（发酵工程专业论文）兽疫链球菌wsh24生产透明质酸的发酵条件研究.pdf

摘要 摘要 透明质酸( h y “u r o n i ca c i do rh y a l u r o n a n ，简称h a ) 是一种由d 一葡萄糖醛 酸和n 乙酰氨基葡萄糖为重复单位，通过p ( 1 3 ) 和p ( 1 4 ) 糖苷键交替连接而成的 直链高分子粘多糖，具有独特的“锁水”功能。h a 在化妆品、外伤及关节和眼 科手术、眼药水等方面有广泛的应用。 兽疫链球菌w s h 2 4 是本研究室最近选育的高产透明质酸菌株，本研究的目 的就是优化该菌株的营养及培养环境条件。通过摇瓶阶段碳源、氮源等的选择， 优化发酵培养基；以工业化为目标，进行了发酵生产透明质酸从实验室规模到7 l 小试，再到1 5 0 0l 中试规模放大试验，考察了营养条件及环境条件对兽疫链 球菌w s h 2 4 合成透明质酸的影响。主要研究结果如下： 1 对菌株w s h 2 4 的发酵培养基进行了优化。通过实验选择了合适的碳源、氮 源及对透明质酸合成有重大影响的金属离子和环境条件，确定了发酵培养基 的配方及发酵环境条件。发酵培养基配方为( g l ) ：葡萄糖5 0 ，蛋白胨l o ， 酵母粉l o ，m g s 0 4 7 h 2 02 。发酵初始p h 值为7 ，o ，培养温度为3 7 。 2 摇瓶阶段发酵条件优化后进行了7l 发酵罐的小试。7l 发酵罐的小试发现 供氧是发酵过程的关键因素。1 2v v m 的通气量和2 0 0r p m 的搅拌速率，能 够满足兽疫链球菌w s h 2 4 发酵产透明质酸对氧的需求，透明质酸最高产量 达到5 3g l ，分子量最高达到18 8 1 0 6d a 。 3 研究了7l 发酵罐中初糖浓度及氮源浓度对透明质酸产量及分子量的影响， 初始葡萄糖浓度为6 5 8g 几、酵母粉浓度为1 0g l 、蛋白胨浓度为1 0 l 时 最有利于透明质酸的合成，透明质酸产量达到5 9 l ，分子量最高达到1 9 0 1 0 6 d a 。 4 根据7l 发酵罐中的研究结果，将透明质酸发酵过程进一步放大到1 5 0 0l 中 试规模，透明质酸产量达到5o l ，分子量达到1 8 0 1 0 6d a 。 关键词：透明质酸兽疫链球菌发酵条件优化，分子量，放大 江南大学硕士学位论文兽疫链球菌孵h 2 4 生产- 落q 质酸的发酵条件研究 a b s t r a c t h y a l u r o n i ca c i d( h a ) i sah 适h - m o l e c u l a 卜w e 逗h tl i n e a r p 0 1 ) 7 s a c c h a r i d e c o m p o s e do fr e p e a t i n gu n i t so fd - g l u c u r o n i ca c i da n dn a c e t y l g l u c o s a m i n el i n k e db y a l t e m a t i n gp ( 1 - 3 ) a n dp ( 1 4 ) g i y c o s i d i cb o n d s h ah a st h eu n i q u ew a t e 卜b i n d i n g 鲫d r e t e n t i o nc a p a c i t y i ti sw i d e l yu s e di nc o s m e t i c s ，m e d i c i n e sf o rw o u n dd r e s s i n g ，e y e d r o p s ，a n dm e d i c i n e sf o ro p h t h a l m i cs u 曜e r ya n da r l l r i t i s 耐，印，o c o c c “s = d d 印i 班七sw s h 2 4 ，as t r a i nw i t hh 噜h h ap r o d u c t i v i t v ，、v a s u s e di nt h i ss t u d y t h en u t r i l i o n a la n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sf o rh ap r o d u c t i o n w e r eo p t i m i z e di nf l a s k sa n d7lf e n n e n t o rt h e nt h ep r o c e s sw a ss c a l e du pt ol5 0 0l f e r m e n t o r f o l l o w i n gt h em a i nr e s u i t sw e r es u n l i t l a r i z e d ： 1t h ec o m p o s i t i o no fm e d i u mf o rs ：d o 印f 如埘j c “sw s h 2 4g r o 、v t ha n dh a p r o d u c t i o nw a sd e t e n n i n e da n do p t i m i z e di nn a s k sg i u c o s ea n dy e a s te x t r a c t w a st h em o s ta p p r o pr i a t ec a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sf o rh ap r o d u c t i o n t h e o p t i m a lm e d i u mc o n t a i n s ( g l ) ：9 1 u c o s e5 0 ，p e p t o n e 1o ，y e a s te x t r a c t1oa n d m g s 0 4 7 h 2 02a tp h7 2 t h ef e n n e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 7 2t h ee n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sf o rh ap r o d u c t i o nw i t hs 三o d 印f 出m 把姗w s h 2 4 w e r ei n v e s “g a t e di na na u t o m a t i cm o d e l7 一lf e r m e n t o rt h eo p t i m a la g i t a t i o n s p e e da n da e r a t i o nr a t ew e r e2 0 0r p ma n d1 2 、r v m ，r e s p e c t i v e l y u n d e rt h e s e o p t i m a lc o n d i t i o n s ，5 3 lo fh aw a so b t a i n e dt h ea v e r a g em o l e c u i a rw e i g h t o f t h e h ar e a c h e d18 8 1 0 。d a 3 t h ee f 琵c to fj n i t i a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o na n dy e a s te x t r a c tc o n c e n t r a t i o no nh a y i e l da n dm o l e c u l a rw e i g h ti n 7lf 音m l e n t o rw a si n v e s t i g a t e d w h e nt h ei n i t i a l 9 1 u c o s ec o n c e n t r a t j o nw a s6 58g la n dt h ec o n c e n t r a t i o n so fy e a s te x t r a c ta n d p e p t o n ew e r e1og ，l ，h a ) r i e l da n dm o l e c u l a rw e i g h tc o u l dr e a c h59g la n d 1 9 0 l0 。d a r e s p e c t i v e l y 4 b a s e do nt h es t u d yi n 7lf 爸n n e n t o lt h ep r o c e s sw a ss c a l e du pt o l5 0 0l f e m e n t o rh av i e l da n dm o l e c u i a rw e i o h tr e a c h e d5 o la n d1 8 0 1 0 6d a r e s p e c t i v e l ) ， k e 、7w o r d s ：h y a l u r o n i ca c i d ，母，印，。c c “j = o o p p f 如脚i f w o p i i m i z a t i o no f f e m e n t a t i o nc o n d i t i o n s m 0 1 e c u l a rw e i 9 1 1 t ，s c a l eu p 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：越壅： 日期：聊6 年弓月，。日 关于论文使用授权的说明 本学位沦文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：盟 第一章绪论第1 6 页 1 1 透明质酸的研究背景 1 1 1 透明质酸的性质与用途 第一章绪论 透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ，h ? a i u r o n a n ，简称h a ) ，又名玻璃酸，具独特 的皮肤保湿、营养、抗衰老、稳定乳化、抗菌消炎、促进伤口愈合及药物载体 等特殊功能，是一种在日化、医药、生化与保健食品等领域内用途极为广泛、 性能优良的功能性生化物质。图j 一1 为h a 的结构示意图，h a 是由( 1 3 ) 一2 乙酰氨基一2 一脱氧一p 一葡萄糖( 1 4 ) 一o p d 一葡萄糖醛酸双糖重复单位所组成的， 是动物体内蛋白多糖分子中的糖链部分，众多的糖链通过共价键与核心蛋白相 连。 n 的生物合成就是起始于核心蛋白，经过多种糖基转移酶和有关修饰酶( 差 相异构酶) 的作用，形成有特定顺序的重复单位的线性分子。因而h a 具有许多 天然粘多糖共有的性质：呈白色，为无定型固体，无臭无味，有强吸湿性，溶 于水，不溶于有机溶剂。 e 妇雠 c 魄 n 拄谆哐o s 掷i 栳 图1 1h a 结构示意图 f 适u r el 一1 s t r u c t u r eo fh a 、 由于h a 分子等空间距离的葡萄糖醛酸残基上的羧基使它又具有特殊的性 质，最突出的是其溶液具有高粘度。从其结构可看出，由于直链轴上基团之间 的氢键作用，h a 分子在空间呈现刚性的双螺旋柱型，在水溶液中h a 分子链上 相邻一n h 哥口c 0 0 。残基之间的“水桥”作用，进步加强其刚性；同时c h 基团 的连续定向排列，又在分子链上形成高度憎水区，为分子链之间的相互缠绕和 链链之间相互作用提供接点。h a 分子链的亲水和憎水特性，使浓度很低( 1 m 旦l ) 的h a 分子也能形成连续的三维蜂窝状网络结构，水分子则在网络内通过极性键 与h a 分子相互结合，使得h a 就像“分子海绵”样，能吸收和保持其自身质量 江南大学硕士学位论文 筋i 椭w s 1 2 4 生产透j 月赝谚皴发酵烈锎院 上千倍的水分。h a 分子在溶液中高度伸展与随机卷曲构型使其占有很大区域， 其流体力学体积较未水化时所占空间大l o o o 倍。h a 溶液具有独特的粘弹性， 剪切力对其粘度值影响很大，溶液的粘弹性随h a 分子量和浓度的增加而增加， 也被认为是分子网络形成的结果j 。 在自然界中，h a 广泛存在于哺乳动物的各种组织中，如脐带、皮肤、血清、 鸡冠、关节滑液、玻璃体等。h a 常与蛋白质结合，并与其他粘多糖共存，在玻 璃体和滑液中以溶解形式存在：在鸡冠和脐带中，以凝胶形式存在。部分细菌 中也含有h a ，现已发现的主要有产气杆菌、绿脓杆菌和a 、b 、c 族链球菌等。 不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的h a 无种属差异，在化学本质和分子 结构上是一致的【“。 人体内约5 0 的h a 存在于皮肤，它对保持皮肤层及其结构有重要作用。 富含透明质酸的化妆品可以从真皮中汲取大量水分。同时，由于表皮脂层的屏 障作用，可以防止水分蒸发与散失，达到维持皮肤水环境的恒定作用。无论在 低湿度还是在高湿度条件下，它都具有相同的高吸湿性。h a 与水分子结合作为 空间填充物而防止皮肤产生皱纹，因此，它被当作一种理想的天然保湿因子， 广泛应用于化妆品中，制成适合不同肤质、气候、环境下使用的产品。目前， 含有这种成分的化妆品被公认为“仿生化妆品”、“第四代化妆品”备受推崇。 添加h a 的化妆品已成为国际日化界的主流产品f 5 】。 h a 本身没有药理作用，且没有副作用，是一个安全的医药品。主要用于眼 科手术用的补助剂和治疗药。国外已将它制成防止伤口粘连的薄膜制品，并实 现了商品化| 6j 。 h a 在化妆品、医药等方面的主要应用列于表1 1 。 表1 1 透明质酸的应用 t a b l e1 lt h ea d d l i c a t i o no fh a 应用领域 主要功能和作用 化妆品 眼科 矫型外科 外科手术 骨关节术 伤口愈合 临床诊断 保健口服液 保湿及改善皮肤生理条件，高档膏霜、乳液、粉底等化妆品的必备添加剂 玻璃体的替代品，舒适的滴眼药，眼科手术中的优良粘合剂。 增强骨骼关节间的滑动，用于矫型手术。 用于耳鼻喉科手术，用作腹部、手部的抗粘连接剂。 有希望将动物关节术中的成功经验用于人类。 促进组织再生、重塑和愈台 用作肝、肿瘤的诊断指标 具有美容、抗衰老等保健功效 第一壹绪沦 第l 6 页 1 1 2 透明质酸的生产 透明质酸的生产方法有动物组织提取法和微生物发酵法。 ( 1 ) 动物组织提取法：此法是最早采用的h a 生产法，以人脐带、鸡冠、哺 乳动物血清、牛眼玻璃体、鲨鱼皮及鲸鱼软骨等为原料，用适量丙酮或乙醇浸 泡过夜，过滤，对原料脱脂、脱水。风干后，将原料改用蒸馏水浸泡一定时间， 过滤。滤液分别用氯化钠溶液和氯仿处理，之后加入胰蛋白酶于5 0 左右保温 酶解定时间，精制去除蛋白质、小分子肽、氨基酸、核酸及其他多糖类杂质。 混合液经离予交换树脂脱无机离子后得精制h a 。该工艺原料来源局限性大，产 品提取率极低，仅为1 左右，工艺程序复杂，生产成本居高不下，造成商品价 格昂贵，限制了它在医药和化妆品中的广泛应用，并不宜进行工业化生产。 f 2 1 微生物发酵法：该法是近年来兴起的一种h a 制备新工艺，是以葡萄糖 或其它糖类作碳源，蛋白胨、酵母膏等为氮源及其他营养物质组成培养基，接 种菌种( 一般多选用链球菌属类菌种) 后，于特定条件下培养发酵。发酵结束后， 过滤，精制除去菌体蛋白、核酸、有机酸及链球菌代谢生成的其他复杂产物等 杂质。再经乙醇沉淀、纯化等程序即能得到高纯度h a 产品【i _ j 。 微生物发酵法制备h a 的工艺特点是不依赖于动物组织，原料来源丰富，产 量不受原料限制，产率较高，成本较低，还能按实际需要来设定产品的分子量； 发酵液中h a 以游离状态存在，易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生 产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点，近年来随着发酵法生产h a 技术 的不断完善，发酵法大有完全取代提取法的趋势1 2 0 “】。因此我国应大力开发微 生物发酵法制备h a 技术，选择高效率的优异菌种，加快发酵法的产业化进程， 以满足国内日益增长的市场需求。 表1 2 为组织提取法与微生物发酵法制备h a 的比较。 表1 2 提取法与发酵法生产h a 的比较 t a b l e1 2 c o m p a r i s o no f e 艏r a c t i o na n d 巧m 0 1 e c h n i c s f o r t h ep r o d u “o no f h a 项目提取法发酵法 在原料中与蛋白质和其他多糖形在发酵液中游离存在，分离精制容 存征状态 成复合体，分离精制复杂 易 分子量与保湿性小于1 o 1 0 6d a 保湿性差大于l5 x1 0 。d a 保湿性强 品质与产量取决于动物原料的品质与数量品质稳定，产量大 应用价格昂贵，应用范围与添加量受价格相对便宜，麻用领域广泛，可 到制约以加大添加量 从动物组织中提取h a ，由于来源受限、提取程序复杂且收率低、生产成本 高，限制了h a 在各领域中的应用。筛选高产h a 的微生物，利用发酵技术生产 h a 是目前最有前途的途径。 江南大学硕士学位论文 兽疫链黼啪4 生产透明顾酸的发酵条件研究 以工业化生产为目的的发酵h a 研究始于8 0 年代初期，日本资生堂借鉴前 人对某些链球菌产生h a 这一重要发现，利用现代发酵技术和设备，以提高h a 产率为目的，对发酵生产h a 进行了较全面的研究，h a 的发酵产率和分子量都 有了大幅度提高。8 0 年代中期，日本已有发酵生产的h a 上市，价格大大低于 从动物原料提取的产品”。 我国对组织提取法工艺的研究虽已趋于成熟，但由于原料短缺，生产出的 h a 多用于医药研究领域，无法满足国内在化妆品及f 临床医学上的需求。近年来 国内建立了多条透明质酸发酵生产线，产品除供应国内化妆品市场外，相当部 分用于出口。当前发酵法生产透明质酸存在的主要问题是产量还不够高，产品 质量不够稳定( 特别是分子量) ，达不到医药应用的要求。 在我国，对h a 的研究还有待迸一步深入，如何结合我国化妆品行业及医药 临床领域的自身特点，不断开拓h a 应用的新方向，还需要科研与技术人员做大 量的研究工作。 1 1 3 透明质酸研究的历史与现状 1 9 3 4 年美国m e y e r 和p a l m e r 等首先从牛眼玻璃体中分离出h a 。1 9 3 7 年， k e n d a l l 等发现溶血性链球菌研7 印，o c c “j d o 砂r j c “s 可以合成h a 并分泌到胞 外形成荚膜，其后，又陆续有报道发现能合成h a 的微生物菌种。许多链球菌都 可以合成以h a 多糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌成为研究得最多的h a 生产 菌“1 。链球菌在生长过程中，荚膜的产生有几种不同的情况，有的菌株整个生长 期都有荚膜，有的在对数生长期的前期产生，后期消失，或稳定期消失，有的 根本不产生荚膜。产生h a 的链球菌有a 族及c 族之分，a 族中主要有酿脓链 球菌等，由于致病性强，较少用作菌种进行大规模发酵：c 族致病性较弱，多采 用此类菌，主要有兽疫链球菌、马疫链球菌和类马疫链球菌等i ”。 早期对链球菌荚膜h a 的研究，主要是为了探索链球菌的荚膜组成和其作用 及实验室少量制备等。发酵法生产h a 方面的研究主要集中在日本，英国和美国 也有少量报道。j o h n s 等1 8 】就p h 、搅拌转速和通气量对h a 合成的影响进行了研究： k i m 等1 对研7 印向f f m 叼“f 突变株的筛选及影响h a 分子量的培养条件进行 了研究：d a 、r i d 等研究了h a 产生菌j f 憎p ，o c o c c “j ：d o p 砘f c “s 的生长及其对氨 基酸的需要，同时也对影响h a 分子量的培养条件进行了研究：2 0 0 3 年b a 州e u 等研究了如何提高研，印，o c c “s 二d o 印胁州i c “j 的细胞还原性；b a r r i e 等【1 2 】的研 究包括h a 的合成、代谢、发酵条件等，还包括分子生物学方面的研究。美国专 利【l “介绍了细菌发酵法生产h a ，另一专利介绍了h a 的合成。日本专利中 介绍培养基中加入溶菌酶或表面活性剂( 如t v e e n 8 0 ) 能使h a 达到稳产高产。 h o j m s t m n 和r i c j c a 采用摇瓶和小罐分批发酵研究了h a 发酵的培养基，k i m l 9 j 第一章绪论 第l 6 页 等考察了小罐分批发酵的条件，d a v “”j 和j o h n s 在小罐发酵的基础上，考察了 培养条件对h a 分子量的影响。 我国h a 研究起步较晚，于八十年代进行了h a 的组织分离提取，九十年代 初已有h a 制剂作为新药上市。山东省生物药物研究院( 原山东省商业科技研究 所) 是国内最早从事h a 研究开发的单位之一，1 9 9 0 年该院郭学平等【】8 】在国内 首先开始h a 的发酵生产研究，先后完成了小试和中试实验。天津药物研究所、 山东医科大学曾先后进行了此方面的制备研究，多用于化妆品配方方面。近年 来虽已有少量的医用h a 工业品问世，但产品的质量及产量都不够理想。宁夏农 学院食品科学系罗瑞明i 旧圾寸一株兽疫链球菌产h a 的条件及其特性进行了研究； 华东理工大学田毅红等研究了高分子量h a 的发酵，考察了对h a 分子量有 影响的培养条件；本研究室已毕业博士高海军1 4 】以兽疫链球菌w s h 2 3 为出发菌 株对h a 的发酵条件进行了研究和优化，h a 的发酵产量和分子量均有所提高。 目前国内h a 的发酵产率为4 l 5g l ，从发酵液到最终产品的纯化收率 为6 0 7 0 。国际先进的h a 发酵产率为6g l 7 l l ”j 。发酵法是h a 生产 的发展方向，应从提高产率、提高产品分子量和分离纯化技术方面进一步研究。 1 2 立题背景和意义 不同用途的h a 对分子量有不同要求，中等分子量h a 主要应用于化妆品， 而高分子量的h a 可应用于眼科手术、治疗关节病、软组织修复和作为药物载体 等，特别是在预防和减少外科手术后组织粘连中取得了较大的进展，具有很高 的应用价值。因此在h a 发酵生产中，高产量、高分子量和高产率依然是研究的 主要目标。 目前我国虽然已有不少研究机构在研究微生物发酵法生产h a ，但在工业生 产中在如何获得高产及高分子量h a 方面仍存在不少问题，同时过于复杂及要求 严格的培养基组成也造成了生产成本过高。本研究立足于h a 的工业化，在保证 h a 高产和高分子量的基础上降低其生产成本。 1 3 研究的主要内容 本课题的研究目的是利用兽疫链球菌& r 印f o c 。c c 坩z o 。印j 如”啦“sw s h 2 4 发 酵生产h a ，通过优化发酵的营养条件及环境条件提高h a 的产量及分子量，并对 生产菌& r 印，d c 。c c 淞：o 。印a 拒j c 淞w s h 2 4 的生产特性进行研究。本课题的研究内 容主要包括： 江南大学硕士学位论文 兽疫链球菌w s h 2 4 生产透明质嘲发酵条件研究 1 对菌株w s h 2 4 的摇瓶发酵培养基进行优化。选择合适的碳源、氮源及对h a 合成有重大影响的金属离子和环境条件，确定发酵培养基的配方及发酵环境 条件，并对抑菌素n i s i n 的添加对发酵的影响进行研究。 2 7l 发酵罐中溶氧( 包括搅拌转速及通气量) 对菌体生长、h a 产量和分子量、 乳酸产生等的影响。 3 7l 发酵罐中初始葡萄糖浓度和初始氮源浓度对菌体生长、h a 产量和分子 量、乳酸产生等的影响，并将发酵法生产h a 从小试规模放大到中试生产规 模。 第二章兽疫链球菌w s h 2 4 发酵法生产透明质酸的摇瓶发酵条件研究 第7 1 7 页 第二章兽疫链球菌w s h 2 4 发酵法生产透明质酸的摇瓶发 酵条件研究 2 1 引言 透明质酸因其良好的生物相容性和保湿润滑功能越来越受到人们的关注。 其应用领域正在急剧扩大，市场增长迅速【2 。虽然最初的h a 产品主要来自动 物器官提取，但自从1 9 8 3 年日本资生堂首次报道用链球菌生产h a 后，英美等 国相继报道采用微生物发酵法生产h a 的方法，大大拓宽了h a 的来源，推动了 h a 的研究和应用。微生物发酵方法生产h a 的实现是h a 生产领域取得的最重 大的进展，不仅可以降低h a 生产成本，而且l a 的质量提高，品质稳定。最近 几年，国内也相继建立了几条发酵法生产h a 的生产线口”j 。但随着生产厂家的 增多，竞争不断加剧，特别是应用市场的不断细分也给生产企业提出了新的要 求，如根据客户要求生产不同纯度、不同分子量的产品。为不断降低生产成本、 提高产品质量，必须不断筛选优良新菌株或改良原有生产菌株，进一步优化发 酵工艺。因此，有关h a 发酵法生产的研究工作不但不应因成功产业化而终止， 而是显得尤为重要和迫切。 兽疫链球菌( 胍p 幻c c 嬲z o o 印i 办f c 淞p ) w s h 2 4 是本研究室最近选育得到 的h a 高产菌株，该菌株具有潜在工业价值。本章以研究兽疫链球菌w s h 2 4 生 产h a 的生产性能为目标，在摇瓶中对该菌株生产h a 的营养条件进行了研究。 在此基础上进一步考察了环境条件包括温度及初始p h 值对h a 发酵的影响。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种 兽疫链球菌( 研r 印，o c o c c s ：o o 印娩f c “s p ) w s h 2 4 ( 研究室保藏号) 。 2 2 2 培养基与培养条件 斜面培养基( g l ) ：生长因子( 研究室自配) 3 7 ，酵母粉1 0 ，葡萄糖1 ，琼脂 粉2 0 ，p h7 o 。 种子培养基( l ) ：葡萄糖2 0 ，酵母粉1 0 ，蛋白胨1 0 ，m g s 0 4 7 h 2 02 ， m n s 0 4 4 h 2 0o 1 ，c a c 0 32 0 ，k h 2 p 0 42 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 01 4 7 ，n a h 2 p 0 4 1 2 h 2 0 江南大学硕士学位论文蒈疫链球菌w s 耻4 生产透明质酸的发酵条佴 f f 究 o6 4 ，n a h c 0 30 ) ，p h 7 o 。 发酵培养基( g l ) ：葡萄糖5 0 ( 文中另有说明除外) ，酵母粉1o ( 文中另有 说明除外) ，蛋白胨i o ，n a 2 h p 0 4 。1 2 h 2 06 2 ，k 2 s 0 41 3 ，m g s 0 4 。7 h ! o2 ， f e s 0 4 7 h 2 0o0 0 5 ，p h7 o 。 斜面与摇瓶种子培养：取保藏在安瓿管中菌种，斜面划线传代。传代斜面 于3 7 下培养15h 后，用接种环挑取1 2 环接入装有5 0 m l 种子培养基的5 0 0 m l 三角瓶中，于2 0 0r p m 的旋转摇床上培养1 6h ，培养温度3 7 。 摇瓶发酵培养：按1 0 的接种量将种子培养液接入发酵培养基中，5 0 0m l 摇瓶装液量4 0m l ，摇床转速2 0 0r p m ，发酵温度如未特殊说明为3 7 。c 。 2 2 3 菌体生长量测定 将发酵液进行适当稀释，在l om l 发酵液中加入1 0m l1 0 ( w v ) 的三氯乙 酸溶液，混匀，4 0 0 0r p m 下离心2 0m i n ，沉淀物于1 0 5 烘干至恒重，称量。 2 2 4 透明质酸含量测定 采用b i t t e 卜m u i r 氏法忆 硼砂硫酸液：称取四硼酸钠47 72 溶于5 0 0 m l 的浓硫酸( a r 级) 中。 咔唑试液：称取咔唑01 2 5g ，溶于1 0 0m l 的乙醇( a r 级) 中，然后置于 棕色瓶中于冰箱中保存。 精密称取葡萄糖醛酸( a r 级) 2 0 m g ，置于1o o m l 的容量瓶中，加水溶解 到刻度，摇匀备用。精密量取标准溶液o 5 、io 、15 、2 0 、25m l ，分别加入 1 0m l 的容量瓶中，加水稀释至刻度，得l o 、2 0 、3 0 、4 0 和5 0p g m l 浓度的对 照品溶液，取6 支具塞刻度试管分别加入硼砂硫酸溶液5m l 置于冰浴中冷却至 4 左右。然后分别取空白溶液( 去离子水) 和不同浓度的标准品溶液各10m l 于试管中，先轻轻震荡，再充分混匀，这些操作均在冰浴中进行。将试管置沸 水中煮沸1 0m i n 后，放入冷水中冷却至室温。加入咔唑试剂o 2m l ，混匀，再 在沸水中加热1 5m i n ，冷却至室温。在5 3 0n m 处测定吸光度a ，以吸光度对应 的浓度c 作图，即可做出标准曲线。 将发酵液进行适当稀释，量取5m l 发酵液，加入i om l 无水乙醇( a r 级) ， 充分混匀，稍加静置后4 0 0 0r p m 下离心5m i n ，弃去上清，用去离子水将沉淀完 全溶解，进行适当稀释。按照标准曲线项下的方法测定吸光度。再从标准曲线 上查出相应的葡萄糖醛酸的浓度，按照下列公式计算发酵液中透明质酸的含量： 透明质酸含量( g f - ) ：堑塑型塑垒型塑壁譬黧堕塑型望竖里里旦 第二章兽疫链球菌w s h 2 4 发酵注生产透明质酸的摇瓶发酵条件研究第7 1 7 页 2 2 5 发酵液中残糖浓度测定 采用3 5 一二硝基水杨酸法【2 3 】。 2 3 结果与讨论 2 3 1 种子生长过程曲线和种龄的确定 种子是进行发酵的基础，其品质的好坏对发酵生产起着关键的作用。种子 质量的优劣不仅与培养基组成有关，还与种子的生理性状有关。当传代菌种接 入种子瓶( 罐) 中，要经过延滞期，对数生长期，静止期和死亡期。过于年轻 的种子接入发酵罐中，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开 始形成的时间推迟，甚至造成异常发酵；过老的种子则会引起生产能力下降， 菌体过早自溶1 2 4 2 ”。因此选择适当的种龄非常重要。生产培养出的种子应是生长 活力强，移至发酵罐后能迅速生长，延滞期短；通常，种龄以菌体处于生命力 极为旺盛的对数生长中后期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时较为合适， 这样既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞量1 2 “。种子培养基要求 营养丰富、全面，氮源、维生素比例应较高1 2 。种子培养基中除了应含有适当 种类和浓度的营养成分外，各种组分之间还应有合适的配比，使有利于种子的 生长和繁殖1 2 “。参考本研究室已毕业博士高海军的研究成果【4 j ，选择种子培养基 配方为本章2 2 2 所述。图2 1 为s ：o o 印娩m f c “sw s h 2 4 的菌体生长曲线。 o 2 4 6 8l o l 2 1 4 1 6 1 82 02 2 2 4 2 62 8 时间( h ) 图2 1s ：o 口印胁肌七“sw s h 2 4 的菌体生氏曲线 f 碴u r e 2 1t i m ec o u r s eo f c e l lg r o 州ho f s 邪。印眈卅j c “sw s h 2 4 口b i o m a s s 口h 由图2 1 可知，种子对数生长期从接种后1 0 h 左右丌始，镜检发现，在1 2h 时出现由少量几个细胞粘联而成的链状；随着菌体量的增加，培养液的p h 逐渐 降低，18h 时，p h 达到最低，此时镜检发现大部分细胞呈链状分布，此后p h 5 4 3 2 1 0 3 8 一趟肇姆 兰童翌至墅生芝型塑垒兰量壅塑型堂坚里! 皇苎垦塑堕竺塑垄壁墨塑 开始升高，菌体量下降。由此可知，在1 6h 前后种子细胞正处于对数生长中后 期，是最活跃的阶段，此时的细胞活力最强且菌体量较高，因此发酵的最佳接 种时间定为】6h 左右。 2 3 2 碳源对透明质酸发酵的影响 从培养基的营养角度讲，兽疫链球菌是很挑剔的阻2s 1 ，t c a 循环不完伞， 有多种氨基酸不能自身合成，需提供多种生长必需物质f 2 9 1 。图2 2 为兽疫链球 菌中h a 的代谢途径。 由图2 2 可见，使菌体大量合成h a 的前提条件包括：充足的h a 合成前体 物质：提供足够的能量：合成途径畅通。碳源是构成细胞骨架前体的重要因素， h a 的两种前体物质u d p 一葡萄糖醛酸( u d p g l c a ) 和u d p n 一乙酰氨基葡萄糖 ( u d p g l c n a c ) 的合成都需要葡萄糖的参与，因此大多文献中部选用葡萄糖作 为唯一碳源4 9 】，也有用蔗糖等研究的，高海军博士的研究结果发现蔗糖仅比 兰7 上一竹引“6 一 ， u d p 砧f u c u r ka c du d p n 哦t y lg l u c o s a m i n 。 2 n d h 。p p f 、，t ，卜g i u t a m a 塘。c o a s h p p l 2n a d + u t p 1 卜g i u t a m i n 钆a c 。t y i c o a ，u t p g i u c o s e7 弋 g l u s e j b 帚+ f c 砸s e 岳p ，l ，2 n d 3 a d p 肿柏p 2 n 驾4 ；嗽叫卜：啪i ，j 二 年，rz n a u h - 3 r p o ，蝴v 2 n d o ， 唯：= ：。叉吠= 2 p c 。叩吒o a ：渤。+ 等竿：k 。切培 图2 2 兽疫链球菌s = ”印，出m f c m 中h a 的代谢途径【1 1 j f i g u r e2 _ 2m e t a b o l i 。p a t h w a yj ns ：。印，出”7 地w 出于工业化的需要，本文选用葡萄糖及蔗糖为碳源，表2 1 为摇瓶发酵条件 下蔗糖和葡萄糖对发酵结果的影响。由表中的数据可以看出，菌体在两种不同 碳源下的生 情况几乎一致，但是以葡萄糖为碳源时h a 的产量明显高于后者， 第二章兽疫链球菌w s h 2 4 发酵法生产透明质酸的摇瓶发酵条件研究 这是因为葡萄糖是最容易利用的碳源，最易转变为h a 合成所需的前体u d p 葡 萄糖醛酸和u d p n 乙酰氨基葡萄糖。 表2 1 不同碳源对h a 合成及菌体生长的影响 t a b i e2 一le 髓c to f d i 行e r e n t c a f b o ns o u r c e so n h a y i e l da r i dc e l lg r o w t h 图2 3 和2 4 为不同初始葡萄糖浓度对发酵结果的影响，由图中数据可以看 出，随着初糖浓度的提高，h a 的产量呈增高趋势，同时h a 对葡萄糖的产率系 数也不断增高，由3 0g l 时的o 0 6 5g 值增加到1 0 0 l 时的o0 7 9g g 。初糖浓 度直接影响碳源代谢的流向，在较高的初糖浓度下有更多的底物合成h a | 】，从 而使h a 对葡萄糖的产率系数增高，但残糖较高，综合以上述分析，表明在摇瓶 培养中采用初始葡萄糖浓度为5 0g l 较为合适。 8 0 拿6 0 9 羹4 0 爨 基2 0 0 5 0 4 0 一 零 3 0 竖 2 0 器 1 0 担 o 3 04 05 06 0 8 0 l o o 初始葡萄糖浓度( g l ) 图2 - 3 不同初糖浓度对葡萄糖利用的影响 f i g u r e2 3e f f e c to f d i f f e r e n ti 1 1 i t i a ig l u c o s ec o n c e n t r a t i o no nt h eu t i j j z a t i o no f g i u c o s e u t 订i z a t i o nr a t eo f9 1 u c o s e 图r e s i d u a l9 1 u c o s ec o n c e n t r a t i o n 闲闷闷闲阏闲闲圈 _ _恩慰闲闲闲图 一 ，f雨闲闲圈 ，| l1f网闲圈 _ j，f雨图 _ l 图 江南大学硕士学位论文营报鸯扛# 茁w s i 2 4 生产透明质酸的发酵条件矸究 3 b 捌 善 甾 喀 s 刿 1 ； 。，“删 3 04 0j o6 08 01 0 0 初始葡萄耱浓度( g ，l ) 00 8 o0 7 5 00 7 o0 6 5 00 6 图2 4 不同初糖浓度对h a 产量的影响 f 谵u r e2 4e f 记c to f d 讯鼍r e mi n i t i a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no nh a ) i e i da n dy ，c h a 团y 2 3 3 氮源对透明质酸发酵的影响 兽疫链球菌不能完全自身合成核苷酸仁7 。3 0 l ，所以需要保证充足的核菅酸，特 别是合成u d p 所需的u m p 的供给，微生物才能正常代谢、合成h a ；同时，由 于多种氨基酸的缺陷，外源氨基酸必须均衡全面，细胞才能正常生长，各种酶 系才能发育正常。氮源不仅为菌体生长提供氮元素，而且大多数有机氮源还能 提供多种必需的生长因子。国外有报道用化学合成培养基1 2 “与酵母粉为氮源垮 养基比较，发现在化学合成培养基中菌体生长速率较低。目前国内大多采用有 机物作为氮源，如蛋白胨，酵母膏，酵母粉等，不同菌株对于氮源的利用情况 相差也很大。姚敏杰等【2 2 】发现对于马链球菌( ，e p f o c o c c “se q “一n 2 5 0 6 ，蛋白胨 是最好的氮源。在前人研究成果的基础上，本文选择酵母粉和蛋白胨为发酵培 养基的氮源。蛋白胨主要供给有机氮化合物，同时也提供一些维生素和碳水化 合物；酵母粉中含有大量的b 族维生素、氨基酸及嘌呤等。表2 2 为不同氮源 对菌体生长及 l a 合成的影响，表中数据表明采用酵母粉为氮源较有利于菌体生 长及h a 合成。 由表2 2 中的数据还可以看出，在所考察的浓度范围内，l og 几蛋白胨较有 利于h a 的生产，可能是由于较高的c 烈有利于菌体生产h a 。研究所用菌种的 t c a 循环不完全对营养要求较高，考虑到酵母粉中含有大量菌体生长所需的 维生素及生长因子，可能会起到促进菌体生产产物的配合作用，于是在以5 0g 儿 葡萄糖作为碳源，l og ，l 蛋白胨作为氮源的前提下，加入不同浓度的酵母粉，考 察其对菌体生长及产物合成的影响。表2 3 为不同浓度酵母粉的添加对菌体生长 及h a 台成的影啊。表中数据表明，l og ，l 酵母粉的添加对菌体生长及h a 台成 均产生了促进作用，菌体量由33g ，l 提高到3 5g l ，h a 产量由1 4g l 提高到 第二章兽疫链球菌w s h 2 4 发酵法生产透明质酸的摇瓶发酵条件研究 第7 1 7 页 1 6q ，l 。 表2 2 不同氮源对h a 合成及菌体生长的影响 t a b j e2 2e 肫c to f d i m r e n tn i t r o g e ns o u r c e so nh ay i e 】da n dc e j l g r o 叭h 表2 3 不同酵母粉浓度对h a 合成及菌体生氏的影响 t a b l e2 3e 恐c to f d i 行e r e n tm i a ly e a s te x t r a c tc o n c e n t r a t i o no nh ay i e l da n dc e l lg r o w t h 考虑到同时满足菌体生长的需要及提高h a 产量，采用1 0g l 蛋白胨和1 0 g l 酵母粉为混合氮源进行摇瓶发酵较为合适。 2 3 4c n 对透明质酸发酵的影响 因为正交试验的限制，我们无法判断碳元素与氮元素对响应指标是否独立， 即二者之间是否存在交互作用。考虑到碳源、氮源对菌体构成的重要影响以及 不必要的时间、资源消耗，所以设计了不同的碳氮比进行试验。表2 4 为不同 c ，n ( c 元素和氮元素之比) 对菌体生长及h a 合成的影响。表中数据表明较高c 小 有利于发酵的进行，这与2 2 3 中的研究结果相统一，即选用1 0g l 蛋白胨和1 0 g l 酵母粉为混合氮源进行摇瓶发酵较为合理。 江南大学硕士学位论文兽疫涟球菌煳4 生产透明廊睃的发酵条件研究 表2 4 不同c m 对h a 台成及菌体生长的影响 t a b l e2 4e 艉c to f d i 雕r e n tc 刖o nh ay i e l da n dc e l lg r o 叭h 2 3 5m 9 2 + 浓度对透明质酸发酵的影响 表2 5 为不同m g ”浓度对h a 产量的影响。由表中数据可以看出，m 矿浓 度对h a 的产量有很大影响随着m g s 0 4 7 h 2 0 用量的增大，h a 的产量呈增高 趋势，当其浓度高于2 og l 之后，h a 产量的变化呈相反变化，可见，m g s 0 4 7 h 2 0 用量为2 o2 l 较有利于h a 生产。 对细胞来说，众多的金属离子当中，m 矿+ 是最为重要的一种，它是许多酶 活性中心不可缺少的一部分。在e m p 途径之中，磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激 酶的催化下形成烯醇式丙酮酸和a t p ，是e m p 途径的一个限速步骤，而m g 对于丙酮酸激酶来说是必不可少的阻”i