（发酵工程专业论文）康氏木霉纤维素酶基因（egⅠ）的克隆与表达.pdf

康氏木霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 摘要 纤维素酶是天然纤维生物降解最主要的酶类。康氏木霉是一种常见产 纤维素酶的微生物，但真菌的发酵周期较长，酶的产量和特性不易控制。 因此，构建和利用基因工程菌作为大规模生产纤维素酶的一种途径。本论 文利用大肠杆菌作为宿主菌克隆表达了康氏木霉纤维素酶基因( e gi ) 。 康氏木霉需要诱导才能产纤维素酶，而碳源是主要的诱导物。在扩增 基因之前选择廉价的碳源( 山梨糖，微晶纤维素、稻草细粉等) 诱导培养 康氏木霉，定时取样，测定内切葡聚糖酶酶活( c m c 酶活) 、外切葡聚糖酶 酶活( p n p c 酶活) 以及总酶活( 滤纸酶活；f p a 酶活) ，探讨不同碳源对 康氏木霉产纤维素酶的诱导作用，为下一步分子克隆奠定基础。实验结果 表明：以微晶纤维素为碳源诱导康氏木霉产纤维素酶酶活最高，第三天内 切c m c 酶活即达到1 7 5 8 u m l ，外切p n p c 酶活达到1 1 3 9u m l ，滤纸酶活 达到1 6 8u m l 。 以微晶纤维素为碳源诱导培养康氏木霉，提取总r n a ，并以其为模板， 利用r t - p c r 扩增纤维素酶的c d n a ，经琼脂糖凝胶电泳分析及测序验证后 重组到t 7 启动子控制下的表达载体p e t h i s 中，构建重组质粒；重组质粒 转入大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 中，经i p t g ( o 4 m m o l l ) 诱导3 h 后，破 胞提取菌体总蛋白，s d s p a g e 表明重组产物为一分子量约为4 5 k d a 的蛋 白质，是与预期目的蛋白相一致的外源蛋白。 对重组酶的粗酶液进行了酶学性质的初步研究，表明：重组酶在 p h 5 o 7 o 之间保持相对较稳定，以p h 值为6 0 时最稳定；重组酶在温度 为3 0 - 一4 0 。c 保温1 h ，酶活力保持在8 0 以上；结果表明m n 2 + 对重组酶 e gi 活力均有明显的促进作用，而c u 2 + 等离子则对酶活力有一定程度的抑 制作用，m n 2 + 浓度为2 m m o l l 时测得酶活力最大。 关键词：康氏木霉纤维素酶克隆表达酶学性质 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fc e l l u l a s e ( e gi )f r o m t k n o n i n g i i 臌e s c h e c h i ac o l i a bs t r a c t c e l l u l a s ei st h em a i n l ye n z y m et od i s a g g r e g a t ec e l l u l o s ef r o mn a t r u e z k n o n i n g i ii so n eo fm i c r o o r g a n i s mw h i c hc o u l dp r o d u tc e l l u l a s e ，b u tf u n g i f e r m e n tt a k el o n gt i m e a n dt h ey i e l da n dc h a r a c t e ro ft h ec e l l u l a s ea r en o te a s y t oc o n t r 0 1 t h u sw eu s eg e n ee n g i n e e r i n gt oc l o n i n ga n de x p r e s s i o no fc e l t u l a s e ( e gi ) e d n af r o mzk n o n i n g i ii ne c o l i zk n o n i n g i fn e e di n d u c et op r o d u tc e l l u l o s e ，s ob ym e a s u r i n ga c t i v i t yo f c e l l u l a s ei nm e d i u mw i t hd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e si nc e r t a i nt i m e ，t h ee f f e c t so f d if f e r e n tc a r b o ns o u r c e so nt h ec e l l u l a s ep r o d u c t i o nd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n w e r er e s e a r c h e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，i nas h a k ef l a s kf e r m e n t a t i o nu s i n g a v i c e la st h ec a r b o ns o u r c e ，d i r e c t l yi n d u c et h r e ed a y s ，g a v et h eh i g h e s ta c t i v i t y o fc e l l u l a s e ( 17 5 8 u m lw i t hc m c a s e ，1 13 9u 札w i t hp - n p c a s e ，1 6 8u m l w i t hf p a a s e ) t h ec e l l u l a s eg e n ew a sa m p l i f i e df r o mt o t a lr n ao fzk n o n i n g i fw h i c h c u l t u r ei nt h ea v i c e lt h a td i r e c t l yi n d u c t e db vi m p c rt e c h n i q u e t h ep c r p r o d u c tw a sc l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp e t h i sw h i c hi sc o n t r o l l e db y t 7 p r o m o t e r ，a n dt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t h i s e g1 w a st h u s c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y t h er e c o n s t r u c t e dp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l i b l 21 ( d e 3 ) p l y s s c o m p e t e n t c e l l t h eb a c t e r i u mw a si n d u c e d b y i p t g ( o 4 m m o l l ) f o r 3h o u r sa n da n a l y z e db ys d s p a g e ，a p p r o x i m a t e l y 4 5 k d ae x o g e n o u sp r o t e i nw a so b s e r v e do nt h es d s - p a g e s t u d yo nt h ei m p u r i f i e dr e c o m b i n a n te n z y m ep r o p e r t i e s ，t h er e c o m b i n a n t e n z y m es h o w e dm eo p t i m a la c t i v i t ya tp h6 0a n d5 0 。c w ea l s of o u n dt h a tt h e r e c o m b i n a n te n z y m ew a so b v i o u s l ya c t i v a t e db ym n 2 + i o n ，b u tw a si n h i b i t e db y f e 3 + a n dc u “t h er e c o m b i n a n te n z y m ea c t i v i t yw a sm e a s u r e dt ot h eh i g h e s t w h e nt h ec o n s i s i t e n c yo fm n 2 + w a s2 m m o l l k e yw o r d s ：z k n o n i n g i i ；c e l l u l a s e ；c l o n i n g ；e x p r e s s i o n ；c h a r a c t e r i z a t i o n i i i 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者躲乡、 沁3 年易月冯e l 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文： 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 凼口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定 敝储獬囊 导师签名：鬻勃龛可n 莎年6 月哆日 广西大掌硕士掌位论文 康氏木霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 1纤维素酶研究状况 1 1 自然界中的纤维素 第一章综述 木质纤维素是木本植物和非木本植物的主要成分，是可再生的有机物质的主要来 源。木质纤维素包括木质素、纤维素、半纤维素，由于木质纤维素的多种化学组分，具 有巨大的生物技术价值【l 】。 自然界中纤维素含量丰富，每年由光和作用产生约1 吨( 干重) 的植物生物质，其中 有一半是纤维素；一些动物( 被膜) 和细菌也产生纤维素。纤维素是以纤维二糖为基本单 位，由许多p d 葡萄糖分子以1 3 - ( 1 ，4 ) 糖苷键连接而成的高分子聚合物( 如图1 1 ) ，同时 具有高度有序的晶体结构和一些无定形结构。 拶赳 h 图1 - 1 通过b 一( 1 ，4 ) 糖苷键联结的葡萄糖长链构成纤维素分子 f i g 1 1 l i n e a rs t r u c t u r eo fc e l l u l o s em o l e c u l e s 可是，面对自然界纤维素这一巨大资源，人们对它的利用是非常少的。当今世界 面临着粮食和能源短缺的巨大问题，可再生的植物纤维资源的开发和利用受到了重视。 改革开放以来，中国经济持续快速发展，我国是能源生产大国，同时也是能源消费大国， 由于经济发展依赖能源供应，能源供应不足或不稳定将导致能源危机。地球上不可再生 资源面临耗竭，而植物纤维素是世界上最丰富的碳水化合物资源，成为食品、能源、燃 料及其它产品的主要原料必将成为趋势。因此，利用生物技术对植物纤维素进行生物转 广西大掌硕士掌位论文 康氏木霉纤维素酶基因( e ci ) 的克隆与表达 化具有重大意义。以前，人们降解纤维素主要方法是使用化学和物理方法，而传统的化 学降解、物理降解纤维素有许多不利之处，如反应条件剧烈、后处理存在环境污染、设 备昂贵等问题，因此利用微生物及其产生的酶降解纤维素成为当前生物学研究领域的一 个热点。 1 2 纤维素酶的生态分布 许多微生物可以产生纤维素酶，利用纤维素进行生长。微生物纤维素酶的研究始于 1 9 1 2 年，k e l l e r m a n k f 等人首次从土壤中分离出纤维素分解菌，此后，各种降解纤维 素的微生物被陆续分离鉴定。纤维素酶分布广泛，在许多微生物、植物及昆虫中都有它 的存在。真菌、细菌、放线菌等在一定的条件下均可以产生纤维素酣2 1 。产生的纤维素 酶的细菌既有厌氧菌，又有好氧菌，既有嗜温菌，也有嗜热菌，如c l o s t r i d i u m ， c e l l u l o m o n a $ ，b a c i l l u s ，t h e r m o m o n o s p o r a ，r u m i n o c o c u s ，b a c t e r i o d e s ，e r w i n i a ，a c e t o v i b r i o , m i c r o b i s p o r a ，链霉菌属的细菌亦可产生纤维素酶。有关用c e l l u l o m o n a s 砌f 和 t h r m o m o n o s p o r a f u s c a 生产纤维素酶已经有大量研究。尽管许多降解纤维素的细菌，特 别是厌氧菌，例如c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 和b a c t e r o i d e sc e l l u l o s o l v e n s 产生的纤维素 酶比活力较高，但总产酶活力不高，且由于厌氧细菌生长速率非常低，并要求厌氧生长 条件，大多数商业纤维素酶生产研究集中在真菌【3 】。 己报道产纤维素酶的真菌包括s c l e r o t l u mr o l f s i i ，pc h r y s o s p o r i u n ，t r i c h o d e r m a ， a s p e r g i l l u s ，s c h i z o p h y l l u n 及p e n i c i l l i u m 等，其中t r i c h o d e r m a 是最重要的纤维素酶生产 菌，研究也最为广泛1 4 1 。 1 3 纤维素酶的组成与分类 微生物水解和代谢纤维素，需要产生胞外或结合在细胞上的纤维素酶。发现三种主 要的酶：( i ) 内切葡聚糖酶或l ，4 - 1 3 一d 葡聚糖4 葡聚糖水解酶( e n d o 1 ，4 p g l u c a n a s ee g ， e c3 2 1 4 ) ，内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定性区，产生不同长度的寡 糖和新链的末端； ( i i ) 外切葡聚糖酶包括1 ，4 - 1 3 d 葡聚糖水解酶( e x o 1 ， 4 1 3 c e l l o b i o h y d r o l a s e ，c b h ) ( 其中包括纤维糊精酶) 和l ，4 - 1 3 d 葡聚糖纤维二糖水解酶 ( e c 3 2 1 9 1 ) ，外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放 葡萄糖( 葡聚糖水解酶) 或纤维二糖( 纤维二糖水解酶) 。外切葡聚糖酶还能作用于微晶纤 2 广西大掌硕士掌位论文康氏木霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 维素，原因可能是其能从微晶纤维素的结构中驱除纤维素链；( i i i ) d 葡萄糖苷酶或p 葡 萄糖苷水解酶( p g l u c o s i d a s eo rc e l l o b i a s eb g l ，e c3 2 1 2 1 ) ，葡萄糖苷酶水解可溶的纤 维糊精和纤维二糖产生葡萄糖【5 】( 图1 2 ) 。 纤维素酶的各个组分大多是糖蛋白，但所含糖的比例很不相同：糖和蛋白质之间的 结合方式亦不同，有的是通过共价连接，有的是可解离的复合物。a k i b a 等【引。用a 甘 露糖苷酶处理黑曲霉，得到糖链长度不同的纤维素酶，从而分子量也不同。可见纤维素 酶的糖基化程度不同造成了纤维素酶的多态性。纤维素酶的最适p h 为4 5 ，大多偏酸 性，最适温度范围在4 0 c 6 0 c ，但某些p 葡萄糖苷酶的最适温度稍高，在5 5 c 7 0 纤维素酶各组分的热稳定性差别较大，一般地，内切酶热稳定性较好，外切酶和p 一 葡萄糖苷酶较差。 ，星 _ _ 一 一，曩褒- ，7 、孑岳鬲 。吒k 撕弓酏) 。，。嘲 净9 二厂 共个循环。 7 2 j 1 2 7 质粒、目的片断的酶切与酶切片断的纯化 ( 1 ) 质粒的双酶切反应 反应体系： b a i n h i 1 2 p l e c o 对 0 5 1 u l b u r r 3 6 9 l d n a l g g 灭菌水 u p t o3 0 9 l 3 7 水浴保温过夜。然后，6 5 保温1 5 m i n 使限制性内切酶失活，0 8 琼脂糖凝 胶电泳检验酶切效果。 2 5 广西大掌硕士掌位论文 康氏木霉纤维素酶基因( e ci ) 的克隆与表达 ( 2 ) 酶切片断的纯化 将酶切完全的样品经6 5 保温1 5 m i n ，使限制性内切酶失活，全部上样，o 8 琼脂 糖凝胶电泳，染色后紫外条件下切胶回收，采用华舜凝胶d n a 回收试剂盒推荐方法回 收载体以及目的基因的片断。 1 2 8 构建重组质粒p e t h i s e gi ( 1 ) 目的基因片段与载体的连接 目的基因片段与载体的连接反应体系，总体积1 0 9 l 。 载体溶液 2 9 l 目的d n a 溶液 6 9 l 1 0 x b u f f e r l g l t 4d n a l i g a s el g l d d h 2 0 u p t o1 0 9 l 1 6 反应过夜。 ( 2 ) 制备大肠杆菌j - m 1 0 9 感受态细胞【叫 a 、7 0 。c 保存菌株，至冰上溶解，将菌液在l b 平板上划线接种，3 7 。c 恒温培养过 夜。 b 、挑单菌落接种至5 m l l b 液体培养基，3 7 c ，17 0 r m i n 摇床培养过夜。 c 、l m l 的菌液接入2 5 0 m l 锥形瓶的5 0 m ll b 培养液中，3 7 ，1 7 0 r m i n 摇床培 养o d 6 0 0 n m = o 3 5 0 5 。 d 、将锥形瓶冰浴1 0 m i n 。 e 、菌液分装在5 0 m l 离心管中，4 0 0 0 r m i n ，4 。c 离心1 0 m i n 。 f 、弃上清，加入3 0 m l 预冷的c a c l 2 溶液( o 1 m o l l ) 重悬菌体，冰浴1 0 m i n 。 g 、4 0 0 0 r m i n ，4 。c 离心1 0 m i n 。 h 、弃上清，加入2 m l 预冷的c a c l 2 - - 甘油溶液重悬菌体，分装于e p p e n d o r f 管， 于4 贮存1 2 - - 2 4 h 后转入一8 0 保存。 ( 3 ) 连接产物转化感受态细胞 a 、取保存在- 8 0 * 0 的感受态细胞，至冰上溶解，取连接反应体系1 0 i t l 加入2 0 0 i - t l 感受态细胞中，混匀，冰浴3 0 m i n 。 广西大掌硕士学位论文 康氏木霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 同时设置阳性对照：2 0 0 9 l 感受态细胞中加入1 0 1 a l 无菌水 b 、将管放入预加温至4 2 。c 的循环水中，恰恰放置9 0 s 。 c 、冰浴冷却l m i n - - 5 m i n 。 d 、加入8 0 0 1 t l3 7 预热的s o c 培养基，然后将管转移到3 7 。c 、1 5 0 r m i n 的摇床， 温育4 5 m i n 。 e 、将已转化的感受态细胞转移到l b 平板上( 含a m p ) 。涂布平板，直至干透。 f 、倒置平板，3 7 恒温培养1 2 h - - - 1 6 h 。 ( 4 ) 提取并验证重组质粒 a 、从转化平板上挑取单菌落到5 m ll b ( 含a m p ) 中，3 7 。c 、1 7 0 r m i n 摇床培养 至o d 6 0 0 n m = 0 6 左右。 同时进行菌落p c r 。 b 、取1 5 m l 菌液，8 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，收集菌体沉淀。 c 、按华舜质粒小量抽提试剂盒推荐方法提取质粒。 d 、b a m h i 和e c o r i 双酶切反应，反应体系同1 2 7 中所述。 f 、3 7 水浴保温过夜，然后6 5 保温1 5 m i n 使限制性内切酶失活，0 8 琼脂糖 凝胶电泳检验重组质粒酶切后片断大小。 2实验结果 2 1康氏木霉总d n a 的提取 根据琼脂糖凝胶电泳的结果显示，提取得到了比较完整的总d n a ，可以作为模板 进行p c r 扩增( 图3 2 ) 。 康氏术霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 图3 - 2 康氏木霉总d n a 电泳图 f i g 3 - 2a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i so ft n c h o d e r m ak n o n i n g i i t o t a ld n a 2 2康氏木霉总r n a 的提取 根据琼脂糖凝胶电泳的结果显示，提取得到了比较完整的总r n a ，适合作为逆 转录合成c d n a 的模板。( 图3 3 ) 图3 3 康氏木霉总r n a 电泳图 f i g 3 - 3a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i so ft n c h o d e r m ak n o n i n g i it o t a lr n a 2 3纤维素酶基因的扩增及鉴定 提取康氏木霉总r n a ，经反转录获得c d n a ，以其作为p c r 扩增的模板，p c r 扩增目的基因，同时以康氏木霉总d n a 为模板，在相同条件下进行p c r 扩增，以对比 所需条带的正确性。1 琼脂糖凝胶电泳显示分别扩增出条带：c b h i 为1 5 k b p 、c b h h 2 8 广西大学硕士掌位论文康氏木霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 为1 5 k b p ，e g i 为1 4 k b p ，b g i 为2 1 k b p ， 物与t 载体连接，测序验证正确。 l 1 5 k b 与理论推测值相符( 图3 _ 4 - - - 3 7 ) ，p c r 产 2m b p 一2 0 0 0 2 5 0 图3 _ 4p c r 产物( c b h i ) 琼脂糖凝胶电泳图 f i g 3 4a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s 1 、p c rp r o d u c to f c d n a ；2 、p c rp r o d u c to f t o t a ld n a ：m 、m a r k e rd l 2 0 0 0 12m b p 2 0 0 0 1 0 0 0 5 0 0 l o o 图3 5p c r 产物( c b h h ) 琼脂糖凝胶电泳图 f i g 3 - 5a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s 1 、p c rp r o d u c to ft o t a ld n a ：2 、p c r p r o d u c to fc d n a ；m 、m a r k e rd l 2 0 0 0 2 9 广西大掌硕士掌位论文康氏木霉纤维案酶基因( e gi ) 的克隆与表达 b p 2 0 0 0 1 0 0 0 2 5 0 醒l2 1 4 k b 图3 - 6p c r 产物( e g i ) 琼脂糖凝胶电泳图 f i g 3 - 6a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s 1 、p c r p r o d u c t o f t o t a ld n a ；2 、p c r p r o d u c to f e d n a ；m 、m a r k e rd l 2 0 0 0 12m 2 0 k b b p 一2 0 0 0 一1 0 0 0 2 5 0 图3 - 7p c r 产物( b g i ) 琼脂糖凝胶电泳图 f i g 3 - 7a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s 1 、p c r p r o d u c to f c d n a ；2 、p c rp r o d u c to f t o t a ld n a ；m 、m a r k e rd l 2 0 0 0 2 4 重组质粒p e t h i s e gi 的构建 p c r 产物与载体p e t h i s 连接后转化大肠杆菌j m l 0 9 感受态细胞，经过茵落p c r 3 0 广西大掌硕士掌位论文康氏木霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 初步筛选( 图3 8 ) ，得到含有外源片段的重组质粒命名为p e t h i s e g i ，用e c o r i 、 b a m h i 进行双酶切处理后可得到两段片段( 图3 - 9 ) ，与预期大小一致。表明已成功获得 含有目的基因片段的定向克隆，克隆方向为b a m h i 至e c o r i 。 ml23 4 56 幻 2 0 0 0 1 o 5 0 0 图3 - 8 p e t h i s e gi 菌落p c r 电泳结果 f i g 3 8t h ec l o n ep c r r e s u l to f p e t h i s e g i 123m 2 9 k b 1 4 k b b 口 一2 0 0 0 1 0 0 0 5 0 0 3 - 9 重组子e c o r i b a n l h i 双酶切、e c o r i 与b a m h i 单酶切电泳结果 f i g 3 - 9 t h ee l e c t r o p h o r e s i so f r e c o m b i n a n td i g e s t e d 1 、p l a s m i dd i g e s t e db ye c o r i b a m h i ： 2 、p l a s m i dd i g e s t e db ye c o r i ； 3 、p l a s m i dd i g e s t e db yb a m h i m 、m a r k e rd l 2 0 0 0 3 1 广西大掌硕士掌位论文 康氏木霉纤维案酶基因( e gi ) 的克隆与表达 3讨论 ( 1 ) 、表达载体的选择：本研究选择的表达载体是具有t 7 启动子的p e t h i s 载体。 p e t h i s 载体是一种在e c o l i 中克隆表达重组蛋白的功能较为强大的系统。目的基因 被克隆到p e t h i s 质粒载体上，受噬菌体t 7 强转录及翻译( 可选择) 信号控制；表达由 宿主细胞提供的t 7r n a 聚合酶诱导。t 7r n a 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分 诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白：诱导表达后仅几个小时，目的蛋白 通常可以占到细胞总蛋白的5 0 以上。 ( 2 ) 、康氏木霉的纤维素酶系基因为诱导酶，在上一章中通过几种诱导方式的比较， 以微晶纤维素为底物的m a n d l e s 诱导培养基，直接诱导培养三天，可以稳定的提取到含 有纤维素酶系基因m r n a 的总r n a ，在以后的实验中才有可能利用该模板扩增到纤维 素酶系基因的e d n a 片段。 r n a 的提取关键一点是灭活r n a 酶活性，防止r n a 的降解。r n a 酶广泛存在 于环境中，且耐酸、碱、高温，因此用d e p c 溶液处理所用的试剂和浸泡处理塑料耗材 以及用1 8 0 千烤所用的玻璃器皿是必需的。另外，操作时使用专用的微量移液器，操 作人员戴口罩、手套，并且在超净台内进行操作也是很重要的。r n a 提取时的起始菌 体量不能过高，起始菌体量如果过高，在细胞研磨后不能完全抑制自身体系内的r n a 酶活性，导致r n a 迅速降解，将严重影响r n a 的完整性和得率。 康氏木霉纤维素酶基因有内含子的存在，内含子的大小通常大于1 0 0 b p ，可以通过 电泳将d n a 和c d n a 扩增得到的片段分开。在实验中，曾对得到的r n a 进行d n a s ei 处理，以消除痕量的d n a 污染，但这一过程就对提取r n a 提出更严格的要求，如果在 提取时r n a 酶去除的不彻底，在用d n a s ei 进行3 7 反应1 5 m i n 消化d n a 时，同时会 使得到的r n a 完全降解，从而使r n a 提取失败，而且即使在添加d n a s e i 的情况下， 仍然很难完全去除d n a 的污染。所以在试验过程中，提取康氏木霉的总d n a ，并以其 为模板，在系统的条件下进行p c r 扩增，如果提取的总r n a 有痕量的d n a 污染，就 可能同时扩增到两段分子量不同的片段，从而在琼脂糖凝胶电泳上分开，就可以初步判 断所得到的片断的正确性。 丝状真菌的d n a 提取多采用c t a b 法，提取康氏木霉的总d n a 。d n a 提取较 r n a 提取容易，对操作和起始菌体量要求不太严格，而且在对模板要求不高的情况下， 加入r n a 酶消化的步骤可以省略，从而使整个操作过程更为简化，更适于批量提取。 3 2 广西大掌硕士学位论文 康氏木霉纤维素酶基因( e ci ) 的克隆与表达 ( 3 ) 、r t - p c r 是一种从r n a 扩增e d n a 拷贝的方法，首先反转录酶催化使r n a 反转录为e d n a 第一条链，一条寡聚脱氧核苷酸引物与m r n a 杂交，然后由r n a 依赖 的d n a 聚合酶催化合成相应互补的e d n a 拷贝，后者能进一步用于p c r 扩增。由于在 合成e d n a 时，体系中使用了高浓度的d n t p ，因此在以e d n a 为模板进行p c r 反应时 应该适量减小d n t p 的使用量，d n t p 会络合溶液中的m g + ，而且浓度过大会增加 t a q d n a 聚合酶的错配率。 ( 4 ) 基因克隆中的问题 在对康氏木霉纤维素酶基因的扩增中，我们得到了纤维素酶基因的四段主要基因 片断( c b h i 、c b h i i 、e g i 、b g i ) ，但p e t h i s 载体的酶切位点少，c b h i 、b g i 基因 序列中均含有载体的酶切位点，对后续的克隆带来不便，由于时间的限制，只成功克隆 得到含有目的基因e g i 的重组质粒p e t h i s e g i 。 实验中，对在重组菌体先进行菌落p c r 鉴定可以初步确定目的片段的插入，减少 下一步提质粒进行酶切鉴定的工作量。用菌落p c r 阳性的转化子进一步提质粒进行酶 切鉴定，确定重组质粒的正确性。 4小结 综上所述，实验成功提取了康氏木霉( t r i c h o d e r m ak n o n i n g i i ) ：a s3 2 7 7 4 菌株的 总r n a ，根据已发表的纤维素酶基因序列设计引物，以康氏木霉菌株的总r n a 为模板 合成了e d n a ，并通过p c r 扩增得到了与预计大小相符的特异性片断。p c r 扩增产物 与p e t h i s 载体连接后转化大肠杆菌j m l 0 9 感受态细胞，经筛选得到含有目的基因片 断的重组质粒命名为p e t h i s e g i 。 本章为该基因在大肠杆菌中的表达提供了基础。 3 3 康氏木霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 第四章康氏木霉纤维素酶基因在大肠杆菌中的表达 将重组质粒p e t h i s - e g i 转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 感受态细胞，经p t g 诱导表达，并提取菌体蛋白进行s d s p a g e 分析。 1材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 宿主菌 e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s ：广西大学生命科学与技术学院食品发酵研究所保藏。 1 1 2 主要试剂 见附录i 1 1 3 实验仪器 见附录 1 2 实验方法 1 2 1 重组质粒p e t h i s e g i 转化e e o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 感受态细胞 制备e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 感受态细胞，重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞， 以p e t h i s 空载体转化的大肠杆菌作为空白对照。 1 2 2 重组蛋白的诱导表达 a 、从转化平板上挑取单菌落到5 m ll b ( 含a m p1 0 0 9 m l ) 液体培养基中，3 7 1 0 0 r m i n 摇床培养至o d 6 0 0 m = o 6 左右； b 、根据文献【7 0 7 1 1 提供的p t g 浓度、培养条件以及诱导时间范围，选择诱导条件为： 3 4 康氏木霉纤维素酶基因( e ci ) 的克隆与表达 添加i p t g ，3 0 1 5 0 r m i n 摇床培养，诱导3 h 。 c 、含有空白载体p e t h i s 的菌株作为空白对照，同样培养。 1 2 3 s d s p a g e 分析【7 2 7 4 】 1 2 3 1 蛋白表达情况 a 、菌体蛋白的预处理 取l m l 的诱导培养菌液，8 0 0 0 r m i n 离心l m i n ，取沉淀，加入5 0 9 l 1 s a m p l e b u f f e r ，混匀，沸水浴5 m i n ，室温1 0 0 0 0 9 离心l m i n ，取上清上样电泳。 b 、上样电泳： 用微量移液器加样1 0 9 l ，在1 2 0 v 恒压下电泳7 0 m i n 。 c 、染色与脱色： 将凝胶置于考马斯r 2 5 0 染色液中，染色3 0 m i n ，放入脱色液中脱色，每隔3 0 m i n 换液一次，直至背景干净为止，观察蛋白表达情况。 1 2 3 2 蛋白的活性鉴定 ( 1 ) 在胶中添加0 1 的底物c m c ，进行非变性蛋白质电泳，电泳完毕后，用水漂 洗蛋白胶两次； ( 2 ) 将蛋白胶置于5 0 m m o l l 的p b s 缓冲液浸泡3 0 m i r a ( 3 ) 放置于o 1 c o n g or e d 染色液中染色3 0 m i n ，放入l m o l f l n a c l 溶液中脱色 1 5 m i n - 一3 0 m i n ，最后用5 的醋酸终止反应直胶成蓝色，观察有无活性蛋白条带。 1 2 4 重组蛋白的可溶性分析 按1 2 2 方法诱导培养重组菌，取1 0 0 m l 上述培养得到菌液，4 。c 下4 0 0 0 r m i n 离 心1 0 m i n ，收集菌体，菌体沉淀用无菌水洗涤一次，同样条件下离心。菌体溶于5 m l p b s 缓冲液中，用超声波细胞破碎器破碎细胞，4 。c 下1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，分别收集上 清液与沉淀，1 3 s d s p a g e 分析。 超声波破碎条件：4 。c ，间隔时间：1 2 s ，破碎时间：1 0 s ，5 0 个循环。 1 2 5质粒的稳定性 将重组菌进行传代培养，每隔五代提取质粒一次，验证重组质粒的稳定性。 3 5 g - 西大掌硕士学位论文 康氏术霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 2 实验结果 2 1s d s p a g e 分析目的蛋白的表达 用含空白p e t h i s 载体的重组菌作为空白对照，经诱导培养后提取菌体蛋白，经 1 0 s d s p a g e 分析，在4 5 k d a 左右处都可见一条特异条带。( 图4 1 ) - 1 5 k d a 8cdl 一鬟瓣 6 6 舞苏。强够髫攀；荔j 攀磐雾。一黪 。： 一 。 。蕊 麓 囊鬈黎缴，豢荔豢。i i 豢鬓鬻鬓黔嘲纛：二王i 图4 - 1 重组子在e c o l ib l 2 i ( d e 3 ) p l y s s 中的表达 f i g 4 - 1p e t h i s e g ie x p r e s s i o ni ne c o l ib l 2 i ( d e 3 ) p l y s s m 、p r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h tm a r k e r a 、t o t a lp r o t e i no fe x p r e s s i o nc e l l si n d u c e dw i t h o u ti p t g b 、t o t a lp r o t e i no f b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s h a r b o r i n ge m p t yp e t h i sa sc o n t r o l c 、t o t a lp r o t e i no fe x p r e s s i o nc e l l si n d u c e dw i t h0 4 m m o l l i p t g d 、t o t a lp r o t e i no f e x p r e s s i o nc e l l sr e d u c e dw i t hl m m o i l i p t g 2 2重组蛋白的活性染色 通过c o n g or e d 活性染色，可以清晰的看到目的蛋白与底物c m c 反应后所产生 的特异条带，说明重组蛋白具有一定的内切葡萄糖酶酶活性( 图4 2 ) 。 3 6 康氏木霉纤维案酶基因( e gi ) 的克隆与表达 2 3重组蛋白的可溶性分析 收集菌体，超声波破碎细胞后离心，分别取上清液与细胞碎片进行s d s p a g e 分析， 结果表明：目的蛋白为胞内可溶性蛋白。( 图4 3 ) 鳖i 鞠 糠霹 徽憋 一j _ 峨。“_ _ “ 图4 3s d s - p a g e 分析可溶性蛋白 f i g 4 3e x p r e s s i o np r o d u c t ss o l u b i l i t ya n a l y z e db ys d s p a g e m p r o t e i nm o l e c u l a rm a r k e r a r e c o m b i n a n te c o l ic e l ld e b r i s b r e c o m b i n a n te c o l ic e l ls a p 2 4质粒的稳定性 通过对重组菌进行传代培养，提取重组质粒，进行双酶切验证的实验，我们得到重 - - 西大掌硕士学位论文康氏木霉纤维素酶基因( e g 工) 的克隆与表达 组质粒具有良好的稳定性，在传代2 0 代以上，重组菌中仍然保留含有目的基因的重组 质粒( 图4 4 ) 。 、i】二3 3讨论 2 9 k b 1 4 k b 图4 4 重组质粒的稳定性 f i g 4 4t h e s t a b ili t yo fr e c o m b i n a n t m 、m a r k e r d l 2 0 0 0l a n el - 5 、d i f f e r e n tg e n e r a t i o no ft h er e c o m b i n a n t 在对重组质粒进行表达的实验时，我们发现有几个可以在一定程度上有利于表达的 步骤： ( 1 ) 表达培养基采用常见的l a 培养基，固体平板倒好后在室外温下放置2 4 d 时， 以使表面变干，有利于表达； ( 2 ) 在培养基中添d n o 2 葡萄糖有利于表达。1 9 9 8 年g r o s s m a n 等首次描述【7 5 】，培 养基中添加葡萄糖可以维持p e t 系统中低水平本底表达。当培养细胞到达稳定期时，葡 萄糖会作为第一碳源首先被利用，而后才是甘油等碳源。替代碳源的代谢导致a , d e 3 溶 原菌中c a m p 水平提高，从而刺激l a c u v 5 启动子指导的转录，t 7r n a 聚合酶表达。与 野生型l a c 启动子相比，l a c u v 5 启动子对c a m p 刺激不如野生型敏感。但研究显示， 足够的刺激可以提高t 7r n a 聚合酶水平，继而t 7 启动子调节目的基因表达【7 6 】； ( 3 ) 尽量挑小的菌落。一般菌落越小，第二天表达量就越高，原因有待探究； 3 8 广西大掌硕士掌位论文康氏木霉纤维素酶基因( e gi ) 的克隆与表达 ( 4 ) 涂布时添力1 5 9 l ( 浓度为l m m l ) 氨苄青霉素_ 并涂布，有利于表达； ( 5 ) p e t h i s 载体采用高拷贝数质粒p u c l 8 做母体，其一方面质粒高拷贝数有利 于高表达，但另一方面其表达分泌的p 一内酰胺酶也很高。而高浓度的p 一内酰胺酶水解 l b 平板上和l b 液体里的氨苄。而一旦氨苄消耗掉了，e c o l ib l2 1 ( d e 3 )