（发酵工程专业论文）低温脂肪酶高产菌株的筛选、鉴定及其发酵产酶条件的优化.pdf

摘要 低温酶在理论研究和工业应用上的双重意义使其成为近年来研究的热点。低温 酶大都由低温微生物产生，从低温环境中开发有价值的产酶微生物对丰富低温酶资 源具有重要意义。本论文通过t w e e n 8 0 平板法与橄榄油油脂同化平板法的结合从 肉联厂低温冷库和家用冰箱中共筛出8 9 株产脂肪酶的菌株，再通过p - n p p 分光光 度比色法复筛，证明有9 株菌可产低温脂肪酶，并最终获得了一株高产低温脂肪酶 菌株u p 3 5 。在此筛选过程中，对两种初筛方法进行了比较，最终确立了一套快速、 简便，精确度高的低温脂肪酶筛选方法。 对菌株u p 3 5 进行鉴定，分别在光学显微镜和扫描电镜下观察了菌体形态、大 小等，对其在t w e e n 8 0 平板和营养琼脂平板上的单菌落形态、大小、颜色等进行 了描述；通过一系列生理生化试验及1 6 s r n a 保守序列的分析，将此菌株初步鉴定 为假单胞菌( p s e u d o m o n a sl p 3 5 ) 。 在摇瓶发酵水平上，对假单胞菌l i p 3 5 的发酵产酶条件进行了研究，确定了其 最佳培养基成分及最佳培养条件。研究了不同碳源、氮源、无机盐、产物、底物等 因素对假单胞菌l i p 3 5 产酶的影响，发现酵母膏、豆粕粉、n a c i 、t w e e n 8 0 浓度对 产酶的影响较大。对酵母膏、豆粕粉、n a a 、t w e e n 8 0 四因素各选取三个水平进 行正交试验，确定假单胞菌l i p 3 5 产酶的最佳培养基成分为酵母膏0 9 ，豆粕粉 6 0 、n a c l0 1 、t w e e n 8 0o 5 。通过摇瓶发酵试验，确定其最佳培养条件为： 摇床2 0 ，2 5 0r m i n ，发酵培养基的起始p h 为9 5 ，接种量为菌浊度o i ) 6 0 0 在2 1 0 0 2 4 0 0 之间的菌悬液5 ( v v ) ，装液量为4 0m i 3 0 0m l ，培养6 7h 。在此条件下 培养，低温脂肪酶酶活力达5 8 9u m l ，比优化前提高了3 5 4 0 倍。 对菌株u p 3 5 的发酵粗酶液进行了酶学性质探讨，结果表明该低温脂肪酶的最 适催化温度为2 0 ；对热敏感，6 0 以上处理5m i n ，酶活性仅残留1 0 。该酶 催化的最适p h8 0 ，适宜催化的p h 范围在7 5 8 0 ，较窄，属于碱性脂肪酶；在 不同p h 下的稳定性试验显示，该酶在p h6 o 9 0 内均较稳定。金属离子中，k + 对酶有较大的抑制作用，使酶活性降低约5 0 ，c a 2 * 则对酶有显著的激活作用，可 将酶活性提高3 倍以上，但e d t a 试验证明，它并不是c a 2 + 依赖酶。 关键词：低温脂肪酶；筛选；菌株鉴定；假单胞菌；产酶优化；酶学性质 s c r e e n i n ga n dc l a s s i f i c a t i o nf o rh i g hc o l d - a d a p t e dl i p a s e p t o d u c i n gs t r a i n sa n d o p t i m i z a t i o no fi t sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s a u t h o r x i a o - s h a0 i e s u p e r v i s o r ：y m g - m i nj i a l v t a j o r f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g a b s t r a c t c o l d - a d a p t e de n z y m e sh a v er e c e n t l yr e c e i v e di n c r e a s i n g l ya t t e n t i o n , d u et ot h e i s r e l e v a n c ef o rb o t hh a s i ca n da p p u e dr a s c a r c h m o s to ft h e mw e r ep r o d u c e db y l o w - t e m p e r a t u r em i c r o o r g a n i s m i t sv e r ys i g n i f i c a t i v e t o e x p l o i t u r e v a l u a b l e e n z y m e - y i e l d i n gm i c r o b e so fl o w - t e m p e r a t u r ee n v i r o n m e n tf o re n r i c h i n gt h er e s o u r c eo f c o l d - a d a p t e de n z y m e s i nt h i st h e s i s 8 9l i p a s e - p r o d u c i n gb a c t e r i a ls t r a i n sw e r ei s o l a t e d f r o m r e f r i g e r a t o r yw h i c hs t o r e sm e a tb yt h ec o m b i n a t i o no ft w e a n 8 0a g a ra n do l i v e o i la g a r , i nw h i c h ，t h eh p a s e so f9s t r a i n sw e r e 呻v c dt ob ec o l d a d a p t e dl i p a s eb yt h e r e p e a t e ds c r e e n i n go fp n p p f i n a l l y , n eh i g h p a s e - p r o d u c i n gs t r a i nl i p 3 5w a s i s o l a t e d t h r o u g hc o m p a r a t i o no ft h et w os c r e e n i n gm e t h o d s as i m p l i e r , f a s t e ra n dm o r e p r e c i s es c r e e n i n gm e t h o dw a se s t a b l i s h e d t h es t r a t ai j p 3 5w a si d e n t i f f e d t h r o n g ho 口t i cm i c r o s c o p ea n ds c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e ，t h el i p 3 5 sm o d a i t y , s i z ew e r eo b s e r v e d m o d a f i t y , s i z e ，c o l o ro fc o l o n y b o t hi nt w e e n a g a ra n da g a rw e r ed e s c r i b e d t h r o u g ht h et r a d i t i o n a lp h y s i o l o 西c a la n d b i o c h c m j c a dt e s t , t o g e t h o rw i t ht h e1 6 s r n as e q u e n c ea n dp h y l o g e n e t ca n a l y s i s 。t h e s t r a i nl i p 3 5w a sf i n a l l ya s c e r t m n e dt ob e p s e u d o m o n a s ( p s e u d o m o n a su p 3 5 ) t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f p s e u d o m o n a sl i p 3 5 ，i n c l u d i n gc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e n s o t l i c e ，i n o r g a n i cs a l t , s u b s t r a t e s ，p r o d u c t sa n ds oo n ，w e r ei n v e s t i g a t e di ns h a k ef l a s k l e v e l i tw a sf o u n dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o n so fy e a s t - e x t r a c t , s o y b e a np o w d e r , n a c i ， 1 w 啪一8 0h a dt h em o r eo b v i o u si n f l u e n c e s t h eo r t h o g o n a lt e s to ft h ef o n rf a c t o r s s h o w e dt h a tt h eo p t i m i z e dc u l t u r em e d i u mw a s ：y e a s t - e x t r a c t0 7 s o y b e a np o w e t6 0 ，n a c io 1 ，1 w e e n 一8 00 5 t h r o u 2 bs h a k ef l a s ke x p e r i m e n t s ，i tw a sa c q u i r e dt h a t t h eb c s tc u l t u r ec o n d i t i o n s ：p h9 5 ，2 0 ，2 5 0r m i n ，4 0m l b 0 0m la n d5 ( v v ) o f b a c t e r i u mc u l t u r e ( o d 6 0 022 1 0 0 - 2 4 0 0 ) ，f o r6 7h u n d e rs u c hc o n d i t i o n s ，t h el i l 2 i a s c a c t i v i t yr e a c h e d5 8 9u m lw h i c hw a s3 5 mt i m e so ft h ei n i t i a ls u a i n 1 1 l i p a s ec h a r a c t e r so ft h ef e r m e n t a t i o nf i q u i dw a sr e s e a r c h e 正o b t a i n e dr e s u l t s h o w e dt h a t ：t h eo p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo fl i p 3 5 sc o l d a d a p t e dl i p a s ew a s2 0 a n dt h ee n z y m ew a st h c r m a ll a b i l i t y , o n l y1 0 o fi t sa c t i v i t yw a sr e m a i n e da f t e r5r a i n i n c u b a t i o na t6 0 a n dh i g h e l t e m p e r a t u r e t h el i p a s es h o w e dh i g hl i p o l y t i ca c t i v i t y f r o mp h7 5t op h8 0a n di 坞o p t i m a lp hf o ra c t i v i t yw a s8 0 b e l o n g e dt ot h ea l k a l i n e l i p a s e t h et e s to fl i p a s ep hs t a b i l i t yi n d i c a t e dt h a tt h el i p a s eo fl i p 3 5w a sm o r es t a b l ei n p h 6 0 - 9 0 t h el i p a s ea c t i v i t yw a si n h i b i t e db yk ? ( a b o u t5 0 o ft h ea c t i v i t yw a s l o s t ) ， b u tw a ss t i m n l a t e db yc r ( m o r et h a nf o u rt i m e so ft h ei n i t i a la c t i v i t yw a sa c h i e v e d1 t h ee d t at e s tt e s t i f i e dt h a tt h i sl i p 蹴w a sn o tc a z + d e p e n d e n te n z y m e k e yw o r d s ：c o l d a d a p t e dl i p a s e ；s c r e e n n i n g ；b a c t e r i a l c l a s s i f i c a t i o n ；p s e u d o m o n a s ； f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n ；u p a s ec h a r a c t e r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 垦盘些盘鲎或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 张绛峨：m 7 年易月缪日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑j 垦盎些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑i 垦垒些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者豁瓣唬钐新签名：像灸 签字日期：l 踟年乡月日签字日期狮7 年6 月，目 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 低温脂肪酶高产菌株的筛选、鉴定及其发酵产酶条件的优化 i 1 本研究的目的和意义 1 引言 低温微生物资源近年来正成为研究开发的热点，除了其在适应低温环境的机理和生命的起源 等理论领域具有重大意义外，低温酶在工业应用中的优势和诱人前景也是重要原因。 1 1 1 低温微生物和低温酶简介 ( 1 ) 低温微生物及其特征 低温微生物是泛指生活在低温环境下的微生物。这类微生物可细分为两类。一类是必须生活 在低温条件下，在0 可生长繁殖，最适温度不超过1 5 ，最高温度不超过2 0 的微生物，称 之为嗜冷菌( p s y c h r o p h i l e s ) 另一类是能在低温条件下生长在0 5 可生长繁殖，最高温度 可达加以上的微生物，称之为耐冷菌( p s y c h r o t r o p h s ) 这两类微生物的生态分布和低温生物 学特性均存在差异，它们以独特的生理功能适应环境。研究这类微生物不仅具有重要的理论意义， 而且在实际应用中已经产生了日益明显的经济意义。同时它们是生物技术和生物产业发展的十分 重要的资源l ”。 嗜冷菌对温度很敏感，即使短时间受热、2 0 以上即引起死亡。因此嗜冷菌的分布很受环境 的限制，主要分布于终年常冷的环境中，如南北两极地区、冰窟，高山、深海和冻土域1 2 l 等低温 环境中。耐冷菌分布范围较宽，从常冷到不稳定的低温环境中均可分离到，除上述低温环境外还 分布于海产品及冷冻食品上。即使从南北两极常冷的环境中分离到的微生物也大部分是耐冷菌， 嗜冷菌只占很少部分。低温微生物具有广泛的微生物类群已发现的嗜冷微生物既有真细菌、蓝 细菌。又有酵母菌、真菌和藻类，但直到现在尚未发现嗜冷的古细菌。在嗜冷菌中研究最多的是 真细菌，有自养菌也有异养菌，有好氧菌也有厌氧菌【”。 低温微生物在长期的环境适应过程中，产生了独特的能耐受低温的细胞学特征和生理生化特 性。这些特征主要包括以下方面低温微生物在更大程度上合成了含有更多不饱和脂肪酸或 短链脂肪酸的中性脂质及磷腊，细胞膜的流动性增强，从而有利于细胞内外的物质交换网。细 胞质【4 】低温防护剂如多元醇和海藻糖等浓度的改变以及冷激蛋白和冷适应蛋白( c o l d _ a c c l i m a t i z a t i o np r o t e i n ) 的表达冷激蛋白和冷适应蛋白是指微生物在受寒冷刺激后过表达的一类 蛋白质。对低温条件下蛋白质合成的调节以及m r n a 的折叠起重要作用。表达特异性的具有 低温催化活性的低温酶在低温条件下，低温微生物能特异性地合成分泌具有低温催化活力的酶， 并利用这些酶在低温下高效地催化合成低温微生物生命活动所需的物质，保证低温微生物在低温 下能够进行正常的生命活动例 ( 2 ) 低温酶及其性质 低温酶( c o l d - a d a p t e de n z y m e s ) 也称嗜冷酶( p s y c h r o p h i l i ce n z y m e ) 、冷活性酶( c o l d a c t i v e e n z y m e ) 或适冷酶( c o l d - a d a p t e de n z y m e ) 低温酶是指在低温条件下能有效催化生化反应的一 类酶。低温酶与中温酶相比有以下特点：酶的最适反应温度较同功能的中温酶低0 3 0 ； 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 在较低温度下( 3 0 ) ，酶的转换数( k 。) 或生理系数( k ：低。) 高于来自中温菌中的同 类酶；低温酶的热稳定性差。低温酶主要是由低温微生物( c o l d - a d a p t e dm i c r o o r g a n i s m ) 产生， 用以调节他们的代谢活动并以此来适应低温环境。由于地球表面上存在大量的低温环境，低温微 生物分布极为广泛，因此其在生态系统中起着重要作用，对低温微生物及其所产的低温酶的冷适 应机制的研究有着重要的生物学意义；同时。低温酶能在低温下有效发挥催化作用的特点，使其 在生物工程领域有着广泛的应用前景因此，对低温微生物的研究无论在理论上还是在实践上都 有重要意义州 低温酶具有特殊的分子机制适应低温环境，根据已获得的低温酶的一级序列和高级结构，低 温酶同中温酶及高温酶相比有以下差异：甘氨酸含量增加；脯氨酸，精氨酸含量减少；盐桥、芳 香环相互作用，疏水作用减弱；分子问、亚基间以及结构域间的相互作用减弱；与溶液间的相互 作用增强；环状结构( 1 0 0 p - s t r u c t m e ) 增加【7 - 1 0 1 这种结构变化赋于蛋白分子较高的柔韧性和较低 的热稳定性 低温酬氐温条件下的高酶活几乎总是与其热不稳定性相关一般来说，高温酶在室温下催化 效率很低。这是因为高温酶在室温下的紧密构象阻碍了酶分子与底物之间的相互作用相反，具 有高柔韧性或可塑性的低温酶分子在消耗较低能量的情况下就能与底物有效结合，但正是低温酶 的柔韧性导致其热不稳定。z a v o d s k y 等u ”利用红外线光谱技术检测氢和重氢的相互交换，测定 二种3 - - - 异丙基苹果酸脱氢酶的相对柔韧性( 分别来自中温菌和高温菌) ，结果发现：虽然中温 酶和高温酶在各自的环境温度下具有相似的柔韧性，但在室温下高温酶比中温酶的分子构象更为 紧密，而这种构象阻碍了与底物的结合，使酶活下降。此外，低温酶的小结构域比嗜热酶的大结 构域具有更强的柔韧性。酶的催化是由小结构域的相互运动引发的，因此，正是这种结构域柔韧 性上的差异导致低温酶能在低温条件下有效行使催化功能州 低温酶的低温催化能力和低热稳定性使其在工业应用上具有以下的优势：通过温和的热处理 使低温酶失活，快速而经济地终止反应；生产过程在低温或室温下进行，无需加热和冷却，可以 降低成本；生产过程便于监控低温酶在工业领域的应用包括以下方面，洗涤添加剂：如蛋白酶、 脂酶、淀粉酶、纤维素酶可以作为洗涤添加剂在冷洗行业具有广泛应用食品工业：低温酶在食 品工业中有广泛的应用，例如。低温卜半乳糖苷酶可以在低温条件下降低牛奶中乳糖的含量。 在果汁工业中，低温果胶酶可以降低果汁的枯性，使终产品变得澄清；在肉食品工业中，低温蛋 白酶有助于肉的嫩化；在面包工业中，低温淀粉酶、蛋白酶、木糖酶可以减少生面发酵时间，提 高面包质量。另外，低温酶还可以用在奶酪、酿酒工业、环境生物治理l 坷、低水活条件下的生物 催化等方面h 。 1 1 2 脂肪酶简介 在微生物中，脂类酯分解酶( 1 i p o l y t i c e n z y m e ) 包括羧酸酯酶( c a r b o x y l e 舭r a s c 。e c 3 1 1 1 ) 、 真脂肪酶( 1 i m el i p a ，e c 3 1 1 3 ) 以及各种磷脂酶( p h o s o p h o l i p a s e s ，e c 3 1 1 4 ) 。其中有重要工 业应用前景的是羧酸酯酶( 简称为酯酶，e s t e r a s e s ) 和真脂肪酶( 简称脂肪酶1 l p a s e s ) ，主要参 与脂质的水解犀应。在特定的非水相系统中，它们还催化水解反应的逆反应，以及酯化合成和 转酯反应1 1 4 l ，被广泛的应用到人类的生产和生活中。例如洗涤剂用酶、污水处理及食品工业、皮 2 低温脂肪酶高产菌株的筛选、鉴定及其发酵产酶条件的优化 革工业、油脂化工工业等p j 脂肪酶是分解三脂酰甘油水解的酶类，被水解底物三脂酰甘油的醇部分是丙三醇，酸部分为 水不溶的1 2 碳以上的长链饱和或不饱和脂肪酸，从催化作用的可逆性考虑可将脂肪酶定义为： 与高级脂肪酸和丙三醇所形成的三脂酰甘油的合成、转酯和分解有关的酶类【“。羧酸酯酶和脂肪 酶很类似，区别在于两者重点作用底物不同，一般羧酸酯酶催化短链甘油酯水解，而真脂肪酶催 化长链甘油酯水解；其标准底物分别为三丁酸甘油酯( t r i b u t y i n e , 4 碳) 和甘油三油酸酯( 仃i o l e i n , 1 8 碳) 。 脂肪酶是最早研究的酶类之一，已有上百年的研究史。1 8 3 4 年就报道了兔胰脂肪酶的话性， 1 8 7 1 年报道了植物种子脂肪酶，微生物脂肪酶是在本世纪初才发现的，我国微生物脂肪酶的研究 始于年代i u j ( 1 ) 脂肪酶的分子结构及特征 脂肪酶是一种糖蛋白，其糖基部分约占分子量的2 5 ，以甘露糖为主，整个分子由亲 水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子的琉水端。研究表明，来源不同的脂肪酶，其氨基酸 组成数目从2 7 0 6 4 1 不等，分子量为2 90 0 0 1 0 00 0 0 1 7 1 迄今为止，人们已经对多种脂肪酶进 行克隆和表达，并利用x 一衍射等手段以及定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、 等电点等参数，确定了组成脂肪酶活性中心的三元组( i l i a d ) 结构绝大多数脂肪酶的活性中心 都是由s e t 和h i s 参与组成l “。h i s 、s e t 与另一种氨基酸残基( 如c c l 和o c l 的g l u ，r m l 和 h l l 的a s p ) 一起构成脂肪酶催化中心的三元组，如图1 1 1 9 j 。人胰脂肪酶( 瑚? l ) 【堋、r h i z o m u c o r m i e h e i 脂肪酶( r m l ) 例和g e oc a n a l a l u m 脂肪酶【2 1 】等的蛋白晶体结构已经研究清楚。对脂肪 酶活性中心的研究发现s e r - g l u - h i s 组成一个有催化作用的三联体，c , e oc a n d d u m 的立体结构也 证明这种三联体的存在。脂肪酶h p l ，r m l 三联体是s e r - g l u - h i s ，即a s p 取代了o l u 上述3 种脂肪酶中，活性中心丝氨酸残基的侧链构象在空间结构方面与丝氨酸蛋白酶的非常相似，不同 的是脂肪酶的活性中心隐藏在蛋白质内部 围1c 州正胁川g 嘲l i p e s e 多肚的拓扑和立体图解 f 嘻1t o p o l o g i c a la n du i d i m e n s i o n a li l l u s t r a t i o no f c 础鲫l i p m p o l y p e p e d c 不同的脂肪酶具有非常类似的立体结构，脂肪酶的氨基酸顺序可能会有较大差别，但却有类 似的折叠方式和活性中心一般的脂肪酶的肽链折叠成两个结构域，即m 末端和c 末端结 构域m 末端的活性部位有一条可结合长链脂肪酸的琉水性的通道，该通道从催化部位的s e r 直到分子的表面网通常情况下，脂肪酶的活性部位被一个螺旋片段( 又称为。盖子”) 所包住 在底物( 如醇、酸或酯等) 存在的情况下酶的构象发生变化，“盖子”打开，舍有活性部位的 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 疏水部分就暴露出来。如图2 所示h d i d d m 口s4 m i 酊脂肪酶活性位点的三维结构“盖子” 中a 螺旋的双亲性会影响脂肪酶与底物在油水界面的结合能力，其双亲性的减弱将导致脂肪酶 活性的降低。盖子”的外表面相对亲水而其面向催化部位的内表面则相对疏水由于脂肪酶 与油，水界面的缔合作用，使“盖子”涨开，活性部位得以暴露，这使得底物与脂肪酶的结合能力 增强，此时底物就容易进入疏水性的通道而与活性部位结合，形成酶一底物复合物田1 田2 出m m “m 硇l n l j p 叠活性位点的三维结构 f 培2n 眦纠恤旧晡锄山曲口咖o f ，h 翟由棚伽删飘喀妇- 耐v 叫弦缸 多数脂肪酶都有变种。不同变种的酶具有绝大多数相同的氨基酸序列，其氨基酸组成数目完 全相同，不同的只是个别氨基酸的差异。一般而言，不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同， 而且位置不变，其分子量和等电点略有不同口1 驯多数脂肪酶都是单链蛋白。大多成熟的天然蛋 白还含有糖类组分，因此实际测得的分子量往往比理论分子量偏大刚 ( 2 ) 脂肪酶的催化特性 脂肪酶是生物体内一类重要的代谢酶，不同于其它多数水解酶催化的一个最显著的特点是， 该酶催化的水解反应是在一种非均相体系中进行，水溶性的酶在底物( 水不溶性) 和水的界面上 催化底物反应，对水溶性底物不起催化作用 脂肪酶催化反应的过程：底物结合在活性位点的s c f 上，产生一个由i - i i s 和a 叩参与帮 助稳定的四面体中间体( 坝咖1 酣f a l i n t e r m e d i a t e ) 如图3 所示；释放醇，形成酰基酶复合物； 产生自由酶和酸、醇；通过亲核基团( 水解反应中为水，转酯作用中为醇或酯) 的攻击重 新行成四面体中间体p j 4 i 、- p 、 f 潘山 广。矿山 田3 膳肪酶催化甘三南水解过程中形成的四面体中间体 f 培3t c n a h c d r a l i n i 印曲l c f o r m e d 蛐l j p 辑酬廊t h e 。h y d r o l y | i so f e i c m 低温脂肪酶高产菌株的筛选、鉴定及其发酵产酶条件的优化 脂肪酶多功能催化作用的开发必须以脂肪酶的底物特异性为基础。众所周知，酶的底物特 异性取决于酶的分子结构，特别是酶活性中心的结构。因此，酶的来源不同，其结构的差异使酶 的底物特异性也不同脂肪酶的底物特异性( s u b s t r a t cs p e c i f i c i t y ) ( 见图4 ) 包括： 葺特异性膏腑一 r a x ，c h 。c h ，佣 r c 0 0 c h 叫目鳓斗f c o c ，h + 曩1 x x j f i + c h o h ii r c d 0 亡h 。c 4 i 删 i 】定向詹 瓤黼i l i 口l 叫a 1 一，h ll 一- c 成h _ f 咖 一i 比o o h ；= 皇r c c x 删 + r h l r c o h r c o 【研i i 明j c 舯 - ) 囊肪t 特鼻性肪 r c o 【x ：h ic v o c 隅c h 棚啊r 。0 0 0 c i b i f c 0 0 c h + 黜：c - 0 c h酬r o 咖+ r c 0 0 c h+ c h 删 r t 【，】c r 屯嘎n b r 1 c 骐咒r c ( x ) 口i 田4 不同类型脂肪奠的底物特异性 f 弛4 轴蛐印c d 丘c i t yo f m 咖枷o f l i p u a 作用于甘三酯时对进攻的位点和水解的脂肪酸均不显示特异性，甘三酯被完全水解为游 离脂肪酸和甘油，甘油二酯和一酯为中问产物i 驯。 位置特异性( p o s i t i o n a ls p e c i f i c i t y ) 它是指酶对底物甘油二酯中s + 1 ( 或3 ) 和s 位酯 键的识别和水解的选择性。o k u m u t a 比较了四种微生物脂肪酶水解甘油三油酸酯的位置选择性， 结果证明，黑曲霉和根霉的脂肪酶仅催化1 ( 或3 ) 位醋键水解对2 位酯键无作用；白地霉和 圆弧青霉的脂肪酶无位置特异性，水解甘油三酯的所有酯键。但从这些酶水解可可腊( 混合脂肪 酸组成) 的实验中得出，白地霉和圆弧青霉的脂肪酸酶虽然都能水解2 位酯键，但是前者优先水 解不饱和脂肪酸，而后者对饱和与不饱和脂肪酸水解能力相同。大鼠脂肪组织的脂蛋白脂肪酶对 甘油三酯的三个位置的酯键水解速度相同；牛奶脂蛋白脂肪( 纯酶) 和人的脂蛋白脂肪酶只水解 1 ( 3 ) 位酯键p ” 立体特异性( s i c m o s p c c i f i c i t y ) 一般是指酶对底物甘油三酯中立体对映结构的1 位和3 位酯键的识别和选择性水解a k s o l l 等发现，来源于荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) 脂肪酶能区分s 1 和s 一位二酰基甘油，但水解s 、s 目二酰基甘油比水解它的对映体速度快得 多嘲。 脂肪酸特异性( a c y lc h a i ns p c c i f i d t y ) 它是指酶对不同( 碳链长度和饱和度) 的脂肪酸 所表现出的特殊反应性。不同来源的脂肪酶水解甘油三酯的脂肪酸特异性有很大差异。例如圆弧 青霉( p e n i c i l l i u mc y c l o p i u m ) 脂肪酶对短链( c b 以下) 脂肪酸，黑曲霉( a c p e r g i l l u 3n i g e r ) 和 根霉( 勋却啦d e e m a r ) 脂肪酶对中等链长( c 8 一c 1 2 ) 脂肪酸例，自地霉( g e o t r i c h u m 以池m ) 脂肪酶对三油酸( 不饱和酸) 分别呈现强的特异性闭 这些只是脂肪酶催化甘油三酯水解反应的各种特异性；事实上脂肪酶在催化酯的合成与交 换时，也具有底物特异性印1 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 在有机溶剂体系中脂肪酶的催化反应可以获得许多其他常规条件下所无法比拟的优势l ： 改善了传统水解酶的应用范围，可以催化酯交换、酯化、氨解等合成反应的进行；可进行 水不溶性物质的催化转化，大大拓展了酶的作用底物范围；由于脂肪酶不溶于有机溶剂， 这就为反应终止后酶的回收和重复利用提供了可能与便利；有机溶剂的使用还为反应过程 及分离过程降低了能耗；酶的热稳定性有了较大的提高；减少或防止了由于水所引起的 副反应；避免长期反应造成的微生物污染。 ( 3 ) 脂肪酶产生菌的来源及筛选 脂肪酶在微生物界的分布很广，据估计，细菌有鸽个属，放线菌4 个属，酵母菌有1 0 个属， 其他真菌2 3 个属。共计6 5 个属的微生物能产脂肪酶，但产酶量高的菌株却不多，袭1 列出了已 经发现的能产脂肪酶的微生物网 寰1 常见的产麝肪奠的徽生物 t a b l e1c o m m o nm i c r o b et h a tc a np r o d e c el j p m 其筛选方法一般为：样品一富集培养一平板分离一平板初筛( 观察透明圈大小) 摇瓶复筛 ( 测酶活力大小) 己发现的微生物的作用条件因菌种的不同差异很大，不同的筛选方法对被分 离的微生物种类及酶的特性有相当大的影响。因此筛选分离脂肪酶产生菌的方法应根据应用对 象、微生物种类、酶的特性而定，最常用的方法是用含有甘三酯的琼脂平板，脂肪酶催化水解产 生清晰的环带或混浊的脂肪酸盐沉淀，也可利用生色底物或产脂肪酶微生物的某些特性如松村 亲报道的适用霉菌筛选的牛脂法：先在培养皿中注入熔化牛脂。再倒上琼脂培养基，产脂肪酶的 菌落周围出现透明圈。根据透明圈的大小可知道酶活高低t s a t y a n a r a y a n a 3 3 j 利用固体培养基， ( 配方：d r f c o 蛋白陈1 ，n a c l 0 5 ，c a c l 2 2 h 2 0 0 0 1 ，吐温- 2 0 1 ，琼脂2 ) ，观察菌落周围是否 有脂肪酸钙沉淀以确定酶活大小又如h i - lu e o h 0 4 1 等利用生色底物p 一硝基苯辛酸盐，p 一硝 基苯肉豆落酸盐和p 一硝基苯棕榈酸盐筛选对不同碳链长脂肪酸具有专一性的脂肪酶产生菌。 t a l h a n d e l s m a n 等m l 以橄榄油为唯一碳源，下培养，筛选出一株耐高温的脂肪酶产生菌。 8 0 年代以来，我国研究者在脂肪酶产生菌的选育方面也做了较多的工作王美荚p q 、陶文沂p 7 l 等采用类似的油脂同化平板，以油脂为唯一碳源，进行同化试验，分别筛选到较高活力菌株。施 巧琴等阱l 采用脂肪酶作用于脂肪后产生的脂肪酸与维多利亚蓝反应呈蓝绿色透明圈平板法筛选 到产碱性脂肪酶的扩展青霉。金其荣等闭以氢化油为唯一碳源，3 6 培养j 筛选到一株耐高温 的根霉菌。 脂肪酶产生菌主要从自然界中寻找，但从保藏菌株中也可筛选到徐家立等印l 从2 4 2 株青霉 属菌株哪帝选出卡门柏青霉- - - p g 3 ， b r a h i mco 等l 柏】从保藏菌种中筛选到热稳定性脂肪酶产生 菌绵毛状腐质霉近年来。随着生物工程的发展，脂肪酶产生菌的诱变、育种和基因克隆等方 6 低温脂肪酶高产菌株的筛选、鉴定及其发酵产酶条件的优化 面也取得了一些进展。如无锡轻工业大学以青霉菌株4 0 4 1 为出发菌株，经钴卯、硫酸二乙酯、 亚硝基胍和紫外线等多次诱变处理，以克霉唑、制霉菌素及柠檬酸钠、丁酸等为筛子筛选到圆弧 青霉白色变株p g 3 7 黄建忠等【4 1 】以扩展青霉n _ - 5 0 3 作为出发菌株，经紫外线、硫酸- - l 酯、 亚硝基胍多代诱变，选育成功产酶水平高达1 2 0 0u m l 的优良菌株一扩展青霉p f 8 6 8 ，其酶活力 较出发菌株提高了1 1 1 ，连续传代1 0 次，产酶性能未见衰退，是一个稳定的突变株。m o t o y a s u o 等报道，脱氮产碱杆菌n 【7 的脂肪酶基因经克隆后转移到大肠杆菌上，并得到表达，载有其脂 肪酶基因的大肠杆菌产酶是原菌体的2 0 倍左右，酶活力提高不少岬j 。 1 1 3 低温脂肪酶简介 ( 1 ) 低温脂肪酶的特征 根据m a r g s i n 等人的定义1 4 z ，可以把最适酶活温度在3 0 左右，在0 左右仍有一定催化 活性的脂肪酶称为低温脂肪酶研究表明，低温脂肪酶不仅具有其它低温酶的共同特征m ，而 且还有自己的一些独特的理化特征，归纳起来大致有以下3 点：有机溶剂耐受性。在一定浓 度的有机溶剂中低温脂肪酶不仅不失活，酶活反而有所提高 4 4 - 4 6 1 ，这特性为低温脂肪酶今后在 化学工业中的应用奠定了基础与大部分酯酶较偏好短链酯类不同，大部分低温脂肪酶对含 有g c i o 这一长链的甘油脂具有更好的催化效率阳州。相对于高温和中温脂肪酶而言，低温 脂肪酶有更宽的p h 适应范围，这就进一步拓宽了它的t 业应用范围m 一般来说，酶的理化特性是由其结构决定的同理化特征一样，低温脂肪酶也具有其它低温 酶的一些共同结构特征，但同时它们还具备了一些独特的结构特征，综合起来主要有：以丝 氨酸为催化中心，具有以丝氨酸( s e t ) 残基为中心的催化三联体结构( s e r - a s p - r i s ) 咿j ；一 级结构中存在大量亲水性精氨酸( a r g ) ，且大多暴露在蛋白质分子表面。研究表明，亲水性基 团的暴露对酶和溶剂分子的相互作用的增强比较有利钙离子配位作用钙离子配位作用使 低温脂肪酶的催化效率得到显著提高俐 在低温脂肪酶的研究中。结构研究得较清楚的是从草莓假单胞菌属( p s e u d o m n a $ f r a g i ) 菌株 i f 0 3 4 5 8 克隆得到的低温脂肪酶蛋白质( p s e u d o m n a s f r a g il i p a s e 。p f l ) 4 3 1 。在对p f l 进行研究时 发现与同源的中温绿脓杆菌( p s e u d o m n a 8a e r u g n o s al i p a s e ，p a l ) 和洋葱伯克氏菌脂肪酶 ( b u d d m d e r ac e p a c i al i p a s e ，b c l ) 一样，p f l 的催化活性中心也是一个以丝氨酸( s e t ) 残基为 中心的催化三联体。研究表明，精氨酸( a r g ) 和脯氨酸( p r o ) 的位置，二硫键( d i s u l p h i d eb r i d g e ) 的数目以及疏水中心之间的相互作用决定着酶分子的柔韧性( f l e x i b i l i t y ) 和在不同温度下的催化 活性i l 哪。在对p f l 进一步研究发现，它与同源的中温脂肪酶p a l 以及b c l 的不同之处在于精氨 酸残基的数目，三者分别为2 4 ，1 1 ，9 ，并且在p f l 的3 d 结构中，全部的2 4 个精氨酸残基中有 2 0 个分布在蛋白质分子的表面，而只有2 个参与形成分子内部的盐桥( s a l tb r i d g e ) ，大量带电 荷的精氨酸残基分布在蛋白质分子的表面，增加了蛋白质分子的柔韧性以及和溶剂之间的相互作 用，确保了酶在低温下仍能保持良好的催化活性。相反地，二硫键的存在可增加蛋白质分子的刚 性和热稳定性，降低分子的柔韧性。在p a l 和b c l 分子中普遍存在的二硫键，在p f l 分子中却 丢失了，降低了p f l 的热稳定性，保证了其在低温下的高活性作为补充，p f l 分子中的两个芳 香族氨基酸残基( w 1 8 4 和f 2 4 4 ) 替代了b c l 分子中相应位置的二硫键，形成堆叠反应( s t a c k i n g 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 i n t e r a c t i o n ) 而适当增加了分子的稳定性，保持了分子的立体结构的完整性另外，在蛋白质分子 的环结构和拐角处( 1 0 0 p sa n da r m s ) 脯氨酸的存在往往可以增加蛋白质分子的刚性而降低分子的 柔韧性t 述三种同源的脂肪酶分子中都含有1 3 个脯氨酸残基，其中8 个分布在蛋白质分子的 保守区域上，其余的5 个在p a l 和b c l 分子中多分布在环结构上，而p f l 分子中仅有一个脯氨 酸残基分布在环结构上，从而降低了p f l 分子的刚性，增加了p f l 的分子柔韧性咿i ( 2 ) 低温脂肪醇的来源与分类 植物种子、动物组织以及微生物细胞中都富古脂肪酶，而作为具有低温活性的低温脂肪酶则 大多是由低温微生物产生这些低温微生物主要分布在南、北两极以及大洋底部等长期处于低温 的环境。目前所发现的产低温脂肪酶的低温微生物大都属于假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、气单 胞菌属( a e m m o n a s ) 等m 这些低温微生物在低温环境下经过长期的进化，形成了适应低温环 境的特殊结构及生理生化机制 目前。对脂肪酶的分类还没有形成一个完整的共识，主要有两种分类方法：按最适酶活 o h 值可分为酸性脂肪酶和碱性脂肪酶，一般植物种子和动物胰脏所含的脂肪酶为酸性脂肪酶， 而微生物所产生的脂肪酶大多为碱性脂肪酶 4 5 - 0 1 。按脂肪酶家族可将脂肪酶分为八个家族 印l fi 、i i ( g d s l ) 、1 1 1 、i v 0 t s l ) 、v 、v i 、v i l l 。而脂肪酶家族i 又细分为6 个亚科，据 报道，假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 微生物产生的低温脂肪酶是一个显著的代表，大多数假单胞 菌属的脂肪酶可划分到i 1 至i 3 亚科i 1 亚科的脂肪酶分子量最小( 约3 0 k d ) ，绿脓杆菌 属( p s e u d o m o n a sa e r u g i a o s a ) 和草莓假单胞菌属c p