（发酵工程专业论文）国产橡木桶贮存赤霞珠干红葡萄酒香气成分变化规律研究.pdf

摘 要 i 摘 要 橡木桶是贮存和酝酿高档葡萄酒的必备容器，经橡木桶贮存后，葡萄酒的颜色、 香气都会产生一系列的变化。陈酿葡萄酒中的一些重要的香气物质只有经过橡木桶 贮存才能获得。橡木桶的香气物质成分很复杂，有源自于橡木的天然成分也有源于 橡木桶加工过程的烘烤。橡树的种类、产地、以及橡木板的自然风干、烘烤和橡木 桶的桶龄、桶容量等因素都会对葡萄酒香气产生影响。 本研究通过对橡木中挥发性香气成分的分析，建立了针对橡木中香气物质的气 相色谱- 质谱(gc- ms)检测方法。检测条件为：进样口温度为 250 ，柱温箱程序升 温为初始温度 50 保持 2 min，以 5 /min的升温速率升至 240 并保持 10 min, 质谱电离方式 e i ，电离电压 70 ev，离子源温度为 200 ，连接杆温度为 220 ，载 气为氦气，流量 1 ml/min，不分流检测。 本研究采用 12 %酒精对橡木制品进行浸提，并检测其可浸出成分得出，中国产 橡木浸提 24 天后可浸出的香气物质含量最大值为橡木块酒精浸提液中糠醛 452.23 ug/l，糠醇 37.21 ug/l，愈创木酚 96.23 ug/l，4- 乙基愈创木酚 23.3174 ug/l，丁香酚 12.59 ug/l，反式橡木内酯 12.33 ug/l，香草醛 714.67 ug/l，橡木花酒精浸提液中顺 式橡木内酯 104.81 ug/l。本研究又对中国、美国、法国橡木制品采用 12 %酒精和葡 萄酒进行对比浸提实验，并对浸提结果进行聚类分析，得出国产橡木块浸出的香气 物质含量与美国橡木块浸出的香气物质含量较为相似。 本研究还针对 2 种赤霞珠葡萄酒进行了入桶陈酿实验。研究了葡萄酒在国产橡 木桶中贮存香气成分的变化规律，主要包括：国产橡木桶贮存和不锈钢罐贮存的差 异分析；不同桶龄国产橡木桶对贮存葡萄酒香气的影响；国产橡木桶和法国橡木桶 贮存葡萄酒香气物质差异研究。 研究发现，2008 年朗格斯酒庄闪蒸赤霞珠干红葡萄酒经国产新橡木桶贮存后， 源于橡木桶的挥发性香气物质含量显著提高，其中顺式橡木内酯、4- 乙基苯酚、香草 醛是在非橡木桶贮存容器中所不能够获得的。 不同桶龄国产橡木桶在物质的浸出含量和浸出速率上都存在一定的差异。其中 一年桶龄的橡木桶糠醛的浸出含量要比新橡木桶糠醛的浸出含量高，顺式橡木内酯、 香草醛、糠醇的浸出量均为随桶龄的增大而减少，国产橡木桶愈创木酚的浸出较为 持续，随桶龄变化不明显。国产橡木桶物质浸出的速率较慢，不同桶龄橡木桶贮存 葡萄酒后香气物质浸出量差距相对较小。 国产橡木桶和法国橡木桶在物质的浸出含量和浸出速率都存在一定的差异。国 产橡木桶贮存的葡萄酒中糠醛和愈创木酚的含量相对较高，丁香酚和顺式橡木内酯 河北科技大学硕士学位论文 ii 的浸出量较为接近，糠醇和香草醛的含量要比法国橡木桶贮存的葡萄酒含量低。法 国橡木桶香气物质的浸出速率较快，物质容易被浸出，新桶相对浸出的物质含量要 高，而由于法国橡木桶物质较容易被浸出，这也造成了随着橡木桶的使用次数的增 加，可浸出物质的含量降低程度较为明显。 本研究为中国产橡木桶在葡萄酒贮存陈酿中的应用提供理论依据，并为葡萄酒 生产企业建立橡木桶陈酿葡萄酒方面的依据，为企业生产有自己特色的陈酿型干红 葡萄酒作指导。 关键词 国产橡木桶；葡萄酒；香气物质；陈酿；桶龄 abstract iii abstract oak barrel is the essential container for storage and brewing of high- end wine. through stored in the oak barrel, the wine s color and aroma will have a series of changes. some important aroma substances of brewing wine can only be got by the storage in oak barrel. the composition of oak barrel s aroma substances is very complex: some are derived from natural ingredient of oak, and some from the process of baking. many factors have impact on the aroma of wine, such as species and origin of oak, oak s natural dried and baking, age and capacity of oak barrel, fermentation in barrel, and so on. through the analysis of the oak s aroma components, this study established a gas chromatography - mass spectrometry (gc- ms) method to detect the aroma components of wine from oak wood. test conditions: the injector temperature was set at 250 ; oven temperature programmed for the initial temperature at 50 keeping 2 min, 5 / min heating rate up to 240 and maintained 10 min. mass spectrometry ionization method was ei, ionization voltage was recorded at 70 ev electron energy. the temperature of ion source and connecting rod were remained at 200 and 220 respectively. the carrier gas was he at a flow rate of 1 ml / min, no split detection. conducted by oak products extracting and testing of its components, after extracted 24 days, the aroma substances of chinese oak content could be to a maximum of furfural 452.23 ug / l , furfuryl alcohol 37.21 ug / l, guaiacol 96.23 ug / l, 4 - ethyl- guaiacol 23.3174 ug / l, eugenol 12.59 ug / l, trans- oak lactone 12.33 ug / l, vanillin 714.67 ug / l in oak blocks; cis- oak lactone 104.81 ug / l in the alcohol extraction of oak flower. cluster analysis was made to compare the extraction result of chinese oak products with the united states and france. and the extracted situation of chinese oak products was similar to the united states. the paper studied two different kinds of cabernet sauvignon wines aging experiment. the changes of aroma components in the wine, which was stored in domestic oak barrels, were also studied. mainly including the variance analysis of storage in oak barrel and stainless steel tank, the influence of wine storage in oak barrel with different barrel ages; a parallel comparison test was also carried with french oak barrel. the study found that, after storage in new domestic oak barrel, the volatile aroma components of cabernet sauvignon wines coming from the oak barrel significantly 河北科技大学硕士学位论文 iv increased. among them, cis- oak lactone、4 - ethyl- phnole、vanillin couldn t get from the container which was not oak barrel. the aroma substances leaching content and rate of domestic different ages were not the same. the leaching content of furfural from the wine stored in one year old oak barrel was higher than the new one. with the increase of barrel ages, the leaching contents of trans- oak lactone、vanillin and furfuryl alcohol were reduction. guaiacol didn t change apparently of different barrel ages. chinese oak barrel s leaching rate was slow, but the leaching contents stored in different barrel ages were nearly the same. there were some differences of the leaching content and rate between domestic and french oak barrels. the contents of furfural and guaiacol in the wine which stored in domestic oak barrel were higher than those of french oak barrel; eugenol and cis- oak lactone were nearly the same; furfuryl alcohol and vanillin were lower. the aroma substances leaching rate in french oak barrel was faster, and the new barrel could leach more composition. just because of it, the content of leaching would reduce apparently when the oak barrel had been used many times. this paper can provide a theoretical basis of storage in chinese oak barrel, and establish a basis for aging wine, so it could be a guide for company to produce aged dry red wine which has its own characteristics. key words chinese oak barrel; wine; aroma substances; aged; oak barrel age 第 1 章 绪论 1 第 1 章 绪 论 1.1 橡木桶与葡萄酒 橡木桶是贮存和酝酿高档葡萄酒的必备容器，葡萄酒在橡木桶中发酵或经橡木 桶陈酿后，能够更好的体现葡萄酒的特点1。橡木桶作为一种储酒容器在很早之前就 已经开始使用了，其历史甚至可以追溯到远古时代。但在历史上人们使用橡木桶的 目的并不仅在于改变葡萄酒的风味、香气和颜色。即使现在有的地区也是如此，如 香槟葡萄酒和波尔多的一些白葡萄酒则将木桶作为酿制高档葡萄酒的辅助手段，这 是一种相对较晚的创新之举2。 由于通过橡木桶储存过的葡萄酒日益得到消费者的认 可和喜爱，橡木桶越来越受到世界各地的酿酒师尤其是葡萄酒新世界国家酿酒师的 青睐3。 橡木桶对葡萄酒的色泽和稳定性都有影响，并且葡萄酒贮存于橡木桶中也会给 葡萄酒带来一个自然澄清过程。但橡木桶对葡萄酒来说最大的影响在于使葡萄酒通 过适度的氧化，使酒的结构稳定，并将橡木桶中的香味物质融入酒中。 橡木桶桶壁的木质细胞具有透气的功能，可以让极少量的空气穿过桶壁，渗透 到桶中使葡萄酒产生适度的氧化作用。过度的氧化会使酒变质，但缓慢渗入桶中微 量的氧气却可以柔化单宁，让酒更圆熟，同时也让葡萄酒中新鲜的水果香味逐渐酝 酿丰富多变的成熟酒香4。因为氧化的缘故，经过橡木桶陈酿的红葡萄酒颜色变得比 贮存前还要淡，并且色调偏橘红；相反白葡萄酒经储存后则颜色变深，色调偏金黄。 空气可以通过桶壁，同样的，桶中的葡萄酒也会穿过桶壁蒸发到空气中，所以 储存一段时间之后，桶中的葡萄酒就会因减少而在桶中留下空隙5。如此一来葡萄酒 氧化的速度会加快而无法提高品质。因此每隔一段时间，酿酒工人就必须进行添桶 的工作，添入葡萄酒将橡木桶填满。如此经过一两年之后，葡萄酒因蒸发浓缩变得 更浓郁。 橡木桶除提供葡萄酒一个适度的氧化环境外，橡木桶原本内含的香味也会融入 葡萄酒中。除了橡木味之外，依据木桶熏烤的程度，可为葡萄酒带来奶油、香草、 烤面包、烤杏仁、烟味和丁子香等香味。橡木的香味并非葡萄酒原有的天然原味， 只是使酒香更丰富的陪衬香味，不应喧宾夺主，掩盖葡萄酒原有的自然香气6。 1. 2 葡萄酒香气物质的种类及作用 葡萄酒的香气分为三大类。第一大类是存在于葡萄浆果中的香气，我们称之为 品种香或一类香气。第二大类是在酒精发酵过程中形成的香气，我们称之为发酵香 河北科技大学硕士学位论文 2 气或二类香气。第三大类是在葡萄酒陈酿过程中缓慢形成的香气，我们称之为陈酿 香气或三类香气7。在葡萄酒的陈酿过程中，氧化作用、还原作用、酯化作用等化学 反应，使葡萄酒的香气向更浓厚的方向转化，降低其品种香气的特征；同时，各种 气味趋于平衡、融合、协调。最后，葡萄酒的氧化还原电位降至最低时，其最佳香 气才能获得。因此陈酿后葡萄酒的主要香气物质包括：挥发性的酯类、醛类、芳香 性物质等1,7。葡萄酒中的单宁在酒的陈酿过程中也变得具有香气。橡木桶的挥发性 成分溶入葡萄酒中，共同构成葡萄酒的陈酿香气，使葡萄酒具有香草味、橡木味。 其主要物质是橡木内酯、香草醛、愈创木酚、香兰素、丁香酚、香芹酚等。 橡木内酯(oak lactone)，又叫威士忌内酯，具有椰子和新鲜木头的气味，它代表 了新鲜木头的大部分芳香潜力。橡木内酯在原木中存在，在橡木的自然干燥或烘干 的过程中，因为其前体物质的生成和脂肪酸的氧化，橡木内酯的含量会增加8,9,10。 丁子香酚(eugenol)，具香料和丁香气味；香料工业用作增香剂，可代替丁香油 制香水，制香草, 也可用作防腐剂。在橡木的干燥和烘干过程中，丁子香酚的含量 有时会升高8,11。 香草醛(vanillin)，又叫香兰素，按结构可分为甲基香兰素和乙基香兰素两种，具 有香草和香子兰气味。香草醛在新鲜橡木中的含量很少，其含量在橡木的干燥和烘 干过程中大幅度上升8,10,11,12。 单宁(tannin)，单宁是一类分子量在（5003000）之间、能与蛋白质发生沉淀反 应的水溶性多酚物质，根据其结构可分为水解单宁和缩合单宁。橡木的单宁主要是 水解单宁，它们同时可影响葡萄酒的颜色、口感和氧化还原反应1,5,7,13。橡木桶给 葡萄酒还带来很多其它的气味成分，但它们对葡萄酒的影响较小。 葡萄酒经过橡木桶贮存陈酿后，能够获得源自于橡木桶的香气物质，这些物质 与葡萄酒中其他物质共同构成葡萄酒的陈酿香，并且能够达到其他陈酿方式所不能 比拟的结果。 1.3 橡木桶贮存葡萄酒的研究现状 1.3.1 国外研究现状 国外在橡木桶陈酿葡萄酒的实验，开展着大量而细致的工作，现在特别是针对 橡木主要成分以及红葡萄酒中的单宁和花色素物质的变化研究也已经做出了大量的 工作。但国外对于橡木桶的研究多法国橡木桶和美国橡木桶，主要是针对一些挥发 性成分的分析研究，没有针对于中国橡木桶贮存期间葡萄酒香气成分变化规律的研 究。 第 1 章 绪论 3 加拿大的 rous 和 alderson14研究了葡萄酒在法国和美国新橡木桶、二次添桶和 三次添桶陈酿过程中， 酚类物质浸提曲线的变化。 从1989年到2004年期间， chatonnet 等人15,16,17,18,19,20先后研究了影响橡木中成分浸提的因素，包括：树种和产地、橡木 板的干燥方式、桶的烘烤程度、桶龄。chatonnet 等201992 年研究了陈酿过程中葡萄 酒中香气成分，以及酚含量的变化。j. r. piggott 等21研究了橡木桶成分鞣花单宁对 葡萄酒风味的影响。1996 年，vivas 等22对橡木成分鞣花单宁与类黄酮酚的氧化性， 以及单宁对葡萄酒颜色稳定性作用进行了研究。之后，通过红葡萄酒在橡木桶中陈 酿的研究，指明橡木桶除了对葡萄酒的香气有影响外，还能深刻改变葡萄酒的成分 和质量。这些改变主要与橡木桶对葡萄酒的氧化 还原反应调节有关23。 2002 年，l. j. pez- priet等人24对 22 l、500 l 和 1000 l 不同容积的美国产橡木 桶陈酿的红葡萄酒的挥发性香气成分进行了分析。 m. i. gomez 等人25用反相高效液 相色谱法直接而快速分离红葡萄酒中酚类化合物 (苯甲酸、黄烷- 3- 醇、肉桂酸、黄 酮醇、花色素)。hector escalona 等26研究了不同体积的橡木桶贮存葡萄酒对酒中芳 香性挥发成分的影响。2004 年，m. del alamo sanza 等对橡木片陈酿后的葡萄酒中 的小分子酚类物质进行了研究。2005 年，teresa garde cerdan等27对橡木桶类型对 葡萄酒中挥发成分的影响做了研究。2007 年，ruth bozalongo 等人28利用顶空微萃 取气相色谱法对不同烘烤程度的美国和法国橡木片挥发性芳香成分进行了分析研 究。 1.3.2 国内研究现状 我国的橡木桶的开发研制起步较晚，对于橡木桶贮存葡萄酒研究的整体水平较 国际先进还有很大的差距，更没有对中国橡木桶陈酿葡萄酒的相关研究。 1998年，李记明、李华29对葡萄酒贮存过程中，橡木溶解到葡萄酒中的成分做 了研究。 2002年烟台张裕葡萄酿酒公司的王霞和王恭堂等人30对国产橡木片( 青岛鲁 丰橡木制品有限公司生产) 和进口橡木片在干红葡萄酒和白兰地中的应用进行了研 究。2005年，华南理工大学曾新安等31研究了干红葡萄酒在橡木桶陈酿过程中溶解 氧的变化。 2006年黄卫东等32对橡木桶陈酿对葡萄酒中黄酮醇的含量影响作了研究。 2006年，温鹏飞等33以华夏酿酒有限公司2004年度赤霞珠为试材，研究了美洲、欧 洲和欧美三种类型橡木桶陈酿对黄烷- 3- 醇和原花色素含量及组成的影响。2008年崔 彦志等34研究了填桶频次对不国产橡木桶中葡萄酒理化指标的影响。 我国对橡木桶贮存葡萄酒的研究较少，且主要为对橡木桶陈酿阶段葡萄酒中类 黄酮类物质的研究。对葡萄酒在橡木桶中陈酿期间香气成分的研究少见报道，更没 有对国产橡木桶的研究。 河北科技大学硕士学位论文 4 1.4 研究的目的与意义 目前世界上最常用、最流行的用于制作橡木桶的橡树树种主要有 3 个， 即产于法 国、奥地利、捷克、斯洛文尼亚、波兰等欧洲国家的卢浮橡(quercus sesiliflora)和夏 橡(quercus. robur l.)以及主产于美国的美洲白栎(quercus.alba l.)5。 中国也有产自于本土的橡木，即蒙古栎， (quercus mongolica),又称蒙古柞、柞树。 主要分布于我国的东北三省和内蒙古自治区等地,为东北次生落叶阔叶林的主要组成 树种和我国的主要用材树种35。因为与欧美橡木同属一种植物，基本形态、树干的 基本成分是相同的。但是由于生长的土壤、气候等生长环境不同，橡木中微量成分 略有差别36。 国内葡萄酒行业各大葡萄酒公司使用的大多是进口的法国橡木桶和美国橡木 桶，只是一味的跟随老牌葡萄酒生产国家的潮流，并没有经过严格的实验研究考证 进口橡木桶对于自己企业所生产的葡萄酒储存是否适合。按中国 2008 年葡萄酒产量 69.83 万千升的 5 %计算， 有 3.4915 万千升葡萄酒需经过橡木桶陈酿， 按标准桶 225 l 计算橡木桶的需求量为 15.5 万个，橡木桶的需求量很大。 朗格斯酒庄( 秦皇岛) 有限公司投资300余万美元在酒庄兴建专属橡木桶厂，可年 产朗格斯橡木桶3600个，采用的全是长白山原始森林的高档橡木，橡木桶除了满足 朗格斯酒庄自身的需要外，还将向别的厂家出售。从而结束了国内高档葡萄酒用橡 木桶全部依赖进口的历史。因此国产橡木桶贮存葡萄酒的相关研究对于国产橡木桶 在葡萄酒陈酿中的应用具有很重要的意义。 在葡萄酒陈酿过程中，部分橡木成分会被浸入葡萄酒中，这些成分与来源于葡 萄原料的成分有着不同的结构和特性。因此本课题针对不同产地橡木制品进行浸提 实验，对其浸出的橡木成分进行对比，进而分析研究国产橡木桶可浸出成分的物质 组成，以及随着贮存时间的延长各成分的变化规律。本课题还以 2008 年赤霞珠干红 葡萄酒，针对朗格斯酒庄( 秦皇岛) 有限公司生产的新橡木桶和使用过一次和两次的 旧橡木桶，研究国产橡木桶贮存葡萄酒香气物质种类的变化和陈酿期间香气物质的 变化规律以及葡萄酒经国产橡木桶储存后形成的独有的香气及口感特色。并以不锈 钢罐贮存和法国产橡木桶作为对照。 本研究为中国产橡木桶在葡萄酒贮存陈酿中的应用提供理论依据，并为葡萄酒 生产企业建立橡木桶陈酿葡萄酒方面的依据，为企业生产有自己特色的陈酿型干红 葡萄酒作指导。 第 2 章 国产橡木浸出物质研究 5 第 2 章 国产橡木浸出物质研究 葡萄酒经橡木桶贮存后，葡萄酒的颜色、香气都会产生一系列的变化。陈酿葡 萄酒中的一些重要的香气物质只有经过橡木桶贮存才能获得。 橡木桶的香气物质成分很复杂，有源自于橡木的天然成分也有源于橡木桶加工 过程的烘烤。橡树的种类、产地、以及橡木板的自然风干、烘烤和橡木桶的桶龄、 桶容量等因素都会对葡萄酒香气产生影响。由于香气物质的挥发性和物质结构的差 异较大，对于橡木中的香气物质检测多应用气相色谱法，也有气相色谱和其他仪器 联合使用的手段。 本研究采用气相色谱仪与质谱仪联用的方法，对国产橡木可浸出的物质进行定 性与定量分析。 2.1 实验原料与仪器药品 2.1.1 实验原料 本研究所用国产橡木花和橡木片，采用长白山蒙古栎为原材料，经中度烘烤制 成，由朗格斯酒庄（秦皇岛）有限公司橡木桶厂提供；美国橡木片和法国橡木片为 中度烘烤，由中粮华夏葡萄酒有限公司提供。实验以 12 %（v/v）酒精和葡萄原酒两 种溶剂对橡木制品进行浸提。 2.1.2 仪器设备 agilent 7820 series gc system agilent technologies agilent 6890 series gc system agilent technologies agilent 7683b serices injector agilent technologies agilent 5973 network mass selective detector agilent technologies agilent hp- innowax capillary column (30m0.25mm0.25um) agilent technologies agilent 10ul injector agilent technologies ar1140 型电子分析天平 江苏常熟双杰测试仪器厂 jj500 型精密电子天平 美国双杰兄弟(集团)有限公司 旋转蒸发仪 巩义市英裕裕华仪器厂 微孔过滤器 高纯氮气 北温气体 河北科技大学硕士学位论文 6 delta 320 型 ph 计 梅特勒- 托利多仪器有限公司 101- oab 型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 spectrum 紫外分光光度计 756p 上海光谱仪器有限公司 2.1.3 实验试剂 糠醛(furfural) sigma- aldrich 糠醇(furfuryl alcohol) sigma- aldrich 愈创木酚(guaiacol) sigma- aldrich 反式橡木内酯(tran- oak lactone) sigma- aldrich 顺式橡木内酯(cis- oak lactone) sigma- aldrich 4- 乙基愈创木酚(4- ethyl guaiacol) sigma- aldrich 丁香酚(eugenol) sigma- aldrich 4- 乙基苯酚(4- ethyl phenol) sigma- aldrich 香草醛(vanillin) sigma- aldrich 正辛醇(3- octanol) 天津永大化学试剂开发中心 二氯甲烷(色谱纯) 天津永大化学试剂开发中心 无水硫酸钠(分析纯) 天津大茂化学试剂厂 氢氧化钠(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂 柠檬酸(分析纯) 北京化学试剂公司 磷酸二氢钠(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂 邻苯二甲酸氢钾(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂 酚酞(分析纯) 北京化学试剂公司 磷酸(分析纯) 北京化学试剂公司 钨酸钠(分析纯) 天津永大化学试剂开发中心 钼酸钠(分析纯) 天津市学试剂四厂 磷钼酸(分析纯) 天津市光复精细化工研究所 硫酸锂(分析纯) 天津永大化学试剂开发中心 溴水(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂 无水碳酸钠(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂 没食子酸(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂 单宁酸(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂 2.2 实验内容与方法 第 2 章 国产橡木浸出物质研究 7 2.2.1 实验内容 2.2.1.1 香气物质检测方法的建立 葡萄酒中香气物质的含量较低，需对样品进行浓缩处理，以达到一个较理想的 可检测浓度。之后对色谱条件进行摸索，很好的分离目标物质，然后依据标准品比 对相对保留时间，并结合质谱图进入谱库比对，最终达到能对目标香气物质进行准 确的定性定量分析的要求。 2.2.1.3 国产橡木制品浸出物质研究 橡木制品在浸提过程中，会溶出很多的橡木成分，这些橡木成分源于橡木的自 然生长过程、橡木的自然风干和橡木制品烘烤过程。主要有：橡木内酯，丁子香酚， 香草醛等。 本实验选取了由朗格斯酒庄（秦皇岛）有限公司橡木桶厂提供的橡木制品，以 12%（v/v）酒精和苹乳发酵后的葡萄原酒为浸提溶剂，试验中橡木制品的添加量为 4 g/l，研究国产橡木在酒精溶液和葡萄酒浸提过程中所释放的橡木成分。 2.2.2.2 不同产地橡木制品浸出物质对比研究 世界上用于制作橡木桶的橡木种类大约有 250 多种，由于其结构和成分的不同， 每一种橡木赋予葡萄酒的风味是不一样的。综合世界各地的成功经验来说最为常用 最为流行的树种主要有 3 个，即产于法国、奥地利、捷克、斯洛文尼亚、波兰等欧 洲国家的卢浮橡和夏橡以及主产于美国的美洲白栎。 为了对比国产橡木制品与其他橡木种类的橡木制品所浸出成分的差异，实验选 取了国产橡木、美国橡木、法国橡木三种橡木制品进行对比研究。 2.2.2 检测方法 2.2.2.1 样品处理 取 100 ml 葡萄酒样品，加入 100 ml 二氯甲烷，放入萃取漏斗摇匀，静置分层收 集下层有机相于旋转烧瓶中，重复操作三次。用旋转蒸发仪在 30 下蒸发浓缩至 5 ml，用无水 na2so4除去浓缩样中的残余水分，用 0.45 um有机滤膜过滤，并收集于 刻度定容管中。用高纯氮气吹扫样品继续浓缩至样品体积为 1 ml，加入 10 ul浓度为 3 ml/100ml 的正辛醇作为内标物，待测。 2.2.2.2 气相色谱仪检测香气物质条件 气相色谱仪进样口温度为250 ， 柱温箱程序升温为初始温度50 保持2 min， 以 5 /min的升温速率升至 240 并保持 10 min。检测器为氢火焰离子检测器， 检测器温度为 250 ，载气为氮气，流量 1 ml/min，不分流检测。 2.2.2.3 气相色谱仪- 质谱仪检测香气物质条件 河北科技大学硕士学位论文 8 气相色谱仪条件同 2.2.2.2，载气为氦气；质谱电离方式 ei，电离电压 70 ev，离 子源温度为 200 ，连接杆温度为 220 。 2.2.2.4 单宁的检测 单宁的检测，福林- 丹尼斯(folin- denis)法。 1)试剂与仪器 a) 福林- 丹尼斯试剂：在 750 ml 水中，加入 100 g钨酸钠(nawo4 2h2o)、20 g 磷钼酸(h3po5moo4)以及 50 ml 磷酸，回流 2 h，冷却，稀释至 1 000 ml。 b) 碳酸钠饱和溶液： 1 000 ml 水中加入 200 g无水碳酸钠，放置过夜。次日加 入少许水合碳酸钠(na2co3 10h2o)作为晶种，使结晶析出，用玻璃棉过滤后备用。 c) 单宁酸标准溶液： 称取 0.500 0 g单宁酸， 用水溶解， 定容至 100 ml(5 mg/ml)。 d) 可见光分光光度计。 2)测定步骤 a) 标准曲线的制备：吸取 0 ml、0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.5 ml、5.0 ml、 7.5 ml、 10 ml 单宁酸标准溶液用水分别定容至 50 ml， 分别取 1 ml 放入盛有 70 ml 水的 100 ml 容量瓶中，加入福林- 丹尼斯试剂 5 ml 及饱和碳酸钠溶液 10 ml，加水 至刻度，充分混匀。30 分钟后以空白作参比，在波长 760 nm 处测定吸光度，以吸光 度对单宁酸浓度绘制标准曲线，用线性回归法得到单宁标准曲线的方程。 b) 试样的测定： 吸取 0.51 ml 葡萄酒， 置于盛有 70 ml 水的 100 ml 容量瓶中， 加入 5 ml 福林- 丹尼斯试剂及 10 ml 饱和碳酸钠溶液，加水至 100 ml，充分混匀。 30 分钟后以水代替试样制成的空白作参比，在 760 nm波长处测定吸光度，由吸光度 带入标准曲线方程计算出单宁的浓度。 2.2.2.5 总酚的检测 总酚的检测，福林- 肖卡(folin- ciocalteu)法。 1)试剂与仪器 a) 福林- 肖卡试剂：称取 100 g钨酸钠和 25 g钼酸钠(na2moo4 2h2o)，将两者溶 于 700 ml 水中，倒入 2 l 圆底烧瓶中，加入 50 ml 85 %磷酸和 100 ml 浓盐酸，放 入几粒玻璃珠，用文火回流 10 h(可不连续)。回流后用 50 ml 水冲洗冷凝管上的附着 物，然后取下。加 150 g硫酸锂(liso4 2h2o)和几滴溴水(边加边摇)至金黄色，加热 沸腾 15 分钟，去除残余溴，用水稀释至 1000 ml，于棕色瓶中保存。 b) 200 g/l 碳酸钠溶液：称取 200 g无水碳酸钠溶于 1 l 沸水中，冷却至室温后， 加数块结晶碳酸钠晶种，24 h后过滤。 c) 酚标准溶液：称取 0.500 0g没食子酸，用水溶解，定容至 100 ml(5 mg/ml)。 d) 可见分光光度计。 2)测定步骤 第 2 章 国产橡木浸出物质研究 9 a)标准曲线的绘制：吸取酚标准溶液 0 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5 ml、 3.0 ml、 5.0 ml 分别置于 100 ml 容量瓶中用水定容。 此溶液的酚浓度分别是 0 mg/l、 50 mg/l、75 mg/l、100 mg/l、125 mg/l、150 mg/l、250 mg/l。从各溶液中分别吸 取 1 ml 放入另外的 100 ml 容量瓶中，各加入 60 ml 水，混合，并加入 5 ml 福林- 肖卡试剂，充分混合。在 30 s 至 8 min 内加 15 ml 200 mg/l碳酸钠溶液，加水定容 至刻度，混匀。再 20 下放置 2 h后，以 1 号瓶作为空白在波长 765 nm 下测其吸 光度。以吸光度对酚浓度绘制标准曲线，用线性回归法得到总酚标准曲线的方程。 b)样品测定：吸取 0.1 ml酒样按上操作，测定吸光度。 c)计算：样品测得吸光值，带入总酚标准曲线得出总酚的浓度，乘以 10 即为酒 样中总酚实际含量。 2.3 结果与讨论 2.3.1 香气物质检测方法建立 在气相色谱分析中的定性分析主要是依据特征性不是很强的保留值，但保留值 的比对需要已知标准物质进行比对。由于即使保留值完全相同的两个峰，也有可能 是两种不同的物质，因此最终准确确定色谱图中的未知物质峰还需要一些辅助技术。 本研究采用 gc- ms 联合定性， 依据样品色谱图与标准品色谱图的相对保留值和各物 质的质谱图结果对检测物质定性。 图 2- 1 为标准品的总离子流图。 由图可看出实验确定的香气物质检测方法能够很 好的把各香气物质进行分离检测，各物质峰的相对保留值相互独立，且色谱分离的 峰型较好。 图 2- 2 为标准品和样品的总离子流对比图， 比对样品色谱图与标准品色谱 图可以看出，该检测方法基本能够对各香气物质进行定性。 河北科技大学硕士学位论文 10 图 2- 1 标准品总离子流图 fig. 2- 1 standard total ion flow diagram 注: （1 糠醛, 2糠醇, 3愈创木酚, 4反式橡木内酯, 5 顺式橡木内酯, 6 4- 乙基愈创木酚, 7丁香酚, 8 4- 乙基苯酚, 9 香草醛） 分钟 1 01 21 41 61 82 02 22 42 62 83 03 23 43 63 8 p a 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 p a 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 后部信号 0 9 0 8 0 9 取0 8 闪赤新桶0 9 0 9 2 2 保留时间 峰面积 后部信号 混标校准1 0 0 1 1 9 图 2- 2 标准品与样品总离子流图 fig. 2- 2 standard and sample total ion flow diagram 第 2 章 国产橡木浸出物质研究 11 图 2- 3 至图 2- 11 为各香气物质的质谱图。通过质谱图与质谱图谱库进行比对， 并结合各香气物质质谱扫描的特征性 m/z 离子片段比对，最终准确定性葡萄酒样品 检测时的香气物质。特征 m/z为：糠醛 m/z=96；糠醇m/z=97；愈创木酚 m/z=109， 124；反式橡木内酯 m/z=70，99；顺式橡木内酯 m/z=71，99；4- 乙基愈创木酚 m/z=137；丁香酚 m/z=164；4 - 乙基苯酚 m/z=107；香草醛 m/z=151，152。最终定 性结果依总离子流色谱图出峰顺序依次为糠醛、二氯甲烷(溶剂)、糠醇、愈创木酚、 反式橡木内酯、顺式橡木内酯、4- 乙基愈创木酚、丁香酚、4- 乙基苯酚、香草醛。 图 2- 3 糠醛质谱图 fig. 2- 3 mass spectrum of furfural 图 2- 4 糠醇质谱图 fig. 2- 4 mass spectrum of furfuryl alcohol 河北科技大学硕士学位论文 12 图 2- 5 愈创木酚质谱图 fig. 2- 5 mass spectrum of guaiacol 图 2- 6 反式橡木内酯质谱图 fig. 2- 6 mass spectrum of tran- oak lactone 图 2- 7 顺式橡木内酯质谱图 fig. 2- 7 mass spectrum of cis- oak lactone 第 2 章 国产橡木浸出物质研究 13 图 2- 8 4- 乙基愈创木酚质谱图 fig. 2- 8 mass spectrum of 4- ethyl guaiacol 图 2- 9 丁香酚质谱图 fig. 2- 9 mass spectrum of eugenol 图 2- 10 4- 乙基苯酚质谱图 fig. 2- 10 mass spectrum of 4- ethyl phenol 河北科技大学硕士学位论文 14 图 2- 11 香草醛质谱图 fig. 2- 11 mass spectrum of vanillin 2.3.2 国产橡木制品浸出物质研究 橡木制品中的可溶出成分与橡木的干燥方式和橡木桶加工过程中的烘烤程度有 很大关系。实验中所用国产橡木制品均为经过三年自然风干的蒙古栎，橡木花为加 工过程中产生的刨花，未经烘烤，橡木片的烘烤程度为中度烘烤。由于橡木花相对 表面积较橡木块大所以从其中浸出的橡木成分含量较大，浸出速度较快。但是由于 未经烘烤，其浸出成分与橡木块有明显差异。橡木花和橡木块浸出单宁与总酚的含 量以及浸出量和浸提时间曲线见图 2- 12，标准曲线方程见表 2- 1。 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 2481 21 62 02 4 时间/ 天 单宁含量/ (mg l- 1) 橡木花橡木块 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 2481 21 62 02 4 时间/ 天 总酚含量/ (mg l- 1) 橡木花橡木块 图 2- 12 单宁和总酚浸出含量变化曲线 fig.2- 12 the tannin and total phenols content leaching curve 第 2 章 国产橡木浸出物质研究 15 表 2- 1 标准曲线方程 tab. 2- 1 standard curve equation 名称 标准曲线方程 r2 单宁 y=0.007x1+0.0104 0.9980 总酚 y=0.0014x2+0.0042 0.9996 注：y，吸光度；x1，单宁含量；x2总酚含量 由图 2- 12 可看出，橡木制品单宁和总酚的浸出变化趋势基本相同，橡木花中单 宁和总酚的浸出量和浸出速率明显高于橡木块。从浸提开始到浸提 12 天时均出现高 峰值，随浸提时间的延长，单宁和总酚的含量均有下降，后期略有回升。由于从橡 木中浸出的酚类物质被氧化，所以酚类物质的检出量随之变化，因此浸出曲线出现 上下波动。浸提 2 4 天后橡木花浸出单宁含量为 60.8 mg/l，总酚含量为 59.2 mg/l， 橡木块浸出单宁含量为 10.8 mg/l, 总酚含量为 18.5 mg/l。 橡木块中香气物质浸出量随浸提时间的延长而变化，具体浸出量数据见表 2- 2。 由表 2- 2 数据可看出其中糠醛、 香草醛和愈创木酚的浸出量随着浸提时间的延长 逐渐增加，并逐渐趋于平缓。其中糠醛和香草醛的浸出量相对较大，糠醛含量为 452.237 ug/l，香草醛含量为 714.674 ug/l。愈创木酚和糠醇均为浸提 8 天后才有检 出，且糠醇的浸出含量较小。丁香酚含量随着浸提时间的延长其含量先增大后减小 后期痕量检出，且最大浸出量也较低，造成丁香酚先增大后减小的趋势是由于丁香 酚容易被氧化，浸提前期由于浸出速率相对较快故呈现缓慢上升趋势，随着浸提速 率的降低和氧化反应的发生，因此在浸提后期丁香酚的含量呈降低趋势。橡木内酯 的浸出含量随浸提时间的延长均呈现先增大后减小的趋势。其中顺式橡木内酯的含 量明显高于反式橡木内酯，其含量比例情况与 garde- cerda n等人 2002 年的文献报 道的其他橡木树种相似 38。 橡木花中香气物质的浸出情况见图 2- 13。 表 2- 2 橡木块中香气物质浸出含量 tab. 2- 2 the content of aroma substances leaching of oak block (ug l- 1) 时间/ 天 糠醛 糠醇 愈创木酚 反式橡 木内酯 顺式橡 木内酯 4- 乙基 愈创木酚 丁香酚 4- 乙基 苯酚 香草醛 2 267.266 0 0 7.748 27.438 0 5.062 0 241.925 4 322.317 0 0 10.337 29.398 0 13.041 0 221.911 8 370.139 0 6.504 8.953 38.334 0.678 6.848 0 310.958 12 399.762 0 73.714 13.042