（发酵工程专业论文）发酵性丝孢酵母发酵产油脂的研究.pdf

摘要 摘要 微生物油脂又称为单细胞油脂( s c o ) ，主要为中性脂、游离脂肪酸、磷脂及不皂化 物，因其特殊功能而具有潜在的工业开发价值，正越来越受到人们的重视。 本文研究了健强地霉( g e o t r i c h u mr o b u s t u m ) 、伯顿拟内孢霉( e n d o m y c o p s i sb u r t o n i i ) 、 发酵性丝孢酵母( t r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n s ) 的生理生化特性，比较了三种油脂酵母的产 油脂能力。通过液体摇瓶发酵，以生物量、细胞的油脂含量、油脂系数等为衡量指标， 考察了碳源种类、氮源种类、碳源浓度、氮源浓度、种龄、接种量、发酵培养基初始p h 值、金属离子( m 9 2 + 、m n 2 + 、c u “、2 r 皿2 + ) 、发酵温度和摇瓶转速对细胞合成油脂的影响。 研究结果表明： 1 健强地霉可发酵蔗糖和可溶性淀粉，可同化葡萄糖、果糖、乳糖、木糖；伯顿拟 内孢霉可发酵蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉，可同化乳糖和木糖；发酵性 丝孢酵母可发酵可溶性淀粉，可同化蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和木糖；三种油脂酵 母均可以利用硫酸铵、蛋白胨和尿素。 2 发酵性丝孢酵母的细胞油脂含量较高，其产油脂的适宜培养基$ 成( g l ) y a ：葡 萄糖1 0 0 ，蛋白胨1 8 ，酵母膏o 5 ，磷酸二氢钾2 。发酵培养基初始p h 值为7 o 时有利 于菌体的生长和积累油脂，生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数均为最大，分别为 1 2 9 9 l 、5 1 9 l 、3 9 4 和9 6 。适量的m g + 、c u 2 + 和z l l 2 + 有利于细胞积累油脂，m n 2 + 对菌体生长及积累油脂不利。 3 发酵性丝孢酵母培养2 4 h 的种子接种发酵可使菌体的油脂产量、油脂含量和油脂 系数均达到最大值，分别为4 6 9 l 、3 7 5 和8 4 。以1 0 接种量进行接种发酵，菌体对 底物的利用率最好，生物量、油脂含量及油脂系数均达到最大值1 2 4 9 z 、3 8 4 和8 4 。 4 发酵性丝孢酵母适宜发酵温度为3 3 。气相色谱结果表明，在2 8 - - 3 8 的温度 范围内，高温有利于饱和脂肪酸的生成，低温有利于不饱和脂肪酸的生成；油脂的脂肪 酸组成包括棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸，其中棕榈酸和油酸含量较高，分别为2 5 2 3 1 9 和4 0 4 4 8 2 。 5 发酵性丝孢酵母适宜的摇瓶转速为1 9 0 r r a i n ，在此条件下，菌体对底物的利用率 最高，菌体的生物量和油脂系数均最大，最大值分别为1 6 9 9 l 和1 0 8 。 6 发酵性丝孢酵母发酵产油脂的优化条件为：发酵温度3 3 ，摇瓶转速1 9 0 r r a i n ， 接种量1 0 ，发酵培养基初始p h7 o 。在此条件下发酵1 2 0 h ，菌体生物量、油脂产量、 摘要 油脂含量及油脂系数均达到最大值，分别为1 8 2 9 l 、1 2 5 9 l 、6 8 5 、1 8 1 。 关键词：发酵性丝孢酵母；发酵；生物量；细胞油脂含量；油脂系数；气相色谱 a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o b i a lo i li sa l s o c a l l e ds i n g l ec e l lo i l s ( s c o ) w h i c hi sp r i n c i p a l l yc o m p o s e do f n e u t r a ll i p i d ，f r e ef a t t ya c i d s ，p h o s p h o l i p i da n du n s a p o n i f i a b l el i p i d ，a n dh a ss o m ei n d u s t r i a l p o t e n t i a ld u et ot h e i rs p e c i f i cc h a r a c t e r i s t i c s t h i s p a p e ra i m s t o s t u d ys o m eb i o c h e m i c a l a n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f g e o t r i c h u mr o b u s t u m ，e n d o m y c o p s i sb u r t o n i ia n dt r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n s ，a n dc o m p a r e t h e i ra b i l i t yo fp r o d u c i n go i l t h ea b i l i t yo ft r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n ss y n t h e s i z i n gl i p i dw a s i n v e s t i g a t e db yl i q u i df e r m e n t a t i o ni ns h a k ef l a s ka n dt a k i n gb i o m a s s ，o i lp r o d u c t i v i t y , o i l c o n t e n ti nc e l l sa n dt h eo i lc o e f f i c i e n ta sm e a s u r e m e n tp a r a m e t e r s t h ei n f l u e n c eo fs o m e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so nt h el i p i da c c u m u l a t i o n si nc e l l sw e l ed e t e r m i n e d ，i n c l u d i n gt h e s o u r c eo fc a r b o na n dn i t r o g e n ，t h ec u l t i v a t i o nt i m eo fi n o c u l a , i n o c u l a t i o nv o l u m e ，t h ei n i t i a l p hv a l u e ，m e t a li o n s ( m 9 2 + , m n 2 + , c u 2 + , 矗+ ) ，t e m p e r a t u r ea n ds h a k i n gr a t e t h er e s u l t sa r c s h o w e da sf o l l o w s 1 g e o t r i c h u mr o b u s t u mc a nf e r m e n ts u c r o s ea n ds o l u b l es t a r c h ，a n da s s i m i l a t eg l u c o s e ， f r u c t o s e ，l a c t o s ea n dx y l o s e e n d o m y c o p s i sb u r t o n i ic a nf e r m e n ts u c r o s e ，g l u c o s e ，f r u c t o s e ， m a l t o s ea n ds o l u b l es t a r c h ，a n da s s i m i l a t el a c t o s ea n dx y l o s e t r i c h o s p o r o n 弦删阴砌邶c a n f e r m e n ts o l u b l es t a r c h , a n da s s i m i l a t es u c r o s e ，g l u c o s e ，f r u c t o s e ，m a l t o s ea n dx y l o s e lo f t h e s et h r e es t r a i n sc a r la s s i m i l a t ea m m o n i u m s u l f a t e ，p e p t o n ea n du r e a 2 l i p i dc o n t e n ti nc e l lo ft r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n si s a tt h eh i 【g h e s tl e v e la m o n gt h e s e t h r e es t r a i n s i t so p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i ai sg l u c o s e1 0 0 ，p e p t o n e1 8 ，y e a s te x t r a c t0 5 ， k h 2 p 0 42 ( g l ) i n i t i a lp h7 0i ss u i t a b l ef o rc e l lg r o w i n ga n da c c u m u l a t i n gl i p i d ，t h e m a x i m a lb i o m a s s ，o i lp r o d u c t i v i t y , o i lc o n t e n ta n do i lc o e f f i c i e n ti s1 2 8 5 9 化5 1 9 化3 9 3 5 a n d9 5 7 ，r e s p e c t i v e l y c e r t a i nq u a n t i t yo fm 9 2 + 、c u 2 + a n dz n 2 + i sb e n e f i c i a lt op r o d u c i n go i l l i p i d ，b u tm n 抖w i l li n h i b i tt h eg r o w t ha n da c c u m u l a t i o no fl i p i do fc e l l s 3 u s i n gt h ec u l t u r eo ft r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n sc u l t i v a t e df o r2 4h a si n o c u l a t i o n ，t h e m a x i m a ly i e l do fl i p i d ，l i p i dc o n t e n ti nc e l la n dl i p i dc o e f f i c i e n tc a nb er e a c h e db y f e r m e n t a t i o n , 4 6 1 9 儿3 7 5 a n d8 4 ，r e s p e c t i v e l y i n o c u l a t i o nv o l u m e1 0 i sb e n e f i c i a lf o r e e l lt oc o n v e r tc a r b o n ss o u r c et ol i p i d ，t h em a x i m a lv a l u eo ft h eb i o m a s s ，o i lc o n t e n ta n do i l i a b s t r a c t c o e f f i c i e n tw i l t s1 2 4 9 似3 8 4 a n d8 4 ，r e s p e c t i v e l y 4 t h e o p t i m a lf e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e o f t r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n s i s3 3 m e a s u r c m e ma n da n a l y s i sb yg a sc h r o m a t o 黟a p hi n d i c a t e dt h a tl l i g ht e m p e r a t u r ew a s b e n e f i c i a lt oa c c u m u l a t i n gs a t u r a t e df a t t ya c i da n dl o wt e m p e r a t u r ew a sb e n e f i c i a lt o a c c u m u l a t i n g u n s a t u r a t e df a t t ya c i dw i t h i nt h er a n g eo f2 8 - - - 3 8 ( 2 t h ef a t t ya c i d so f t r i c h o s p o r o n 归r 坍翻纽邶l i p i di n c l u d ep a l m i t i ca c i d ，s t e r i ca c i d ，o l e i ca c i da n d l i n o l e i ca c i d ， w h i c hi sr i c hi np a l m i t i ca c i d ( 2 5 2 - 3 1 9 ) a n do l e i ca c i d ( 4 0 4 4 8 2 ) 5 t h eo p t i m a ls h a k i n gr a t ef o rt r i c h o s p o r o n 弦，m 绷细搬t of e r m e n ti s1 9 0 r m i n ，u n d e r w h i mt h em a x i m a lb i o m a s sa n do i lc o e f f i c i e n tr e a c h1 6 9 9 la n d1 0 8 ，r e s p e c t i v e l y 6 t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rt r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n st op r o d u c eo i la r c c u l t i v a t i o nw i t l l1 0 i n o c u l a t i o ni no p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i aa ti n i t i a lp h7 0f o r1 2 0 ho n s h a k e ra t3 3 ，1 9 0 r r a i n ，u n d e rw h i c hc e l lb i o m a s s ，o i lp r o d u c t i v i t y , l i p i dc o n t e n ta n do i l c o e f f i c i e n tr e a c h e d1 8 2 9 几1 2 5 9 儿6 8 5 ( w w ) a n d1 8 1 ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：t r i c h o s p o r o nf e r m e n t a n s ，f e m e n t a t io n ，bio m a s s ，c o n t e n to fi ipidin c el is o i lc o e f f i c i e n t 。g a sc h r o m a t o g r a p h i v 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目： 蕴醛挂丝塑醛堡筮醛芒迪目直数班荭 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文的 规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密毛b ，保密期至：b 刁艿年夕月和日为止。 学生签名：至刍导师签名，垫耋：鱼 ? 切么年肇月扩日 第一章绪论 1 1 微生物油脂 1 1 1 微生物油脂 第一章绪论 微生物油脂又称单细胞油脂( s c 0 ) ，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定 条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，辅以无机盐在菌体内产生 的大量油脂和另外一些具有商业价值的脂质1 1 , 2 1 ，其组成与植物油类似，主要为中性脂肪 酸、游离脂肪酸、磷脂及不皂化物1 3 1 。 1 1 2 微生物油脂的研究历史 微生物油脂的研究已有半个多世纪的历史。 油脂的研究开始于第二次世界大战，由于连年战火，油脂奇缺，德国曾准备利用内 孢霉属e n d o m y c e sv e r n a l i s 和单细胞藻类镰刀茵属f u s a r i u m 的某些菌种作为油脂生产菌 株【，以解决当时食用油的不足。之后，美国也开始着手微生物油脂的研究，但都没有 实现工业化生产。直至第二次世界大战前夕，德国科学家筛选到了适于深层培养的菌株， 并进行规模生产。第二次世界大战之后，脂酵母l i p o m y c e s 、红酵母r h o d o t o r u l a 、曲霉 属a s p e r g i l l u s 、青霉属p e n i c i l l i u m 、小球藻c h l o r e l l a 和念珠菌属c a n d i d a 都成为研究对 象【3 1 。 1 9 7 6 年，日本铃木修等人发现从真菌的头孢霉菌中提取的油脂含y 亚麻酸较高f 它 是人体必需的，但又是人体内不能自行合成的具有特殊功能的脂肪酸) 1 4 1 。 8 0 年代初，日本成功地建立了发酵法工业化生产长链二元酸的新技术，结束了以蓖 麻油裂解合成十三碳二元酸的历史。 1 9 8 6 年，日本和英国等国家率先推出含微生物y 亚麻酸( g l a ) 油脂的保健食品、 功能性饮料和高级化妆品等产品【5 】。 我国这一领域起步较晚，到9 0 年代初才开始有产脂微生物合成菌油的研究报道， 研究主要集中在菌种筛选、发酵工艺条件优化等方面【6 】。 第章绪论 1 1 3 微生物油脂的研究现状 近十多年来，微生物油脂的研究热点主要集中在利用微生物生产经济价值高的特殊 营养油脂、特殊工业用途油脂，即微生物功能性油脂，如富含花生四烯酸“，二十碳 五烯酸( e p a ) 、二十二碳六烯酸( d h a ) 、y 亚麻酸等不饱和脂肪酸的油脂。 在国外，欧洲、中东、南亚以及澳洲等地已允许将某些微生物油脂添加到婴儿食品 中【7 l ；日本、德国等国家也有y 亚麻酸、双高y 亚麻酸和花生四烯酸等发酵产品问世【s , s l ， 如日本o n a c l sc e m e n t 公司生物研究所m o r i oh i r s n o 和东京农业大学生物工程系y u n k i m i u r a 等对新鲜海水中的蓝丝藻( s p i r u l i n ap l a k t e n s i s ) 和小球藻( c h l o r e l l as p n k 0 4 2 4 0 ) 进 行光照培养均获得y 亚麻酸，其含量分别为总脂肪酸的2 6 2 5 和1 0 【2 1 。除了y 亚麻 酸，其他特种油脂目前均未能实现工业化生产。日、英、法、美等国进行的微生物多不 饱和脂肪酸研究，所采用的菌株多为被孢霉菌类，如深黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ) 、 葡酒色被孢霉( m v i n a c e a ) 、高山被孢霉( m a l p i n ai s 4 ) 、拉曼被孢霉( m r a m a n n i a n a ) 以及 矮被孢霉( m n a n a ) 等，其中以深黄被孢霉及其突变株研究最多，每升发酵液可得干菌体 1 5 0 - - - 4 0 0 9 ，含油脂3 0 7 0 ，脂肪酸中y 亚麻酸含量3 1 1 【引。 国内在菌株筛选、诱变选育、中试发酵等方面的研究也有不菲成绩。上海市工业微 生物研究所，已完成发酵法生产y 亚麻酸的中试，干菌体生物量为3 5 ，总脂肪得 率4 0 - 5 0 ，y 亚麻酸含量为8 1 0 , n 】：福建师范大学与工厂合作在6 0 m 3 发酵罐中试 生产，利用菌株以m i s a b e l l i n a a s 3 3 4 1 0 为出发株的突变株m 0 1 8 株，采用三级发酵( 即 两级液体种子) ，使生物量达到3 7 8 9 干菌体l 发酵液，油脂产量达7 9 2 ，y 亚麻酸 产量7 左右【1 2 , 1 3 , 1 4 。华南理工大学用被孢霉属微生物生产的花生四烯酸研究已有报道， 所产的花生四烯酸占总脂的1 0 0 6 1 1 5 j 。山东大学对g r k l 3 粘红酵母( r h o d t o r u l eg l u t i n i s ) 进行了诱变选育，得到一株高产油脂粘红酵母，最终油脂产量可达6 7 2 1 1 6 1 。吉林大学 以微生物转化脂肪醇合成不饱和脂肪酸的研究已取得阶段性成果，不饱和脂肪酸含量占 9 7 0 5 【1 7 1 。 1 9 9 3 年张峻等人选育到一株被孢霉的突变株m 6 ，其菌体得率2 5 ，油脂含量为 3 2 8 ，y 亚麻酸含量为8 8 4 。同年，据南开大学生物系报道，他们用深黄被孢霉 a s 3 3 4 1 0 为出发菌株，经紫外线诱变得变异株，在1 0 l 罐中发酵产生y 亚麻酸时，菌 体得率为2 9 3 ，油脂含量达4 4 7 ，其中，y 亚麻酸含量达9 4 4 1 1 8 l 。 1 9 9 7 年朱法科等人以一株被孢霉菌( m o r t i e r e l l a 印) 为出发菌株，经紫外线诱变得到 花生四烯酸( a a ) 高产菌株( m o r t i e r e l l am 1 0 ) ，发酵结果花生四烯酸得率可达0 8 3 9 a 。研 2 第一章绪论 究还发现，不同培养时间的菌丝体( 3 5 d ) 在室温下老化1 5 d ，总油脂含量由1 8 3 0 上升至3 6 - 4 1 ，花生四烯酸含量由1 1 2 6 升至2 6 - - 3 7 【1 9 1 。 据9 8 年菌物系统报道，以拉曼被孢茵( m o r t i e r e l l ar a m a n n i a n a ) s m 5 4 1 为原始菌株， 经紫外线复合氯化锂诱变处理，得到突变株s m 5 4 1 9 ，其生物量由1 2 6 9 l 提高到2 8 8 9 l ， 油脂含量由5 8 9 l 升到1 5 7 9 t , ，花生四烯酸的含量由3 2 1 m g l 增加到6 2 3 m g l ，传代实验 表明，s m 5 4 1 9 具有良好的遗传稳定性【2 j 。同年，李春明等对被孢霉进行原生质紫外线 诱变，变异株的亚麻酸产量比对照组的y 亚麻酸产量提高5 3 1 - 7 0 7 1 2 0 。黄建忠等人 以紫外线、硫酸二乙酯、亚硝基胍复合诱变，变异株m 1 0 8 的油脂含量达6 5 6 t 】。 2 0 0 0 年6 月，武汉烯王生物工程有限公司与安阳市升华工程技术有限责任公司合 作，建成了利用四号溶剂低温浸出法从富含多不饱和脂肪酸的干茵体中提取微生物油脂 的中试厂，并推出含有微生物油脂的功能性食品和系列化妆品【2 1 1 。同年，刘淑君等人以 油脂酵母( l i p o m y c e s s t a r k e y i ) 为出发菌株经紫外线和e m s 复合诱变筛选出高产油脂的突 变株，命名为l s t a r k e y i i l l ，以废糖液作为碳源，发酵后所得菌体油脂含量达到5 3 5 l 捌。 1 2 微生物油脂的用途、优点及研究意义 1 2 1 微生物油脂的用途 微生物油脂因其组成中的脂肪酸而具有特殊的生理功能，具有潜在的工业价值【矧， 经常被应用于保健食品、功能性饮料、特殊性化妆品中。微生物油脂的脂肪酸组成包括 单烯不饱和酸，如棕榈油酸等；多烯不饱和酸，如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十 碳五烯酸和二十二碳六烯酸等；及羟基脂肪酸、支链脂肪酸等，这些脂肪酸的功能各不 相同。 花生四烯酸是人体中一种重要的多不饱和脂肪酸，也是“必需脂肪酸之一，它是 合成前列腺素e 2 、前列环素、血栓烷素a 2 、白三烯b 4 和c 4 等物质的直接前体，具有促进 生物体内脂肪代谢，降低血脂、血糖、胆固醇的作用，对心脑血管疾病的预防也具有重 要作用，因此，在1 9 9 9 年6 月中华人民共和国卫生部首次公布了花生四烯酸作为新的营 养强化剂可用于婴幼儿配方食品【2 1 2 4 2 5 】。 y 亚麻酸也是人体的一种必需脂肪酸，对生物体正常的代谢起着十分重要的作用， 如对血清甘油三酯的降脂作用，是目前报道的治疗高血脂疗效较佳和安全性最高的方 法；同时，对降低血清胆固醇效果也很好l 矧，因此，常把它作为食品添加剂添加到饮料、 糖果、果酱中当成一种健康食品，也添加到化妆品制品中1 2 7 1 。添加y 亚麻酸到食品中 3 第一章绪论 可对人起到改善血脂、特异反应皮炎，改善胶原病、糖尿病并发症；同时可以起到抑制 癌细胞繁殖，缓解酒精中毒，治疗多发性硬化症，预防或抑制中老年疾病( 如血栓、动 脉硬化、高血压、心虚性心脏病等) 等保健作用1 2 】。 二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) 同样具有重要的生理功能，如可以预 防和治疗动脉粥状硬化、血栓及高血压，并且能防治乳腺癌、前列腺癌和结肠癌，还可 以治疗气喘、关节炎、周期性偏头痛，同时还能促进婴儿神经系统和视觉系统的发育【1 1 。 因此利用微生物发酵法生产不饱和脂肪酸并应用于人们的日常饮食中对人类的健康将 会有很大的帮助，值得深入研究。 1 2 2 微生物油脂的优点 微生物发酵法生产的油脂具有动植物油脂所不可比拟的优点，因为微生物适应性 强，生长繁殖速度快，生产周期短，代谢活力强，易于培养和品种改良，可以生产经济 价值高的功能性油脂，如富含y 亚麻酸、花生四烯酸、e p a 、d h a 等的油脂及代可可 脂等，而且微生物生长所需的原料丰富，可以利用农副产品下脚料、工业废弃物作为生 长原料，既降低处理废物的成本，又保护了环境；除此之外，微生物生活所占空间小， 所需劳动力少，同时不受场地、季节、气候变化的影响，可以连续大规模生产，降低成 本；最重要的是微生物油脂的生物安全性好【1 ，2 ，2 8 】，所以生产微生物油脂代替某些紧缺、 贵重的食用油脂和工业用油脂，可以缓解油脂紧缺的局面。 1 2 3 生产微生物油脂的意义 油脂是构成和维持生命活动的基本物质，也是重要的工业原料，尤其是不饱和脂肪 酸( g l a 、a a 、e p a 、d h a ) 具有多种生理功能，随着人们对其生理功效( 降血脂、降糖、 健脑、益智等) 的深入了解，逐渐引起国内外的广泛重视。当前生物柴油的研究已是世 界科研的焦点，但其原料油脂的供应受耕地、气候、时间的影响，为了解决这一问题， 就需要开发微生物油脂为生物柴油的生产提供原料油脂，值得深入研究。 目前用于生产油脂的原料主要来源于石油和动植物等，如国际上销售的y 亚麻酸 仍以月见草油为主要来源，花生四烯酸主要是从深海鱼油中提取，而石油储藏量在逐年 减少，动植物的养殖业和种植业也日益饱和，像月见草种子的产量和含油量受到气候、 产地等条件的影响较大，经常供给不足；受季节、产地等因素的影响，鱼油中花生四烯 酸含量也常常不稳定，同时还存在资源匮乏的问题。在这种情况下，微生物油脂作为可 无限再生产的资源，可弥补自然资源的短缺，虽然石油是人类不可缺少的资源，但其开 4 第一章绪论 采量仅能供人类使用5 0 年。因此，石油化工产品逐渐向油脂化学产品转移也是必然的。 生产微生物油脂可通过微生物发酵，充分利用工业中产生的废弃物，附加值提高，有利 于环境保护，而且生产过程不受场地、季节和原料生产的影响，可连续生产。微生物油 脂的研究和开发，不仅丰富了传统的油脂工业技术，而且是工业化生产油脂的一个重要 途径，尤其是在人口增长迅速的今天，日益增加的油脂需求量与自然资源严重短缺的矛 盾愈发尖锐，开辟微生物油脂这一新的油脂资源更具有非常重要的现实意义1 6 , 2 9 , 3 0 1 。 1 3 产油脂微生物 1 3 1 工业化产油脂微生物必备条件 ( 1 ) 具备或改良后具备合成油脂的能力，油脂积累量大，含油量稳定在5 0 以上且油脂 转化率不低于1 5 ； ( 2 ) 能利用农副产品及工业废水、废料； ( 3 ) 繁殖力旺盛，杂菌污染困难，沉淀、过滤、分离油脂容易； ( 4 ) 油脂风味良好，食用无害，易消化吸收； ( 5 ) 用于工业化生产时能适应工业化深层培养，装置简单l 啦j 。 1 3 2 常见的产油脂微生物种类 目前研究的产油脂微生物主要包括酵母、霉菌、藻类和细菌，其中研究较多的是酵 母、霉菌和藻类。 常见的产油脂酵母有：浅白色隐球酵母( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 、弯隐球酵母 ( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 、弯假丝酵母( c a n d i d ac u r v a t a ) 、斯达氏油脂酵母( l i p o m y c e s s t a r k e y i ) 、茁芽丝孢酵母( t r i c h o s p o r o ns t a r k e y i ) 、产油油脂酵母( l i p o m y c e sl i p o f e r ) 、胶粘 红酵母( 融o d o t o r u l ag 觑砌西) 、类红冬孢酵母( r h o d o s p o r i d i u mt o r u l o i d e s ) 等。 常见的产油霉菌有：土曲霉( a s p e r g i l l u st e r r e u s ) 、高山被孢霉( m o r t i e r e l l aa l p i n a ) 、 深黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ) 、拉曼被孢霉( m o r t i e r e l l ar a m m a n i a n a ) 、紫癜麦角菌 ( c l a v i c e p sp u r p u r e a ) 等。 常见的产油微藻有：普通小球藻( c h l o r e l l av u l g a r i s ) 、丛粒藻( b o 缈o c o c c u sb r a u n i i ) 、 盐生杜氏藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 、粉核小球藻( c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a ) 等。 常见的产油细菌有：分枝杆菌、棒状杆菌、节杆菌0 厂f 7 l 加6 口c 玉盯跟) 等【7 3 。 5 第章绪论 1 3 3 微生物油脂合成机理 1 3 3 1 乙酰c o a 的产生 产油微生物合成油脂首先要经过糖类分解( e m p 途径) ，生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮 酸脱氢酶复合体( 含2 4 个分子丙酮酸脱羧酶，2 4 个分子硫辛酸转乙酰酶及1 2 个分子二 氢硫辛酸脱氢酶) 催化下最终生成乙酰c o a 。乙酰c o a 是脂肪酸合成的引物，在有氧条 件下，一部分进入三羧酸循环被彻底氧化为二氧化碳和水，并产生生命活动所需的大量 能量；另一部分则作为脂类合成的起始物质进入到油脂代谢中。 1 3 3 2 脂肪酸的合成 脂肪酸的生物合成的初始反应是由乙酰c o a 不可逆地羧化生成丙二酰c o a 。 ( 1 ) 饱和脂肪酸的合成 饱和脂肪酸的合成在细胞质中进行，丙二酰一c o a 是合成的前体物，过程如下： 乙酰c o a 与酰基载体蛋i 刍( a c p ) 在乙酰转移酶的作用下结合，同时，乙酰c o a 在乙酰 羧化酶的催化作用下生成丙二酰c o a ，丙二酰c o a 再经丙二酰单酰转酰基酶活化生成 丙二酰a c p 后，可直接用于饱和脂肪酸的合成。 含偶数碳原子饱和脂肪酸合成的起始物为乙酰c o a ，而含奇数碳原子饱和脂肪酸合 成的起始物为丙二酰c o a t 3 2 j 。 ( 2 ) 不饱和脂肪酸的合成 不饱和脂肪酸生物合成可采用需氧或厌氧机制，其合成与膜结合的酶有关。微生物 本身存在去饱和酶系，是微生物通过氧化去饱和途径生成不饱和脂肪酸的关键酶，其生 物学功能是提供生物膜必须的流动性和基本的脂双层结构，而去饱和作用发生在内质网 中。利用乙酰c o a 羧化酶的羧化催化反应，可将双键引入到c o a 结合的脂肪酸中，经 过去饱和酶的一系列去饱和作用等，完成整个生化过程，铁离子参加了去饱和酶催化中 心的构成【6 , 3 2 , 3 3 , 3 4 1 。 禹慧明等人对产生g l a 机理进行探讨，认为微粒体膜的苹果酸酶活性与菌体油脂 g l a 含量存在显著相关关系，这是因为苹果酸酶原位产生的n a d p h 是微粒体膜磷脂上 脂酰基完成去饱和作用的关键所在，而胞基质上的n a d p h 在脂肪酸延长和去饱和中不 能发挥作用，从而认为苹果酸酶有着不可替代的作用。k e n d r a c k 等人发现苹果酸能促进 卷枝毛霉( m u c o rc i r c i n e l l o i d e s ) 微粒体的去饱和作用，使g l a 含量增高，这可能是苹果 酸酶为了去饱和作用提供n a d p h 结果【3 5 ，3 6 绷。c r a t l e d g e 认为抑制苹果酸酶活性会使 6 第章绪论 油脂积累量减少，苹果酸酶是为脂肪酸合成提供n a d p h 的唯一来源1 3 8 】。 ( 3 ) 甘油三酯的合成 生物合成甘油三酯是在动、植物和微生物界广泛存在的多酶催化过程，属初级代谢 的一部分。目前研究表明，t a g 甘油三酯的合成代谢中关键的两个中间产物是磷脂酸( p a ) 和甘油二酰( d a g ) 。在脂肪酸合成过程中，合成的脂酰a c p 在脂酰转移酶作用下，可 以直接同q 磷酸甘油反应生成a 磷酸甘油二酯，再经磷酸脂酶作用脱去磷酸生成甘油 二酯，最后在脂酰转移酶作用下与脂酰- a c p 反应生成甘油三酯脂肪，这一生化反 应主要在内质网和线粒体内进行1 3 9 舯，4 1 1 。 1 3 4 微生物油脂合成的影晌因素 不同种属的微生物的产油脂量、油脂脂肪酸组成及含量各不相同。即使是同一种微 生物菌株，在不同培养条件下，其油脂产量、油脂脂肪酸组成及含量也不尽相同。与此 相关的影响因素主要包括培养基组成、温度、p h 值等。 1 3 4 1 培养基组成的影响 ( 1 ) 碳源对菌体产油脂的影响 微生物高产油脂的一个关键因素，就是培养基中碳源充足而其他营养成分缺乏，在 这种状况下，微生物菌株主要将过量的碳水化合物转化为脂类。目前发酵生产食用级脂 类的碳源主要有葡萄糖、淀粉、糖蜜和乙醇等。通常采用的碳源是葡萄糖，因为葡萄糖 作为碳源所生产的菌体生物量高，且产脂量也高。 黄建忠等人在利用深黄被孢霉产脂变异株m 0 1 8 合成y 亚麻酸的研究中发现，不同 碳源( 葡萄糖、淀粉、双糖) 对菌体的生长和油脂的合成有影响。以葡萄糖为碳源时可获 得最大的生物量3 1 2 9 l ，最大的油脂含量6 6 4 ，而以淀粉为碳源时，生物量为1 2 3 9 l ， 油脂含量为4 1 2 t 1 3 】。 咸漠等人研究发现产脂微生物利用不同碳源的速度也有差别，深黄被孢霉以葡萄糖 为碳源时，4 8 h 可获得生物量为3 0 1 9 l ，而以丁醇为碳源时，9 6 h 可获得的生物量为 3 1 9 l 1 4 2 1 。 ( 2 ) 氮源及碳氮比对菌体产油脂的影响 不同氮源对油脂合成和菌体生长也有影响，但是培养基中氮源浓度和c n 比是影响 微生物油脂含量的主要因素。 赵人俊等人在研究被孢霉m 1 4 菌株产脂条件时，认为无机氮有利于不饱和脂肪酸 7 第一章绪论 产生，有机氮有利于细胞增殖【4 3 1 。一般来说，培养基中含氮化合物越多，则细胞蛋白质 含量越多；缺乏含氮化合物，则油脂积累。当培养基中氮浓度一定时，增加碳源可增加 菌体油脂含量。低c n 比有利于菌丝体产量的提高，高c n 比可以促进细胞内油脂合 成。当然对碳源、氮源的绝对量要限制，氮源太少则细胞的油脂含量多而细胞增殖显著 减少；碳源太多则渗透压增大而使细胞收获量减少。因此进行实际操作时，采取培养初 期供给大量氮源( 微生物迅速增殖，获取大量菌体细胞) ，后期改为含糖量多的培养条件 ( 油脂积累) ，这样可以提高油脂含量【。 ( 3 ) 无机盐、微量元素及其它成分对菌体产油脂的影响 对真菌而言，适当增加无机盐和微量元素的添加量，能提高油脂合成速度和产油量。 c a r r i d o 等人对构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 的研究表明，调整培养基中n a + 、k + 、m g ：+ 、 s 0 4 2 _ 、t o ? 一等的含量比，可使油脂含量从2 5 - - - 2 6 ( 油脂生成率6 7 7 9 ) 提高到 5 1 ( 油脂生成率1 7 2 ) 【。j a m e sp w y n n 等人也对构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 产油脂 进行研究，发现金属离子对苹果酸酶活性和脂肪合成有一定的影响，而苹果酸参与脂肪 酸的合成，苹果酸酶是为贮存脂质的合成提供n a d p h 的主要来源，它的功能主要集中 在丙酮酸的代谢合成方面1 4 4 1 。k a t a r i n aj e r n e j c 等人研究了金属离子对a s p e r g i l l u sn i g e r 中苹果酸酶活性和脂肪合成的影响，发现培养基中m 9 2 + m n 2 + 同时存在能够获得更多的 生物量，总体油脂的百分含量也较单独存在m 9 2 + 的培养基多，但是柠檬酸显著减少， 在m 9 2 + 存在的条件下，硫酸铜浓度增加到0 1 6 m m 时刺激分泌柠檬酸，但是继续增加其 浓度时所得结果却相反【4 5 j 。长沼等人通过研究油脂酵母发现，增加培养基的f e “浓度可 使油脂合成速度加快，增加z n “浓度可使油脂含量增加。一般讲，在略高于最适生长盐 浓度的条件下会积累油脂，但盐浓度过高时将阻止油脂积累【l j 。还有研究表明，一定浓 度的z n 2 + 可提高油脂的不饱和度。许多离子还可作为去饱和酶的激活剂和抑制剂而影响 不饱和脂肪酸的产生。添加脂肪酸合成的中间物或能形成中间物的c 2 化合物可以增加 油脂含量，有些菌株要求添加维生素b 族，还有些菌株添加e d t a 来防止糖与盐类生成 复合物，减少糖的损失，增加油脂的收获型1 , 3 , 1 2 , 1 3 】。 关洁文等采用5 l 发酵罐研究非离子表面活性剂和植物油对被孢霉发酵生产亚麻酸 的影响，研究发现培养基中添加2 的橄榄油和0 5 m l l 的吐温2 0 可使菌体量及亚麻酸 产率提高2 0 ，最终发酵的菌体量为5 1 s g l ，油脂含量为质量分数2 5 1 ，y 亚麻酸 产量为2 0 8 9 l t 矧。另外，c o h e n 发现吡啶族除草剂可显著抑制去饱和酶的活性，影响 菌体的油脂产量i l 引。 8 第一章绪论 1 3 4 2 培养条件的影响 ( 1 ) 温度对菌体产油脂的影响 温度影响油脂的含量和组成1 1 l ，是由于细胞对外界温度变化有一种适应性反应。通 常情况下不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸低，短链脂肪酸比长链脂肪酸低。因此当菌 株从高温转移到低温生长时，细胞膜中不饱和脂肪酸及短链脂肪酸含量增加，主要是棕 榈油酸或油酸等含量的增加；而当温度升高时，平均链长就增长。这些变化都是为了保 证细胞膜的正常流动性和通透性1 5 , 6 l 。 ( 2 ) p h 值对菌体产油脂的影响 p h 值的变化对微生物产生油脂的影响也较大，一般产油的最适p h 值随微生物种类 不同而不同，一般最适产生油脂的p h 值与其最适生长p h 值相一致【5 们。 施安辉【明等通过对红酵母属一变异株g l r 5 1 3 产脂的研究发现，通过调节p h ，可 使油脂含量由质量分数2 1 2 提高到3 7 9 ，5 0 m l 培养液中生物量由0 3 1 9 提高到 0 5 2 9 。 ( 3 ) 其它条件对菌体产油脂的影响 培养时间对油脂的合成也很重要。培养时间不足，微生物菌体总数达不到最大值而 影响油脂产量；培养时间过长，微生物个体变形、自溶，形成的油脂进入培养基中难以 收集，同时影响油脂产量。 菌体生长期孢子数量对油脂产量也有影响。孢子数量过多，单细胞油脂产量较低； 而细胞内积累的油脂过多，又会使菌体失去增殖的能力，因此，要控制孢子数量，使菌 体保持在最佳的生理状态。 通氧量可影响不饱和脂肪酸的形成，因为去饱和反应需要氧的参与i 矧。此外，微生 物利用糖类基质合成油脂也需要氧气。研究发现产油真菌在供氧不足的条件下，甘油三 酯合成会强烈受阻，并引起磷脂和游离脂肪酸大量积累；通气条件下，游离脂肪酸