（材料学专业论文）电化学生物传感器的研究.pdf

上海大学硪士学位沦文 摘要 本论文采用电化学方法，对固体电极表面组装蛋白质和d n a 进行了比较系统的 研究。我们用共轭导电高分子包裹血红蛋白沉积到玻碳电极表面，得到了较好的蛋 白质直接电化学信号，利用上面体系成功地进行了过氧化氢对血红蛋白的催化氧化 检测；另外，我们还在电化学d n a 传感器上做了一些研究，分别在固体金电极和钯 电极表面组装巯基d n a 作为探针，并用巯基己醇封闭位点，用巯基己醇进行处理被 证明能够有效地竞争性去除松散结合d n a ，防止非特异性吸附，从而提高杂交效率。 巯基d n a 巯基己醇混合组装表面是一个高度功能化的界面，在其上可以实现高效 率，可重复的杂交反应。本实验结果可能有助于进一步设计高性能的电化学d n a 传 感器。 关键词： 生物传感器，蛋白质电化学，共轭导电高分子，表面自组装 d n a 传感器 上海大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h i s p a p e r , w ei n v e s t i g a t e dp r o t e i ne l e c t r o c h e m i s t r yu s i n ge l e c t r o c h e m i c a l t e c h n i q u e s ，b yp r e c i p i t a t i n gh e m o g l o b i n ( h b ) a tg l a s yc a r b o ne l e c t r o d e ( g c ) s u r f a c e s ， c o n d u c t i n gp o l y m e r sw e r eu s e dt oe n t r a pe n z y m e sf o r m i n ga ne n z y m ee l e c t r o d e w e d e m o n s t r a t et h ei n f l u e n c eo fs p a no nc vr e s p o n s eo fl i b i na d d i t i o n ，w es h o w e d i n f l u e n c eo fh 2 0 2o nt h ec a t a l y t i cc vp e a ko fh b a l s o ，w es y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e d d n ai m m o b i l i z a t i o n ，h y b r i d i z a t i o na n dd e h y b r i d i z a t i o na tg o l ds u r f a c e sa n dp a l l a d i u m s u r f a c e s t h et r e a t m e n to fm e r c a p t o h e x a n o li s p r o v e nt oc o m p e t i t i v e l yr e m o v el o o s e l y b o u n dd n aa n dp r e v e n tn o n s p e c i f i ca d s o r p t i o na tb o t hg o l ds u r f a c e sa n dp a l l a d i u m s u r f a c e s a l t h o u g hi t se j c ti sn o tc o m p l e t e as h d n a m e r c a p t o h e x a n o lm i x e ds u r f a c e i sh i g h l yf u n c t i o n a l ，o nw h i c he f f i c i e n ta n dr e p e a t a b l eh y b r i d i z a t i o nc a nb ea c h i e v e d t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t sp r e s e n t e dh e r em i g h tb eu s e f u lf o rd e s i g no fh i g hp e r f o r m a n c e e l e c t r o c h e m i c a 】d n as e n s o r s k e y w o r d s ：b i o s e n s o r ，p r o t e i ne l e c t r o c h e m i s t r y , c o n d u c t i n gp o l y m e r s ，s a m d n a b a s e ds e n s o r v l 上海大学碗士学位论文 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。除 了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发表或撰 写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：盟日期： 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留论文及送交论文复印件允许论文被查阅和借阅；学校可以公 布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：盟导师签名骖期 上海大学硕士学位论文 1 课题来源 绪论 本课题得到国家自然科学基金( 2 0 4 0 4 0 1 6 ) 和上海市启明星计划资助项目资助 2 课题研究的目的、意义和概况 生命科学在2 0 世纪取得了巨大的进展，许多科学家预言，2 1 世纪是生命科学 的世纪。生物芯片技术，被喻为2 l 世纪生命科学的支撑技术，是便携式生化分析仪 器的技术核心。自从1 9 9 1 年f o d o r 等人提出d n a 芯片概念后，近年来以d n a 芯 片为代表的生物芯片技术得到了迅猛发展，目前已有多种不同功能的芯片问世，有 的已经在生命科学研究中发挥重要作用。生物芯片己被公认将会给2 1 世纪的生命科 学和医学研究带来一场革命，并因此成为各国学术界和工业界瞩目和研究的一个热 点。美国商界权威刊物f o r t u n e 将生物芯片的重大意义与微处理器作了对比，认为微 处理器使我们的经济结构发生了根本的改变，给人类带来了巨大的财富，改变了我 们的生活方式：而生物芯片可能会从根本上改变人类的医学行为和生活质量，从而 改变世界的面貌。生物芯片技术的出现将会给生命科学、医学、化学、新药开发、 生物武器研制、外太空探索、司法鉴定、食品和环境卫生监测等领域带来一场革命。 该技术利用微电子工业技术，将现在生命科学研究中“各自为阵”的分析过程、 成千上万个与生命相关的信息集成在一块指甲大小的生物芯片上，使生命科学及医 学工作者可以在方寸之上进行和完成一系列实验程序，专家们因此将其称之为“缩微 ：芯片实验室”。采用该技术可进行生命科学和医学中所涉及的各种生物化学反应，从 而达到对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的。 生物芯片的基础是生物传感器，所谓生物传感器是一种是一类特殊的化学传感 器，它是以生物活性单元( 如酶，抗体，核酸，细胞) 作为生物敏感基元，对被测 目标物具有高度选择性的检测器。它通过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物 与敏感基元之间的反应，然后将反应的程度用离散或连续的电信号表达出来，从而 得出被测物的浓度。 、，i 上海大学硕士学位论文 生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透 成长起来的高新技术，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂 的体系中进行在线连续检测的特点；生物传感器的高度自动化，微型化和集成化， 减少了对使用者环境和技术的要求，适合野外现场分析的需求，在生物、医学、环 境监测、食品、医药及军事领域有着重要应用价值，已引起世界各国的极大关注。 生物传感器的结构一般有两个主要组成部分：其一是生物分子识别元件( 感受 器) ，是具有分子识别能力的生物活性物质( 如组织切片，细胞，细胞器，细胞膜， 酶，抗体，核酸，有机物分子等) ；其二是信号转换器( 换能器) ，主要有电化学电 极( 电位，电流的测量) ，光学检测元件，热敏电阻，场效应晶体管，压电石英晶体 及表面等离子共振器件等。当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合 物( 或光，热等) 通过信号转换器转变为可以输出的电信号，光信号等，从而达到 分析检测的目的( 图1 ) 。生物传感器的选择性取决于它的生物敏感元件，而其它性能 则和它的整体组成有关。 图1生物传感器的一般构成 与传统的分析方法相比，生物传感器这种新的检测手段具有如下的优点：生 物传感器是由选择性好的生物材料构成的分子识别元件，因此一般不需要样品的预 处理，样品中的被测组分的分离和检测同时完成，且测定时一般不需加入其它试剂； 由于它的体积小，可以实现连续在线检测：响应快，样品用量少，且由于敏感 材料是固定化的，可以反复多次使用；传感器连同测定仪的成本远低于大型的分 析仪器，便于推广普及。 在众多生物传感检测方法中，基于分子电学性质的电化学技术具有独特的优越 上海大学硕士学位论文 性。电化学检测技术灵敏、快速、成本非常低廉，而且检测装置轻便、低能耗且易 于微型化和集成化，符合手持式检测装：! 置以及未来的芯片实验室( l a b o n a c h i p ) 的要 求。需要指出的是，由于电化学检测技术涉及到复杂的界面问题，因而电化学生物 传感器目前尚远不如基于光学检测技术的生物传感器发展成熟。然而我们看到，以 分子自组装技术( s e l f - a s s e m b l ym o n o l a y e r ) 为代表的界面分子设计和以扫描探针显微 镜( s p m ) 为代表的界面纳米分析技术的发展和成熟为电化学生物传感器提供了前所 未有的发展机遇。为此，著名的n a t u r eb i o t e c h n o l o g y 杂志曾在2 0 0 0 年以“电化学 d n a 分析时代即将到来”( e l e c t r o c h e m i c a ld n aa n a l y s i sc o m e so f a g e ) 为题发表了一 篇评论。与此相应，近几年电化学生物传感器的最新成果不断出现在顶级学术刊物 上。例如b e n s o n 等( s c i e n c e2 0 0 1 ) 报道了通过蛋白质结合配体前后的构象变化实现检 测目标配体的电化学生物传感器；x i a o 等( s c i e n c e2 0 0 3 ) 报道了利用纳米金粒子作为 葡萄糖氧化酶的电子传递通道进行葡萄糖的电化学酶传感检测；b o o n 等( n a t u r e b i o t e c h n 0 1 2 0 0 0 ) 和樊春海等( p n a s2 0 0 3 ) 分别利用d n a 双螺旋内的电子传递特 性和表面有序组装的d n a 茎环结构实现了高效的电化学d n a 传感检测。这一趋势 在国内也有着类似的反映，高校和中国科学院的多个研究组均有电化学生物传感器 方面的重要进展在j a c s ，a n a lc h e m 等权威学术杂志报道。 3 论文的主要研究内容 本论文是以作者攻读硕士学位期间承担课题的工作为基础，在绪论部分中阐述 了课题研究的来源、目的、意义以及国内外研究的现状。论文分两部分，第一部分 为蛋白质直接电化学的研究，主要是用导电高分子放大的血红蛋白的直接电化学的 研究：第二部分是基因识别的电化学检测，主要是金电极和钯电极上自组装巯 基d n a 作为探针，对探针性质和杂交检测的研究。 上海大学硕士学位论文 1 1 引言 第一部分蛋白质直接电化学的研究 第一章电化学方法简介 电化学是一种重要的分析手段。由于法拉第、伏打等创始者以及其他一些杰出 化学家的汞献，电化学很早就已发展成为物理化学学科中一门成熟的分支学科。近 二十年来，由于电子、计算机技术的迅速发展以及学科交叉的深入，电化学技术取 得了革命性的进展。目前，以伏安技术为代表的电化学方法己被广泛的应用到化学 研究的各个方面，尤其引人注目的是电化学技术在生命科学( 主要是涉及电子传递 的生命过程) 中的应用。 1 、电化学测定方法的特点 以伏安法为中心的电化学测定方法是将化学物质的变化归结为电化学反应，也 就是以体系中的电位、电流或者电量作为体系中发生的化学反应的量度进行测定的 方法。电化学方法测量到的电流和电位与通常回路中观测到的电流和电位有以下几 点区别： ( 1 ) 在电化学测定中，一般的情况下，电流与电位之间的欧姆定律不成立。 ( 2 ) 电极的电特性难以用单纯的电阻或者阻抗来说明。 ( 3 ) 在回路中电流不为o 的测定法中，伴随着化学反应( 电化学反应) 的发生所以， 尽管测定条件( 如电位) 保持一定，但测量数据( 如电流) 仍随着时间而变化，难以 一直保持稳定状态。 ( 4 ) 电极反应与电极测定前的状态紧密相关，造成实验的重现性比较差。 上述几点可以说是电化学测定方法的缺点，也可以把它看作电化学测定方法的 特性。另外，电化学研究的指导理论包含了热力学和反应动力学等庞大的理论知识。 电化学反应不是通常的均相溶液中的反应，而是电极表面的异相反应，即在固液界 面上发生的反应，因此，其处理方法也不同于一般的反应。但是，一旦理解了电化 学测定法的基本特点以后，电化学侧定方法就能灵活应用于各种研究领域，成为解 析各种反应机理的强有力的手段。 上海大学硕士学位论文 2 、电化学测定方法的优点 ( 1 )测定简单可以将一般难以测定的化学量直接变换成容易测定的电参数加 以测定。 ( 2 ) 测定灵敏度高因为电化学反应是按法拉第定律进行的，所以，即使是微量 的物质变化也可以通过容易测定到的电流或电量来进行测定。以铁的测定为 例，1 c ( 库仑) 相当于0 2 9 m g 的铁，而电量的测定精度可达1 0 - 1 6 c 。所以，利用 电化学测定方法，即使是1 0 。9 9 数量级的极其微量的物质变化也可以在瞬间测 定出来。 ( 3 )即时性利用上述高精度的特点，可以把微反应量同时检出，并进行定量。 ( 4 )经济性使用的仪器都比较便宜，而且具有灵敏度高，即时性等优点，是一 种经济高效的测定方法。 电化学方法可分为两大类：界面和溶液方法。界面电化学主要研究发生在电极 一溶液界面上的化学过程。它可以再被细分为两类：平衡和动态方法。本论文主要 采用界面动态电化学方法。其中，伏安法是最主要的研究手段。 1 2 电化学系统简介 伏安法实验中通常采用三电极系统，分别是工作电极、参比电极和辅助电极( 见 图1 1 ) 。这种三电极的设置可以使测量时仅需关注在工作电极上发生的反应即可。 电极电流可以看作是工作电位的函数。恒电位仪是提供工作电压和收集检测电流的 电子设备。 lt t n “， i。 图l1 三电极系统( 工作电极的电位是相对于参比电极的，电流流经工作电极和辅助电极、 工作电极常用的电极材料有 1 、 铂电极 铂是最常用的一种电极捌料 铂、金、碳和汞。 铂具有化学性质稳定、氢过电位d 、容易进行加 上海大学硕士学位论文 工等特点，而且高纯度的铂容易得到，所蚍，铂是实验室中不可缺少的电极材料。 图1 2 是电位扫描测量电流电位曲线实例，从图中可以看出：氢过电位很小， 在阴极扫描中，氢气几乎在理论电位上发生。氢气产生之前有两个峰，这是氢离子 的吸附峰；氢气生成后，进行阳极极化时，可以观察到氢气的氧化峰。进行阴极扫 描时可以看到吸附的逆反应即相对应的脱附峰。吸附峰和脱附峰的大小随着电位 扫描的速度而改变。铂电极的电位窗门是相当宽的。 f 一1 峰呲“ 从一 年 f 【v n l lr j 图1 2 0 5 m h 2 s 0 4 中p t 电极的电流电位曲线( 2 5 c 扫速：0 3 1 v s “) r e f 1 2 、金电极 金和铂一样，是一种经常使用的电极材料。图1 3 是用电位扫描法得到的金电 极的电流一电位曲线。图中不出现氢吸附峰。在d h 为4 1 0 的范围内，氢过电压为 0 4 0 5v ，这说明：金电极在阴极区域的电位窗口比较宽。但是，在h c l 水溶液中， 由于生成氯化物的络合物而发生阳极溶解。这种由于形成络合物而发生的阳极溶解 在含有其它卤素离子或者c n 一离子的水溶液中也会发生。金电极还有一个特点，就 是形成薄层氧化膜。把金电极与铂电极进行比较，其作为固体电极的最大缺点就是 电极制作麻烦。但是，金比铂更容易与汞形成汞齐，旋转圆盘电极分析法中经常使 用金圆盘电极。 “ ”。芒 ” 圈i3 1 mh ! s o 。中a u 电极的电流电位曲线( 2 5 。c 扫述 上海大学硕士学位论文 3 、碳电极 碳电极是一种总称它包括：石墨电极、碳糊电极、玻璃态碳电极等。碳电极 电位窗口宽、容易得到、使用方便。 石墨电极大致可分为两个种类。一种是浸入石蜡的多孔性石墨电极，另一种是 热分解制作的致密性石墨电极。 因为高纯度的石墨是多孔性的，使用时会因浸入电解液或者氧气而影响测定， 所以，应进行浸石蜡预处理后方可使用。这种处理后的石墨电极，虽然具有较大的 残余电流，但却有相当宽的电位窗口。通过砂纸摩擦后可得到新的表面。 热分解石墨( p g ) 是高温减压条件下，在2 0 0 0 。c 左右的基板上使碳水化合物热 分解形成的很薄的具有结晶构造的层状物。因此，液体和气体进不去，金属等杂质 的混入量比起多孔性石墨也少得多，所以，残余电流较小。但液体等容易从层的边 缘部分进人层间，所以，也应进行浸石蜡预处理。热解石墨电极是各向异性的。有 两种表面：基面和棱面。基面和棱面的结构和表面功能基团差别很大( 图1 4 ) ，因 此在它们上面发生的电化学响应是不一样的。通过研磨或者用砂纸擦亦可得到新的 表面。 糊状碳电极是在润滑油中加入石墨粉，并用石蜡、环氧化物、硅橡胶等作载体 做成的电极。它具有制作简单、再现性好、阳极极化的残余电流小等优点。此外， 与铂电极相比，在阳极区具有较宽的电位窗口，这是因为电极本身不会形成氧化膜 的缘故，而且，由于材料本身较软，所以容易更新电极表面。但是，在非水溶液中， 有的载体会溶解。 玻璃态碳电极( g c ) 具有导电性好、对化学药品的稳定性好、气体无法通过电 极、纯度高等特点。其性质与热解石墨棱面性质大致相似。它具有价格便宜、表面 通过研磨可以再生、氢过电位和溶解氧的还原过电位小等特点。随着玻碳电极的普 及化，利用它进行研究的人数也在不断增加。 4 、汞电极 汞具有常温下是液体、氢过电位大两大特征。汞电极有滴下型、流动型、池型 三种形状，特别是前二者，能经常保持新鲜的电极表面，不受生成物和不纯物吸附 的影响。因此不必进行电极的磨光和洗净等前处理。因为其氢过电位很大，所阻汞 电极在还颢区域的电位窗口范围很宽。 5 、其它垒属电极 上海大学顶= 七学位l 仑文 p d ，o s ，l r 等贵金属i 土l 经常用作电极材料，特别是p d 的氢过电位和铂一样小， 而且具有多孔性表面，容易吸藏氢，用作氢电极非常台适。此外，n i ，f e ，p b ，z n ，c u 等也经常作为电极材料。 6 、特殊电极 具有导电性且透明的电极，如i t o 电极。还有像s i c d s ，t i 0 2 那样的半导体电 极，以及碳电极上涂上高分子化合物的电极。这些电极表面各具特性，所以也叫做 功能性电极。 固体电极每次实验前需要更新表面，通常是用砂纸打磨，然后在0 0 5 1 0 微米 的氧化铝与水的混合物上研磨至镜面平整。 b a s a ln l o 薹垂寒囊塞， 勰荩霎囊摹毫辞 薹薹薹蓦萋曼 芎事蓬萋辫 o ，4 m n 图14 热解石墨的结构 常用的参比电极有饱和甘汞电极( s c e ) 和银氯化银( a g a g c l ) 电极。辅助 电极采用有较大面积的惰性材料，常用铂片或铂丝电极。 图1 5 是电化学实验中电极和电解池简图，实验中一般需要通氮气除氧。 e l e c t r o d e s r e f e r o n e 上腮大学硕士学位论文 1 3 电化学分析方法简介 1 3 1 伏安法 循环伏安法是最常用的电化学技术。它能提供关于氧化还原过程的大量信息。 循环伏安法最吸引人之处在于：它能够很方便的从e ，2 估测出一个氧化还原电对的 表观标准电极电位( e o ) 。e o 反映了一个氧化还原电对的氧化态和还原态物质的相对 稳定性，它对于研究超分子复合物是很有价值的，可以作为研究氧化还原蛋白结构 受环境影响的研究指标。循环伏安法的检测限一般只有1 0 一m o l l ，这对于通常的 分析应用来说是不够的。改变加载电位的波形是解决这一问题最有效的方法。这种 被称为脉冲伏安法的方法可以有效地降低充电电流，从而提高了检测灵敏度。常用 的有示差脉冲伏安法( d p v ) 和方波伏安法( s w v ) 。d p v 灵敏度很高，可达到1 0 _ 8 m o l l 的检测限。因此d p v 在样品量少的情况下是很有用的，对于生物样品检测 尤为实用。s w v 是新发展起来的一项技术。与d p v 相比，s w v 允许使用较快的扫 描速率，这也是它的主要优点。随着计算机技术的发展，方波伏安法受到了广泛的 欢迎，甚至被誉为明天的伏安技术。 1 3 2 计时电量法 计时电量法也称计时库仑法。是一种主要用来研究电极表面吸附现象，并定量 地测定电活性物质或表面活性物质在电极表面吸附量的电化学分析法。它的基本原 理与极谱法相同，但所测的是在电解池线路中流过的电荷，而不是电流与电解时间 的关系，故称计时电量法。计时电量法能更清楚地观察电活性物质有无特性吸附- 也是证实电极过程中有无吸附和测出i j 及附量的较新的电化学分析法。 1 4 生物电化学 生命过程的核，0 问题之一是能量转换，例如呼吸作用和光台作用而能量转换 的中心过程是电子的传递，因此生物电子传递过程是生命科学基础理论研究的热点 之一。从电菏传递的角度看生命现象也表现为一种电化学现蒙，而：好电化学的基 本理论、方法用于生命过程的研究就形成了生物电化学( b i o e l e c t r o c h c n l l s t r y l 这门 上渐大学硕士学位沧文 边缘学科。 一般可以认为，生物内发生的反应是由一种叫做酶( e n z y m e ) 的催化剂而引起 的。这种酶的反应同电极上发生的电化学反应有许多相似之处。例如，可以把细胞 膜( c e l lm e m b r a n e ) 内酶的反应看作同在固体液体界面上发生的电极反应一样，都 属于非均相反应。无论是细胞膜还是电极表面都带有电荷。而且生物体内反应的d h 值，离子强度和温度等与电化学反应时常用的条件类似。特别是酶粒子的氧化还原 反应，完全可以认为是一种有电子转移的电化学反应。我们生命活动中伴随着呼吸 作用而发生的能量传递过程，以及植物的光台作用都是以氧化还原为基础的电化学 反应。 从测量技术的角度看，电化学可作为获得生物体反应的热力学信息( 例如，氧 化还原电位) 、电子迁移速度及有关反应机理信息的手段。作为生命科学重要领域的 生物信息测量、转换及其医学方面的应用，电化学起到了很大的作用。用电化学的 方法可以把生物体系做成人工模型系统。例如神经模型、光合成模型等。也可以考 虑利用酶和微生物进行发电或者进行有用物质的电化学生产。 生物电化学是电化学与生物学的交叉学科，它以生命过程的电化学现象以及外 电场对不同生物体系的影响为主要研究对象，旨在从分子水平或超微结构水平揭示 相关生物事件的本质和规律1 _ 5 1 。作为其当前较有代表性研究课题之一的蛋白质直接 电化学，是在化学修饰电极出现的基础上于二十世纪八十年代末形成的新领域 。 蛋白质容易在裸露的电极表面吸附、变性，因而难以得到电信号引。而化学修饰电 极为蛋白质的电子交换反应提供了良好的仿生界面，使蛋白质的电化学离体研究成 为可能【9 3 0 1 。 参考文献 1j 2 3 4 藤蝙昭，相泽益男著电化学测定方法 m 】陈震，姚建年译，北京大学出版社1 9 9 5 b a t t i s t u z z ig ，b o r s a r im d a l l a r id l a n c e l l o t t ii ，s o l am ，a n i o nb i n d i n gt om i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e scs t u d i e dt h r o u g he l e c t r o c h e m i s t r ye f f e c t so ft h en e u t r a l i z a t i o no fs u r f a c e c h a r g e s0 1 3t h er e d o xp o l e n t i a l j 3 e u n jb i o c h e m ，19 9 6 2 41 2 0 8 214 m e y e rt e m a l n 3 s t r o mbg j b i o c h e mb i o p h y sa c t a ，1 9 8 9 9 7 5 1 彭旧活，杨丽菊譬；南学中的电分析化学f m 】杭州犬扎扳让，1 9 9 9 上海大学硕士学位论文 金文睿汪乃兴，彭图治，生物电分析化学 m 山东大学出版社，1 9 9 4 考利达主编，医学生物电化学方法f m 】董绍俊，殷晋尧，张月霞，江尔康，章咏华潍， 吉林人民出版社，1 9 8 3 b r e t tc ma ，b r e t ta m0 ，“e l e c t r o c h c m i s t r y ：p r j n c i p l e s ，m e t h o d sa n da p p l i c a t i o n s ”【m o x f o r du n i v e r s i t yp r e s s ，o x f o r d ，u k ，1 9 9 3 g u ol ，h i l l h a o ， j a d v i n o r g c h e m ，1 9 9 1 ，3 6 ，3 4 1 r e e dd e ，h a w r i d g ef m ，d i r e c t e l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n so fc y t o c h r o m eca ts i l v e r e l e c t r o d e s hj a n a l c h e m ，19 8 7 ，5 9 ，2 3 3 4 董绍俊r 车f - $ l ，谢远武，化学修饰电极 m 科学出版社 金利通，仝威，徐全瑞，方禹之，化学修饰电极 m 】华东师范大学出版社，1 9 9 2 吲嘲 吲 嗍嘲 呻 上海大学硕：七学位论文 2 1 引言 第二章蛋白质直接电化学综述 蛋白质直接电化学是一个研究者长期非常感兴趣的领域。蛋白质在生物体内广 泛存在于荷电界面上，如生物膜就是一种荷电界面。电极作为一种研究荷电界面 的模型系统有助于我们深入了解蛋白质在生物膜中发生电子传递的分子机制1 2 j 。因 此在电化学发展的早期研究者就提出这样的问题：是否能在电极表面模拟生物体内 的电子传递过程，电极充当电子传递的供体而直接将电子注入蛋白质，或作为受体 即从相关蛋白质中获取电子? 而这个问题直到1 9 7 0 年代后期才得到初步的解答，并 且直到今天也还是一个热门的研究课题。 蛋白质直接电化学研究的意义在于：首先，可以方便地获得蛋白质的热力学和 动力学性质，有助于深入了解蛋白质电子传递过程：其次，由于蛋白质直接电化学 涉及界面专一性、界面相窖性和蛋白质的变性问题等，因此在研究过程中可以得到 很多关于生物大分子界面问题的启示，进而模拟生物体内的电子传递过程；再次， 从应用角度来讲，这项研究把电极与生物大分子联系起来，可以获得一种专一的电 催化模式，以实现高灵敏度和高选择性的分子传感。目前与蛋白质直接电化学相关 的研究领域包括蛋白质界面相互作用、蛋白质电子传递机制、酶氧化还原中间态、 蛋白质分子识别、电极界面设计和生物传感器等。本文将按照蛋白质直接电化学在 裸电极、分子自组装层修饰电极和模拟生物膜界面的研究及其应用进行综述。 2 2 裸电极上的蛋白质直接电化学 早期的研究者大多试图在裸电极表面获得蛋白质直接电化学。当时的研究对象 主要涉及一些简单的，结构与功能比较清楚的血红素类氧化还原蛋白质( 分子量通 常为5 2 0k d a ) 。细胞色素c 是研究最多的一种蛋白质。最初的突破是y e h 等人在 1 9 7 7 年发现细胞色素c 在掺锡的氧化铟电极上有良好的电化学响应口j 。茸那以后， 研究不断深入，并发现了很多适台于蛋白质直接电化学的新电极材料。 半导体材料( 如金属氧化物) 具有生物相容性比较好的优点。i n t t l ，金属氧 化物电极受到了较多的关注。、7 e h 和k u w a n a 首次观察到细胞色素c 的准可逆赢接电 上海大学硕士学也论文 化学就是在掺锡的氧化铟电极上实现的 】。h a w k r i d g e 等对肌红蛋白在氧化锢电极上 的电化学行为也开展了一系列研究【4 0 】。肌红蛋白本身不是一种电子传递蛋白质，其 电子传递能力是比较弱的。事实上，它在氧化铟电极上的电化学过程可逆性也比较 差【4 】。研究表明，电极表面的清洁程度和肌红蛋白的纯度对其异相电子传递速率有 较大的影响】。 a r m s t r o n g 等首先采用了石墨电极进行蛋白质电化学研究并且取得了很大的成 功。热解石墨和玻碳的表面层含有丰富的功能基团，因而适合于蛋白质的固定和反 应】。研究表明，蛋白质在不同性质的石墨表面的电子传递能力有显著的差别 。 以细胞色素c 为例：基面热解石墨表面的疏水性比较强，而且氧化物含量比较少 ( o c = o 0 1 ) ，细胞色素c 在基面热解石墨电极上的电子传递能力是比较差的，电化 学信号也比较小。相反地，棱面热解石墨表面亲水性比较强，氧化物含量也比较多 ( o c = o 3 3 ) ，细胞色素c 在棱面热解石墨电极上就能给出很好的准可逆电化学响应 【9 】。玻碳的表面性质比较接近棱面热解石墨，因此细胞色素c 在玻碳电极上也能给 出较好的电化学响应。 在以上研究基础上a r m s t r o n g 等进一步发现，在一些共吸附物( 如新霉素等) 的存在下，很多电子传递蛋白质或酶可以牢固吸附在热解石墨电极上并给出良好的 电化学信号。a r m s t r o n g 将此方法称为蛋白膜伏安法( p r o t e i nf i l mv o l t a m m e t r y ) 7 “1 ”。 蛋白膜伏安法的主要优点是蛋白样品用量很少且避免了蛋白质扩散带来的影响；可 以在一个比较宽的范围内对蛋白质的电活性中心快速精确地施加电压控制】。 a r m s t r o n g 研究了一种线粒体电子传递酶，琥珀酸脱氢酶( s d h ) 。该酶在传递电子 的时候具有二极管效应，即只允许电子向一个方向流动。琥珀酸脱氢酶在催化延胡 索酸还原的时候，只允许外加电压处于一个很窄的电位范围内，如果超出这个范围， 酶活性就会被“关闭”j l ”。而另外个与其功能相近的酶延胡索酸还原酶，则没有 表现出这样一种二极管效应【1 “。蛋白膜伏安法研究还表明氢氘同位素置换对于琥珀 酸脱氢酶的双向催化有明显的影响。最近，结合蛋白膜伏安法和晶体学研究，他们 以铁硫蛋白为模型在原子尺度上展示了该蛋白质是一个氧化还原驱动的质子泵：即 被包埋在蛋白质骨架中的铁硫中心的还原过程吸引一个溶剂化质子，而其再氧化过 程则受质子解离所控制“。蛋白膜伏安法的另一个重要应用是可以研究含多个电子 传递中心的酶分子，如铁氧还蛋白【。6 17 1 ，黄素细胞色素c 3 t | l = 钏胞色索c 过氧化物 上海大学硕士学位i 它文 酶【19 1 ，细胞色素c 亚硝酸氧化酶2 0 1 等，可以清晰地阐明其电子传递中心之间的电子 传递过程及与之耦联的底物催化过程。 蛋白质在裸金属电极表面通常是没有电活性的，然而有报道称细胞色索c 在经 过特殊预处理的金属电极上能给出直接电化学响应【2 ”，例如：用等离子体处理过的 金箔，用氢火焰燃烧过的金丝，王水处理过的铂等。尽管如此，能否获得稳定可靠 的电化学信号仍然是一个问题，因而这方面的研究工作相对较少。 近年来，随着纳米科技的兴起，研究纳米尺度电极上的蛋白质电化学已成为研 究的热点。由于蛋白质大小通常在纳米尺寸，纳米材料与蛋白质的尺寸匹配性好， 因而为其界面电子传递带来极大的好处。例如，u g o 等在微孔聚碳酸酯材料上通过 无电子沉积制备了金纳米集合电极，并发现细胞色素c 在这种电极上有良好的电化 学响应【”1 。l i u 等分别在银纳米粒子修饰的电极上在获得了细胞色素c 的直接电化 学，并发现细胞色素c 电子传递速率较快口”。碳纳米管是一类一维碳纳米材料，具 有特殊的纳米效应。目前已有很多研究表明很多蛋白质在碳纳米管修饰电极上都具 有良好的电化学响应，包括细胞色素c ，肌红蛋白，血红蛋白，辣根过氧化物酶和 葡萄糖氧化酶等2 4 - 2 7 。然而蛋白质在吸附于碳纳米管上后是否保持天然折叠状态尚 存在争议，碳纳米管对蛋白质电化学的促进机制也还没有很好地阐明。 2 3 分子自组装层表面的蛋白质直接电化学 某些物质在固一液界面上能自发地组装成一种高度有序的单分子层，这被称为 表面“分子自组装层”( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 2 8 2 9 。例如：含硫化合物在 金表面 3 0 ，脂肪酸在金属氧化物表面0 1 1 ，硅烷在二氧化硅表面等都会发生自组装过 程i 3 2 。这一发现引起了广泛的兴趣，这意味着人们可以通过i 殳计使固体表面带j 二所 需的功能化基团，将极大地提高科学家们控制和操纵界面过程的能力 3 ”。；司= l 羊，分 子自组装技术也引起了电化学家的注意，目前已成为蛋白质电化学领域的一个重要 手段。 众所周知，在生理状态下，蛋白质在与其它分子相互作用的时候涉及到很多 大分子之间的识别过程，如：氢键、盐桥、疏水作用等。通过表面分子自组装控制 固体表面，引入特定的功能基团，就有可能模拟这样一种识别过程。h i l l _ 、组藩先 发现细胞色素c 在含有4 ，4 b i p y r i d i n 的溶液中能在金电极上发生准可逆的电1 二传递 上晦大学碳士学位论文 过程l ”l 。在这过程中，4 , 4 b i p y r i d i n ( 4 ，4 - 联吡啶) 吸附到金表面，形成单分子层，促 进了细胞色素c 的异相电子传递过程。这种可促进蛋白质电子传递过程，而自身没 有电活性的试剂称为“促进剂” 3 ”。以后的研究发现，含硫的吡啶化合物吸附更牢固， 促进作用也更明显。现在已发现了5 0 多种促进剂，这些促进剂一般都是“x y ”双功 能基团型的，其中x 基团把促进剂固定到电极表面，而y 基团则与蛋白质的氨基酸 相作用，使蛋白质在电极表面能形成一种有利于电子传递过程的分子定向。 随着研究的进展，人们已经对自组装膜表面的蛋白质电化学行为有了深入的了 解。蛋白质在裸电极上难以得到氧化还原信号的主要原因在于非特异性吸附导致蛋 白质在电极表面以不规则的取向排列成单分子或多分子层。由于其不规则取向，蛋 白质中发生电子传递的活性中心不能有效地与电极发生电子传递，同时这一层或多 层蛋白质分子又阻碍了溶液中的蛋白质分子向电极表面的扩散。研究者以细胞色素 c 为模型，用带巯基和不同功能化基团的自组装层( 即x 为巯基，y 为羟基、羧基 和氨基) 很好地阐明了这一机制。细胞色素c 在金表面严重吸附因而在裸金电极 上是没有电化学信号的。当金表面为羟基自组装层覆盖后可以得到扩散控制的准可 逆的细胞色素c 氧化还原信号口”。接近电中性的羟基表面防止了细胞色素c 与金的 直接接触，因而蛋白质可以从溶液扩散到电极表面发生电子传递，然后又可以很快 地解离下来。当然，由于羟基表面不能完全防止细胞色素c 的吸附，这样的电极在 细胞色素c 溶液中扫描几十分钟后信号会逐渐降低。在带负电荷的羧基表面则得到 吸附控制的细胞色素c 氧化还原信号。这是因为细胞色素c 的血红素1 5 1 袋附近有 若干带正电荷的赖氨酸，因而在静电吸引力的作用下可以选择性地以血红素靠近电 极的取向排列在自组装层表面，有利于电子传递。而静电力的存在也使细胞色素c 不能从自组装层表面解离下来，因而获得的是吸附控制的电化学过程。事实上，将 表面含羧基的电极浸泡在细胞色素c 溶液中后可以获得稳定的细胞色素c 组装层， 这样的电极即使在空白溶液中也能给出细胞色素c 的氧化还原峰。细胞色素c 完全 不能在氨基表面发生氧化还原，这是因为带正电荷的氨基排斥同样带有正电荷的细 胞色素c 的接近。有趣的是，带负电荷的细胞色素b 5 则不能在带负电荷的表面发生 电子传递mj ，这进一步证明了上述机制。 分子自组装技术为蛋白质电化学研究提供了极大的便利。如m a b r o u k 用巯型：l | _ 啶修饰电极研究了细胞色紊c 在多种有机溶剂存在下的电化学行为指出血l 红素口 上海大学硕士学位论文 袋内的介电常数列于其氧化还原电位有决定性作用i ”】。f a n 等利用巯基己醇自组装 膜用电化学方法并结合多种光谱手段系统研究了细胞色素c 与吡啶的相互作用，确 证了吡啶既可以作为细胞色素c 的配体，同时也可以诱导细胞色素c 发生特定构象 变化，从而阐明了这复杂的相互作用过程” 。s o l a 及其合作者则利用分子自组装 技术系统研究了一系列电子传递蛋白质( 细胞色素c ，铜蓝蛋白等) 的氧化还原热 力学及配体诱导效应，并在此基础上提出了轴向配体及蛋白质环境对于其氧化还原 电位的调控机制【3 9 “ 。 2 4 模拟生物膜内的蛋白质直接电化学 生物膜是由蛋白质和磷脂构成的，磷脂则是一种双亲分子，带有一个疏水端和 一个亲水端。我们知道，生物体内很多电子传递蛋白都是膜蛋白。那么蛋白质的电 子传递能力与其所处的膜环境是否存在联系呢? 有趣的是，一些表面活性剂或脂链 在固体基底( 如石墨) 表面成膜后可以自发组装成有序的模拟生物膜( b i o m e m t i c m e m b r a n e s ) ，并且可以稳定地包裹蛋白质。t o l l i n 等人的研究表明，细胞色素类蛋 白质在磷脂双分子层中电子传递能力明显提高【4 5 1 。h a w k r i d g e 等也发现当细胞色素c 氧化酶被包埋于脂双层中并固定到金电极上后，能够与金之间发生直接电子传递【4 “。 n i e 等则把肌红蛋白固定在冰水凝胶膜内，实现了肌红蛋白在玻碳电极表面的直接 电化学【4 7 。 r u s l i n g 小组的系列工作把研究更推进一步。他们把蛋白质固定于模拟生物膜 内，发现其电子传递能力明显增强 4 q 。例如，r u s l i n g 等把肌红蛋白包埋到一种阳离 子表面活性剂，双十二烷基二甲基溴氨( d i d o d e c y l d i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d d a b ) 中，发现其异相电子传递速率比在水溶液中提高了1 0 0 0 倍以上【4 9 】。肌红蛋 白在磷脂膜【5 0 1 ，d n a 膜洲中电子传递能力均有不同程度的提高。在此之后r u s l i n g 和其他研究组进步研究了其它血红素蛋白质，如血红蛋白5 2 , 5 3 、细胞色素p 4 5 0 5 4 在各种模拟生物膜中的性质，包括表面活性剂酬核酸 5 6 , 5 7 ，无机材料等实验 观察到这些蛋白质在膜相的电子传递能力均有明显提高，可以发生直接电化学。光 谱证据表明，血红索在膜相会形成特定的分子定向，这可能是蛋白质电子传递速率 提高的原因。此外，原子力显微镜研究提供了肌红蛋白分别在裸的热解石墨表面和 在d d a b 脱内的形貌对比，结果显示j 帆红蛋白在石墨表面聚集成一种链状结构，而 上海大学硕士学位论文 在膜内则处于液晶相【5 ”。这种不同的物理存在状态也可能是蛋白质电子传递能力提 高的重要因素。 模拟生物膜内的蛋白质研究也是蛋白膜伏安法的一种，同样具有蛋白膜伏安法 的众多优越性。z h a n g 等建立了肌红蛋白在模拟生物膜内与配体( 以咪唑为例) 相 互作用的电化学研究体系，在此基础上系统探讨了膜的特性对蛋白质一配体相互作 用的影响【6 0 】，并研究了其氧化还原热力学过程f 6 ”。f a n 等对血红蛋白与一氧化氮 ( n o ) 的分子相互作用进行了深入研究，并发现血红蛋白在模拟生物膜存在下可直 接催化还原n o ，并显著降低n o 的还原能 5 “。通过将该过程与血红蛋白的直接电 化学过程耦联，研制成可对n o 这一生理过程中重要信号分子进行快速灵敏检测的 生物传感器f 5 ”。 最近的研究表明，模拟生物膜不仅促进了蛋白质电子传递，而且有着更为深刻 的生物学意义。例如，细胞色素c 在包埋于合成的脂双层膜中并与之形成超分子化 合物后获得了n 一去甲基酶( n 。d e m e t h y l a s e ) 活性1 6 孙。这种使蛋白质获得新的酶活性的 方法可以看作为一种非共价相互作用的蛋白质工程6 3 1 。蛋白质的这种功能调节与功 能转换可能与脂膜提供的特定微环境有关f 6 3 。同样，蛋白膜伏安法研究在模拟生物 膜中也发现了蛋白质的功能转换。细胞色素p 4 5 0 在微生物降解环境中的有机卣化物 的过程中有重要的作用【掣。肌红蛋白虽然在结构上与细胞色素p 4 5 0 有一定的相似 之处，但其天然状态不具有脱卤化能力。然而，当把肌红