（发酵工程专业论文）发酵法生产十五碳二元酸.pdf

摘要 摘要 麝香是药中珍品，又是一种极为重要的香料。天然麝香量少价高，主要成分为3 - 甲基环十五酮( 人工麝香) ，以十五碳二元酸( d c a l 5 ) 为原料通过化学合成可得到人工麝 香，得率高、成本相对较低，可大量生产，并可替代天然麝香。因此研究开发高纯度 d c a l 5 的发酵生产技术具有现实意义。 本论文对d c a l 5 生产菌株热带假丝酵母( c a n d i d at r o p i c a l i s ) 进行了选育，研究 其摇瓶发酵条件和发酵技术，通过代谢调控，进一步强化仅，0 3 氧化能力、弱化p 氧化能 力，并对d c a l 5 提取纯化工艺进行研究。 以c t r o p i c a l i s0 7 2 为出发菌株，经紫外线、亚硝酸诱变和氯丙嗪平板筛选，筛选得 到一株遗传特性稳定的d c a l 5 生产菌株c t r o p i c a l i s4 1 0 ，d c a l 5 产量达1 7 5 0g l ，烷烃 转化率达2 9 6 3 ，d c a l 5 产量和烷烃转化率均比出发菌株提高4 5 。 对c t r o p i c a l i s4 1 0 生产d c a l 5 的摇瓶发酵条件及发酵培养基进行优化。确定其摇瓶 发酵条件：挡板三角瓶( 2 5 0m l ) ，装液量2 5m l 2 5 0m l ，转速1 8 0r m i n ，接种量8 ( v v ) 。 在单因素试验基础上，利用均匀设计法，并借助m a t l a b 7 1 对数据进行统计分析，得 到发酵培养基：尿素o 5g l 、乙酸钠3 7g l 、k h 2 p 0 49 1g l 、酵母膏1g l 、玉米浆粉 1g l 、n a c l1g l 。在此优化条件下，d c a l 5 产量达2 9 3 2g l ，比初始条件下提高了6 7 5 ； 转化率达3 5 4 6 ，比初始条件下提高1 6 4 4 。 对c t r o p i c a l i s4 1 0 生产d c a l 5 进行代谢调控。考察a ，氧化促进剂、p 氧化抑制剂 对发酵的影响，初步探索生长代谢与产物合成代谢的关系。最后确定，1 2h 添加o 5g l g t ，1 0 氧化促进剂苯巴比妥，2 4h 添加2g lp 氧化抑制剂丙烯酸，4 8h 添加1 0g l 蔗糖，d c a l 5 产量达3 8 8 2g l ，比初始条件下提高3 2 4 0 ，转化率达4 1 0 8 ，比初始 条件下提高1 5 8 0 。并在7 l 罐上确定p h 梯度上升调控策略，即从第2 4h 开始，每隔 1 2 hp h 上调o 1 。 优化d c a l 5 提取纯化条件：破乳静置发酵液p h 7 ，添加10g l 活性炭及1 5 h 2 0 2 除色除菌体蛋白，6 0 ，p h 9 0 水洗涤活性炭滤饼，将发酵液加热到8 0 后再调p h 2 3 结晶。采用优化后的提取工艺，d c a l 5 得率达9 6 ，纯度达9 5 以上 关键词十五碳二元酸，热带假丝酵母，p 氧化，a ，氧化 a b s t r a c t ，_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ 。_ - _ 。_ 。_ 。_ - _ 。_ _ _ - 。_ _ _ 。- _ 一 a b s t r a c t m u s ki sn o to n l yat r e a s u r ei nt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n eb u ta l s oa ni m p o r t a n t p e r f u m e n a t u r a lm u s ki s r a r ea n de x p e n s i v e ，w h o s em a i nc o m p o n e n ti s3 - m e t h y l c y c l o p e n t a d e c a n o n e c h e m i c a ls y n t h e s i s f r o mp e n t a d e c a n e d i a c i d ( d c a l 5 ) h o l d s c h a r a c t e r i s t i c so fh i g hy i e l da n dl o wc o s t t h ek e yp o i n to ft h i sr e a s e r c hi sh o wt or e d u c et h e c o s to fh i g h p u r i t yd c a l s d e v e l o p m e n to fp r o d u c t i o no f1 1 i g hp u r i t yd c a l sh a sp r a c t i c a l s i g n i f i c a n c e n l i sp a p e rf o c u s e do nb r e e d i n gd c a is - p r o d u c t i o ns t r a i nc a n d i d at r o p i c a l i s ，t h e c o n d i t i o no fs h a k i n gf l a s ke x p e r i m e n t ，t h ew a y sh o wt os t r e n g t h e n0 l ，o x i d a t i o na n dw e a k e n 1 3o x i d a t i o nb ym e t a b o l i cr e g u l m i o na n de x t r a c t i o no fd c a l 5 1 1 1 em u t a n ts t r a i nct r o p i c a l i s410w i t hs t a b l eg e n e t i cc h a r a c t e r , w h i c hh a db e e nt r e a t e d w i t l lu va n dn i t r o u sa c i d w a si s o l a t e dw i t he f f e c t u a ls c r e e n i n gm e t h o df r o mt h e t r i d e c a n e d i o i ca c i d p r o d u c i n gs t r a i nc a n d i d at r o p i c a l 西0 7 2 1 1 1 ey i e l do fd c a lsw a s16 2 0 g la n dt h ec o n v e r s i o nr a t eo fa l k a n ew a s2 9 6 3 丑圮s u t i a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eu s i n go fb a 用e dc o n i c a lf l a s k ( 2 5 0m e ) ，v o l u m e o fm e d i 啪2 5m l 2 5 0m 1 t h es p e e do fs h a k e r18 0r m i n , t h ei n o c u l 啪s i z e8 ( v v ) t h eu n i f o r l t l d e s i g na n d 嗄a t l a b 7 1w e r ee m p l o y e dt oo p t i m i z et h ef e r m e n t a i o nm e d i u mb a s e do ns i n g l e f a c t o rt e s t t h eo b t a i n e do p t i m a lm e d i u mw e r ea sf o l l o w s ，u r e a0 5g l ，m o n o b a s i cp o t a s s i u m p h o s p h a t e 9 1g l ，s o d i u ma c e t a t e3 7g l ，y e a s te x t r a c t1g l ，c o ms t e e pl i q u o rlg l 1 1 1 ey i e l d o fd c a i sw a s2 9 3 2g la n dt h ec o n v e r s i o nr a t eo fa l k a n ew a s3 5 4 6 u n d e rt h eo p t i m u m m e d i u m 1 h ee f f e c t so fbo x i d a t i o ni n h i b i t o ra n d0 t ，o x i d a t i o na c c e l e r a n ta n dt h er e l a t i o nb e t w e e n g r o w t h m e t a b o l i ca n dp r o d u c e m e t a b o l i cw e r es t u d i e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ，a d d i n g o 5g lp h e n o b a r b i t a la t12h ，a d d i n g2g la c r y l i ca c i da t2 4ha n da d d i n g10g ls u c r o s ea t 4 8h ，玎1 ey i e l do f d c a l 5w a s3 8 8 2g la n dt h ec o n v e m i o nr a t eo f a l k a n ew a s4 1 0 8 u n d e rt h i s c o n d i t i o n n eo p t i m a lp hc o n t r o ls t r a t e g yw a sa l s oo b t a i n e d ，w h o s ep hw a si n c r e a s i n go 1e v e r y 1 2hf r o m2 4h 硼妮o p t i m a lc o n d i t i o n s f o rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fc a r b o x y l i ca c i d sf r o m f e r m e n t a t i o nb r o t h sw e r es t u d i e d t 1 1 er e s u l tw e r ea sf o l l o w s ，a d j u s t i n gt h ep ho ft h e f e r m e n t a t i o nb r o t ht oa b o u t7 0f o rd e m u l s i f i c a t i o n a d d i n g10g la c t i v a t e dc a r b o na n d1 5 h 2 0 2f o rd e c o l o r a t i o na n dd e p r o t e i n i z a t i o n ，w a s h i n ga c t i v a t e dc a r b o nf i l t e rc a k e 、v i m6 0 a n dp h 9 0w a t e r , c r y s t a l i n ga tp h 2 - 3w h i c hh a dh e a t e du pt o8 0 cf i r s t u n d e rt h eo p t i m a l c o n d i t i o n ，d c a i s 嘶t hap u r i t yo f o v e r9 5 a n day i e l do f 9 6 w a so b t a i n e d k e yw o r d sp e n t a d e c a n ed i a c i d ，c a n d i d at r o p i c a l i s ，po x i d a t i o ni n h i b i t o r , o , t oo x i d a t i o n i l 缩略词注释表 缩略词 a c o c a t c o t c p r c p t c y p d c a l 5 d c a l 6 f a l d h f a o n - c 1 5 p r r s t h i o l a s ei t h i o l a s e i i i 缩略词注释表 中文全称 酰基辅酶a 氧化酶 肉毒碱乙酰基移酶 肉毒碱辛酰基转移酶 n a d p h p 4 5 0 还原酶 肉毒碱棕榈酰转移酶 细胞色素p 4 5 0 酶 十五碳二元酸 十六碳二元酸 醛脱氢酶 醇氧化酶 十五烷烃 过氧化氢酶体增殖剂 乙酰乙酰辅酶a 硫解酶 3 一酮脂酰辅酶a 硫解酶 英文全称 a c y l c o e n z y m ea o x i d a s e c a n i t i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e c a n i t i n eo c t a n o y l t r a n s f e r a s e n a d p h c y t o c h r o m ecr e d u c t a s e c a n i t i n ep a l m i t o y l t r a n s f e r a s e c y t o c h r o m ep 4 5 0 p e n t a d e c a n ed i a c i d h e x a d e c a n ed i a c i d a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e f a t t ya l c o h o l o x i d a s e 刀p e n t a d e c a n e p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o ra c t i v a t e dr e c e p t o r s a c e t o a c e t y l c o at l l i o l a s e 3 - k e t o o a c y l c o at h i o l a s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是泰人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 长链二元酸( l o n gc h a i nd i c a r b o x y l i ca c i d ，简写为d c a i ，i 表示二元酸分子中碳原 子数目) 是指碳链中含有八个及以上碳原子的脂肪族二羧酸，且值、位都是羧基，其分 子简式是h o o c ( c h 2 ) n c o o h ，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工中间体【1 1 。 长链二元酸不存在于自然界中，目前主要由化学合成法和生物发酵法生产。发酵法 生产长链二元酸，以正构烷烃为原料，在常温常压下利用微生物特有的氧化能力和微生 物胞内酶的作用，生成相应链长的各种长链二元酸。正构烷烃是石油生产的副产物，供 应充足，发酵法以其为原料，克服了单纯的化学合成法以及植物油裂解制取方法的各种 不足，为长链二元酸的大量生产开辟了新的途径。 1 2 十五碳二元酸理化性质及应用 1 2 1 十五碳二元酸理化性质 十五碳二元酸( p e n t a d e c a n ed i a c i d ，简写为d c a l 5 ) ，又名十五烷二酸，是一种重要 的长链二元酸，其直链碳链中含有1 5 个碳原子，且、位都是羧基。结构简式为 h o o c ( c h 2 ) 1 3 c o o h ，分子结构如图1 1 所示。 冒冒 i li l h n 八八o h 图1 - 1d c a l 5 结构 f i g 1 1t h es 仃u c n a lo fd c a l 5 d c a l 5 纯品为白色结晶粉末，分子简式为h o o c ( c h 3 ) 1 3 c o o h ，分子量为2 7 2 3 8 ， 熔点为1 1 3 1 1 5 ，易溶于乙醚、乙醇、丙酮，不溶于水，但其钠盐易溶于水，在发 酵液中通常以钠盐存在，提取后才能得到纯品。 1 2 2 十五碳二元酸应用 长链二元酸及其衍生物可以用于制造高级香料、高性能尼龙工程塑料、高级润滑油 和耐寒性增塑剂等，工业用途十分广泛，是一种极为重要的精细化工中间体【1 1 。d c a l 5 主要用于香料行业和制药行业，用于合成环十五酮、环十五内酯和人造麝香酮，可以替 代天然麝香配置各种名贵中成药，具有抗菌消炎、通经活血等疗则3 4 1 。天然麝香日趋匮 乏，国家发展改革委员会指出，自2 0 0 5 年7 月1 日起，可以使用天然麝香的有漳少i 1 片 仔癀药业的片仔癀、北京同仁堂集团的安宫牛黄丸、上海雷允上药业和苏卅i 雷允上药业 的六神丸、厦门中药厂的八宝丹五家企业四个品种，其他中成药不得使用天然麝香，改 用等量的人工麝香。我国长链二元酸生物发酵研究的“领军人”中科院微生物研究所陈 远童研究员说，“这种合成的麝香酮完全可以代替天然麝香配制中成药，在医药上将有 广泛用途，对我国中医药走向世界具有十分重要的意义。 江南大学硕士学位论文 以d c a l 5 为原料，经酯化、醇酮缩合及还原反应合成环十五烷酮，再进一步引入甲 基生成3 甲基环十五酮，原料易得，操作简便，收率较高【4 1 。d c a l 5 合成赛可通、麝香 酮工艺简介如下【4 ，5 】：( 1 ) 酯化反应：d c a l 5 和过量的无水乙醇在浓硫酸催化下加热回流 生成正十五烷二元酸二乙酯；( 2 ) 环化反应：正十五烷二元酸二乙酯悬浮在溶剂中与熔 融态的金属钠反应，闭环形成环状羟基酮；0 ) 还原反应：环状羟基酮在冰醋酸和氢碘 酸溶液中直接还原得到环十五烷酮；( 4 ) 引入甲基：制得的环十五烷酮经d 位溴代、脱 溴化氢、然后在3 位上用格利来试剂引入甲基即成3 甲基环十五酮。 麝香酮( m u s c o n e ) ，化学名3 甲基环十五酮，分子式c 1 6 h 3 0 0 ，是天然麝香的主要成 分，具有幽雅的麝香香气，并持有甜润的动物香韵，主要用于高级化妆品、香精等，是 不可多得的定香剂，还可用于医药，具有兴奋中枢神经，增加心肌营养性血流量，改善 管脉的循环作用，口服无毒性。用麝香酮代替天然麝香制成的中成药用于治疗冠心病、 小儿高烧、急性肠胃炎、跌打损伤、五官科炎症、乳腺炎、淋巴结核、扁桃腺炎、腮腺 炎等疾病均收到良好疗效1 3 j 。 赛可通( c y c l o p e n t u d e c a n o n e ) ，化学名环十五烷酮，分子式c 1 5 h 2 8 0 ，具有甜而强的 麝香香气。药理研究表明：赛可通无皮肤吸收毒性，对皮肤无局部刺激作用，无致敏影 响。赛可通能增加耐缺氧能力，具有松弛血管肌的作用，特别对子宫肌的松弛作用尤为 明显。目前，赛可通主要在一些外用药中代替天然麝香，并取得良好的效果。由于赛可 通的价格远较天然麝香，麝香酮便宜，因此该产品的应用有着非常广阔的前途【3 ，4 】。 1 3 十五碳二元酸生产方法 1 3 1 植物油裂解制取十五碳二元酸 可裂解制取d c a l 5 的植物油主要有蓖麻油、菜籽油和蒜头果油。以蓖麻油为原料， 经高温裂解，然后通过溴代和丙二酸化、还原反应制得0 【，十三烷二醇，再经过溴代和 丙二酸反应制得d c a l 5 。以菜籽油为原料，用臭氧将其中的芥子酸氧化成十三碳二酸， 再以丙二酸二乙酯接长2 个碳链成为d c a l 5 。以蒜头果油为原料，经皂化、酸化提取其 中的脂肪酸，再经臭氧氧化成d c a l 5 。其中，蒜头果油被认为是合成d c a l 5 的理想原料。 蒜头果油的典型分子结构如图1 2 所示，以蒜头果油为原料合成d c a l 5 的简单工艺流程 如图1 3 所示1 5 j 。但是以蒜头果油为原料制取d c a l 5 ，纯度低，而且原料来源有限，提 取工艺复杂，难以大规模生产。 c 心o o o r l i c h o o c r a i c h 2 0 0c ( c h 2 ) 1 3 c h - = - c h ( c h a ) 7 c h 图1 2 蒜头果油中的脂肪酸三甘油酯结构 f i g 1 - 2t h es t r u c t r a lo ft r i g l y c e r i d ef a t t ya c i df r o mm a l a n ao l e i f e r ao i l 蒜头果油呈生脂肪酸盐垦壁生脂肪酸皇量重堡臭氧化中间俸兰重量墅生十五碳二元酸 图1 3以蒜头果油为原料d c a l 5 制取工艺 f i g 1 - 3p r o c e s so f p r e p a r i n gf o rd c a l 5f r o mm a l a n ao l e i f e r ao i l 2 星二雯堑笙 1 3 2 微生物发酵法生产十五碳二元酸 1 9 6 2 年，k e s t e r 和f o s t e r l 2 】首先观察到棒状杆菌( c o r j m e b a c t e r i u m7 e 1 c ) 能将正烷烃 分子的两末端氧化成饱和二元脂肪酸。1 9 7 3 年，g a l l o 6 1 等发现热带假丝酵母( c 口刀幽妇 t r o p i c a l i s ) 具有氧化烷烃的能力，该氧化反应不是简单的烷烃脱氢作用，它是在常温、常 压下通过c t r o p i c a l i s 胞内酶的作用氧化正构烷烃，生成与基质正烷烃相应链长的各种长 链二元酸。发酵法生产d c a l 5 具有原料来源丰富( 石油中的副产物一正构烷烃) ，生产条 件温和( 在常温、常压下生产) 、工艺简单、规模大、能耗低、产品纯度高、成本低和环 境污染小等优势，既解决了市场需求量大，又解决了化工合成所造成的严重环境污染问 题，弥补了植物油裂解制取d c a l 5 的不足。 1 4 十五碳二元酸国内外研究进展 发酵法生产二元酸的研究始于2 0 世纪6 0 年代初【2 】，中国和日本处于国际领先地位， 日本研究学者主要有：k e s t e r l 2 1 ，f o s t e r l 2 1 ，u e m u r a l 2 1 1 ，f u k u i 7 , 8 ，y 锄a u l u r a 【8 】，t a i l a k a 【8 】， k a w a m o t o 引，u e d a i 引，n o z a l ( i 【8 】等。国内研究学者主要有：沈永强【1 1 , 1 2 , 1 3 1 ，陈远童【1 9 】， 曹竹安 9 1 ，李元广，刘树臣1 9 1 ，许晓增【1 0 1 ，佟明友【1 0 1 等。关于长链二元酸发酵的研究主 要集中在菌种的筛选和诱变【1 1 , 1 2 】、发酵技术研列1 3 1 、产品的分离与纯化1 4 , 1 5 】、代谢途径 及相关酶系【8 , 1 6 】、利用基因工程构建高产工程菌株【1 7 , 5 9 1 ，但未见基因工程菌株用于工业 化生产的相关报道。 1 9 6 2 年，k e s t e r 和f o s t e r 2 】首先观察到棒状杆菌( c d ，= 胪p 6 口c 胞，f “聊7 e 1 c ) 皂将正烷烃 分子的两末端氧化成饱和二元脂肪酸，但是生成二元酸的量很少，而且大都只积聚短碳 链二元酸。19 7 9 年，沈永科1 1 , 1 2 , 1 3 】等连续报道发酵生产d c a l 5 的研究结果，他们用一株 热带假丝酵母突变株n 1 5 ，从n c 1 5 发酵生产d c a l 5 ，实验室摇瓶发酵8d ，d c a l 5 产 量达到7 7 2g l ；1 9 8 0 年，用高浓度的休止细胞转化刀c 1 5 生产d c a l 5 的试验l 删，1 0 0h ， d c a l 5 产量达到1 0 9g l 。1 9 8 5 年，u e m u r a l 2 1 】报道用一株热带假丝酵母从n c 1 5 生产 d c a l 5 ，在3l 发酵罐中发酵1 0 0 1 1 0h ，d c a l 5 产量达到9 0g l 。1 9 9 5 年，陈远童等1 1 9 j 进行发酵生产d c a l 5 的研究，实验室摇瓶发酵4d ，d c a l 5 达到7 3 5g l ，1 6l 罐扩试， 发酵7d ，d c a l 5 达到1 3 0g l ，在2 5 0 0l 罐上，发酵5d ，d c a l 5 高达1 8 0 5g l 。1 9 9 6 年，c h a n 5 5 j 以铜绿假胞菌( p s e u d o m a n a sa e r u g i n o s a ) 生产d c a l 5 ，发现3 ( v v ) t w e e n8 0 可以使d c a l 5 产量提高1 6 倍，但是发酵液中高浓度d c a l 5 却影响d c a l 5 的分泌，作者 通过休止细胞转化实现d c a l 5 的连续生产，并使d c a l 5 产量进一步提高4 倍。 1 9 9 9 年和2 0 0 2 年，淄博广通公司和上海凯赛公司先后转让中国科学院微生物研究 所的长链二元酸生物合成技术在山东淄博龙泉地区和济宁地区建成两座千吨级规模生 物合成工厂，2 0 0 6 年3 月，在江苏省淮安市耸立起第3 座千吨级规模的长链二元酸生物 合成工厂。2 0 0 6 年9 月，在江苏省南通市建立起第4 座千吨级规模的长链二元酸生物合 成生产工厂，中科院微生物所的混合长链二元酸专有技术落户于南通圣诺鑫生物高科技 公司。到2 0 0 6 年底，4 座千吨级规模的d c a l 5 生物合成工厂总生产能力超过1 万吨 年，形成一个我国独有的、原创性的、环保型的民族新产业，使我国成为当今国际上唯 3 江南大学硕士学位论文 一能够应用生物合成技术实现长链二元酸大规模工业化生产的国家，产品远销欧美和日 本【i s 。 近年来，微生物发酵法生产长链二元酸技术有了很大的提高，正逐步发展成一个新 兴产业，主要得益于以下几方面的进步。 1 4 i 长链二元酸生产菌种 长链二元酸是微生物两端氧化正烷烃的中间代谢产物，酵母菌【6 】、细菌【2 】、霉菌有 不同程度氧化正烷烃产生长链二元酸的能力，酵母菌中尤其是假丝酵母属( c a n d i d a ) 的酵 母菌是正烷烃生产二元酸的高产微生物，主要是c t r o p i c a l i s s l l j 和阴沟假丝酵母( 劬刀幽妇 c l o a c a e ) t 2 2 1 。目前，国内外用于发酵生产长链二元酸研究和工业生产的假丝酵母都是 c t r o p i c a l i s 1 9 1 。 野生菌株d 氧化能力强，难以积累同底物相同链长的二元酸，一般对野生菌株诱变 得到1 3 氧化能力减弱的突变株。常用的诱变方法有紫外线诱变和亚硝酸诱变等【1 9 】，除传 统的诱变方法外，还有新的诱变源离子束，离子注入微生物细胞会呈现不同于辐射生物 学的特征，杨艳裴【3 6 】经两次n + 离子注入对c t r o p i c a l i s 进行诱变，筛选到高产突变株， 产酸量由2 9 7 7g l 增加到7 3g l ：沈永强等1 1 2 】用秋水仙素和樟脑进行多倍体的诱变育 种，产量由1 0g l 提高到1 8g l 左右；还可以采用细胞融合技术，陈金春等【37 j 采用电 融合法获得高温高产长链二元酸酵母菌。随着分子生物学在微生物学中的应用，代谢工 程为烷烃发酵菌种改良带来新的生机。目前已研究清楚热带假丝酵母在代谢烷烃过程 中，细胞色素p 4 5 0 是氧化的关键酶，增加该酶的表达可以促进产物形成；酰基辅酶 a 氧化酶是长链二元酸降解的限速酶，阻断此酶表达可以抑制产物降解1 5 6 j ；1 9 9 2 年， p i c a t a g g i o 等【5 9 】构建一株c t r o p i c a l & ，编码该酵母酰基辅酶a 氧化酶同工酶的四个基因 均被敲除，d 氧化完全被阻断，烃酸转化率达到1 0 0 ，作者又增加细胞色素p 4 5 0 和 n a d p h p 4 5 0 还原酶的表达，强化氧化，使得其长链二元酸产量进一步提高3 0 。 脂酰辅酶a 的转运是d 氧化中的重要环节，这一环节中起到关键作用的就是肉毒碱酰基 转移酶，阻断此酶表达亦可以提高烃酸转化率。高弘等m 】构建了肉毒碱酰基转移酶基因 单拷贝缺失和双拷贝缺失，并对基因重组菌的生长及产酸特性进行研究，发现肉毒碱酰 基转移酶基因双拷贝缺失菌不能够代谢烷烃，肉毒碱酰基转移酶基因单拷贝缺失菌肉毒 碱酰基转移酶酶活降低，d 氧化减弱，减少了烷烃的无谓消耗。人们试图寻找各种代谢 调控方式来改造这些关键酶系的编码基因，但至今未见工程菌用于长链二元酸生产的报 厶 垣。 长链二元酸发酵培养基需要碳源、氮源、生长必需的无机盐及微量生长因子等。沈 永强等【l3 j 发现乙醇、可溶性淀粉、尿素、磷酸氢二铵等为较好的碳、氮源。当存在适量 尿素( o 1 ) 时，长链二元酸大量合成，但当尿素量增至o 2 以上时，长链二元酸基本不 积累，但短链二元酸，主要是庚二酸有所增加 4 3 , 4 4 1 。沈永强等【1 3 】还发现，磷酸二氢钠为 0 1 - - - 0 2 ，磷酸氢二钾为0 4 加6 对长链二元酸积累较好。p a u l 等1 4 l j 用玉米浆粉和 酵母膏作为碳、氮源。玉米浆粉和酵母膏价格便宜适合工业化生产，而且还含有氨基酸、 维生素等微量元素，这是纯的葡萄糖等碳氮源所没法提供的。酵母膏对增加酸产量是必 4 墨二皇丝堕 要的，其最适质量分数为0 0 5 0 , - 0 10 ，超过此即限度产酸量减少；最适宜的镁离子质 量分数为0 0 5 ，如果镁离子缺乏，酸产量可下降约7 5 。 1 4 2 代谢途径及相关酶系 c t r o p i c a l i s 可以利用烷烃作为碳源，烷烃被吸收进入细胞后，首先在微粒体中被细 胞色素p 4 5 0 酶系( 细胞色素p 4 5 0 单加氧酶和细胞色素还原酶) 氧化生成a 元醇，a 元醇 再进一步由醇氧化酶和醛脱氢酶催化氧化成一元酸。接着，a 元酸再在相同酶系的催化 经过氧化生成目的产物二元酸。此外，在q 、氧化过程中生成的一元酸和二元酸都 可以被肉毒碱酯酰转移酶转移进入过氧化物酶体中经过p 氧化生成乙酰辅酶a 。乙酰辅 酶a 进入t c a 循环，为细胞生命活动提供能量。所以利用c t r o p i c a l i s 生产长链二元酸， a 、氧化是一个需要增强的代谢途径，而p 氧化是需要削弱的代谢途径。 1 4 2 1 氧化途径及相关酶系 c t r o p i c a l & 的氧化过程主要涉及的生化反应由细胞色素p 4 5 0 酶系 ( c y t o c h r o m e p 4 5 0 ，简写为c y p ) 、醇氧化酶( f a t t ya l c o h o lo x i d a s e ，简写为f a o ) 和醛脱 氢酶( a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，简写为f a l d h ) 等催化完成【删。 c y p 参与催化对烷烃末端碳原子进行单加氧的羟化反应，反应在细胞内的微粒体中 发生田】。c y p 催化的一般反应过程为： n a d p h + h + + 0 2 + r h n a d p + + h 2 0 + r o h 这个催化过程同时还需要n a d p h p 4 5 0 还原酶( n a d p h c y t o c h r o m ecr e d u c t a s e ，简 写为c p r ) 的协助。c p r 的主要功能是为c y p 传递电子，与c y p 同为氧化过程中的 限速酶。c y p 是一种以铁卟啉原作为辅基的血红素蛋白，其种类繁多，可以利用多 种不同的底物【2 9 】。b e r t r a n d 3 0 】等指出c p r 是一种以f a d 、f m n 为辅基的黄素蛋白，在 电子传递过程中发挥主导作用p 0 1 。通过电子传递作用，c y p 可以对底物进行循环催化【3 0 1 。 b e r t r a n d 【3 0 j 等还发现c y p 在以烷烃为底物时含量比以葡萄糖为底物时高出2 0 倍。当底 物与c y p 结合后酶上的铁原子接受一个电子，形成还原型复合物。复合物与氧分子结 合后，铁原子重新被氧化。形成的氧化型复合物接受另一个电子及两个质子，形成一个 新的复合物，此复合物失去一分子水，并将氧原子传递给底物。氧化后的底物被释放后， 游离c y p 可进入下一个循环【2 引。 c y p 是氧化的关键酶，其活力的提高必然会提高细胞的产酸能力。在种子培养 基中( 或发酵的生长阶段) 加入烷烃可以诱导c y p 酶活的提高。在烷烃代谢中充当重要作 用的c y p 也是一个细胞的“解毒 工具。在高浓度的烷烃条件下，由于烷烃本身并不 利于细胞的生长，但是却促进了c y p 的表达1 2 3 , 2 9 1 。此外，巴比妥盐类和过氧化氢酶体 增殖齐t j ( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o ra c t i v a t e dr e c e p t o r s ，p p a r s ) 对c y p 也有诱导作用。19 9 6 年，o h t o m o 等【6 1 1 首次报道p p a r s 对低等真核生物麦芽糖假丝酵母( c a n d i d am a l t o s a ) c y p 的诱导作用。f e ”可以提高c y p 酶活1 2 引。 1 4 2 2b 氧化途径及相关酶系 c t r o p i c a l & 降解长链二元酸的d 氧化酶系包括酰基辅酶a 氧化酶( a c y l c o e n z y m ea o x i d a s e ，简写为a c o ) 、烯酰辅酶a 水合酶( e n o y l c o ah y d r a t a s e ) 、3 羟基脂酰辅酶a 脱 江南大学硕士学位论文 氢酶( 3 一h y d r o x y a e y l - c o ad e h y d r o g e n a s e ) 、3 一酮脂酰辅酶a 硫解酶( 3 一k e t o o a c y l c o a t h i o l a s e ，简写为t h i o l a s e l i i ) 和乙酰乙酰辅酶a 硫解酶( a c e t o a c e t y l c o at h i o l a s e ，简写 为t h i o l a s ei ) 【2 4 ，2 5 ，3 1 1 。此外，一些相关酶包括酰基辅酶a 合成酶、肉毒碱酰基转移酶 ( c a m i t i n ea c y l t r a n s f e r a s e ) 等。p 氧化的场所在过氧化物酶体1 3 。 在c t r o p i c a l i s 中，a c o 是长链二元酸降解的限速酶，缺失a c o 基因的c t r o p i c a l i s 产酸水平明显升高【2 7 ，2 引。1 9 7 9 年，s h i m i z u 等【2 8 1 对a c o 酶学性质进行研究，指出a c o 是一种黄素蛋白，每摩尔a c o 含8 摩尔f a d 。a c o 可催化棕榈酰辅酶a 和氧气生成 十六烷酰辅酶a 和过氧化氢，a c o 可作用于钆2 0 碳的酰基辅酶“2 8 j 。丙烯酸是a c o 的反竞争性抑制剂，k i 为0 6 3 3m m o l l ；维生素c 是a c o 的竞争性抑制剂，k i 为2 0 1x 1 0 弓 m m o l l 。这两种抑制剂可以应用于长链二元酸的发酵，丙烯酸为反竞争抑制作用，提高 产量的程度可能有限；而维生素c 有强烈的抑制作用，且价格便宜，考虑用于长链二元 酸的发酵实验。金属离子a 矿和p b 2 + 完全抑制a c o 活性，而b a 2 + ，c a 2 + 和m 9 2 + 有明显 抑制作用。非离子型表面活性剂对a c o 都有不同程度的抑制作用1 2 7 。 在c t r o p i c a l i s 代谢长链烷烃的过程中，脂肪酸的p 氧化是降低烷烃转化率的主要因 素。脂酰辅酶a ( a e y l c o a ) 的转运是d 氧化中的重要环节，这一环节中起到关键作用的 是肉毒碱脂酰转移酶。肉毒碱脂酰转移酶是一族酶，它包括：肉毒碱乙酰基转移酶 ( c a n i t i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e ，简写为c a t ) 、肉毒碱辛酰基转移酶( c a n i t i n e o c t a n o y l t r a n s f e r a s e ，简写为c o t ) 和肉毒碱棕榈酰转移酶( c a n i t i n ep a l m i t o y l t r a n s f e r a s e ， 简写为c p t ) 。在脂酰辅酶a 的转运过程中，三种肉毒碱脂酰转移酶有选择地催化不同 碳链长度的底物1 6 2 j 。 19 7 8 年，k a w a m o t o 等【8 】指出在c t r o p i c a l i s 中，肉毒碱酰基转移酶作为酰基辅酶a 梭体，同时存在于过氧化物酶体和线粒体的膜上。因为，长链二元酸氧化的最终产物( 乙 酰辅酶a ) 和中间产物( 一些短链酰基辅a ) 不能通过过氧化物和线粒体的膜，而肉毒碱酰 基转移酶能可逆地催化2 “碳的酰基辅酶a 生成相应的酰基肉毒碱，酰基肉毒碱可以通 过过氧化物和线粒体膜，从而实现酰基辅酶a 在过氧化物和线粒体之间的转运，促进脂 肪酸b 氧化的进行。降低肉毒碱酰基转移酶酶活，可以减少长链二元酸在1 3 氧化中的无 谓消耗，从而使烷烃的摩尔转化率得到了提高。 c p t 包括存在于线粒体外膜上的c p ti 和存在于线粒体内膜上的c p ti i 。k e m e r 等【6 5 】指出c p t i 的活性受丙二酰辅酶a 的抑制。c o t 的活性也受丙二酰辅酶a 的抑带j j 6 2 】。 1 9 8 7 年，k u r i h a r a 等【3 2 】对硫解酶的位置及作用进行研究，发现硫解酶有三种 t h i o l a s ei ，t h i o l a s ei i 和t h i o l a s e l i i ，t h i o l a s ei 是乙酰乙酰辅酶a 硫解酶，作用于乙酰乙 酰辅酶a ，t h i o l a s ei i ，t h i o l a s e l i i 是3 一酮酰辅酶a 硫解酶，作用于长链3 酮酰辅酶a 。 k u r i h a r a 等【3 2 】指出脂肪酸降解成乙酰辅酶a 需要硫解酶的参与，b 氧化发生在过氧化物 酶体中。k a n a y a m a 3 5 】等发现培养基中有丁酸或烷烃对t h i o l a s e l i i 有强烈的诱导作用，但 t h i o l a s ei 是组成酶，烷烃对其诱导作用不明显。u e d a t 乃j 等发现缺乏t h i o l a s e l i i ，会增加 t h i o l a s ei 及过氧化物本酶体中其它蛋白的合成。而缺乏t h i o l a s ei 则没有什么影响。 t h i o l a s e l i i 贡献比t h i o l a s ei 大。由烷烃氧化所得的脂肪酸的降解主要由t h i o l a s e l i i 负责。 6 蔓二童堕丝 k a m 绷1 3 4 】等运用免疫电泳显微镜法，指出t h i o l a s ei ，t h i o l a s e l l l 只存在于过氧化物体 中，进而说明b 氧化只存在于过氧化物体中。 2 0 0 1 年，h a r a 等【7 l 】构建一株c t r o p i c a l i sm 1 2 1 0 a 3 ，指出a c o 的表达与长链二元 酸产量没有必然联系。并指出编码t h i o l a s e l i i 基因的缺失也没有导致长链二元酸产量的 提高。而酰基辅酶a 合成酶表达量降低，长链二元酸产量提高。 1 4 3 发酵技