（发酵工程专业论文）原生质体融合选育纤维素发酵产脂菌株.pdf

中文摘要 中文摘要 原生质体融合技术是通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合而达到杂交目 的的基因重组技术。深黄被孢霉3 3 4 1 0 ( m o r f i e r e l l ai s a b e l l i n aa s3 3 4 1 0 ) 是油脂高产 菌，但是不能直接利用纤维素，而黑曲霉s l 2 - l l l ( a s p e r g i l i u sn i g e rs l 2 1 1 1 ) 有高纤 维素酶活性，但是不能产生油脂。本实验通过原生质体融合技术筛选能直接利用纤 维素原料的产油菌株。 本研究的主要结果如下： ( 1 ) 深黄被孢霉3 3 4 1 0 和黑曲霉s l 2 1 1 1 的原生质体制备和再生的方法。深 黄被孢霉3 3 4 1 0 原生质体制备和再生条件是：采用0 8m o l l m g s 0 4 7 i 2 0 作为渗透 压稳定剂，培养2 0 h 的菌丝体在浓度为1 2 溶菌酶+ 0 5 纤维素酶+ o 8 蜗牛酶的 混合酶液中酶解4 h ，酶解温度为3 0 c ，p d a 高渗再生培养基上进行再生培养。原 生质体的浓度达到6 3 1 0 7 + m r ，再生率达到2 5 1 。黑曲霉s l 2 i i i 原生质体制 备和再生的条件是：采用o 8m o l ln a c l 作为渗透压稳定剂，培养1 2 h 的菌丝体在 浓度为1 o 溶菌酶+ 1 5 纤维素酶+ o 5 蜗牛酶的混合酶液中酶解4 h ，酶解温度为 3 0 ，p d a 高渗再生培养基上进行再生培养。原生质体的浓度达到7 2x1 0 7 个m l ， 再生率达到2 8 6 。 ( 2 ) 深黄被孢霉3 3 4 1 0 和黑曲霉s l 2 1 1 1 的原生质体灭活的方法。分别用紫 外灭活和热灭活方式对深黄被孢霉3 3 4 1 0 和黑曲霉s l 2 1 1 1 原生质体进行灭活。结 果，深黄被孢霉3 3 4 1 0 在1 5 w 紫外灯距离1 0 e r a 处照射1 5 m i n 或者在5 5 恒温水 浴锅中加热1 5 m i r a 黑曲霉s l 2 1 1 1 在1 5 w 紫外灯距离1 0 c m 处照射1 5 m i n 或者在 5 5 c 恒温水浴锅中加热2 0 m i n ，两亲株原生质体的灭活率也达到1 0 0 。 ( 3 ) 原生质体融合的方法。使用4 5 的p e g 作为助融剂，对经紫外灭活的深 黄被孢霉3 3 4 1 0 原生质体和热灭活的黑曲霉s l 2 1 1 1 原生质体进行融合，融合温度 为3 5 ( 2 ，融合时间为1 0r a i n ，融合率达到1 9 2 。对融合菌株进行挑选，获得了能 直接利用纤维素原料的产油菌株。初步实现了选育目的。 关键词深黄被孢霉，黑曲霉，原生质体融合，纤维素，产油菌株 中文文摘 中文文摘 由于石油价格不断上涨、石油资源逐渐枯竭，全世界都面临着能源短缺的危机。 生物柴油是从可再生脂质资源，如植物油、动物脂或微生物油脂中得到的长链脂肪 酸烷基单酯，是由长链脂肪酸的单烷基酯组成的燃料。“生物 是指它相对于石化柴 油而言，是一种可再生的生物资源；“柴油”指的是它可用于柴油发动机。生物柴油 作为一种替代性燃料，它能够以纯态或与石化柴油混合使用。 生物柴油的生产方法主要有：化学法、生物酶法和微生物法。 虽然目前大多数国家是以油料作物和食用油所产生的废油为原料来生产生物柴 油的，但由于我国用于扩大常规油料作物种植的土地资源没有保障，要依托农业油 脂作为原料来生产生物柴油并不现实。因此在应对我国油脂供应形势的决策上，要 理性分析我国的国情，防止发生生物柴油产业出现“与人争粮 、“与人争油”和 “与粮争地的矛盾。 而微生物法生产柴油可以从根本上解决这个矛盾。微生物柴油是利用微生物油 脂与甲醇或乙醇等短链醇进行酯交换反应，产生微生物柴油和甘油等物质。在适宜 条件下，某些微生物产生并储存的油脂占其生物总量的2 0 以上，已知细菌、酵母、 霉菌、藻类中都有能产生油脂的菌株，但以酵母菌和霉菌为主。 本实验中选取的产油菌株深黄被孢霉a s 3 3 4 1 0 ( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n aa s 3 3 4 1 ，属于藻状菌纲、毛霉目、被孢霉科，在特定的培养基上，菌体中油脂得 到积累，其油脂含量为5 0 嚅5 亏，微生物油脂产量可达到1 8 o g l 培养基。每 消耗1 9 葡萄糖，总的生物量增加0 3 4g ，干菌体中的油脂含量增加o 1 7 9 。 深黄被孢霉3 3 4 1 0 的产油能力已得到证实，但是经由实验证明，该菌株不能直 接利用纤维素原料。而本实验室保藏的黑曲霉s l 2 - 1 1 1 ( a s p e r g u l l u sn i g e rs l 2 1 1 1 ) 是一株具有很高的纤维素酶活力的菌株。为了获得一株能够直接利用纤维素原料的 产油脂菌株，我们利用原生质体融合技术对两亲本菌株进行改良。 原生质体融合，就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生 v 福建师范大学) 【) 【) 【硕士论文 质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或者化学的或者生物的助融条件， 使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，发生基因组间的 交换重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，再通过合理的筛选 程序，从再生细胞中获得重组子的过程。与常规育种方法比较，原生质体融合可以 使两亲本的遗传物质更加充分融合，得到的重组子遗传特性更加稳定、突变幅度更 大，在工业化生产中有较强的实用价值。 原生质体融合育种一般分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记选择、双亲本原 生质体制备与再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体( 称为融合子) 分离、遗 传特性分析与测定。 影响原生质体制备和再生的重要因素有菌体的预处理、菌体培养时间、酶系和 酶浓度、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂。此外，培养基组成、茵体培养方式、 酶的作用p h 值、菌体密度、酶解方式等对原生质体的形成亦有一定影响。 原生质体融合是生物体互相结合的复杂过程，其融合效率受到众多因素的影响。 融合方法、融合温度、亲株的亲和力和原生质体的活性、无机离子都对原生质体融 合有重要的影响。此外，合适的细胞密度、年轻的、残余菌丝较少，这些都有助于 提高融合率。 利用灭活原生质体作为遗传标记选择融合子，是在原生质体融合前，将亲本原 生质体通过紫外线照射、加热或经某些化学试剂的处理，使得原生质体丧失在再生 培养基上再生的能力，而只能作为遗传物质的供体，从而只根据另一亲株特性设计 选择条件而选择融合子。 本实验利用双亲本灭活原生质体进行融合的方法来选育产油脂菌株。实验分别 从两亲株原生质体的制备和再生、原生质体灭活方式以及融合条件的选择进行了研 究和探讨。 ( 1 ) 两亲株原生质体制备和再生条件的研究：分另啦从混合酶酶系、菌丝体菌龄、 酶解时间、酶解温度、稳定剂种类和浓度、再生培养基等方面对深黄被孢霉3 3 4 1 0 和黑曲霉s l 2 1 1 1 的原生质体制各和再生进行了研究。结果表明：深黄被孢霉3 3 4 1 0 原生质体制备和再生条件是：采用o 8m o l lm g s 0 4 7 h 2 0 作为渗透压稳定剂，培养 v i 中文文摘 2 0 h 的菌丝体在浓度为1 2 溶菌酶+ o 5 纤维素酶+ 0 8 蜗牛酶的混合酶液中酶解 4 h ，酶解温度为3 0 ，p d a 高渗再生培养基上进行再生培养。原生质体的浓度达到 6 3 x1 0 7 叶 m l ，再生率达到2 5 1 。黑曲霉s l 2 1 l l 原生质体制备和再生的条件是： 采用0 8m o f l n a c i 作为渗透压稳定剂，培养1 2 h 的菌丝体在浓度为1 o 溶菌酶+ 1 5 纤维素酶+ 0 5 蜗牛酶的混合酶液中酶解4 h ，酶解温度为3 0 ，p d a 高渗再生 培养基上进行再生培养。原生质体的浓度达到7 2 1 0 7 4 n 1 l ，再生率达到2 8 6 。 ( 2 ) 两亲株原生质体灭活条件的研究：原生质体灭活可采用热灭活和紫外灭活 等方式。分别考查了热灭活的温度和时间，以及紫外灭活的时间和距离对深黄被孢 霉3 3 4 1 0 和黑曲霉s l 2 i i i 原生质体灭活的影响。结果，深黄被孢霉3 3 4 1 0 在1 5 w 紫外灯距离1 0 c m 处照射1 5 r a i n 或者在5 5 恒温水浴锅中加热1 5 m i n ；黑曲霉 s l 2 1 1 1 在1 5 w 紫外灯距离1 0 c m 处照射1 5 m i n 或者在5 5 恒温水浴锅中加热 2 0 m i n ，两亲株原生质体的灭活率也达到1 0 0 。 ( 3 ) 原生质体融合条件：分别考查了原生质体灭活方式的组合、助融剂的种类、 助融剂的浓度、融合时间、融合温度等条件对双亲灭活原生质体融合的影响。使用 4 5 的p e g 作为助融剂，对经紫外线灭活的深黄被孢霉3 3 4 1 0 原生质体和热灭活 的黑曲霉s l 2 i i i 原生质体进行融合，融合温度为3 5 ，融合时间为1 0m i n ，融合 率达到1 9 2 。 ( 4 ) 融合菌株的筛选。用平板法对得到的融合子进行粗筛，挑出若干透明圈较 大的菌株，对其进行连续传代，然后挑出遗传性状稳定的菌株，以纤维素钠盐作为 唯一碳源进行发酵实验，挑选出能够产油的菌株。结果获得了能直接利用纤维素原 料的产油菌株，初步实现了选育目的： 目前国内尚未有与本课题相同的研究报道。 a b s t r a c t a b s t r a c t p r o t o p l a s tf u s i o ni sak i n do fg e n er e c o m b i n a t i o nt e c h n o l o g yo fp r o t o p l a s tf u s i o n b yt w op a r e n ts t r a i nw h oh a v ed i f f e r e n tg e n e t i c t r a i t st oa c h i e v et h ep u r p o s eo f h y b r i d i z a t i o n m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a 3 3 4 1 0i sa s t r a i nc o u l dp r o d u c em u c ho i l ，b u tc o u l d n o tu s ec e l l u l o s ed i r e c t l y a s p e r g i l l u sn i g e rs l 2 11 1h a sah i g hc e l l u l o s ea c t i v i t y , b u tc a n n o tp r o d u c eo i l t h i se x t p e r i m e n t ，t h r o u g hp r o t o p l a s tf u s i o nt e c h n o l o g yt of i l t r a t et h e d i r e c tu s eo fc e l l u l o s er a w m a t e r i a l s ，o i l - p r o d u c i n gs t r a i n s t h em a i nr e s u l t so ft h i ss t u d ya l ea sf o l l o w s ： ( 1 ) s t u d i e dt h ep r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nm e t h o d so f m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a 3 3 4 1 0a n da s p e r g i l l u sn i g e rs l 2 1 1 1 ：m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a3 3 4 1 0p r o t o p l a s t p r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nc o n d i t i o n sa r e ：u s i n g0 8m o l lm g s 0 4 7 h 2 0a sa l l o s m o t i cs t a b i l i z e r , 2 0 hc u l t u r e dm y c e l i u me n z y m o l y s i s e df o r4 ha tac o n c e n t r a t i o no f 1 2 l y s o z y r n e + 0 5 c e l l u l a s e + 0 8 s n a i lc e l l u l a s ee n z y m em i x t u r eo fe n z y m e s o l u t i o n , h y d r o l y s i st e m p e r a t u r eo f3 0 ，p d ah y p e r t o n i cc u l t u r em e d i u mf o r r e g e n e r a t i o n p r o t o p l a s tc o n c e n 仃a t i o nr e a c h e d6 3x1 07 m l ，r e g e n e r a t i o nr a t eo f 2 5 1 a s p e r g i l l u sn i g e rs l 2 11 1p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nc o n d i t i o n s a r e ：u s i n g 0 8m o l ln a c la sa no s m o t i cs t a b i l i z e r , 1 2 hc u l t u r e dm y c e l i u m e n z y m o l y s i s e df o r4 ha tac o n c e n t r a t i o no f1 o l y s o z y m e + 1 5 c e l l u l a s e + 0 5 s n a i lc e l l u l a s ee n z y m em i x t u r eo fe n z y m es o l u t i o n ，h y d r o l y s i st e m p e r a t u r eo f3 0 ， p d a h y p e r t o n i cc u l t u r em e d i u mf o rr e g e n e r a t i o n p r o t o p l a s tc o n c e n t r a t i o nr e a c h e d 7 2x 1 0 m l ，r e g e n e r a t i o nr a t eo f 2 8 6 ( 2 ) s t u d i e dt h em e t h o do fp r o t o p l a s ti n a c t i v a t i n go fm o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a3 3 4 1 0a n d a s p e r g i l l u sn i g e r s l 2 111 s e p a r a t e l y i n a c t i v a t e d b y u v - i n a c t i v a t e da n d h e a t - i n a c t i v a t e do fm o r t i e r e u ai s a b e l l i n a3 3 4 1 0a n da s p e r g i l l u sn i g e rs l 2 - 1 1 1t o i n a c t i v a t e d p r o t o p l a s t t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tm o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a3 3 410 i r r a d i a t e da t1 5 wu vl a m pd i s t a n c e1 0 c mf o r1 5 m i no rh e a t e da t5 5 c o n s t a n t t e m p e r a t u r ew a t e rb a t hp o tf o r15 m i n , a s p e r g i l l u sn i g e rs l 2 - 1 1 1i r r a d i a t e da t 15 w u v l a m pd i s t a n c e10 c mf o r1 5 m i no rh e a t e da t55 c o n s t a n tt e m p e r a t u r ew a t e rb a t h p o tf o r15 m i n , t h et w op a r e n ts t r a i np r o t o p l a s ti n a c t i v a t i o nr a t ea l s oh a p p e nt or e a c h 1 0 0 i l l 福建师范大学x x x 硕士论文 ( 3 ) s t u d i e dt h em e t h o do fp r o t o p l a s tf u s i o n 4 5 o f t h ep e gu s e da saf i n a n c i a la g e n tt o h e z pu v - i n a c t i v a t e dm o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a3 3 4 1 0p r o t o p l a s ta n dh e a t - i n a c t i v a t e d a s p e r g i l l u sn i g e rs l 2 1 11p r o t o p l a s tf u s i o n ，f u s i o nt e m p e r a t u r eo f 3 5 ，f u s i o n t i m eo fl o m i n , f u s i o nr a t er e a c h e d1 9 2 o ff u s i o ns t r a i n ss e l e c t e d ，o b t a i n e ds t r a i n s c o u l dd i r e c t l yu s i n gc e l l u l o s er a wm a t e r i a l sa n dc o u l dp r o d u c eo i la n df a t a c h i e v et h e p u r p o s eo f b r e e d i n gp r e l i m i n a r y k e y w o r d s m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ，a s p e r g i l l u sn i g e r ，p r o t o p l a s tf u s i o n ，c e l l u l o s e ， s t r a i np r o d u c e do i l s i v 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名)绘堑匾学号星q q 鱼! q 星昼专业筮醛王程 所呈交的学位论文( 论文题目：原生质体融合选育纤维素发酵产脂菌株) 是本人在导师指导下，独立进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除论文中已特别标明引用和致谢的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本论文的研究工作做出贡 献的个人或集体，均已在论文中作了明确说明并表示谢意，由此产生的 一切法律结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 福建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被 查阅和借阅；本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内 容采用影印丁缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文厂- 并按国家 有关规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆、中国科学技术信息研究 所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 学位论文作者签名： 糊雨 签字日期： 护歹年易月厂日 藉导教师签名：畛二 签字日期：0 罗年么月7 e t 绪论 绪论 第一节原生质体融合综述 原生质体融合( p r o t o p l a s tf u s i o n ) 是2 0 世纪7 0 年代发展起来的基因重组技术。该 项技术是通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的1 。1 9 6 0 年 法国的b a r s i 2 研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，几 乎在同时日本的d k a d a 发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞的彼此融合，从而开 始了细胞融合的探索。1 9 7 4 年匈牙利的f e r e e z y l 3 等人采用离心力诱导的方法使得 白地霉( g e o t n c h u mc a n d i d u m ) 营养缺陷型突变株原生质体融合得以实现；1 9 7 8 年， 最早由z i m m e r m a n nm 报道的该项技术是原生质体融合技术的新突破；同年，国际 工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体融合的问题，使这一技术迅速扩展到了育 种领域；1 9 7 9 年匈牙利的p e s t i 铬首先提出了运用融合育种技术提高青霉素产量的 报告，从而开创了原生质体融合技术在工业微生物育种实际工作中的应用晒。 原生质体融合技术开辟了育种工作的新途径，微生物遗传育种主要可以通过以 下几种途径进行。 利用物理、化学因素单独或者复合处理诱发突变是行之有效的，但是诱变有着 工作量大，盲目性大的缺点。而且一株菌种经多次处理以后，其生活能力逐渐下降， 孢子量减少也不利于菌种的保藏和传代，对环境的适应性也会减弱等。在经过连续 多次诱变处理后，菌株对诱变剂的反应也会变迟钝，难以获得进一步的提高，而且 对于某些菌株来说，诱变作用并不是很明显。 基因重组是微生物育种的一个重要的途径。微生物中的有性杂交、准性生殖、 转化、转导都是基因重组在细胞水平上的反应。然而，基因转移并不是所有微生物 都可以实现的，原因是有性重组局限性比较大。能进行杂交的微生物并不多，原核 生物中发生接合出现基因重组概率大约为l o 6 ，所以说是极为罕见的。无有性过程 的微生物中，只有部分微生物可以实现转化，而且在可以转化的种属中，能进行转 化的菌株很少。转导育种也不是能够普遍进行的。总之，要实现基因重组还存在很 福建师范大学工学硕士论文 多困难。 基因工程技术是现代生物技术中最引人瞩目的一方面，它是微生物育种能够定 向的途径，因而也就要求有设计精密的实验、价格昂贵的酶制剂、高度精确的仪器 和设备，目前，一般实验室很难具备这些条件和实验水准。 原生质体融合，就是在高渗环境中使亲本菌株的细胞壁分别通过酶解作用去除， 释放出只有原生质体膜包被着的原生质体，然后将亲本菌株的原生质体在高渗条件 下混合，由聚乙二醇( p e g ) 助融，使它们相互凝聚，通过细胞质融合，发生基因 组之间的接触、交换，从而发生基因组的重组，再通过合理的筛选程序，从再生细 胞中获得重组子。 微生物原生质体融合技术作为一种重要的育种方法来说也有其缺点，主要是工 作量大、定向性差，然而与上述几种方法相比，它却有着以下几个优点： l 去除细胞壁的障碍，使得没有有性过程、没有转化和转导系统的微生物，或 者是相同接合型的真菌细胞也能发生原生质体融合，而且可以冲破种、属的界限， 广泛地在微生物种间以至属间进行杂交育种；， 2 原生质体融合后，两个亲株的整套基因相互接触，有机会发生多次交换，产 生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子； 3 有p e g 作为助融剂，重组效率高； 4 可以和其他的育种方法相结合，把从其他方法得到的优良性状通过原生质体 融合再组合到一个单株中，又可以多个亲株融合一体； 5 可以进行包含无活性原生质体的融合，即用温度、药物或紫外线照射处理钝 化亲株一方的原生质体，然后再与一亲株的原生质体相融合，这样可以在筛选中除 去亲株中的一方，提高筛选效率； 6 融合工作要求设备条件不高，一般实验室都可以进行。 虽然微生物原生质体融合工作开始得比较迟，但已取得了很多重要的成果口1 。 例如，味之素公司利用细胞融合技术使得产生氨基酸的短杆菌杂交，获得比原产量 高出3 倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高产菌株嘲。酿酒酵母和糖化酵母进行种间杂交， 融合子后代中菌株有的具有糖化和发酵的双重能力。顶头孢霉通过原生质体融合， 绪论 头孢霉素产量提高了4 0 叫。庆丰霉素产生茵庆丰链霉素和井岗霉素产生菌吸水链 霉素的进行原生质体的种间融合，得到了可以生产不同于两亲株所产生的新的有较二 强抗细菌活性的抗生素n 们。芽孢杆菌种间原生质体的融合，可以得到产蛋白酶能力： 提高2 0 的融合子，再对该融合子的原生质体进行紫外诱变，产酶能力又提高了大 约3 0 。上海第三制药厂通过复合使用诱变、细胞融合、再诱变的方法，获得了有 效成分产量提高2 5 的红霉素产生菌株，且由于新菌株发酵液中所产生的妨碍提炼 的成分下降至仅占5 以下，使提炼得率提高了1 3 ，目前该菌已经投入生产叫。 总之，微生物原生质体融合技术由于可在种内、种问甚至在属间进行，不受亲 缘关系的影响，而且遗传信息传递量大，不需了解双亲详细的遗传背景，因而便于 操作。这一技术为遗传操作、分子生物学和基础理论研究提供了一种重要工具，也 为遗传育种提供了一种有性手段。随着科学的发展，这项技术将会不断发展，显现 出越来越重要的作用“引。 原生质体融合育种一般分为五大步骤“：直接亲本及其遗传标记选择，双亲本 原生质体制备与再生，亲本原生质体诱导融合，融合重组体( 称为融合子) 分离， 遗传特性分析与测定。其基本过程如图1 。 图1原生质体融合过程示意图 f i g u r e1 s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h ep r o c e s so f p r o t o p l a s tf u s i o n 圆圆蔫益国蚕 嘛蝴一一一 离(、，r_、 糟q 嘉，蔫、9 甲 福建师范大学工学硕士论文 1 1 原生质体融合的技术路线 1 1 1 直接亲本及其遗传标记的选择 用于原生质体融合的二亲本菌株都应该带有定的遗传标记，以便于重组体的 检出1 。当然，所需的目的基因并不一定要与标记基因连锁，但它毕竟可以大大减 少工作量，提高育种效率( 1 3 ) 0 遗传标记除常用的带隐性性状的营养缺陷和抗性标记 之外，也可以采用热致死( 灭活) 、菌落形态和孢子颜色作为标记。实际应用时究竟 采用哪种遗传标记，可以根据试验的目的来确定。如果原生质体融合目的是为了遗 传分析，就采用带隐性基因的营养缺陷型菌株或抗性菌株；如果原生质体融合是为 了育种，最好避免采用对正常代谢有影响的营养缺陷型。但是在实际工作中很难得 到完全符合要求的标记菌株，而且筛选这些遗传标记菌株要耗费大量时间和人力。 所以最好采用灭活的方法，把双亲中任一方的原生质体用热灭活或用紫外线、药物 灭活，使细胞内的某些酶或代谢途径钝化，然后和另一方具有正常活性的原生质体 融合而获得重组体。采用灭活标记融合频率较低，但是重组体产量较高。 。一些新的原生质体融合筛选方法，在育种中具有很大意义，如荧光染色标记就 是一种非人工遗传标记。它是在双亲原生质体悬浮液中分别加入不同的荧光色素， 然后离心除去多余染料后，将带有不同色素的亲本原生质体融合。融合后挑选同时 具有双亲染色的两株荧光色素的融合体。此外，复合使用不同选择标记的方法替代 人工标记，也可提高融合频率。 1 1 2 原生质体制备与再生 1 1 2 1 原生质体的制备 制备大量具有活性的原生质体是原生质体融合育种的前提。要制备原生质体， 就必须有效地去除在细胞外面的细胞壁。常用的去壁方法主要有三种：机械法、非 酶分离法和酶法。采用前两种方法制备得到的原生质体效果差，活性低。目前人们 最常用的是酶法，该法时间短，效果好。酶法分离原生质体实际上就是以微生物细 绪论 胞壁作为底物的酶水解反应“。影响酶法制备原生质体的因素有很多，主要有以下 几个方面： ( 1 ) 菌体的预处理n 1 ；在用酶类处理菌体之前，最好根据细胞壁的结构和组成 不同加入某些物质进行预处理，以抑制或阻止某一种细胞壁成分的合成，从而使得 酶液易于渗入，提高酶对细胞壁的水解效果。例如，可以在细菌中加入e d t a 、甘 氨酸、青霉素和d 一环丝氨酸等；在粟酒裂殖酵母中加入2 脱氧d 一葡萄糖等；在酵 母菌中加入e d t a 和琉基乙醇等。在放线菌培养液中加入0 2 4 的甘氨酸，可 利于原生质体释放，其作用机理是：在细胞壁合成过程中，甘氨酸错误地代替分子 结构相类似的丙氨酸而干扰细胞壁网状结构合成，使酶液趁机而入，有助于瓦解细 胞壁。甘氨酸加入的时间随菌株而异，有的放线菌开始培养时就要加入，有的菌株 前期培养不加甘氨酸，让菌丝充分生长后，再加入，继续培养1 8 2 4 h ，再进行酶 处理，效果良好。 ( 2 ) 菌体培养时间：菌龄明显地影响原生质体释放的频率。为了使菌体细 胞易于酶解，一般选择对数生长期的菌体。这时的细胞正在生长。代谢旺盛，细胞 壁对酶解作用最为敏感。用此时的菌体来酶解，原生质体形成率高，再生率也高。 一般地说，细菌采用对数生长后期为好，放线菌，采用对数生长期到平衡期之间的 转换期最为合适。丝状真菌以年轻的茵丝用来制备原生质体最合适，尤其是菌丝体 尖端细胞为最佳。 ( 3 ) 酶系和酶浓度n ：各种微生物，由于细胞壁组成成分不同，用于水解细胞 壁的酶的种类也不尽相同。原核微生物中的细菌和放线菌细胞壁的主要成分是肽聚 糖，可以用溶菌酶来水解细胞壁。真菌类细胞壁组成较为复杂，其中霉菌的成分主” 要为纤维素、几丁质，酵母菌细胞壁的成分主要为葡聚糖、几丁质。用于水解真菌 类细胞壁的酶类，有蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶、溶壁酶等。对于不同种属的微生 物来说，不仅对酶的种类要求不同，就是酶的的浓度也有差异。一般地说，酶浓度 增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率的提高不明显。 酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降 低。 福建师范大学工学硕士论文 ( 4 ) 酶解温度n ：不同的酶有各自不同的最适温度，同时还要注意到菌株生长 的最适温度，以避免因温度不当而导致原生质体活性降低，甚至被破坏。确定酶解 温度时要两者兼顾。按照经验，细菌类酶解温度较高些，霉菌、酵母菌则要低些， 放线菌介于二者之间。 ( 5 ) 酶解时间“耵：随着酶解时间的延长，菌体去壁程度愈完全，原生质体形 成率也逐渐上升。当酶解达到一定时间时，大多数菌体细胞己形成原生质体，如继 续进行酶解，酶液便会进一步对原生质体发生作用而使得细胞膜受到损伤，造成原 生质体破裂，从而使原生质体失活，表现为原生质体再生率急剧下降。即原生质体 的质和量与酶解时间密切相关。酶解时间过短，原生质体形成较少，结果会影响原 生质体间的融合；酶解时间过长，原生质体的再生率降低，最终也不利于原生质体 的融合。因此，必须要选择合适的酶解时间。 ( 6 ) 渗透压稳定剂n ：稳定剂不仅能防止原生质体的破裂，控制并达到最大的 数量，而且对提高酶的活性，促进酶和底物结合都具有相当的优越性。常用的稳定 剂包括n a c l 、k c l 、m g s 0 4 、c a c h 、蔗糖、甘露醇、山梨醇等，都是一些有效的稳 定剂。对于不同的微生物，其原生质体的渗透压稳定剂组成也不同。已证实无机盐 对丝状真菌原生质体制备效果较好，而糖和糖醇对酵母的原生质体制备更为合适， 细菌原生质体制备多使用蔗糖或n a c l ，放线菌中的天蓝色链霉菌菌株的原生质体制 备用0 3 m o l l 蔗糖。稳定剂是一种高渗溶液，但浓度也不能过高，否则会使原生质 体皱缩，一般浓度都在0 3 - - 1 0 m o l l 之间。 除以上几个因素外，培养基组成、菌体培养方式、酶的作用p h 值、菌体密度、 酶解方式等对原生质体的形成亦有一定影响。 1 1 2 2 原生质体的再生 原生质体具有细胞全能型，但本身不能立即进行分裂、增殖，首先必须重新合 成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就 是原生质体的再生n 。原生质体再生主要与其再生能力、菌种本身特性、原生质体 分离及保持条件、再生培养基和再生条件等有关系嗍n 7 1 。 绪论 ( 1 ) 菌体生理状态，就丝状菌来说，一般年轻细胞再生能力比衰老细胞要强， 顶端菌丝又比老菌丝产生的原生质体再生能力要强。 ( 2 ) 稳定剂：原生质体由于渗透压敏感性，在蒸馏水或低渗溶液中易于破裂， 所以再生培养基必须是高渗的；细菌、放线菌和酵母菌多用糖醇系统的稳定液，霉 菌常用盐溶液系统，如n a c l 、k c l 、m g s 0 4 等组成的稳定液，浓度为0 3 - - - ，1 0 m o l l 。 ( 3 ) 酶浓度和酶作用时间，酶解混合液中的酶浓度不宜过大，处理时间也要适 当，过长、过浓均会使原生质体脱水皱缩，活性下降而影响再生率。 ( 4 ) 再生培养基组成：真菌的再生培养基中常常补加酵母膏、蛋白质、糖类或 氨基酸等作为营养因子，而细菌、放线菌的再生培养基中常补加水解酪蛋白、血清 白蛋白、氨基酸和琥珀酸钠等作为营养因子，这些物质可能是作为细胞合成的前体 物质，也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢加速细胞壁合成的 作用。 ( 5 ) 再生方法：原生质体的再生可以通过固体培养或液体培养两种方式完成， 但是同液体培养法相比，固体培养法明显有利于原生质体的再生。 此外，原生质体的再生率还受菌体预处理的方式、原生质体的贮存时间和贮存 方式、原生质体密度、是否排除再生培养基上的冷凝水等多种因素的影响。 1 1 3 原生质体融合 原生质体融合的生物学过程：两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定剂中，在 化学或物理融合剂的诱导下，两个或两个以上凝集成团，相邻原生质体紧密接触的 质膜面扩大，相互接触的质膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞，异核体的 细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合二倍体，通过染色体交换，产生各种重 组体，称为融合子n ( f u s a n t ) 。原生质体融合程序及基因重组如图2 。 福建师范大学工学硕士论文 亲本 ：一 体 重组体 o 细胞墅 细胞核_ 、 细胞质 原生质体 细胞腰_ j 图2原生质体融合程序及基因重组示意图 f i g u r e2 s c h e m a t i cd i a g r a mo f p r o t o p l a s tf u s i o na n dg e n er e c o m b i n a t i o np r o c e s s 原生质体融合是生物体互相结合的复杂过程。其融合效率受到众多因素的影响。 ( 1 ) 融合方法：为了使制备好的亲株原生质体融合在一起，选择适宜的融合方 法很重要。融合的方法可分为物理法和化学法“射。 化学融合法中普遍采用p e g 作为促融剂，p e g 是一种多聚化合物，具有一系 列的分子量，分子式为h ( o h c h 2 c h 2 ) n o h ，商品名为卡波蜡。一般以p e g l 0 0 0 , - - 6 0 0 0 较为适用。不同种类微生物对p e g 分子量的要求也不尽相同。放线菌适用相 对分子质量范围常为1 0 0 0 - 1 5 0 0 ，也有人使用4 0 0 0 - - 6 0 0 0 的，真菌一般采用分子 量4 0 0 0 - 6 0 0 0 ，细菌用分子量1 5 0 0 - - 6 0 0 0 。p e g 常用的浓度为3 0 5 0 ，但随 着微生物种类不同而异，实际工作中要做预备实验。酵母菌原生质体融合时采用低 浓度的p e g , 常用浓度在2 0 - - 3 5 ，真菌在3 0 左右效果较好，低于2 0 0 6 0 则失去 稳定性，导致原生质体破裂，高于3 0 又会引起原生质体皱缩，过高还会产生中毒 现象。链霉菌适宜浓度为0 - - 5 0 “们。 0上 绪论 p e g 的促融机制，p e g 是一种特殊的脱水剂，它以分子桥形式在相邻原生质体 膜之间起中介作用，改变质膜的流动性能，从而降低原生质体膜表面势能，使膜中 的镶嵌蛋白质颗粒凝聚，形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层。在c a 2 + 存在下，引起细胞膜表面电子分布的改变，从而使接触处的质膜形成局部融合，出 现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个原生质体全部融合n 引。 该法不需要特别的仪器，操作简便，但是原生质体聚集不易控制，p e g 对原 生质体有一定的毒性，可能影响原生质体的再生，融合率也不高。 物理法分为电融合和激光诱导融合。 原生质体电融合方法起始于2 0 世纪8 0 年代。是由s e n d a 等于1 9 7 9 年提出的， 随后z i m m e r m n n 等于1 9 8 0 年创立了电融合技术。这一技术将电学与生物化学恰当 结合，产生了高频率的原生质体融合效果。故此原生质体电融合被视为遗传工程和 细胞改良的有效手段n 。 电融合的机制嘲是：原生质体悬浮液在交流非均匀电场作用下，细胞受到电介 质电泳力的作用，原生质体向电极的方向泳动。与此同时，细胞内产生偶极化，促 使原生质体相互粘连，并使细胞沿电力线方向排列成串，待融合细胞之间形成紧密 接触：然后在外加瞬间高频直流强电压作用，以5 0us 的时程脉冲冲击原生质体粘 连点，扰乱原生质体膜的分子排列，使之穿孔，然后发生原生质体膜复原过程，相 连接的原生质体发生融合。电融合设备及原理如图3 。 毓 a 警行多电檄教套襞曩电黩奁纭室豢澎臻c 翟览瀛电蛹巾髹垒蕨俦 爱零意臻上l 麴援臻下l 翻瀚捧捌成客猿轶，爱室数螽 图3电融合设备及原理图 f i g u r e3e q u i p m e n to fe l e c t r i ci n t e g r a t i o na n ds c h e m a t i cd i a g r a m 黜 l_1j缸 福建师范大学工学硕士论文 该技术广泛应用于动物和植物的细胞融合，而且在各类微生物细胞的改良中也 十分常见。该技术有融合率高、无残余毒性、参数容易控制，还能直接在显微镜下 观察融合过程等优点。缺点就是要在专门的电融合仪和配套的融合小室上进行，所 需的设备费用较贵。 激光诱导融合技术是从1 9 8 7 年始发展起来的，很快就被应用到动物细胞及植物 原生质体的融合中，后来又被应用于微生物的原生质体融合中。 激光融合的原理是让细胞或原生质体先紧密贴在一起，再用高峰值功率密度激 光对接触处进行照射，使质膜被击穿或产生微米级的微孔。由于质膜上产生微孔是 可逆过程，质膜在恢复过程中细胞连接小孔的表面曲率很高，处于高张力状态，细 胞逐渐由哑铃形变为圆球状时，说明细胞已融合了。影响原生质体的关键是要控制 微束激光的能量级，应使其稍低于质膜上产生明显微孔的能量密度。 激光融合的优点是毒性小，损伤小、定位性强。但由于其所需设备昂贵复杂， 操作技术难度大，很难推广应用。在微生物原生质体融合中应用激光微束技术，融 合效率较低，且丧失了高度选择性的优点有赖后续步骤检出融合子激光诱导融合技 术仍处在发展初期，还有待进一步完善n 们。 ( 2 ) 温度n ：温度对原生质体融合率有很重要的影响，高温会降低p e g 粘度， 增加质膜流动性，有利于融合。丝状真菌适宜的融合温度约为3 0 c ；而细菌原生质 体融合的温度往往偏低，据报道认为4 c 或2 0 c 比3 7 。c 更好；放线菌则通常在常温 ( 约2 0 ) 下进行融合。总的来说在2 0 - - 3 0 c 下进行融合效果较理想。融合处理时 间从l m i n 到1 h ，但绝大多数微生物在l - q o m i n ，处理时间过长，原生质体因脱水 ，j 而失活，时间过短则融合率低。 ( 3 ) 亲株的亲和力和原生质体的活性“：这两方面与融合率关系密切，亲和力 是指双亲亲缘关系，亲缘关系近，亲株之间也相对易于融合。亲缘关系远，融合染 色体交换后重组体不稳定，易分离。此外，对亲株原生质体先进行紫外照射处理， 然后再融合，也能显著提高融合频率。 ( 4 ) 无机离子：在p e g 介导融合时，一定粘度的c a 2 + 和m 9 2 + ，能更有效地促 进融合。通常用浓度为0 0 5 m o l l 的c a c l 幻或者0 0 2m o l l 的m g c l ：。对于各种菌 绪论 又有所不同，丝状真菌融合时c a c l ：浓度以0 0 0 1 , - - 0 0 1m o l l 为佳，酵母菌以浓 度为o 0 5m o l l 时融合率最高。 电融合时，融合液中离子的存在对电场及原生质体偶极化形成偶极子有一定的 影响，会干扰融合，一般采用糖或糖醇为稳定剂，尽量减少无机离子。 此外，合适的细胞密度、年轻的、残余菌丝较少，都有助于提高融合率。 1 1 4