（发酵工程专业论文）丙酮丁醇梭菌的改良及发酵工艺的研究.pdf

摘要 摘要 丙酮一丁醇发酵是一项传统的大宗发酵，曾经是仅次于酒精发酵的世界第二大发酵 过程。但在上世纪五十年代以后，由于石化工业的迅速发展，丙酮一丁醇发酵逐渐衰退。 近年来，由于石油等化石资源的日益匮乏，丙酮一丁醇发酵作为转化生物质为化学品和 液体燃料的重要手段重新引起人们的广泛关注。但丙酮一丁醇发酵目前还存在产物浓度 低、生产效率低等问题，这些问题严重制约了该产业的发展，因此开展高产菌株的选育、 发酵工艺优化的研究十分必要。 本论文以实验室保藏的丙酮丁醇梭菌作为出发菌株，经过紫外线和亚硝基胍复合诱 变，选育出一株高产菌株e 1 1 ，在未优化的条件下，其总溶剂产量为1 7 2 0g l ，比原始 出发菌株的产量提高了1 6 ，经过多次传代接种，表现出较好的遗传稳定性。 以总溶剂产量作为主要参考指标，确定了最佳发酵工艺条件：玉米浆浓度3 ，玉 米醪浓度7 ，l 一半胱氨酸浓度0 1 、初始p h 5 2 、接种量8 、培养温度3 7 。在优 化的条件下，总溶剂产量为1 8 7 9g l 。 考察了部分代谢副产物( 乙酸和丁酸) 对菌体生长和溶剂合成的影响，以期提高丙 酮丁醇发酵的生产效率。实验结果表明：发酵液中乙酸或丁酸的过量积累不但抑制菌体 生长，加速菌体退化，同时抑制目的产物的合成，但向培养基中添加适量的乙酸或丁酸 可以促进细胞生长和溶剂的合成。与对照组相比，培养1 4h 后添加1 5g l 乙酸的效果 最为明显，最大生物量、最终生物量分别提高了9 5 9 和1 2 7 6 ；发酵结束时乙酸的质 量浓度比对照组降低了1 9 0 2 ，丙酮的最终质量浓度提高了2 0 ，由5 4 0g 几提高到 6 5 0g l ：与对照组相比，在培养1 4h 后添加2 0g l 丁酸的效果最为明显，最大生物量、 最终生物量分别提高了3 7 7 和3 0 6 ，发酵结束时丁酸的质量浓度降低了3 3 3 ，乙 酸的质量浓度降低幅度不明显，丁醇的最终质量浓度提高了1 1 6 ，由1 1 5 1e , t ，提高到 1 2 8 4g l ，丙酮最终质量浓度变化较小。 关键词：丙酮丁醇发酵；丙酮丁醇梭菌；诱变；代谢副产物 a b s t r a c t a b s t r a c t t 1 1 ea c e t o n e b u t a n o lf e r m e n t a t i o ni so n eo ft h eo l d e s tk n o w ni n d u s t r i a lf e r m e n t a t i o n s n w a sr a n k e d s e c o n do n l yt oe t h a n o lf e r m e n t a t i o ni ni t ss c a l eo fp r o d u c t i o n ，a n dw a so n eo ft h e l a r g e s tb i o t e c h n o l o g i c a lp r o c e s s e se v e rk n o w n h o w e v e r , s i n c et h e19 5 0 。si n d u s t r i a la b e f e r m e n t a t i o nh a sd e c l i n e dc o n t i n u o u s l y c u r r e n t l ya b ef e r m e n t a t i o ni sb e c o m i n gm o r e a t t r a c t i v ef o rp r o d u c i n gc h e m i c a l sa n dl i q u i df u e l sd u et ot h ee x h a u s t i o no fn a t u r a lo i la n dg a s r e s o u r c e s h o w e v e r ，b e i n gl o wi nb o t hs o l v e n ty i e l da n dp r o d u c t i o ne f ! f i c i e n c ym a k e s a c e t o n e b u t a n o lf e r m e n t a t i o nu n e c o n o m i c a l t h e r e f o r e t h es t u d yo nb r e e d i n go fh i g hy i e l d s t r a i na n do p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yi sa b s o l u t e l yn e c e s s a r y i nt h i sp a p e r , c 肠s t r i d i u ma c e t o b u t ) 7 l i c u mw a st r e a t e dw i t hu va n dn t gam u t a n tn a m e d e 1 1w a ss e l e c t e d u n d e rt h eu n o p t i m i z e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n t h ey i e l do ft o t a ls o l v e n t w a s17 2 0 l ，i n c e a s e db y16 t h a nt h a to ft h eo r i g i n a ls t r a i n t h em u t a n tw a sg e n e t i c a l l y s t a b l e w i t hs o l v e n tp r o d u c t i o na st h em a i ni n d e x ，t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d ： t h ec o n c e n t r a t i o no fc o r ns t e e pl i q u o r ，c o r ns t a r c h , l c y s t e i n e ，t e m p e r a t u r e ，i n i t i a lp h ，a n d i n o c u l a t i o nq u a n t i t i e sw e r e l ，7 ，o 1 ，3 7 ，5 2 ，8 ，r e s p e c t i v e l y t h et o t a ls o l v e n ty i e l d r e a c h e d18 7 9 9 lu n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s t oi m p r o v ea c e t o n e b u t a n o l p r o d u c t i o ne 伍c i e n c yo f c d s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m b y - p r o d u c t s ，w h i c hw e r et h eb y - p r o d u c t so ff e r m e n t a t i o n , w e r ea d d e di nt h ef e r m e n t a t i o n p r o c e s st oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fb y p r o d u c t so nc e l lg r o w t h ，p r o d u c t i o no fa c e t o n e - b u t a n o l a n do t h e rb y p r o d u c t s a d d i t i o no f1 5 9 e la c e t a t ec o u l da c c e l e r a t et h ec e l lg r o w t ha n d e n h a n c ea c e t o n ep r o d u c t i o n t 1 1 eb i g g e s tb i o m a s sa n df i n a lb i o m a s sw e r ei n c r e a s e db y9 5 9 a n d12 7 6 r e s p e c t i v e l y a n dt h ef i n a lc o n c e n t r a t i o no fa c e t o n ew a si n c r e a s e dt o6 5g lb y 2 0 w h i l et h eb u t a n o lp r o d u c t i o nc o u l d n tb ee n h a n c e d a d d i t i o no f2 0g lb u t y r i ca c i d c o u l da l s oa c c e l e r a t ec e l lg r o w t ha n de n h a n c eb u t a n o lp r o d u c t i o n t h eb i g g e s tb i o m a s sa n d f i n a lb i o m a s sw e r ei n c r e a s e db y3 7 7 a n d3 0 6 r e s p e c t i v e l y a n dt h ef i n a lc o n c e n t r a t i o n o fb u t a n o lw a si n c r e a s e db y1 1 6 r e a c h e d12 8 4g l w h i l et h ea c e t o n ep r o d u c t i o nc o u l d n t b ee n h a n c e d k e y w o r d s ：a c e t o n e b u t a n o lf e r m e n t a t i o n ；c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ；m u t a n t ；b y - p r o d u c t s 独创巨声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 盗坚 日 期： 沙3 、6 2 2 ， 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 乃 协波 日 期：留厶) 1 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 丙酮一丁醇发酵的发展情况 丙酮一丁醇发酵工业是最为古老的发酵工业之一，曾经是仅次于酒精发酵工业的大 规模生物技术产业。其发展与产丙酮一丁醇的微生物发现、产品用途的开发及原料的选 用有关，同时也受到政治、军事和经济的影响【l j 。 早在1 8 5 2 年，w u r t z 首先发现丁醇是杂醇油的一种常见成分。1 8 6 1 年p a s t e u r 观察 到乳酸及乳酸钙用于丁酸发酵时，丁醇以副产物出现。1 9 5 0 年s c h a r d i n g e r 从马铃薯中 分离得到一种好氧性菌b a c i l l u sm a c e r a n s ，该菌发酵淀粉可生成丙酮和乙醇等。 1 9 1 1 年，f e m b a t h 教授受英国s t r a n g & g r a h a m 公司的委托，在研究丙酮的合成过 程中，分离获得f 池型菌。该菌除能生成丁醇外，还可生成丙酮。但是该菌只适用于发 酵马铃薯淀粉，不适用于其他淀粉质原料，应用范围受到了限制，后来逐渐被淘汰。 1 9 1 4 年著名的w e i z m a n 博士成功地分离得到一种丙酮丁醇菌，属于b y 型菌。它能 发酵多种淀粉质原料，且发酵产物中丙酮含量比f i t z 型菌提高了4 倍，溶剂生成比例是： 丁醇：丙酮：乙醇= 6 ：3 ：1 ( 即b ：a ：e = 6 ：3 ：1 ) ，该菌后来被命名为c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m w e i z m a n 。此菌的发现为丙酮一丁醇发酵的工业化奠定了基础，促进了丙酮一丁醇发酵工 业的发展。 1 9 1 4 年8 月第一次世界大战爆发，丙酮需求量激增，英国为了制造纸状炸药对发酵 法生产丙酮非常重视。1 9 1 4 年英国建立了世界上第一座丙酮发酵工厂，由于使用了 w e i z m a n 的方法，生产获得了成功。英国当时由于粮食紧缺，1 9 1 6 年将工厂移到玉米丰 产的加拿大，在多伦多成立了英国丙酮公司，后来又在美国成立了多家丙酮发酵工厂。 在第一次大战期间，因供应军火需要，丙酮的需求量大幅增加，当时将丙酮丁醇发酵 工业称为丙酮发酵工业。但在生产过程中得到了大量的丁醇，由于当时没有发现丁醇的 利用价值而积储起来。大战结束后，杜邦公司首先发现：丁醇可制得乙酸丁酯，可用作 硝酸纤维喷漆的优良溶剂。因此，丁醇由积压的废物一跃成为宝贵的溶剂，丙酮一丁醇 发酵工业又改称为丁醇发酵- r - 业t 2 。 1 9 4 2 年1 2 月爆发了第二次世界大战，日本的丁醇被封锁。由于丁醇的作用非常重 要，它不仅是飞机翼涂料的溶剂，而且又可用作高辛烷值的航空燃料的原料，所以日本 积极研究丙酮一丁醇发酵技术，不久由日本科研工作者分离得到利用糖蜜发酵的菌种， 在中国台湾利用糖蜜发酵生产丁醇，年产总溶剂2 5 万吨。 美国在1 9 4 5 年改用以糖蜜等廉价原料进行生产，丙酮一丁醇发酵工业取得长足发展。 与此同时，丁醇的用途越来越广，逐渐应用到增塑剂、邻苯二甲酸二丁酯( d b p ) 等方 面，丙酮在醋酸纤维素、维生素c 及有机玻璃等方面的应用也引起人们的重视。 江南大学硕士学位论文 由于糖一醋丁基梭菌( c l o s t r i d i u ms a c c h a r o a c e t b u t y l i c u m ) 和糖一丁基一丙酮梭菌 ( c l o s r i d i u ms a c c h a r o b u t y l - a c e t o n i c u m l i q u e f a c i e n s ) 的获得和比玉米廉价的糖蜜两个条 件的具备。美国在1 9 3 6 年威斯曼专利法定期满后，先后在特尔豪、费城、马里来、波 多里及日本等地兴建了许多丙酮一丁醇发酵工厂。发酵罐容积达到1 9 0 1 9 0 0m 3 。虽然通 过石油化工合成丁醇在上世纪3 0 年代末期已告成功，但是发酵法仍占主要地位。上世 纪6 0 年代，随着石油工业的快速发展，美国、日本等发达国家开始通过石油合成方法 生产丙酮、丁醇，发酵法生产丙酮一丁醇逐渐被淘汰。只有中国、前苏联和南非由于特 殊的政治和历史原因，继续维持丙酮一丁醇的发酵生产。近年来，由于世界经济的高速 发展，石油消耗量快速增长，石油价格持续攀升，丁醇、丙酮价格长期高位徘徊，古老 的丙酮一丁醇发酵技术，作为一种有效的、利用生物质资源生产重要平台化合物及燃料 的生物转化技术，又开始重新被人们重视【2 j 。 1 1 2 我国丙酮一丁醇发酵工业现状 1 9 5 4 年底，我国依靠自己的力量首先建成了上海溶剂厂，随后各省市也纷纷新建了 很多发酵法生产溶剂的工厂，丙酮一丁醇发酵工业取得了长足发展。在众多发酵工厂中， 绝大多数工厂采用玉米和山芋干为原料，少数工厂也曾采用过糖蜜、大米等其它淀粉质 原州2 1 。 我国丙酮、丁醇的产品质量已达到国际先进水平，并且还出口到海外。原料和能源 的消耗也相当低，达到世界一流水平。菌种方面采用我国自行选育的优良菌种，发酵速 度快、得率高，还具有抗噬菌体特性。技术方面，我国完全有能力自主设计、制造、安 装、调试、生产。经过多年的发展，造就了一大批这方面的技术人才。但是从上世纪9 0 年代开始，随着石油化工产业的发展，通过石油化工合成溶剂的成本大幅降低，我国的 丙酮- 丁醇发酵工业逐渐衰退，19 9 6 年我国最后一家利用发酵法生产丙酮一丁醇的厂家关 闭。 2 0 0 4 年以来石油价格持续攀升，2 0 0 7 年国际原油价格每桶逼近1 0 0 美元，通过石 油化工获得丙酮、丁醇成本大幅提高，通过发酵法生产丙酮、丁醇重新显示出其优势。 2 0 0 4 年河南天冠企业集团公司下属的上海天之冠可再生能源有限公司和中国科学院上 海生命科学研究院正式签订了丙酮- 丁醇发酵技术合作项目，双方决定在“改进丙酮一丁 醇发酵技术 的相关项目方面开展合作研究，加快其产业化进程。2 0 0 7 年6 月由联通实 业、上由房地产公司等公司投资8 0 0 0 万美元兴建了江苏联海生物科技有限公司，设计 年产2 0 万吨正丁醇、1 0 万吨丙酮，一期工程将于2 0 0 8 年6 月竣工，同时国内其它溶剂 生产厂家也在恢复生产。 1 1 2 国内外研究现状 目前，国内外丙酮、丁醇的生产主要通过石油化工合成获得。丙酮的生产主要通过 丙烯直接氧化( w a c k e r ) 法、异丙醇法、异丙苯法生产，丁醇的生产主要是采用丁辛醇联 产技术丙烯羰基合成法。近年来，随着石油价格的持续上涨，通过石油化工方法生 产丁醇、丙酮的成本大幅提高，给发酵法生产丙酮、丁醇带来了新的机遇。目前，制约 2 第一章绪论 丙酮一丁醇发酵生产的主要因素有：转化率低，产量低，生产强度低，发酵后处理复杂 以及原料成本较高等。为了解决上述问题，在经济上能与石油化工法相竞争，自上世纪 六十年代以来，世界各国科研工作者在菌种改造、发酵底物、代谢途径、产物分离等方 面进行了大量研究【3 1 ，我国科研工作者对丙酮一丁醇发酵也进行了一系列探索，中国科学 院微生物研究所1 9 5 9 年在微生物学通讯发表了我国关于丙酮一丁醇发酵研究的第一 篇学术论文，1 9 8 5 年焦瑞生、孙志浩等人发表了丙酮一丁醇连续发酵研究和生产的学术 论文。1 9 9 6 年中科院上海植物生理研究所成功筛选出高丁醇比丙酮丁醇梭菌，总溶剂在 2 0g l ，其中丁醇稳定在7 1 9 【4 】。1 9 9 8 年陈守文等人进行了利用纤维质原料发酵生产丙 酮一丁醇的研究【5 】，但是近年来我国在这一领域的研究较少，而且研究不够深入。随着代 谢工程和基因工程技术的发展，国外科研工作者已经在基因水平对丙酮一丁醇发酵进行 研究，1 9 8 9 年获得了c l o s 护i d i u m a c e t o b u t y l 纪甜肌a t c c8 2 4 的全基因序列i o j ，并且在发 酵分离耦合技术方面也取得长足的进步，在这些方面我国的差距还比较大。 丙酮一丁醇发酵的各产物中，由于丁醇在价格和应用等方面的价值远高于丙酮，如 何提高丁醇的生产能力成为国内外研究的热点和难点【7 】。丙酮丁醇梭菌丙酮一丁醇发酵代 谢途径如图1 1 所示，代谢支路较多，如何使代谢流更多的流向丁醇是解决丁醇生产能 力较低的关键 8 l 。近年来的研究表明，为了解决丙酮一丁醇发酵所面临的上述问题，最有 希望的方法是利用基因工程和代谢工程手段对丙酮丁醇梭菌进行改造。h a n sb l a s c h e k 等 人通过同源重组使得s o l r 基因( 编码假定的丁醇、丙酮阻遏物) 失活获得了丁醇最终浓 度提高3 2 倍的突变株；通过过度表达雄因编码的质粒获得的突变株能将丁醇的浓度 由1 3 1 9 l 提高到1 6 4 9 l 。通过使p 细基因失活降低磷酸转乙酰酶( p t a ) 和乙酸激酶( a k ) 的活力能大幅降低乙酸的产生；通过使6 甜堪因失活能降低丁酸激酶( b k ) 的活力从 而降低丁酸的产量，提高丁醇的产量。与野生菌相比，丁醇升至5 0 ，丙酮降至2 0 5 0 p j 。 尽管基因工程手段被认为是最有前途的手段之一，且c l o s 护i d i u m a c e t o b u t y l i c u ma t c c 8 2 4 的全基因序列已经获得，但是由于丙酮一丁醇发酵途径极其复杂以及在代谢过程中基 因控制很难操作，所以在这一领域的进展很缓慢。目前为止，尚没有基因工程菌能适合 工业化生产【l o 】。 在借助基因工程手段对菌种进行改造的同时，国外科研工作者通过研究新的发酵工 艺来提高丙酮一丁醇发酵的生产能力，如使用细胞回流和固定化细胞技术来提高细胞浓 度和反应器的效率，以及通过萃取发酵来减弱产物抑制 。在a b e 发酵过程中通过旋 转过滤反应器使细胞循环，可以使细胞量达到4 9g l ，丁醇的生产效率达到1 1 4g l h 。 通过固定化细胞技术可以提高细胞浓度并且使发酵液中菌体残留量减少，从而减轻产物 提取的压力【1 2 】。通过萃取发酵可以在原位将丁醇从发酵液中移出，使丁醇的生产效率提 高两倍。虽然各国科研工作者对上述工艺进行了探索，但是目前通过丙酮丁醇一发酵生 产丁醇的最高浓度仍低于2 0g l ，生产效率低于4 5g l h ，并且由葡萄糖生产丁醇的产 率低于2 5 ( w w ) 【1 3 】。 江南大学硕士学位论文 丙酮 乳酸 葡 氧化型红 还原型红 c o a 图1 1 丙酮一丁醇发酵代谢途径 f i g 1 1a b ef e r m e n t a t i o np a t h w a y so f c l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i u m 酶代号：a - 3 - 磷酸甘油醛脱氢酶；b - 丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；c - n a d h 铁氧还蛋白氧化还原酶：d - n a d p h - 铁氧还蛋白氧化还原酶；e n a d h 一红素氧还蛋白氧化还原酶； f - 氢酶g 磷酸酰基转移酶；h - 乙酸激酶； i 硫激酶；j - 3 - 羟基丁酰- c o a 脱氢酶； k _ 巴豆酸酶：1 丁酰c o a 脱氢酶； m 磷酸丁酰转移酶；n - 丁酸激酶：o - 乙醛脱氢酶；p 乙醇脱氢酶；q 丁醛脱氢酶；r - 丁醇脱氢酶；s - 乙酰乙酰c o a ：乙酸丁酸：c o a 转移酶；t - 乙酰 乙酸脱羧酶；u - 葡萄糖磷酸变位酶： v - a d p 葡萄糖焦磷酸化酶；w 淀粉糖合成酶；x - 淀粉糖磷酸化酶 4 第一章绪论 2 0 0 1 年美国环境能源公司和俄亥俄州州立大学共同合作开发出二步法发酵工艺，如 图1 2 所示，通过二步法发酵简化了复杂的发酵途径，通过引导葡萄糖发酵产生丁酸， 再进行发酵生产丁醇【1 4 】。通过二步法发酵丁醇的产率大于4 0 ( w w ) ，这几乎是传统 发酵的两倍。该工艺采用两个不同的菌种，在发酵过程中通过调控可以让两个菌种在各 自最佳的p h 和温度下进行发酵，该工艺可以提高反应器的生产效率，使得生产效率达 到8 1 5g l l a 。 固定 反应 淀粉 丁酸 丁醇 提取装置 图1 - 2 二步法发酵示意图 f i g 1 - 2at w o s t e pf e r m e n m t i o np r o c e s s 在丙酮一丁醇发酵过程还伴有大量氢气的产生，长期以来一直被当做废气排放，2 0 0 1 年美国环境能源公司研发出新的发酵工艺，可以将发酵过程中产生的氢气收集利用，这 使得丙酮丁醇发酵工业更富有竞争力【l5 1 。 1 2 丙酮、丁醇的性质和用途 1 2 1 丙酮的性质及用途 丙酮又称醋酮或二甲基酮，是饱和脂肪酮系列中最简单的酮，分子式c h 3 c o c h 3 。 以游离状态存在于自然界中，在植物界主要存在于精油中，如茶油、松脂精油、柑橘精 油等：人尿和血液及动物尿、海洋动物的组织和体液中都含有少量的丙酮。糖尿病患者 的尿中丙酮的含量异常地增多。无色易燃液体，有特殊气味。熔点9 5 3 5 ，沸点5 6 2 ，相对密度o 7 8 9 9 。能溶于水、乙醇、乙醚及其他有机溶剂中。蒸气与空气混合可形 成爆炸性混合物，爆炸极限2 5 5 1 2 8 ( 体积) 。 丙酮是一种重要的有机原料，主要用于生产醋酸纤维素胶片薄膜塑料和涂料的溶 剂。丙酮与氢氰酸反应所得的丙酮氰醇( a c h ) 是制备甲基丙烯酸甲酯( m m a ) 的原料。丙 酮也是制备环氧树脂、聚碳酸酯中间体双酚a 的原料。丙酮除作为维生素c 的原料外， 还可用作各种微生物与激素的萃取剂，石油炼制的脱蜡溶剂以及用作制造其他合成材料 的原料等，用途十分广泛【1 6 】。 1 2 2 正丁醇的性质及用途 正丁醇又称1 丁醇，习惯上简称丁醇，化学式为c 挪l o o 。无色透明液体，具有强 江南大学硕士学位论文 烈的气味，稍溶于水，能溶解很多有机化合物，有毒、易燃，属二级易燃危险品。 丁醇是一种重要的c 4 平台化合物，也是一种战略性产品，用途非常广泛，主要用于 邻苯二甲酸正丁酯、脂肪二元酸和磷酸丁酯、丙烯酸丁酯及醋酸丁酯等的合成；可经过 氧化生产丁醛或丁酸；还可用作油脂、医药和香料的提取溶剂以及醇酸树脂的添加剂等。 此外，可用作有机染料和印刷油墨的溶剂、脱蜡剂。我国丁醇主要用于生产醋酸丁酯、 丙烯酸丁酯、邻苯二甲酸二丁酯及医药中间体等，用量较大的是醋酸丁酯、丙烯酸丁酯 和邻苯二甲酸二丁酯( d b p ) ，分别占我国丁醇消费总量的3 2 7 、1 5 3 和9 。 丁醇还是一种重要的具有极大潜力的新型生物燃料，无论是燃烧值还是辛烷值丁醇 都与汽油接近。同时，丁醇可按高比例与汽油进行混合作为燃料，而不需要对汽车进行 改装；比使用汽油与乙醇的混合燃料更实惠。丁醇的低蒸汽压力和疏水性，使得丁醇的 运输依靠现有的汽油输送管道及分销渠道成为可能，这充分表明丁醇是理想的汽油替代 燃料。 1 3 立题意义及研究意义 目前，世界上丙酮的生产方法主要有异丙苯法、微生物发酵法、异丙醇脱氢法、丙 烯直接氧化法( w a c k e r 法) 、醋酸副产法以及乙炔水合法等。其中，异丙苯法是目前丙酮 最为经济的生产方法，世界上约9 3 的丙酮是通过该方法生产的。随着国际原油价格的 持续上涨，通过异丙苯法生产丙酮的成本提高，发酵法重新获得青睐。 近年来我国丙酮的需求情况如表1 1 所示，从1 9 9 8 年开始，我国丙酮的产量逐年提 高，1 9 9 8 年丙酮产量仅为1 1 5 7 万吨，2 0 0 5 年达到2 8 o o 万吨。但是由于我国丙酮的生 产能力不能满足实际生产的需求，因此每年都需要大量进口，1 9 9 8 年我国丙酮的进口量 为6 7 1 万吨，2 0 0 5 年达到3 3 7 4 万吨，自给率由6 2 5 下降到4 5 4 【l 。 随着我国汽车、建筑及冶金工业的迅猛发展，预计到2 0 1 0 年，我国丙酮的总消费 量将达到约9 0 o 万吨，届时仍存在较大的市场缺1 ：3 1 8 j 。但是由于石油价格的上涨，通 过石油化工获得丙酮的成本增加，这为丙酮丁醇发酵工业的发展提供了契机。 表1 1 近几年我国丙酮需情况 t a b1 1r e c e ms u p p l ya n dd e m a n do f a c e t o n ei nc h i n a 6 第一章绪论 丁醇在我国主要作为一种重要的平台化合物，由于丁醇经酯化、取代、消去、还原、 氧化等化学反应可以生成丁二烯、丁胺、丁醛、丁酸等重要的化工原料，因此丁醇在化 学工业中发挥着重要作用。目前，我国正丁醇的生产厂家有2 0 多家，总生产能力约为2 0 万吨年，生产工艺主要采用羰基合成法和发酵法，其中采用合成法的生产能力约占正丁 醇总生产能力的8 0 。近几年我国丁醇的供需情况如表1 2 所示，虽然近年来我国丁醇 的产量有很大提高，但仍然不能满足国内实际生产的需求，进口量已经占到国内总消费 量的约5 0 ，近几年我国丁醇的进口情况为：1 9 9 6 年的进口量为8 2 5 万吨年，2 0 0 3 年的 进口量为2 9 5 8 万吨。随着国际原油价格的上涨，正丁醇的价格在2 0 0 7 年8 月份突破1 4 0 0 美刀吨 1 9 1 。 表1 2 近几年我国丁醇的供需情况 t a b l e1 - 2r e c e n ts u p p l ya n dd e m a n do fb u t a n o li nc h i n a 我国丁醇的应用领域仍以增塑剂为主，随着我国p v c 树脂的发展( 2 0 0 5 年需求7 0 0 万吨，2 0 1 0 年将达9 5 0 万吨) 及其应用领域的不断扩大，丁醇的需求量将大幅增加，预计 2 0 1 0 年国内丁醇需求量将达7 5 万吨【1 9 】，通过石油化工法生产丁醇已经不能满足日益增 长的需求，迫切需要寻找新的生产方法。 乙醇作为一种重要的可再生的燃料已经引起足够的重视，但丁醇的在燃料方面的重 要性尚未引起足够的重视。与乙醇相比，丁醇具有以下明显的优势，如表1 3 所示。 表1 3 各种生物燃料的燃烧值及辛烷值 t a b l e1 3t h ee n e r g yc o n t e n to fd i f f e r e n tb i o d i s e l 可以看出无论是燃烧值还是辛烷值丁醇都最接近汽油。此外丁醇亲水性弱，腐蚀性 7 江南大学硕士学位论文 小，便于管道输送，而且能与汽油任意比混合，无需对汽车发动机进行改造，与汽油一 乙醇燃料相比具有更好的燃料经济性，这充分表明丁醇是理想的汽油替代燃料。欧洲最 大的石油公司b p 公司与杜邦公司将联手开发、生产和销售新一代生物燃料丁醇，用作可 再生的运输燃料，两家公司计划于2 0 0 7 年在英国市场上推出他们用作汽油组分的第一个 产品生物丁醇。b p 和杜邦与英国食品联合会的成员英国糖业公司合作，将使英国以 甜菜为原料的第一套乙醇发酵装置转产3 万吨年( 9 0 0 万加仑年) 丁醇。杜邦公司加快 与b p 公司合作，两家公司将使用杜邦公司的科学和技术及其销售经验，将生物丁醇推向 市场。杜邦正在开发基因工程菌，以用作新技术的催化剂，采用新技术可大大提高原料 加工成燃料的转化率，提高发酵设施能达到的丁醇产率和浓度。近年，我国已经认识到 丁醇作为能源的潜力，中科院青岛生物能源与过程所已经成立燃料丁醇高强度生物合成 课题组。 当前石油等短缺问题已经成为制约我国经济发展的主要因素，我国石油资源安全的 问题日益突出，严重影响经济发展和国家安全，必须寻找出可以保障能源安全的根本途 径和替代方法。自上世纪七十年代爆发石油危机以来，世界各国一直在寻找可以代替石 油的可再生能源。我国是石油消费大国，但石油储备仅占全球的2 ，2 0 0 5 年我国石油 进口依存度高达4 1 3 ，2 0 2 0 年预计将超过6 0 ；能源运输方式9 0 依靠海运，存在导致 油路中断的众多不安全因素，油价一路走高，对经济将产生重大的影响【2 0 1 。因此，开展 生物发酵法生产大宗化工产品对我国能源安全非常重要。 中国“十一五”规划中明确要求，n 2 0 l o 年单位产值能耗降低2 0 ，这意味着我 国发展模式要进行根本性的转变【2 1 | 。节约和合理利用能源，降低能源消耗，提高能源利 用效率，既是我国缓解能源供应紧张的重要措施，更是提升经济增长质量、创新发展模 式的重要手段。为此，我国必须在能源结构上进行天翻地覆的换代转型，发展新型能源。 2 0 0 6 年6 月国家能源领导小组办公室副主任兼国家发改委能源局局长徐锭明透露，根据 国务院要求，国家发改委正在组织编制可再生能源中长期发展规划，确定了未来1 5 年可再生能源发展的目标：n 2 0 2 0 年可再生能源在能源结构中的比例争取达到1 6 1 2 2 1 。 而丙酮- 丁醇发酵作为转化生物质化学品和燃料的重要手段将在我国能源战略和能源安 全领域扮演越来越重要的作用。 本实验室在检索大量国内外文献的基础上，对丙酮丁醇梭菌的选育、工艺条件优化 及副产物代谢调控等方面进行了研究工作，具有一定的研究意义和参考价值。 1 4 本课题的研究任务 丙酮一丁醇发酵虽然是一项传统的大宗发酵，但是近年来随着石油资源的紧张，又 重新引起世界各国科研工作者的重视，尤其是在高产菌株的选育及发酵工艺方面的研究 显得尤为重要，本论文着重在以下几个方面进行研究： ( 1 ) 利用紫外线和亚硝基胍复合诱变技术筛选出总溶剂产量较高，遗传性稳定的优良 菌株。 8 第一章绪论 ( 2 ) 对筛选出的高产菌株进行发酵工艺条件优化，获得最佳发酵工艺的条件。 ( 3 ) 考察副产物对丙酮丁醇梭菌生长及溶剂合成的影响，对丙酮一丁醇发酵的代谢机制 进行初探，以期对工业化生产提供参考。 9 江南大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章丙酮丁醇梭菌的诱变选育 虽然丙酮一丁醇发酵具有工艺简便、发酵周期短及原料来源广泛的特点，但由于丙酮 一丁醇发酵产物浓度过低，使得产物提取费用增加，同时产生大量的废水对环境的危害 极大，因此提高菌种的生产能力已经成为促进丙酮一丁醇发酵工业发展的重要途径 2 3 1 。 同时，由于丁醇无论其价格还是用途都明显优于其它溶剂组份，因此筛选出高丁醇比的 菌株一直是国内外研究的热点。 诱变育种是利用物理化学因素处理微生物细胞，促使其中少数细胞的遗传结构发生 变化，从而引起微生物遗传性状发生变化，然后从群体中筛选出少数优良突变株的过程， 诱变不但可以提高菌种的生产能力，而且可以改进产品质量，方法简单，收效显著。但 缺点是缺少定向性，劳动量大。 丙酮丁醇梭菌发酵过程分为产酸和产溶剂两个阶段，其代谢途径如图1 - 1 所示。在 发酵初期，产生大量的有机酸( 乙酸、丁酸等) ，p h 值迅速下降，此时有较多的c 0 2 和 h 2 产生。当酸度达到一定值后，进入产溶剂期，此时有机酸部分被还原，产生大量的 溶剂( 丙酮、丁醇、乙醇等) ，在发酵结束时仍残留部分有机酸，这些残留的有机酸对 菌体生长及溶剂的合成的影响最为显著【2 4 】。据文献报道，根据代谢支路耦联的特性，在 发酵结束时代谢副产物积累的越少，在发酵结束时溶剂的产量就越高【2 4 j 。实验结果还表 明，产酸较低的突变株表明该突变株转化有机酸为溶剂的能力较强，合成溶剂的能力提 高，发酵结束时有机酸的积累减少【2 5 】。因此，本实验采用大剂量紫外线作为诱变剂，利 用b c p 平板( 以溴甲酚紫作为指示剂，通过透明圈的大小来判断最终产酸的多少) 作 为筛选标记挑选产酸能力较低的菌株，从而获得高产菌株。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验料材 2 211 出发菌株 丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) 本实验室保藏。 2 2 1 2 筛选平板 ( 1 ) y e m 平板： 葡萄糖4 0g ，酵母膏2g ，牛肉膏2g ，磷酸氢二钾o 5g ，无水硫酸镁o 2g ，七 水硫酸亚铁o 0 1g ，醋酸铵3g ，琼脂2 0g ，调p h6 5 7 0 后，1 2 1 ，灭菌3 0m i n 。 ( 2 ) b c p 平板： 葡萄糖1 0g ，酵母膏8g ，水解干酪素2 2g ，无水硫酸镁o 2g ，硫酸锰0 o lg ，七 水硫酸亚铁0 0 1 9 ，天冬酰胺4g ，溴甲酚紫o 4g ，琼脂2 0g ，p h 至7 o 后，1 2 1 ，灭 菌3 0m i n 。 2 2 1 3 培养基 1 0 第二章丙酮丁醇产生菌的诱变选育 ( 1 ) 种子培养基： 5 t 米醪培养基，称取过4 0 目筛的玉米粉5 0g ， 足挥发的水份。灭菌条件：1 2 1 ，3 0m i n 。 ( 2 ) 发酵培养基( g l ) ： 7 玉米醪培养基，配制过程如上。 2 2 1 4 主要试剂 葡萄糖分析纯 玉米粉 酵母粉生化试剂 蛋白胨生化试剂 水解干酪素分析纯 玉米浆粉 生化试剂 牛肉膏生化试剂 七水硫酸亚铁分析纯 无水硫酸镁分析纯 硫酸锰分析纯 天冬酰胺分析纯 醋酸钠分析纯 醋酸铵分析纯 磷酸氢二钾分析纯 亚硝基胍分析纯 溴甲酚紫 分析纯 磷酸氢二钠分析纯 l 半胱氨酸分析纯 琼脂条生化试剂 2 2 1 5 主要仪器 电子天平 4 5 真空干燥箱 u v 2 8 0 0 a h 分光光度计 电热恒温培养箱 电热恒温水浴锅 台式恒温摇床 电热式压力蒸汽消毒器 加ll 自来水，煮沸5 0m i n 后，补 国药集团化学试剂有限公司 市售 英国o x o i d 公司 国药集团化学试剂有限公司 s i g m a 公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海金山区塔美兴化工厂 上海试剂二厂 国药集团化学试剂有限公司 温州市试剂厂 无锡市民丰试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂 上海第三分析仪器厂 上海第三分析仪器厂 上海跃进医疗器材厂 北京靖卫科学仪器公司 江苏太仓市实验设备厂 无锡第二医疗器械厂 江南大学硕士学位论文 超净工作台 精密数显p h 计 w 5 0 1 升降恒温水浴锅 真空泵 高效液相色谱h p l1 0 0 g c 2 0 1 0 气相色谱仪 高速冷冻离心机 厌氧瓶 a n a e r o p a c k 厌氧产气袋 a n a e r o p a c k 2 5 l 厌氧罐 振荡器z p 2 0 0 磁力加热搅拌器j j 7 9 1 微型涡旋混合器 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 厌氧培养方法 厌氧产气 苏州空气净化设备厂 北京h a n n a 公司 上海申顺生物科技有限公司 巩义市英峪予华仪器厂 美国惠普公司 上海精密科学仪器有限公司 德国s i g m a 公司 江阴玻璃仪器厂 日本三菱化学有限公司 日本三菱化学有限公司 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 上海和欣科教设备有限公司 上海跃进医疗器械厂 封圈 平板 图2 - 1 厌氧罐示意图 f i g 2 - 1t h es k e t c ho fa n a e r o b i ct a n k 由于在菌种分离培养过程中对无氧环境要求较高，菌体的培养主要是在厌氧罐中进 行，具体操作如下，将待培养的平板放入罐中，同时将厌氧产气袋迅速打开放入罐中， 将顶盖封好。厌氧产气袋通过化学反应吸收容器中的氧气，同时产生二氧化碳和氢气， 3 0 6 0 m i n 内氧气被完全吸收，从而确保罐内的无氧环境。 在复筛过程中，菌种的培养是在厌氧瓶中进行，接种完毕后，将厌氧瓶的橡皮塞塞 紧，然后用循环水真空泵抽真空，为菌体的生长创造无氧环境。 2 2 2 2 茵悬液的制备 取3 7 。c 培养1 8h 的细菌培养液以3 0 0 0r m i n 离心，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生 理盐水再离心洗涤，过滤，收集单细胞悬液，用无菌生理盐水稀释至1 0 8 个m l 。 2 2 2 3 诱变方法 1 紫外州) 诱变 1 2 第二章丙酮丁醇产生菌的诱变选育 u v 诱变是一种使用最早、应用广泛、效果明显的物理诱变剂，主要是促使d n a 与 蛋白质的交联、胞嘧啶与尿嘧啶之间水合、d n a 键的断裂和形成嘧啶二聚体等【2 6 1 。取4 m l 制备的菌悬液加到直径9c m 培养皿中，放入一无菌磁力搅拌器，然后置磁力搅拌器 上、1 5w 紫外线下3 0c m 处。在正式照射前，应先开启紫外线1 0r a i n ，让紫外灯预热， 然后开启皿盖正式在搅拌下照射。吸取照射菌液2m l 进行中间培养，培养一定时间后， 取中间培养液进行稀释，然后在筛选平板涂布培养。 2 亚硝基胍( n t g ) 诱变【2 6 j 2 7 】 亚硝基胍是一种单功能基团烷化剂，主要是通过烷化基团使d n a 分子上的碱基及 磷酸部分烷化，d n a 复制时导致碱基配对错误而引起突变。它能使细胞发生一次或多 次突变，还能使多基因并发突变，诱变效果好，有超诱变剂之称。 ( 1 ) 所需试剂：p h 6 。0 的磷酸缓冲液；o 。8 5 生理盐水；1m e d m l 的n t g 母液( 称取 1 0 - 2 0m g n t g ，n t g ：丙酮：p h 6 0 的磷酸缓冲液= 1 0 m g ：l m l ：9 m l 的比例配制) ；1 5 m o l l 的n a o h 溶液。 ( 2 ) n t g 诱变步骤： 准确吸取2 0m l 的磷酸缓冲液到带玻璃珠的碘量瓶中，刮1 3 环培养至对数生 长期后期的平板菌种到碘量瓶中。振荡碘量瓶将菌团打碎( 5r a i n ) ，制成菌悬液。然后吸 取1 5 m l 于诱变碘量瓶中。 吸取5m l n t g 母液于诱变碘量瓶中，摇匀后3 7 保温1 0 6 0m i n 。 吸取3m l 的反应液于离心管中，1 0 ，0 0 0r m i n 离心5m i n ，倒掉上清液于处理液 中，加入3m l 的生理盐水，1 0 0 0 0r m i n 离心