（发酵工程专业论文）乳酸生成菌的乳酸发酵调控及分子改造.pdf

， 0 一 ， 1 、 1 7 1 4 6 6 5y at h e s i ss u b m i t t e df o rt h e a p p l i c a t i o no f t h em a s t e r sd e g r e eo fe n g i n e e r i n g t h el a c t i ca c i dg e n e r a t i n gb a c t e r i a sf e r m e n t a t i o n 一 。 一n r e g u l a t i o na n dm o l e c u l a rm o d i n c a t i o n c a n d i d a t e ： m e n gw u s p e c i a l t y ： f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r ：w a n gr u i m i n g s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h ti n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a j u n e ，2 0 1 0 c 、岛i i i 气 r 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义l 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用j ：其他学位申请的论文或 成果，与我一一同工作的l r d 志对奉研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名：室典 同期：虹年么月丝f 1 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及中请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相父的学术论文或成果时， 署名单位仍然为i lj 东轻工业学院。 论文作者签名：进 p 导师签名： 、 h i l l ：趁生年j 月业 j 同期：丝! 堡年么月亟同 1 一 山东轻t 业学院坝i j 学位论义 目录 摘要i a b s t r a c t i 第l 章绪论1 1 1 乳酸简介l 1 2 乳酸的用途l 1 3 乳酸的发酵菌种及特点2 1 4 乳酸的生产3 第2 章乳酸生成菌的乳酸发酵实验5 2 1 材料与方法5 2 1 1 菌种5 2 1 2 培养基5 2 1 3 主要试剂6 2 1 4 主要仪器和设备7 2 1 5 菌种培养与发酵方法7 2 1 6 检测方法8 2 1 6 1 标准曲线8 2 1 6 2h p l c 测定方法8 2 1 6 3 生物传感仪法9 2 1 6 4 分光光度计测定菌体浓度9 2 2 结果与讨论9 2 2 1 大肠杆菌w 3 1 1 0 的发酵产乳酸实验9 2 2 1 1 不同接种最的对比试验9 2 2 1 2 含不同糖浓度的m 9 培养基对比试验9 2 2 1 3 溶氧量对比试验1 0 2 2 1 4 大肠杆荫w 3 1 1 0 以葡萄糖为碳源的发酵实验1 0 2 2 1 5 大肠杆菌w 3 l1 0 以木糖为碳源的发酵实验1 2 2 2 1 6 大肠杆菌w 3 1 1 0 的钴6 0 诱变试验1 3 2 2 2 乳酸菌1 6 2 2 2 1 三种乳酸菌以葡萄糖为碳源的乳酸发酵实验1 6 目录 2 2 2 2 乳酸细菌以木糖为碳源的发酵实验1 8 2 2 3 米根霉h z s 6 2 0 2 3 本章小结2l 第3 章乳酸调控提高乳酸生成茵的产乳酸光学纯度实验2 3 3 1 材料与方法2 3 3 1 1 菌种2 3 3 1 2 培养基2 3 3 1 3 主要试剂2 3 3 1 4 主要仪器和设备2 3 3 1 5 菌种培养与发酵方法2 3 3 1 6 检测方法2 3 3 2 结果与讨论2 4 3 2 1 添加l 乳酸对米根霉产物光学纯度的影响2 4 3 2 2 添加l 乳酸x , j - 孚l 酸细菌产物光学纯度的影响2 6 3 2 3 大肠杆菌测定结果与分析2 6 3 3 本章小结一2 8 第4 章分子改造大肠杆菌低氧诱导五碳糖代谢合成乳酸研究3 1 4 1 材料与方法3l 4 1 1 主要试剂3l 4 1 2 培养基3 2 4 1 3 菌种3 2 4 1 4 手要仪器和设备3 2 4 1 5 菌种培养与发酵方法3 2 4 1 6 检测方法3 2 4 1 6 1h p l c 测定法一3 2 4 1 6 2 标准曲线3 2 4 1 6 3 分光光度计测定菌体o d 值3 2 4 1 6 4s d s p a g e 检测3 2 4 1 6 5r t - p c r 检测3 2 4 1 7 试验流程3 3 4 1 8 质粒构建3 3 4 1 8 1 细菌总d n a 及质粒的提取3 3 2 、 j 山东轻1 业学院颁i j 学位论文 4 1 8 2p c r 扩增x y l a 、x y l b 、t a l a 、t k t a 基因3 4 4 1 8 3 酶切3 5 4 1 8 4 连接3 5 4 1 8 5 细菌感受念的制备3 6 4 1 8 6 转化3 6 4 1 9 重组子筛选与验汪一3 6 4 1 9 1 菌落的p c r 验汪3 6 4 1 9 2 质粒的p c r 验证3 6 4 1 9 3 质粒的双酶切验汪3 6 4 2 结果与讨论3 7 4 2 1 质粒的构建3 7 4 2 1 1 质粒的构建流稗图3 7 4 2 1 2p c r 扩增x y l a 、x y l b 、t k t a 、t a l a 、p v g b 基因3 7 4 2 1 3 质粒的构建3 8 4 2 2 重组大肠杆菌生产菌株的构建3 9 4 2 3 基因工程菌e c o l i w 3 1 1 0 ( a a d h e ，a p f l b ) 的生理特性4 0 4 2 4 重组大肠杆菌菌株抗性遗传稳定性的检测一4 l 4 2 5 大肠杆菌w 3110 重组菌株发酵生产乳酸4 2 4 3 本章小结4 5 第5 章结论与展望4 7 5 1 结论4 7 5 2 展望4 8 参考文献4 9 致谢5 3 攻读硕士学位期间发表的论文5 5 3 山东轻丁业学院硕i ? 学位论文 摘要 论文介绍了乳酸的分类、用途及其发酵方式与尘产、产乳酸菌的种类；通过 几种乳酸产q ：菌分别以葡萄糖和木糖为碳源的乳酸发酵，研究其最适发酵条件。 从目f i l l 的研究水平，通过改变培养条件来得到1 0 0 光学纯度的乳酸 常困 难。已经有报道通过对p h 值、温度、氮源量和糖浓度等凶素仞始发酵条件的研究， 观察乳酸生成菌株的产物光学纯度以及产乳酸量的影响。本实验在几种产乳酸菌 最适发酵条件的基础上研究了发酵调控方法，以更高的光学纯度、更低的成本和 更火的产物量生产乳酸。通过在发酵前期对底物添加l 哥l 酸或d 乳酸，分别考察 了发酵初期添) j h 乎l 酸凋控对米根霉菌、大肠杆菌、乳酸发酵细菌产物光学纯度的 影响。 发酵初期在米根霉菌的发酵养培基中添加l 哥l 睃可以调控提高发酵产物乳酸 的光学纯度。随着添加l 乳酸量的增加，所产l 乳酸的光学纯度随之增加，当l 乳酸的添加量1 5 l 时，不再产生d 乳酸。同时，l 乳酸的产量、糖转化率、 生物量也随之降低。该调控方法对大肠杆菌发酵调控产d 乳酸纯度没有效果，对 乳酸荫调控产l 乳酸光学纯度影响不大。 为了提高大肠杆菌的d 一乳酸发酵产量，对人肠杆菌w 31 1 0 进 j 二钴6 0 诱变， 通过比较实验挑选出d 乳酸高产菌株。 通过基因改造大肠杆菌利用木糖发酵产d 乳酸，提高五碳糖利用率，转化为 更多的发酵产物。构建表达大肠杆菌五碳糖代谢的关键基因：木酬糖激酶基因 ( x y t b ) 、转醛醇酶基因( t a l a ) 、转酮醇酶基因( t k t a ) 、木糖异构酶基凶( x y l a ) 。 关键词：乳酸；光学纯度；发酵调控；米根霉；乳酸生成菌 山东轻丁业学院硕l ：学位论文 a b s t r a c t i n t h i sp a p e r , c l a s s i f i c a t i o n ，u s e s ，m e t h o do ff e r m e n t a t i o na n dp r o d u c t i o no fl a c t i c a c i dw e r ei n t r o d u c e d s e v e r a ll a c t i ca c i db a c t e r i as t r a i n sa r eu s e dt os t u d yt h eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw h i c hr e s p e c t i v e l yu s e dg l u c o s ea n dx y l o s ea sc a r b o ns o u r c e o fl a c t i ca c i df e r m e n t a t i o nm e d i u m i nt h ec u r r e n tl e w e a lo fs t u d y , i ti sv e r yd i f f i c u l tt og e t10 0 o p t i c a lp u r i t yo fl a c t i c a c i d t h e r eh a v eb e e nr e p o r t sa b o u tp h ，t e m p e r a t u r e ，n i t r o g e na n ds u g a rc o n c e n t r a t i o n o fs u c hf a c t o r sa st h ea m m o u n to ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h ei n i t i a ls t u d yt o o b s e r v et h ea m m o u n to fl a c t i ca c i da n dt h eo p t i c a lp u r i t yo ft h ep r o d u c t i nt h i ss t u d y , s e v e r a ll a c t i ca c i db a c t e r i as t r a i n sa r eu s e dt os t u d yt h ef e r m e n t a t i o nc o n t r o lm e t h o dt o o b t a i nah i g h e ro p t i c a lp u r i t y , l o w e rc o s ta n dg r e a t e rp r o d u c t i o no ft h ep r o d u c to ft h e a m m o u n to fl a c t i ca c i do nt h eb a s i so fo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s s t u d y i n gt h e e f f e c to fc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so nt h eo p t i c a lp u r i t yo fa d d i n gl a c t a t ei nt h ei n i t i a l f e r m e n t a t i o nm e d i u mb yr h i z o p u so r y z a e ，l a c t o b a c i l l u sa n de s c h e r i c h i ac o l i t h ee f f e c to fc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so nt h eo p t i c a lp u r i t yo fl l a c t i ca c i dp r o d u c e d b yr h i z o p u so r y z a ew a si n v e s t i g a t e d t h ei s o m e r i cc o m p o s i t i o no fl a c t i ca c i dw a s i n f l u e n c e db yt h es u p p l e m e n t a t i o no fl l a c t i ca c i dt of e r m e n t a t i o nm e d i u m l - i s o m e r i n c r e a s e dw i t ht h ed o s a g e ，n od - l a c t i ca c i dw a so b s e r v e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f s u p p l e m e n t e dl l a c t i ca c i di nm a t r i xw a s 1 5g l h o w e v e r , t h el - l a c t i ca c i dy i e l d b i o m a s sa n dg l u c o s ec o n v e r s i o nr a t ed e c r e a s e dw i t ht h ed o s a g e a st h es a m em e t h o d ， t h es u p p l e m e n t a t i o no fl l a c t i ca c i dt os u b s t r a t ew a sal i t t l ee f f i c i e n tf o ri n f l u e n c e i s o m e r i cc o m p o s i t i o no fl a c t i ca c i db ye s c h e r i c h i ac o l ia n dl a c t o b a c i l l u s w eu s e dc o - 6 0m u t a t i o nm e t h o dt oi m p r o v et h ep r o d u c t i o no fd - - l a c t i ca c i d p r o d u c t e db ye s c h e r i c h i ac o l i b a s e do ns t u d i e sa n dc o m p a r i s o n s ，w es e l e c t e dd l a c t i c a c i dh i g h - y i e l d i n gs t r a i n i no r d e rt ot a k ea d v a n t a g eo fx y l o s ea n dt oi m p r o v et h e u t i l i z a t i o no fx y l o s ea n dt h ep r o d u c t i o no fl l a c t i ca c i d ，w e g e n e t i c a l l ym o d i f i e dt h e e c o l iw 3 11 0 t h ek e yg e n e ：砂l b 、t a l a 、t k t a 、x y l a k e y w o r d s ：l a c t i ca c i d ，o p t i c a lp u r i t y ，r e g u l a t i o nf e r m e n t a t i o n ，r h i z o p u so r y z a e ，l a c t i c a c i dg e n e r a t i n gb a c t e r i a ， 山东轻丁业学院硕i j 学位论文 第1 章绪论 1 1 乳酸简介 乳酸，即a 羟基丙酸，分子式为c 3 h 6 0 3 ，是天然存在的一种有机酸，其广泛 存在f 人、动物、植物和微生物等生物体中，是生物的代谢中间体及代谢产物， 被世界公认为三大有机酸之一。乳酸是自然界最小的手性分子，其结构中含有一 个刁i 对称的碳原子，因此具有旋光性，按其构型町分d 乳酸和l 乳酸如图1 1 所示。人体内只含有l 乳酸脱氧酶，只能代谓 利川l 乳酸，过多食用d 乳酸或d l 乳酸就会导致人体代谢功能的紊乱，危害人体的健康【2 】，闵此世界卫生组织提倡在 食品及医药行业使用l 乳酸【3 】。 m i r r o r l 和笔h h i i - i o o c ic o h c 坞 d ( ) d a c 6 cl c i d 罔1 1 毳酸的阿种对跃体结构式 1 2 乳酸的用途 乳酸是一种多用途的精细化学品，乳酸、乳酸舱及其衍生物是重要的生物化 工产品，它们在医药、酿造、食品、皮革、卷烟、印染、化工等领域有着广泛的应 用。l 乳酸、l 乳酸盐及酯可作为酸味剂、调味荆、防腐剂广泛用于食品工业【4 】， 另外l 乳酸钙、l 乳酸哑铁、l 哥l 酸锌都是补充金属元素的良好药品【5 1 。l 乳酸也 作为植物生长调节剂、替代氯化钠作为输液用盐水等应用于医药、农业；在生物 材料领域，由于l 乳酸是可生物降解塑料聚l 乳酸的原料而倍受科学家的重 视，聚l 乳酸在空气、水和普通细菌存在下完全分解成二氧化碳和水，u 丁以形成 良好的生态循环。在美国和几本，聚乳酸【6 】已用于透明塑料容器、涂料层、发泡容 器、餐馆容器、儿章玩具、薄膜、蔬菜包装等方面。因此，聚乳酸因其，| 物柏容 性、丌j 吸收性和可生物降解性，成为良好的绿色材料，可望在将来代替p p 、p v c 等各种不可生物降解的塑料，以消除“白色污染”所造成的环境危机【7 1 。另外，还是 由于聚l 乳酸良好的生物相容性，被应用作医用材料，如药物缓释材料、手术缝 合线、组织工程材料、骨折固定件等0 1 。d 乳酸作为一个手性分子，是多种手性 第1 章绪论 物质的日订体，广泛s , x 7 j n 于医药、高效低毒农药除草剂以及化妆品等领域的手性合 成，并且外消旋体d ，l 乳酸具有重要的用途，它作为原料、添加剂、防腐剂、消 毒剂、调节剂任酿造、农业、医药、食品、化：【、纺织等t t q k 中发挥着重要作用， 乳酸衍生物如乳酸盐、乳酸酯等用途也极其广泛。 1 3 乳酸的发酵菌种及特点 自然界中有很多微生物能够发酵，卜产l 乳酸，一些乳酸荫如l a c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u s 、嗜淀粉乳杆菌和德式乳杆菌能够生产高产量的l 乳酸。也有很多微乍 物能够发酵，l 产d 乳酸，一些乳酸菌如保加利亚乳杆菌能够生产高纯度d 乳酸。 商业化的乳酸菌如乳杆菌等具有较高的酸耐受性，并且能够通过基因操作选择性 生产d 型或l 型乳酸，但其营养要求高，生长率较低，很少或不能完全利用戊糖， 不能够很好的用于大规模工业生产。其他的乳酸生成菌包括根霉菌( r h i z o p u s ) 、 大肠杆菌( e s c h e r i c h i a ) 、乳杆菌( b a c i l l u s ) 、酵母菌( s a c c h a r o m y c e s ) 、芽孢杆菌 ( b a c i l l u s ) 、克鲁维酵母菌( k l u y v e r o m y c e s ) 等具有更广泛的底物范围、营养要求 低、高产率和得率、光学纯度高、无质粒和抗性标记等优点，可以通过基冈操作 的手段，运用代谢工程和发酵工程的技术方法可控地生产高光学纯度的d 乳酸或 l 乳酸。 乳酸发酵主要为细菌发酵和真菌发酵，以乳酸菌和根霉菌为代表进行比较， 乳酸菌的发酵温度较高，产酸量高，并且对糖的利用率高，糖酸理论转化率可达 1 0 0 ，产酸率相对较高，可达1 8 以上，大多属于微耗氧或厌氧发酵，发酵4 i 需 要通氧气，动力消耗小；但其营养要求复杂需添加氨基酸、无机盐和维生素等， 并且无菌操作要求严格，给实际生产带来操作的不便，且产生的乳酸光学纯度偏 低，不利于产品的后加工。而根霉埘糖的利用率不如乳酸菌高，转化率也比细菌 低，发酵乍产需要在有氧条件下进行，在通气不足或厌氧条件下，乳酸产最下降 明显；但根霉的营养要求远比乳酸芮要简单，只需添加无机氮及少量其它尤机铺 即可，培养条件料犷、菌体大且易分离，不易染菌，有利r 制得纯净的l 乳酸， 且在发酵过程中很少发生消旋作用，发酵周期较短，色素生成少，杂质含量低， 易于产品的分离提取。因此使用根霉发酵生产乳酸仍具自很大的潜力。而通过分 子改造构建尘产乳酸的重组大肠卡t 菌则具有更加方便、实用的优点：第一、人肠 杆菌可以利用各种糖，包括戊糖( 木糖) 。第二，大肠杆菌遗传背景清晰，营养要 求简单，在有氧或厌氧的条件下均能较快的生长。第三、其基因操作技术成熟， 通过基因操作的手段、运用发酵二 程和代谢工程的技术方法可控制地生产高光学 纯度的l 乳酸或d 乳酸，具有很大的市场自仃景。 2 山东轻丁业学院硕i j 学位论义 1 4 乳酸的生产 目前，全世界乳酸的产量约为2 0 万吨，乳酸的来源主要是化学法合成和微生 物发酵生产。山r 采用发酵法生产，碳源利用率很高，甚至可以达剑l o o 】，并 且可以转化利用作物秸秆以及林业废料等可再生资源( 同自，j 已有利用稻草、麦草、 木屑及废纸发酵制备乳酸的报道【1 2 。16 】) ，因此国内外普遍使用微乍物发酵法来生产 乳酸。微7 物i - , l k 发耐1 7 】生产方法主要包括细蔺发酵：乳酸菌发酵法( 此法一直 为生产厂家，e 广：乳酸的主要方法) ；真菌发酵：米根霉乳酸发酵法( 发酵生产高光 学纯度l 乳酸的主要荫株) ，此方法生产乳酸需要培养基的营养比细菌发酵简单， 但副产物多，乳酸菌的分离纯化有一定难度【隅】。 长期以来，由于生产工艺的局限，市售的乳酸商品一般指外消旋体d l 乳酸， 但随着近代分离方法和分析仪器的研究发展，人们对l 乳酸、d 乳酸、d ，l 哥l 酸 及其衍生物的生理活性和理化性能有了深入的了解，在手性溶剂、手性药物、生 物农药及助能性材料等领域拓宽了乳酸对映体的应用范围，市场对高光学纯度的 乳酸需求也不断增加。目前，荷兰和荚国在光学纯度乳酸的生产上走在 壁界的前 列，我刚在这方面的研究起步较晚，除2 3 家，- 产厂家进行着l 一乳酸生产外， 其余的还处于实验室研究阶段，d 乳酸的制备研究或q - j 虹国内尚末见报道。本论 文研究了一种新的提高乳酸生成菌株生产高纯度乳酸的调控方法。以日前的研究 水平，很难通过改变培养条件来获得1 0 0 光学纯度的乳酸。本实验通过在发酵前 期添加l 一乳酸进行发酵调控，研究其对所产乳酸纯度及产量的影响，从而以更低 的成本柬提高所产乳酸的光学纯度和产量。分别考察了发酵初期通过添j r l 孚l 酸对 米根霉h z s 6 、发酵乳酸菌、德氏乳酸杆菌、大肠杆菌w 3 1 1 0 产物光学纯度及产量 的影响。 传统的乳酸发酵所用的原料主要为淀粉类和葡萄糖类原料，但足以葡萄糖或 淀粉为原料进行的生产成本依然较高，限制了l 哥l 酸的广泛生产和应用，尤其是 限制了聚乳酸作为可降解颦料在环保领域中的应用。i 爿绕降低l 乳酸的生产成本， 以选择廉价、广泛的纤维素为原料生产l 乳酸成为近来研究热点之一。如果能采 用呵再生植物秸秆纤维原料发酵制取乳酸，将大大拓展其生产原料的来源，并解 决秸秆直接焚烧造成环境污染及资源浪费的问题，近几年清华大学，天津科技大 学等高校鄙丌始了利用甜高粱秸秆、木薯等纤维原料进行同态发酵产酒精或乳酸 的项 研究，并且清华大学f - 2 0 0 8 年已经在内蒙和海南建立了生产基地投入了生 产。 近几年来，聚乳酸高分子材料及乳酸发酵工艺的研究活跃，乳酸成为一个极 具潜力的精细化工品，并有望成为继柠檬酸之后的又一大宗发酵产品，备受国内 外的广泛关注。 山东轻t 业学院顺f j 学位论文 第2 章乳酸生成菌的乳酸发酵实验 乳酸的制备方法有化学合成法和发酵法两种，其中发酵法生产的乳酸冈其没 有有害有毒物质摄入、食用安全而在世界范围内广泛采用，自然界中町以发酵产 生乳酸的微，物很多，但是产酸最能力强，可以应用到工业生产上的却只有霉菌 中的根霉及细菌的孚l , f l ：菌属、芽孢杆菌属及链球菌属。细菌发酵属于微好氧或厌 氧，细菌的一型发酵般足通过糖酵解途径而异型发酵有6 磷酸葡萄糖酸途径和双 歧途径两种。根霉发酵属于好氧异型发酵，但其途径j 细菌异型发酵小旧，是通 过糖酵解途径，发酵产；a l l 一乳酸的| 一j 时产生乙醇、富码酸等，糖转化率较低。 凶此，本章分别采用一i 种乳酸生成菌( 发酵乳酸荫、植物g l t i ：荫、德氏乳酸 杆菌) 和分子改造大肠杆芮w 3l1 0 ( 发酵主要产物为d 乳酸【。9 】) 利用i 碳糖( 葡 萄糖) 和血碳糖( 木糖) 的发酵产乳酸试验，研究四种菌对两种糖的利用率及产 乳酸的量和光学纯度，总结最佳产酸量及发酵条件；研究分析米根霉h z s 6 干i 用葡 萄糖产l 乳酸2 0 2 1 1 的发酵条件。 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种 用于此项研究的米根霉( 尺o r y z a e ) h z s 6 ，系清华大学核能与新能源研究院 8 0 1 实验室保存。发酵乳酸菌( l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t u m ) 、植物乳杆菌【2 2 】 ( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 、德氏乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u c k i i ) ，系山东大学生 命科学学院孔健教授提供，分子改造大肠杆菌w 3 1 1 0 高产乳酸基因1 程菌由山东大 学生命科学学院祁庆生教授提供。 2 1 2 培养基 l b 培养基【2 3 】( g l ) ：胰化蛋白胨1 0 0 ，酵母提取物5 0 ，n a c i5 0 。1 5 p s i 高压 下灭菌2 0 m i n 。 m 9 培养荩( l ) ：6 o gn a 2 h p 0 4 ，3 0 9k h 2 p 0 4 ，1 0 9n h 4 c 1 ，0 5 9n a c l ，2 4 6 5 r a g m g s 0 4 ，1 4 7 9c a c l 2 ，1 0 m gv b l 。1 5 p s i 高压下灭菌2 0 m i n 。 乳酸菌m r s 2 4 】种f 培养基( g l ) ：蛋白胨1 0 0 ，牛肉膏1 0 0 ，酵母粉5 0 ， 葡萄糖2 0 0 ，柠檬酸：铵2 0 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 8 ，m n s 0 4 4 h 2 00 2 5 ，乙酸钠5 0 ， k 2 h p 0 42 0 ，吐温8 02 0m l ，p h6 2 6 4 ，1 2 l 火菌1 5m i n 。 乳酸菌m r s 发酵培养基( g l ) ：蛋白胨1 0 0 ，牛肉膏1 0 0 ，酵母粉5 0 ，葡 萄糖或木塘( 浓度待定) ，柠檬酸二铵2 0 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 8 ，m n s 0 4 4 h 2 00 2 5 ， 乙酸钠5 0 ，k 2 h p 0 42 0 ，吐温8 02 0m l ，p h6 2 6 4 ，1 2 l 灭菌1 5r a i n 。 第2 章乳酸生成菌的乳酸发酵实验 以j ：发酵均用5 0 n a o h 溶液( 灭菌) 调p h 。 产孢了培养基( l ) ：马铃薯6 0 0 0 ，葡萄糖6 0 0 ，琼脂1 8 0 ，水1 0 0 0m l ，p h 自然。 米根霉种子培养肇( l ) ：葡萄糖2 0 0 ，n h 4 n 0 32 0 ，k h 2 p 0 40 2 ，m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 5 ，z n s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，p h 自然。 米根霉发酵培养基( g l ) ：葡萄糖1 0 0 0 ，n h 4 n 0 30 5 2 0 ，k h 2 p 0 40 2 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 5 ，z n s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，c a c 0 35 0 ，p h 自然。 2 1 3 主要试剂 名称 蛋门胨 酵母粉 牛肉膏 吐温8 0 无水乙醇 酵母膏 胰化蛋白胨 琼脂 无水葡萄糖 k h 2 p 0 4 n a c l k 2 h p 0 4 z n s 0 4 7 h 2 0 n h 4 c l c a c 0 1 柠檬酸二铵 n h 4 n 0 3 m n s 0 4 4 h 2 0 m g s 0 4 7 h 2 0 c a c l 2 酵母浸出汁 马铃薯 纯度生产单位 天津市广成化学试剂有限公司 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 6 一f ：海国药集团化学试剂有限公司 天津市天达净化材料精细化：【厂 天津市大茂化学试剂j 。 天津市大茂化学试剂j o x o i d 公司 o x o i d 公司 o x o i d 公司 北京奥博旱生物技术有限公司 上海联试化工试剂有限公司 上海化学试剂总厂 北京市红星化j 厂 天津市天大化r ：试验厂 天津市广成化学试剂有限公司 中国医药( 集体) 上海化学试剂公 司 天津市河东区红岩试剂厂 天津市广成化学试剂有限公司 莱阳经济丌发精细化工厂 天津市广成化学试剂有限公司 天津市天大化【：试验厂 上海棱光酵f 江制品有限公司 购于批发市场，源自不同产地 山东轻t 业学院硕i ：学位论文 2 1 4 主要仪器和设备 名称 p l 4 0 3 电子天平 z d p 2 0 5 0 电热恒温培养箱 s b a 4 0 c 生物传感分析仪 岛津l c m s 2 0 1 0 e v 高效液相色谱 质谱联用仪 检测器：s p d m 2 0 a l e g e n dm i c r o2lr 高速离心机 n a n o d r o p1 0 0 0 分光光度汁 d h z d a 普通摇床 y x q g 0 1 型蒸汽消毒器 2 1 5 菌种培养与发酵方法 生产单位 m e t t l e rt o l e d o 上海智城分析仪制造有限公司 山东省科学院生物研究所 岛津( 日本) 岛津( 同本) t h e r m oe l e c t i o nc o r p o r a t i o n t h e r m o 江苏太仓市试验设备厂 山东新华医疗器械厂 大肠杆菌种子培养：挑取大肠杆菌单菌落- - - * l b 培养基( 1 0 0 m l ) 1 8 0 r p m 、 3 7 、1 2 d , 时。 大肠杆菌发酵培养：将1 0 m l 大肠杆菌的种子培养液_ 含5 葡萄糖m 9 培养基 ( 1 0 0 m l ) 1 8 0 r p m 、3 7 、5 小时后3 7 培养箱静置培养。 乳酸菌的种子培养：挑取乳酸菌单菌落( 发酵乳酸菌跟德氏乳酸杆菌) _ m r s 种子培养基1 0 0 m l ( 5 0 0 m l 三角瓶) 、3 4 静置培养1 2 d , 时。 乳酸菌的发酵培养：将乳酸菌种子培养液按l o 接种量接种到乳酸荫m r s 发 酵培养基1 0 0 m l ( 5 0 0 m l 三角瓶) 、3 4 静置培养。 米根霉的种子培养：将米根霉接种到产孢子培养基斜面培养，3 7 培养3 天， 用接种环收集孢子，将其悬浮在蒸馏水中，利用血球计数板测定悬浮液孢子量。 每次试验，将1 0 m l 孢子悬浮液接种到含有3 0 0 m l 米根霉种子培养基的l ，0 0 0m l 摇 瓶( 1 8 0r p m ) 中，3 9 灭菌c a c 0 3 添加到其中用于调节p h ，3 4 培养2 2 d , 时，最终 达到孢子量约为l 1 0 6 个m l 。 米根霉的发酵培养：将米根霉种子按l o 接种量接到盛有2 0 0 m l 米根霉发酵培 养基的5 0 0 m l _ = 角瓶( 灭菌) ，3 4 、1 8 0 r p m 摇床培养。 第2 幸乳酸生成菌的乳酸发酵实验 2 1 6 检测方法 2 1 6 1 标准曲线 硝 o o c 巴 _ 日 。 山 日 - o c 口 l c 口 。 乱 l23456 d l ac o n c e n t r a t i o n ( u g u l ) y = 0 l23456 l - l ac o n c e n t r a t i o n ( u u l ) 幽2 1d - - 孚l 酸与l 一乳酸的标准曲线 f i g 2 1t h e s t a n d a r dc u r v eo fd l a c t i ca c i da n dl - l a c t i ca c i d 2 1 6 2h p l c 测定方法 取1 0m l 的大肠杆菌发酵液，1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，除去大肠杆菌菌体和部 分沉淀物，再用0 4 5 9 m 的滤膜过滤；滤液用于糖跟乳酸的测定。有机酸跟剩余的 葡萄糖利用高效液相色谱( h p l c ) 在紫外检测器下测定。 取1 0m l 的乳酸菌发酵液，1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，除去乳酸菌菌体和部分沉 淀物，再用o 4 5 1 t m 的滤膜过滤；滤液用于糖跟乳酸的测定，有机酸跟剩余的葡萄 糖利用高效液十h 色谱( h p l c ) 在紫外检测器下测定。 取5 0m l 的米根霉发酵液，1 0 0 0 0 r m i n 离，t 、j , 5 m m ，除去米根霉菌丝体和碳酸 钙沉淀，再用0 4 5 9 m 的滤膜过滤；滤液用于残糖跟乳酸的测定。有机酸跟剩余的 葡萄糖利用高效液柏色谱( h p l c ) 在紫外检测器下测定。 h p l c 色谱柱b i o r a dh p x8 7 h 柱用于对产物进行分离，测定残余葡萄糖的浓 度。柱温：4 5 ；流速：0 5m l m i n ；流动相：4m mh 2 s 0 4 水溶液；检测波长：2 5 4 一n l t i ： 进样量：l o u l 。 h p l c 色谱柱a s t e cc l c d ，d i k m a ，u s a 分离并测定l 乳酸和d 哥l 酸的浓度。 咖 咖 o o o o o o o o 0 2 o 8 罴一。 加 o o o 0 o 0 o o o o o o o o o o o 0 o 0 o 0 o o o o o o o o o o 0 o o o o o o o 0 o o 4 2 o 8 6 4 2 山东轻丁业学院顺i j 学位论文 柱温：3 0 。c ；流动相：5m mc u 2 s 0 4 水溶液；流速：1 0m l m i m 检测波长：2 5 4 n n q ； 进样最：51 a l 。 2 1 6 3 生物传感仪法 s b a 4 0 c 型生物传感器足以固定化酶为关键单元，利用微电脑控制双指标智 能化仪表，其具有两支生物探测电极，可以同时测定同一样品中的乳酸和葡萄糖 含量。 用微量进样器吸取适当稀释的大肠杆菌发酵滤液2 5 9 l ，按照仪器的操作要求 进样，2 0 秒后即可同时读取乳酸和葡萄糖( 残糖) 含量的测试数据。 2 1 6 4 分光光度计测定菌体浓度 取适量密度均匀的人肠杆菌及乳酸菌的发酵液，利用n a n o d r o p1 0 0 0 分光 光度计( t h e r m o ) 对菌体浓度( o d 5 5 0 n m ) 进行测定。 2 2 结果与讨论 2 2 1 大肠杆菌w 3 11 0 的发酵产乳酸实验 2 2 1 1 不同接种量的对比试验 对大肠杆菌w 3 1 1 0 进行接种量分别为1 0 、2 0 、3 0 、的浓度梯度试验，接 入含5 筒萄糖的m 9 培养基进行摇瓶发酵，然后缚隔2 4 d 时进- i t h p l c 检测产酸量。 发酵2 4 d 、时，检测得到对应的d - 乳酸产量分别为：1 8 2 9 、1 9 7 9 、2 0 4 9 ；发酵4 8 小时，检测得到对应的d - 乳酸产量分别为：6 1 6 9 、6 6 5 9 、6 7 6 9 ；发酵进行到第6 天，检测得到对应的d 一乳酸产：量分别为：1 8 7 8 9 、1 8 9 7 9 、1 9 0 2 9 。通过对比不同 发酵时问的d 乳酸产量得出：1 0 、2 0 、3 0 的接种量只是在发酵初期对d 一乳酸 的产量有影响，随着发酵时f u j 的增长d 一乳酸的产量趋于相同，再考虑到火罐生产， 综合得出1 0 的大肠杆菌w 3 1 1 0 接种量是最合适的。 2 2 1 2 含不同糖浓度的m 9 培养基对比试验 进行大肠杆菌w 3 l l o 分别利用5 、1 0 、1 5 三个浓度梯度葡萄糖含量的m 9 培养基