（发酵工程专业论文）基于doph测量的微生物流加培养过程的在线模式识别和控制的研究.pdf

摘要 本论文在p h s t a t 法和d o s t a t 法的基础之上建立起了一种新型的用于微生物 营养物质流加的反馈流加方式：我们收集了大量p h s t a t 法和d o s t a t 法培养大 肠杆菌和毕赤酵母时不同振动模式的p h 和d o 数据以及人为造成的基质过量时 p h 和d o 的数据，为了得到d o 和p h 所有可能出现的变化模式，提高神经网络 的通用性，我们在获得的p h 和d o 的数据上添加了大量随机噪音。将这些数据 进行归一化后，利用m a t l a b 数据处理软件建立起了两个人工神经网络( a n n s ) 识别模型，分别识别出了微生物流加培养过程中d o 和口h 的变化模式。利用人 工神经网络识别模型对d o 和p h 变化模式的识别结果，依据我们设定的一套规 则，较好地判别出了培养过程中葡萄糖是过剩还是匮乏。依据上述判别结果，我 们编程利用程序可控蠕动泵在线自适应地调整营养物质的流加速率。离线的监测 数据验证该种反馈流加方式可以较好地控制培养过程中葡萄糖的浓度。我们将该 流加策略先后用于e c o l ik 1 2 和p i c h i ap a s t o r i sk m 7 1 表达植酸酶基因工程菌的 高密度培养，与p h - s t a t 流加方法相比较，在相同培养时间内，该种流加方式使 得大肠杆菌菌体密度从3 6 9 d c w l 提高到5 6 7 9 d c w l ，菌体密度提高了5 0 ； 毕赤酵母茵体密度在诱导开始前提高了2 1 ，植酸酶的表达量也有所提高。该种 控制方法不需要昂贵的检测仪器，只需要p h 和d o 电极。这两种电极已普遍应 用于工业生产中，操作简单、性能可靠。故该种流加方法易于用于工业化生产， 有望为工业化生产外源蛋白提供一种新型的微生物高密度培养的方法。 关键词：神经网络模型：高密度培养；在线自适应控制；状态识别；p h ，d o 电极 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a no n l i n ea d a p t i v ec o n t r o ls t r a t e g yb a s e do nd o p hm e a s u r e m e n t sa n da r t i f i c i a ln e u r a l n e t w o r kp a t t e r nr e c o g n i t i o n ( a n n p r ) m o d e lf o rf e d - b a t c hc u l t i v a t i o np r o c e s s e sw a s p r o p o s e d v a r i o u sc h a n g i n gp a t t e r n so fp ha n dd i s s o l v e do x y g e nc o n c e n t r a t i o n ( d 0 ) u n d e r p s s t a r , d o s t a t , a n dt h ec o n d i t i o n so fs u b s t r a t ei ne x c e s sw e r ec o l l e c t e da n du s e dt ot r a i n t h ea n n p rm o d e l s t of u r t h 剖 i m p r o v et h eu n i v e r s a la b i l i t i e so ft h ea n n p r m o d e l s ，e x t r a w h i t en o i s e sw i t ha p p r o p r i a t ev a r i a n c ew e r ea d d e do nt h eb a s i so f t h eo r i g i n a lt r a i n i n gd a t a b a s e do nt h eo n - l i n em e a s u r e dp ha n dd od a t a , t h er e c o g n i t i o nr e s u l t so nc u r r e n t p h y s i o l o g i c a ls t a t ew a sd e d u c e db yt h ea n n p rm o d e l s ，a n dt h e nt h eo n - l i n ea d a p t i v ec o n t r o l o f n u t r i e n tf e e d i n gr a t ew a si m p l e m e n t e d c o m p a r e dw i t l lt h et r a d i t i o n a lp h s t a tc o n t r 0 1 t h e p r o p o s e dc o n t r o ls t r a t e g yi n c r e a s e de c o l ic e l lp r o d u c t i v i t yf r o m3 6 9 1 ) c w lt o5 6 7 9 0 c w l a n dp i c h i ap a s t o r i sc e l lp r o d u c t i v i t ya b o u t1 2 3 w i t h o u tb y p r o d u c ta c c u m u l a t i o n o n l yt h e o n l i n em e a s u r e m e n to ft h em o s tt r a d i t i o n a lv a r i a b l e so fp ha n dd ow e r er e q u i r e df o rt h e a n n - p r - c o n t r o lp r o p o s e di nt h i sp a p e r , a n dt h es u b s e q u e n tc o n t r o lc o u l db e e a s i l y i m p l e m e n t e du s i n gv e r ys i m p l er e g u h t i n gr u l e s t h ea n n - p r - c o n t r o ls y s t e mc o u l df i s s u r e c e l lg r o w t ha tah i g h e rr a t ea n da c e t a t ea c c u m u l a t i o na tv e r yl o wl e v e la tt h es a m et i m e t h e c h e a p ，u n i v e r s a l ，r o b u s t ，a n ds i m p l ea n n p r - c o n t r o ls y s t e mc o u l db ea p p l i e df o rh i g hc e l l d e n s i t yc u l t i v a t i o no fr e c o m b i n a n tm i c r o o r g a n i s m st oe f f i c i e n t l ye x p r e s sv a l u e - a d d e df o r e i g n p r o t e i n so re n z y n l ei ni n d u s t r i a l i z e ds c a l e k e yw o r d s ：a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k ；h i g h - d e n s i t yc u l t u r e ；o n l i n ea d a p t i v ec o n t r o l ；p a r e m r e c o g n i t i o n ；t r a d i t i o n a lp ha n dd os e n s o r s 一 l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：盈垡翌： 导师签名；迭生翌 日期；矽年尹月，日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 微生物发酵过程控制的研究现状和发展趋势 1 1 1 发酵过程控制概论 所谓发酵过程控制，顾名思义就是把发酵过程的某些状态变量控制在某一期望的恒 定水平上或者时间轨道上。控制和最优化是两个不同的概念，但是彼此之间又是紧密关 联的。很多情况下，过程的最优化就是靠把某些状态变量定值控制在某一水平或者程序 控制在某一时间轨道上才得以实现的。比如说，在酵母菌和大肠杆菌的流加培养中，将 底物浓度控制在c r a b u 效应的临界值附近【1 , 2 1 ，实际上就是一种间接形式的最优化控 制，因为此时细胞的增殖速度最大、生产强度最高、代谢副产物的生成水平也最低。 根据对某一发酵过程动力学的了解状况，尤其是能否在线测定某些反映发酵过程特 征的状态变量，可以将发酵过程的控制分成两类：离线控制和在线控制。离线控制的最 大特点，就是它不需要在线测量任何状态变量，也不需要进行有关控制系统稳定性、响 应特性和定常特性的分析【3 1 。从控制角度上来讲，是一种典型的开回路一前馈控制方式。 它利用已知的非构造式动力学模型或其他已知的方式，来计算和确定控制变量( 策略) 。 最简单的例子莫过于在流加培养中使用的指数流加法，通过使基质流加速度与操作时间 呈指数形式变化，让细胞按指数规律生长，同时保持底物浓度恒定虽然离线控制不需 要对过程状态参数进行在线测量，但是，它要求描述过程动力学特征的数学模型一定要 准确。一旦实际环境下的过程动力学特性发生变化和偏移，离线控制的性能和效果就会 产生不同程度的恶化。 在线控制则是典型的闭回路一反馈控制方式。在反馈控制中，至少有一个状态变量 必须可以在线测量。根据测量值与被控变量设定值之间的偏差，反馈控制调节器按照一 定的方式，自动地对操作变量进行调整和修改，使得测量值能够迅速和稳定地被控制在 其设定值附近。反馈控制器的建立与调整，实际上就是通过确定和改变控制器的控制参 数，使得反馈控制器具备良好的稳定性、响应特性、和定常特性。反馈控制器的建立与 调整离不开有效的数学模型，控制系统的类型也因使用的数学模型的不同而不同。如果 使用非构造式的动力学模型，控制系统是一般是传统p i d 控制系统；如果使用基于状态 变量和操作变量时间序列数据的黑箱性质的模型，则控制系统就是所谓的在线自适应控 制系统；如果使用经验型的、以言语规则为中心的定性模型，则过程控制就是所谓的模 糊逻辑控制。在控制精度要求不高的条件下，甚至可以利用最简单的开关( o r l - o l f r ) 控 制的手段来控制诸如溶氧浓度、p h 等状态变量。而对于控制精度要求比较高的过程， 往往需要利用控制理论来设计和确定控制器的形式和参数。基于时间序列输入输出( 操 作变量和状态变量) 数据和黑箱模型的控制，一般假定某一时段内过程的输入和输出存 坚堕查兰婴主兰竺笙茎 在着线性关系，而模型参数，即线性模型的系数可以通过逐次最小二乘回归法求得。根 据在线回归得到的模型以及线性控制理论，反馈控制器的参数可以得到适当的调节，以 确保控制系统具有良好的稳定性和( 对于控制变量目标值变化的) 响应特性。此时，由 于模型是一种在线模型，模型系数要随时间和环境的变化而不断更新，反馈控制器的参 数也要随着在线模型的变化而不断地调整和改变。这种能够适应过程动力学特性漂移、 环境因子变化的在线自适应控制系统特别适合于生物过程。 生物过程中最常见的定值控制包括：发酵罐的温度和压力控制、发酵液的溶解氧和 p h 控制、代谢呼吸商的控制等1 4 】。近年来，随着生物传感器技术以及其他在线检测技 术的发展，诸如代谢产物和基质浓度的定值控制、细胞比增殖速度的定值控制等的研究 也多有报道。由于生物过程是高度非线性的，基于线性控制理论基础上的传统p i d 控制 理论，难于直接应用于这类场合。这时，通常的办法就是对状态方程式( 非构造式动力 学模型) 在定值控制点( 平衡点) 附近进行线性化，也就是可以把过程在定值控制点近 旁的动力学特征近似看成一个线性系统，然后再直接套用传统的控制理论和方法。 1 1 2 发酵控制现状和发展趋势 九十年代初期，国内一些发酵工厂已开始采用计算机进行在线控制。传统的操作方 式对环境参数如p h ，发酵温度，溶氧d o 都可以控制得很好，但由于微生物生长过程 具有高度的非线性和时变性，关键变量，如菌体浓度和产物浓度又不可在线测量，使发 酵过程控制问题变得很复杂。所以，生化工业的闭环控制落后于一般的工业生产过程控 制【5 1 。 加强发酵过程的监督和控制是提高发酵效益的重要措施。近几年，人们开始用估计 技术来预估发酵过程的重要变量如菌体浓度和产物浓度，实现发酵过程的建模，其中包 括对环境参量和过程状态的建模【6 】。建模方法分别基于数学模型( 状态方程，差分方 程或回归方程等) 或智能模型( 模糊模型，神经网络模型或专家系统模型等) ，建模最 终目的是实现优化控制，包括环境参量优化和流加方法优化，提高产品得率。环境参量 优化即在不同的发酵时期采用不同的最适环境参量，迄今为止，仍采用多次实验试值的 方法。流加方式优化即控制补料流加方式，使各过程变量按优化轨线进行，采用的方法 多为根据经验确定流加时机和流加速率。近年来，智能模型尤其是神经网络建模在发酵 过程中得到了越来越广泛的应用。l l k o v a ，t z o n k o v 铡用神经网络模型优化大肠杆菌的 动力学模型，得到较优的培养条件和营养物质的流加速率，从而使得菌体的密度提高了 3 4 。m n a k a j i m a i s 等建立了一种在线控制乳酸发酵的专家系统，能在线检测出产生 的错误，给出= 些建议并修正它们上- 从而很好的控制了乳酸的产量和质量，p e t r o s1 9 】等 建立了一种自适应模糊控制方法控制营养物质的流加，培养b h k 重组细胞，细胞量达 到：1 2 1 0 6 m l ，乳酸的积累也有所降低。 在线控制是当前发酵控制的发展趋势，然而实现发酵过程的在线优化和控制，需要 在线测定一些过程参数。然而，现实中能够用于大规模工业生产，而且操作维护简易、 性能稳定、价格低廉的检测设备并不多。能够最真实地反映过程内在状况和本质的基质 2 兰二兰丝丝 浓度、产物浓度、细胞浓度等的在线测定设备价格昂贵、操作维护复杂、基本上仍然停 留在实验室的水平。工业上较为成熟的可测量变量一般只有p h 、d o 、发酵罐进出口 处的气体分压等为数不多的几个。因此，除了不断地开发适用于生物过程的新型传感器 和在线检测技术，当前如何能够有效地利用为数不多成熟的在线检测设备对发酵过程进 行控制也是急需研究的课题之一。由于该种控制方法一般是对菌体p h ，d o 和尾气等 的变化模式进行研究，所以一般对于有该类菌体具有通用性。本论文在p h s t a t 和d o s t a t 法基础之上建立了一种新型的大肠杆菌和毕赤酵母流加控制方法，该种不需要昂贵的检 测仪器，只需要检测p h 和d o 的电极，有望为工业化生产外源蛋白提供一种新型的菌 体高密度培养的方法。 1 1 3 神经网络模型在发酵控制中的应用 发酵过程，由于涉及生命体的生长和繁殖，机理复杂，数据获取的准确性较差。同 时，过程的影响因素多，该过程具有高度的非线性、时变性和不确定性。因此，采用经 典的机理解析式模型描述发酵过程比较困难【1 0 l 。人工神经网络由于具有较强的白适用能 力和容错能力，通过网络训练，可以相当准确地模拟系统行为。近年来，以专家系统、 模糊集方法、人工神经网络等为主要内容的人工智能方法在发酵工程中的应用正以迅猛 的势头发展。人工神经网络应用于发酵过程的模拟和预测研究己取得可喜成绩。在系统 辨识、建模、控制、优化等各方面它都有巨大的作为l l 这一现象取决于神经网络的以 下特剧1 2 i ： 多层前馈神经网络能够以任意精度逼近任意非线性映射，给复杂系统的建模带 来了一种新的、非传统的表达工具； 并行信息存储与处理结构，从而具有独特的容错性： 固有的学习能力降低了不确定性，增加了适用环境变化的泛化能力； 多输入多输出的结构模型可方便地应用于多变量控制系统； 并行计算特点，使其具有快速实现大量复杂的控制算法的潜力。 神经网络不需了解过程内部机理和先验知识，一般而言，它是被用作对象的输入输 出模型，其内部各节点间的连接权值暗含着对过程输入、输出关系的描述，通过网络拓 扑结构的选择和较为方便的学习过程，神经网络能由已知输入得到对象的输出，从而建 立对象的模型，用以预估过程众多的可测或不可测状态变量。主要体现在运用一些在线 可测量状态，估计该时刻的不可测状态量，如菌体浓度，底物浓度等，或是通过学习试 图做到用当前时刻的物理量来预测下一时刻的某些状态量。在此估计预测过程中，神经 网络充当了一个逼近真实过程的模型，它内部的连接权值的综合作用即是模型的具体表 达。神经网络建模效果的好坏主要是看该网络用于训练样本和检验样本能否达到令人满 意的精度或可信度。本论文则将神经网络引入到发酵过程中的菌体生理状态的识别中， 从而设计出了一种新型的在线营养物质的流加方式。与定量预测相比，定性模式识别对 提供学习数据的要求不很高。仅对几套实验数据进行学习，就能使人工神经网络模型具 备足够的模式识别精度，大大增强了人工神经网络模型的通用能力。 3 江南大学硕士学位论文 1 2 微生物的高密度培养 1 2 1 高密度培养简介 高密度培养技术( h i 曲c e l ld e n s i t yc u l t u r e ，h c d c ) ，也称高密度发酵，是指在培养过 程中通过流加补料，也就是不断补充营养，使菌体在较长时间内保持较高的生长速率， 从而提高菌体的浓度，最终提高目的产物的生产强度( 单位体积单位时间内产物的产 量) 。不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资 从而降低生产成本，极大地提高产品在市场上的竞争力【l3 1 。由于外源蛋白的分泌量与菌 体浓度基本呈正比关系，人们一般采用高密度培养来实现外源蛋白的高效表达在利用 重组基因工程菌进行重组蛋白和生物酶的合成生产中，大肠杆菌、酵母、枯草杆菌是应 用最广泛的生产外源蛋白质的表达系统。上述重组菌的高密度培养便成为提高重组蛋白 产率及产量的最有效方法。但由于上述重组菌具有如下的生理特征：耗氧型菌株，培 养时需要大量供氧。存在c r a b t r e e 效应，c r a b t r e e 效应的临界值很低，一般在0 1 1 9 l 左右，基质浓度超过该值，对菌体生长有抑制作用的代谢副产物( 乙酸、丙酸、乳酸， 乙醇等) 便会随之产生。其中的一些酸性物质会造成p h 低下。代谢副产物对菌体生 产、特别是外源蛋白的表达存在很大的抑制作用，据l e e 报道，利用大肠杆菌表达外源 蛋白时，代谢副产物乙酸量 s g l 就会抑制菌体生长，当其含量 0 6 9 几就会严重抑制外 源蛋白的表达。所以它们在表达外源蛋白时受很多因素影响，要考虑菌体自身的因素， 还要顾及培养过程中的外部环境条件，如营养成分、温度、p h 、溶氧浓度d o 、特别是 基质浓度的影响i l 。所以要达到微生物的高密度培养和外源蛋白的高效表达，就必须严 格控制营养物质的流加速率，使得发酵罐中营养物质刚好满足微生物的需要。 1 2 2 高密度培养的补料方式 一；非反馈补料 非反馈补料主要有恒速流加、变速流加、指数流加等方法。 恒速流加法：补充的营养按预先设定的速率流加，培养过程中细菌的比生长速率逐渐下 降，菌体总量里线性增加。陈坚等i t s l 利用恒速流加法高密度培养大肠杆菌生长谷胱甘肽， 培养4 1 5 小时获得7 7 5 e l 的d c w 。 变速流加法：在菌体密度较高时营养物的流加速率不断增加，以满足细胞生长的营养需 求。李民等【1 6 1 在高密度培养温度诱导的大肠杆菌时，利用三阶段式葡萄糖流加法获得 o d 6 0 0 为5 3 的菌体密度。 指数流加法i 营养物的流加速率呈指数增加，菌体总量可在恒定的比生长速率下呈指数 增加，该法简便易行，前提是要预先设定比生长速率等过程参数。陈坚【1 5 】等用此法流加 葡萄糖，设定比生长速率为0 2 h 1 ，培养2 5 小时即获得8 0 9 l 的d c w 。而根据尾气分析 或其它参数通过模型计算，反馈控制补料速度以维持一个低于代谢副产物产生的比生 长速率，或维持在对表达最有利的比生长速率。r i e s e n b e r g 1 7 】等用这种方法控制比生长 4 苎二兰丝丝 速率为0 1 1h ，得到了1 l o g d c w l 。用相似的方法控制后期比生长速率在0 1 5h 1 完 成了i f n2 a 工程菌的高密度培养，得到了6 0 9d c w l 。 二：反馈补料 反馈补料的反馈指标主要有基质浓度、p h 、溶氧、比生长速率等。反馈补料的优点是 控制准确，操作重复性好，技术要求较低。但所需在线测量设备较多，控制复杂。 残糖浓度反馈法：利用葡萄糖浓度的离线或在线数据，维持培养基中较低的残糖浓度。 但化学法、酶法分析葡萄糖耗时过长，葡萄糖电极技术也尚未成熟，对流加的控制较为 滞后，菌体密度不够理想。b e i l e y 1 8 】等控制残糖浓度在0 2 1 2g l 时培养非重组大肠杆 菌得到3 0 9 d c w l ，培养重组大肠杆菌得到了1 2 9 d c w l 的菌密度。 p h - s t a t 法：培养过程中当葡萄糖耗尽时，培养基的p r i 会升高，因此在p h 上升时反馈 流加一定量葡萄糖，利用葡萄糖代谢产生的有机酸代替通常调节p h 的酸液，使培养基 p h 保持恒定。该方法缺点是p h 变化并不完全是葡萄糖代谢的结果，容易造成补料的错 误。p a r kp g 等利用p h s t a t 法培养b a c i l l u ss u b t i l i s 达到18 4 9 几 d o - s t a t 法：培养过程中葡萄糖浓度降低到一定程度时，菌体代谢强度下降，消耗氧能 力降低，反映为培养基中溶解氧浓度急剧上升，因此可在溶氧上升时反馈流加葡萄糖。 h k l i m 2 0 1 等利用d o s t a t 法培养重组毕赤酵母达到1 4 0 9 l ，谷胱甘肽达到4 5 0 i u l 。 补氨关联补糖法：依据菌体每消耗1 9 氨氮的同时需要消耗1 5 9 葡萄糖的数量关系，可 在培养过程中用氨水控制v i i ，根据补氨量反馈确定补糖量，e p p s t e i n 等【2 l 】采用此方案， 结合富氧培养的方法，曾得到1 1 1 a g e 大肠杆菌的干重。 由于微生物生长代谢的复杂性，非反馈补料方式很难达到需要的控制精度。而反馈 控制方式中，无疑是残糖浓度反馈补料法的控制精度和效果最好，但是由于葡萄糖电极 难以承受高温灭菌，且价格昂贵，所以很少用于工业化生产中。目前在工业化生产中应 用的最多是p h s t a t 和d o s t a t 法。虽然这两种控制方法能很好地控制发酵罐中的营养 物质不过量，但是其使得发酵罐中的营养物质长期处于一种匮乏状态。所以两这种流加 方式是以牺牲微生物的生长速率来控制代谢副产物的积累。也就是说这两种流加方式并 没使得发酵罐中的营养物质处于c r a b t r e c 效应的临界值，而是远远低于这个i l 缶界值，所 以使用这两种补料方式使得微生物长期处于基质匮乏状态，且由于d o 和p h 的很大的 波动，所以这两种流加方式也不能达到很高的菌体浓度。本论文在这两种流加方式的基 础之上建立起了一种新型的营养物质的反馈流加方式。 1 2 3 高密度培养的国内外研究进展 菌体的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效方法。根据r i e s e n b e r g 的计算， 大肠杆菌最高菌体密度理论上可达干重( d c w ) 4 0 0g l 。考虑了培养基和其他因素，最 高菌体密度仍可达2 0 0g ，l ( d c w ) m 。最近报道的最高值为1 9 0g l ( d c w ) ，同时蛋 白的表达量也可达到2 5 以上。而国内报道的发酵密度则大多低于5 0 l ，与国外还 存在一定差距【2 4 】。 垩童查兰堡主兰垡笙苎 增加菌密度的同时，提高蛋白的表达量，可使形成的包涵体包裹得更为紧密，包涵体 内目的蛋白也较纯，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养与表达 系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素有关。培养基为重组大肠杆菌的生 长与合成产物提供了碳源、氮源、无机盐等物质基础。按培养基组分可将其分为限定培 养基、复合培养基和半限定培养基3 种类型。为了获得高密度菌体，经常采用半限定 培养基，即在限定培养基的基础上添加各类能促进细胞的生长和产物的形成的有效物 质少量的酵母粉、蛋白胨等天然物质可加速茵体生长，缩短发酵周期一些盐类如 m g s 0 4 ，c a c h ，f e s 0 4 等与细胞外产物合成的动力学平衡有关，可稳定目的产物，此外 加入适当的痕量离子如k + ，c u 2 + ，c 0 2 + ，m n 2 + ，z n 2 + 等，氨基酸如组氨酸，亮氨酸，色氨 酸，苏氨酸，谷氨酸等，维生素如维生素b 1 等则可促进菌体细胞的代谢，有利于高密 度和高表达。因此这一类培养基常用作高密度发酵培养基。如上所述，高密度培养一般 采用补料流加的培养方式。而各种培养条件如p n ，d o ，比生长速率等的控制也直接关系 到能否达到菌体的高密度培养 2 5 1 。余雪冰等人 2 6 1 利用甘油作为碳源，蛋白胨、州h 4 ) 2 s 0 4 作为复合氮源来高密度培养毕赤氏酵母，在摇瓶条件下发酵3 d 后菌体干重达到2 5 3 9 l 。 叶冰等人1 2 7 荆用葡萄糖作为碳源，蛋白胨、酵母抽提物作为复合氮源在小型罐中高密度 培养植酸酶毕氏酵母，利用变速补料方式，发酵结束时细胞干重最高可达s 0 9 l 郭美 锦1 2 9 以甘油为碳源、( n h 4 ) 2 s 0 4 为氮源的全合成高密度摇瓶培养基墙养毕赤酵母，在补 料发酵时细胞干重可达到1 1 5 9 l - 1 6 0 9 l 。s c h i r a l d i 2 9 1 等用b l 2 1 ( d e 3 ) 为宿主高密度培养 时获得5 0 9 l 细胞干重( d c w ) 。c h u ny e o nl e e l 3 0 1 等人在利用毕赤酵母高密度发酵生产 g i 淀粉酶时，利用溶氧控制碳源甘油的流加速率，并以流加氨水来补充氮源并控制p h 为5 0 ，经优化后的最大细胞干重可达1 1 0 9 l 。h k l i m 3 1 1 等人同时控制溶氧跟甲醇流 加速率来诱导表达r g u a m e r i n ，补料结束时细胞干重可达1 4 0 9 l 。 1 2 4 高密度培养时代谢副产物的抑制作用 乙酸是影响大肠杆菌高密度培养的主要代谢副产物，大肠杆菌对葡萄糖的过量摄取 是生产乙酸积累的原因。大肠杆菌对糖类的转运能力很强，而且在葡萄糖进入细胞的同 时，糖酵解作用就已经开始，使得大量的碳代谢流涌入细胞。由于大肠杆菌的氧化磷酸 化和三羧酸循环的能力有限，造成碳代谢流在糖酵解途径中过量。大肠杆菌通过分泌部 分氧化的副产物使碳代谢流得到平衡，乙酸即是这类主要的副产物。其主要产生途径是， 乙酰c o a 在乙酸激酶( a c k ) 和磷酸转乙酞基酶( p t a ) 的作用下转化为乙酸。同时由于产 生一分子乙酸时有一分子a t p 产生，因此细胞易产生乙酸的积累【3 2 i 。 一般认为乙酸在p h 中性环境中以离子化( c h 3 c o 和质子化【c h 3 c o o h ) 两种形 式存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内，在胞内( p h7 5 ) 解 离成c h 3 c o o 和付，降低了膜内p h 值，使膜内外的质子势能差减少，大大减少了能 量的产生，因而严重扰乱了细胞的正常代谢和生理活性。不同宿主菌对乙酸的耐受力不 同，通常乙酸浓度在0 6 一1 2 9 l 以下时，大肠杆菌的生长和表达可不受影响；乙酸浓度 6 兰二兰丝丝 在1 4 9 l 以上时大肠杆菌h b l 0 1 即停止生长】。因此，解除乙酸对大肠杆菌生长和表 达的抑制效应，是实现大肠杆菌高密度培养的关键技术 减少乙酸积累的对策有利用代谢工程策略，通过抑制乙酸生成的关键酶直接阻断乙 酸的产生途径，限制糖酵解途径上的碳代谢流；将过量碳代谢流转化为其它低毒的副产 物；对碳代谢流进行分流等。如张惟材等1 3 4 1 利用p t a 缺陷的b l 2 1 ( d e 3 ) 变株进行高密 度培养，发酵终期时乙酸含量为4 2 2 w c l ，仅为亲株b l 2 1 ( d e 3 ) 的4 3 。杨运桂等l j 刈 在p t a - a c k 缺陷的大肠杆菌中整合了透明额菌血红蛋白基因，提高宿主菌在低氧条件 下对氧的利用率，在高密度培养时乙酸积累仅有7 8 5 9 l 1 ，是对照菌株的1 2 ，而细胞 干重却比对照菌株提高了4 7 。但由于乙酸代谢是中央碳代谢的一部分，涉及e m p 途 径、t e a 循环和乙醛酸补给反应，还与能量代谢相关，利用代谢工程单一地改造碳代 谢的某一部分，不易为过量的碳代谢流找到合理的出路：改造过多时容易对代谢产生副 作用1 3 2 1 在发酵工艺水平上，还可通过降低发酵温度、限制加入碳源的方法适当降低比 生长速率，来获得乙酸的低水平积累。采用合适的补料方法，使培养液中保持葡萄糖持 续的低浓度，是利用工艺手段减少乙酸生成，实现高密度培养的简便有效的方法。 s h i l o a c h l , j 3 6 等利用高糖分批培养带有假单胞菌外毒素基因e c o h l 3 l 2 1 ( v c a 5 ) 及带有麦 芽糖结合蛋白和h 1 v 蛋白酶的融合蛋白基因的j m l 0 9 ( p b p 3 2 2 ) ，产乙酸分别为2 9 l 和 1 0 9 l ，而采用低糖浓度先分批培养然后再流加补料培养，两菌株产酸量减少了l 倍多。 1 3 立题意义 近年来随着基因工程技术的飞速发展，由重组基因工程菌合成生产高附加价值重组 蛋白和生物酶等产物的发酵过程越来越受到重视，商业化生产也在逐步地形成和完善。 发酵法生产的重组蛋白，如a 淀粉酶、1 3 半乳糖苷酶、干扰素吖等，广泛应用在农产 品加工、食品工业、纺织工业、造纸、化学、医药等国民经济诸多行业。发展和完善有 效的重组蛋白和生物酶合成工业化技术将对国民经济和地域社会的发展起重要作用。为 了以最小的代价获得最大的产值和利润，重组异源蛋白的工业化生产，除了需要构建出 高效稳定表达外源基因产物的工程菌外，大规模培养工程菌的技术和工艺显得日趋重 要。高密度培养技术( h c d c ) 就是为满足这一需要而发展起来的一门新兴技术它具有 高生产率、低生产成本、培养体积小、工业污水少、下游处理方便等诸多优点。而高密 度培养的核心技术就是如何在控制代谢副产物的积累下，让菌体以最佳的比生长速率增 长。如前所述为了控制代谢副产物的积累，主要有两种方案：( 1 ) 利用代谢工程策略改 造菌种对代谢副产物的耐受性或阻断代谢副产物的合成途径。( 2 ) 在发酵工艺水平上， 采用合适的补料方法，使培养液中葡萄糖保持持续的低浓度，减少代谢副产物的生成。 由于利用代谢工程策略对菌种进行改造，动一发而动全身，产生一些意外的结果，常常 是抑制这种代谢副产物而又积累了另外一种代谢副产物。所以在工业化大生产中利用得 最多还是在工艺水平上的控制，但是如前所述，现在还是没有一种非常好的流加方式。 本论文则以工业上利用得最多的p h s t a t 法和d o s t a t 法的为基础，进行了一些改进， 7 江南大学硕士学位论文 建立了一种新型的营养物质的在线流加方式。该种流加方式较好地把发酵罐中的营养物 质控制在了一个合适的水平，既不积累代谢副产物又能使得菌体以最大的比生长速率增 长。所以该种流加方式缩短生产周期，提高了菌体的密度和外源蛋白的表达量。且该种 控制方法不需要昂贵的检测仪器，只需要p h 和d o 电极。该种电极己普遍应用于工业 生产中，操作简单、性能可靠。该种流加方法易于用于工业化生产，有望为工业化生产 外源蛋白提供一种新型的微生物高密度培养的方法。该控制方法在毕赤酵母和大肠杆菌 的高密度培养中都获得了成功，可知该控制方法还具有一定的通用性，其适用于培养耗 氧，在基质过量时代谢酸性代谢副产物，且具有c r a b t r e e 效应的微生物 发酵过程是一个复杂、非线性和时变性的过程，迄今为止大量研究集中在开发准确 和透明机制的定量生物模型上，而过程固有的复杂性又阻碍了多年来在这方面的重要突 破及应用。发酵过程确实存在着大量的反映其内在实质和特征的模式。对发酵过程中特 有的模式和变化特征进行识别，把显形但隐藏内在过程的影响从测量变量中提取出来， 进行合理定量的判断和数据解释，进而采取措施实现发酵过程优化的方法，是一种全新 的控制模式和概念，国内外的相应研究非常缺乏。因此，对发酵过程的模式识别技术进 行全面、深入的研究，确立其在发酵过程优化中的地位和作用，提高发酵产物的产量和 产率，具有重要的学术意义和应用价值。本论文在国内首次将神经网络的状态识别功能 引入到发酵状态的识别中。这对今后对发酵过程中状态的识别有一定的参考意义，是把 控制学中先进的控制手段与传统发酵行业结合的一次很好尝试。 1 4 本论文的主要研究内容 分析了p h s t a t 法和d o s t a t 法培养大肠杆菌和毕赤酵母时d o 和p h 的变化 状态以及人工造成营养基质过量情况下大肠杆菌和毕赤酵母d o 和p h 的变 化状态。 验证了d o 和p h 的变化状态与发酵罐中营养物质浓度的关系。并利用多次 实验时大肠杆菌和毕赤酵母d o 和p h 的数据建立了两个神经网络，检验了 该神经网络对d o 和p h 状态的识别结果。 建立了一种新型的基于神经网络识别d o 和p h 变化状态( a r t i f i c i a ln e u r a l n e t w o r kp a t t e r nr e c o g n i t i o n , a n n p r ) 的营养物质在线流加方法。 将a n n = p r = 控制方式和p h - - s t a t 法进行了比较，并对毕赤酵母表达植酸酶 的诱导条件进行了一定的研究。 8 ) ) ) ) n q o “ 第二章建模数据的获取和a n n 模式识别模型的建立 第二章建模数据的获取和a n n 模式识别模型的建立 2 1 引言 在发酵过程中隐藏着大量的反映其内在实质和特征的模式。比如溶氧( d o ) 和p a 的变化模式与菌体生长速率和基质浓度的关系，p , q 的变化与菌体中代谢途径的变化等 叨。对发酵过程中特有的模式和变化特征进行识别，把显形但隐藏内在过程的影响从测 量变量中提取出来，进行合理定量的判断和数据解释，从而有望实现发酵过程的优化。 但由于发酵过程是一个复杂、非线性和时变性的过程，过程固有的复杂性使得利用常规 的数学方法来识别出这些特定的模式变得困难重重。人工神经网络由于其有一定的容错 能力，处理复杂、非线性系统的能力很强，所以在发酵优化过程中得到了广泛使用。神 经网络模型各种各样。它们是从不同角度对生物神经系统不同层次的描述和模拟。有代 表性的网络模型有感知器，多层映射b p 网络，r b f 网络，双相联想记忆( b a m ) ，h o p f i e l d 模型等1 3 柳。利用这些网络模型可实现函数逼近，数据聚类，模式分类，优化计算等功能。 b p 网络是一种多层前馈神经网络，其神经元的变换函数是s 型函数，因此输出量是为 0 到l 之间的连续量，它可以实现从输入到输出的任意的非线性映射。由于权值的调整 采用反向传播( b a c kp r o p a g a t i o n ) 的学习算法，因此也常称为b p 网络。在确定了b p 网 络的结构后，利用输入和输出样本集对其进行训练，也即对网络的权值和阙值进行学习 和调整，能使网络实现给定的输入输出映射关系。经过训练的b p 网络，对于不是样本 集中的输入也能给出合适的输出，这种性质称为泛化( g e n e r a l i z a t i o n ) 功能。从函数拟合 的角度看，这说明b p 网络具有插值功能。所以b p 神经网络能较好的识别出复杂非线 性系统的一些特定的模式。 作者通过研究大肠杆菌培养过程中大量的溶氧( d o ) 和p h 的基础数据，发现d o 和口h 的变化存在一些特定的模式，且该模式与大肠杆菌培养过程中的葡萄糖浓度相关 联，即如果识别出这些特定的模式则能判定培养过程中的葡萄糖的浓度。比如：d o 在 剧烈的振动，而p h 也相应的在上限振动，则葡萄糖匮乏；d o 基本不振动，而p h 也 在下限振动，则葡萄糖的浓度过高。利用m a t l a b 数据处理软件建立起的两个b p 人工神 经网络系统分别识别出了流加培养过程种的d o 和p h 的特定的状态模式，较好地判别 出了培养过程中葡萄糖的过剩与匮乏，并在此基础之上建立起了一种新型的用于大肠杆 菌高密度培养的流加方式。 9 江南大学硕士学位论文 2 2 材料与方法 2 2 1 材料 试剂与原材料： 葡萄糖 硫酸铵 牛肉膏 蛋白胨 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 酵母粉 七水合硫酸镁 七水合硫酸铁 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 仪器与设备： 5 l 发酵罐 p h 和d o 电极 j a l l 0 2 电子天平 1 1 2 a 气相色谱 u v - - 2 1 0 0 型分光光度仪 s b a - 4 0 b 生物传感仪 h y 0 一回转式恒温调速摇瓶柜 超静工作台 菌种； e c o l ik 1 2 ( 由本实验室提供) 中国医药集团上海化学试剂公司 上海试剂一厂 中国医药集团上海化学试剂公司 国药集团化学试剂有限公司 上海化学试剂总厂 上海恒信化学试剂有限公司 英国0 x o i d 公司 上海化学试剂总厂 上海化学试剂总厂 上海保兴生物设备工程有限公司 瑞士h a m t o n 公司 上海海康电子仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 尤尼柯上海仪器有限公司 山东省科学院生物研究所 上海欣芯自动化设备有限公司 苏净集团安康公司 培养基： 平板保藏及活化培养基( g l ) ： 蛋白胨5 ，酵母膏5 ，葡萄糖l ，琼脂2 0 ，k 2 h p 0 4 l 。 种子培养基( g l ) ： 葡萄糖l o ，硫酸铵5 ，磷酸氢二钠3 ，磷酸二氢钾2 ，酵母粉1 。 发酵罐培养基组成( 胡一 葡萄糖1 0 ，牛肉膏3 ，蛋白胨5 ，七水合硫酸镁0 8 ，七水合硫酸铁o 2 5 ，硫酸铵2 5 。 流加培养基( g l ) ： 葡萄糖5 0 0 ，蛋白胨5 0 ，硫酸铵5 0 ，酵母粉2 0 。 培养基灭菌条件：0 1 m p a ，1 2 1 下灭菌2 0 m i n 。 1 0 第二章建模数据的获取和 洲模式识别模型的建立 2 2 2 培养方法及条件 种子培养条件： 将菌种斜面活化后，接两环与装有1 0 0 m l 种子培养基的5 0 0 m l 三角瓶中，置摇床 上于转速1 8 0 r m i n ，温度3 7 下培养8 小时左右。 发酵罐培养条件： 5 l 的发酵罐，罐压：0 0 7m p a ；开始罐的装液量：2 l ；接种量：1 0 ；温度：3 t c ； p h ：7 0 左右( 发酵过程中通过流加氨水( 2 5 ) 来控制p h ) 。 发酵培养( 获取建模数据) 过程中营养物质流加的控制策略： 菌体培养的开始阶段不流加营养物质，在培养过程中当d o 突然上升而p h 也随之 上升时，即表示发酵罐中的营养物质己耗尽，开始补料。补料的策略为通过与溶氧联动 或与口h 联动来流加营养物质。一般d o 的界限控制在8 0 3 9 1 ，即当发酵罐中的溶氧超 过8 0 就开始流加营养物质；p h 的界限控制在7 3 【柏】，即当发酵罐中的p h 的值超过 7 3 就开始流加营养物质。在流加培养的某阶段人为地大量流加营养物质造成葡萄糖过 量的环境，从而获取基质过量时p h 和d o 的建模数据。补料的流加瓶放置在电子天平 上，每时刻流加瓶的重量都被纪录。从而可以计算出补料的流加速率。在流加培养的后 期，由于通空气不能满足菌体生长所需的耗氧量，通纯氧进行流加培养。 2 2 3 分析方法 葡萄糖的测定： 采用s b a - 4 0 b 生物传感仪( 山东省科学院生物研究所产) 测定：发酵时每一个小 时取一次样，发酵液经过1 0 0 0 r m i n 离心1 0 r a i n 。将待测液稀释到5 0 1 2 0 0 m g 1 0 0 m l 的 范围；利用s b