轻工业学院硕士学位论文 包括几丁二糖在内的几丁质寡糖。微生物几丁质酶绝大多数为外切酶。这两 种几丁质酶分子水平的结构差异还未完全弄清，有待于进一步研究刚f 6 2 】。 ( 2 ) 分子量 微生物几丁质酶的分子量差异很大，一般为1 0 1 0 0 k d t 6 3 】。放线菌产几丁 质酶的分子量多在3 0 k d ，而细菌、真菌所产酶分子量变化较大：粘质沙雷氏 菌产生分子量分别为5 7 k d 、5 2 k d 、4 8 k d 、3 6 k d 和2 1 k d 的5 种几丁质酶。 ( 3 ) 金属离子的影响 许多金属离子尤其是重金属离子如a r 、f e 3 + 、c u 2 十、z n 2 + 、h 9 2 + 、s n 2 + 、 c 0 2 + 等，对微生物所产几丁质酶活力都有不同程度的影响 6 州。如5 m m o l l 的 h g ”能使粗糙链孢霉( s n e u r o s p o r a c r a s s a ) 的几丁质酶彻底失活，1 0 m m o l l 的f e 抖存在时，酶活力仅剩余1 5 ( v y a s 和d e s h p a n d e t 9 9 3 ) ：a g + 、c o + 、z n + 可抑制链霉菌s 1 0 0 1 几丁质酶活力2 4 7 6 ( 陈亚成，1 9 9 7 ) ；而一些金属 离子如m 9 2 + 、c a 2 、k + 、n a * 等，对微生物产几丁质酶活力无抑制作用，有 的还有激活作用，如l 4 0 m m o y l 的m 9 2 + 可使交链单胞菌( a l t e r o m o n a ss p ) 的产几丁质酶活力提高1 6 倍”。 ( 4 ) 温度的影响 微生物几丁质酶对温度的适应性较强，最适温度多在5 0 。c 6 0 。c 6 “，温 度较高时，酶活力很快丧失，如棉花黄萎病菌( v e r t i c i l l u m l ma l b o a t r u m ) 几 丁质酶的最适温度为5 l ，在6 5 * ( 2 时酶活力只有最高酶活力的4 0 ，7 0 。c 时 酶完全失活。瘤黑粘座孢霉( m y r o t h e c u m l mv e r r u c a r i a ) 几丁质酶在6 0 下 保温1 5 m i n ，酶活力仅剩余5 0 1 6 ”。然而，微生物几丁质酶在低温下比较稳 定，粘质塞氏杆菌几丁质酶贮存在2 0 。c 下至少四年内是稳定的。棉花黄萎病 菌几丁质酶2 下贮存数月也是稳定的。 ( 5 ) p i 及最适p h t 硼i 微生物所产几丁质酶p i 变化较大，如烬灰红链霉菌( x c i n e r e c r u b e r ) 产几 丁质酶的p i 为8 6 ，而红霉素链霉菌( s e r yt h r a e u s ) 产几丁质酶p i 为3 7 。大 多数微生物几丁质酶是酸性蛋白，其等电点因几丁质酶来源不同而有所差异。 环状芽孢杆菌( bc i r c u l a n s w l 1 2 ) 的六种几丁质酶p 1 分别为4 7 、4 5 、6 6 、 5 9 、8 5 和5 2 。据统计，微生物几丁质酶的活性在p h 3 0 1 1 0 之问都比较稳 定。 1 4 6 微生物几丁质酶研究的发展方向 微生物几丁质酶的研究一直是很活跃的领域。目前的研究总体上从三个 侧面开展： ( 1 ) 几丁质酶系的研究 9 第一章绪论 主要研究几丁质酶、壳聚糖酶、n 乙酰葡萄糖胺酶、壳二糖酶等几丁质 水解酶系统的多样性、复杂性和种属特异性，探讨几丁质水解酶系统与生物 体自溶、形态发生和营养代谢过程的关系，发生水解作用的机制等。 几丁质酶系由能水解几丁质成n 一乙酰葡萄糖胺( n a g ) 或氨基葡萄糖胺 的一系列酶组成，该酶系有多种作用方式的酶：内切几丁质酶( e c 3 2 1 1 4 ) ， 对几丁质长链进行随机降解，最终产物是几丁二糖和少量的几丁三糖；夕 切 几丁质酶( e x o e h i t i n a s e ) ，此酶从几丁质链非还原端连续释放几丁二糖或低聚 料1 0 】；n 。乙酰葡萄糖胺酶( e c 3 2 1 1 0 ) 6 9 1 ，亦称几丁二糖酶( c h i t o b i a s e ) ，能 降解几丁二糖，生成游离态n a g ：几丁质脱乙酰酶 ( c h i t i n d e a c e t y l a s e ，e c 3 5 1 4 1 ) 可以水解脱掉几丁质上的乙酰基，将几丁质变 为壳聚糖1 7 0 j ：壳聚糖酶( e c 3 2 1 9 9 ) 【6 9 1 以内切作用方式催化水解壳聚糖中氨 基葡萄糖苷键，生成聚合度为2 8 的低聚糖聚合物，与几丁质酶区别在于， 壳聚糖酶的底物不同，仅能作用于几丁质脱乙酰化后的产物