（发酵工程专业论文）基于代谢网络模型的谷氨酸发酵在线优化与控制的研究.pdf

摘要 摘要 本论文以谷氨酸为研究对象，对其发酵过程的优化和控制进行了研究。在利用谷 氨酸棒杆菌s 9 。- 。进行谷氨酸发酵过程中，通过分析不同操作条件下的表观现象和数 据，发现不同溶氧条件下谷氨酸和主要副产物乳酸的积累模式有着明显的差别，通过 利用代谢网络模型计算发现造成这种差异的主要原因是代谢通量在谷氨酸、乳酸和 t c a 循环三者之间发生了迁移。因此运用酶学分析的方法对不同溶氧条件下谷氨酸发 酵过程中与产物形成有关的关键酶( 谷氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶) 进行了跟踪分析， 研究发现溶氧浓度对谷氨酸脱氢酶( g d h ) 的酶活影响很大，低溶氧条件下g d h 酶 活较高，同时谷氨酸和乳酸也大量生成。根据刻意设计的非正常发酵条件下的结果发 现，极端缺氧条件对g d h 酶活以及谷氨酸的合成有着极大的损害作用。同时还分析 了溶氧( d 0 ) 与呼吸商( r q ) 之间的关系，从发酵表观数据分析，在发酵产酸期d o 高相应的r q 也高、d o 低r q 也低，两者之间有一定的联动关系。通过对酶活的时 序分析，初步阐明了该过程中细胞水平酶活力对过程代谢调节的时序性动态变化，并 结合d o 与r q 之间的关系，为基于r q 的平衡代谢控制提供了依据。 确立了基于r q 在线测量的控制策略，以达到调节g d h 酶活以及t c a 循环代谢 通量，从而实现提高谷氨酸的产率的目标，并根据这种控制方法提出了“平衡代谢控 制”的策略。通过分析r q 对于搅拌速度大辐阶跃式变化的时间响应，我们发现对r o 的控制完全可以通过调节转速来实现。为此我们设计了p i 反馈控制器来实现对r o 的 控制，从而使t c a 循环的代谢通量保持在一个合适的水平以实现谷氨酸发酵过程的 优化。试验结果表明通过逐级降低r o 设定值的控制策略，可以实现代谢通量在糖酵 解、t c a 循环以及谷氨酸形成之间达到平衡，从而实现抑制乳酸积累的目的。这一控 制策略得到了优良的控制效果，相对于d 0 定值控制的最好结果，产酸率和产酸强度 两个指标大致相同，但谷氨酸产率提高了1 3 ，乳酸浓度为d 0 定值控制最好结果的 3 5 ，基本达到了在提高谷氨酸产酸率的前提下基本抑制乳酸积累的目标。 关键词：谷氨酸发酵；代谢网络模型；谷氨酸脱氢酶：乳酸脱氢酶；发酵过程优化 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h i s p a p e r s t u d i e dt h e o p t i m i z a t i o n o f g l u t a m a t ef b 珊e n t a t i o np r o c e s s t h e e x p e r i m e n t a ld a t as h o w e dt h a t ，i nt l l eg l u t a r l l a t ef e 舯e n t a t i o nb ys t r a i nc d r p 6 d c f p r f “埘 甜f 口珊f c “肼s 9 ，g l u t 锄a t ep r o d u c t i o na 1 1 dl a c t a t e ( b y p r o d u c t ) a c c u r n u l a t i o no c c u r r e di n d i f f 色r e n tw a y sw h e nc o n t m l l i n gd 0a td i f f e r e n tl e v e l s b ya n a l y z i n gt h ee x p e r i m e n t a ld a t a u s i n gt h em e t a b o l i cn e “，o r km o d e l ，w ef o u n dt h a tt h em e t a b o l i cn u xs h i r e dq u a n t i t a t i v e ly s u b s e q u e n t l y ，e n z y m a t i ce x p e r i m e n t sw e r ec 枷e do u tt ov e r i f yt h i sp h e n o m e n o n t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t ，d 0l a i g e l ye f 诧c t e dg l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y ( g d h ) ，ah i g h e r g d ha c t i v i t y ，a sw e l la st l l e o v e r p r o d u c t i o no fb o t hg l u t a i i l a t ea n dl a c t a t ec o u l db e a c h i e v e da tal o w e rd 0l e v e l t h eo x y g e nl i m i t i n gc o n d i t i o nw a se x t r e m e l yh a 矾如1 t o g d h a c t i v i t ya n dg l u t a m a t ep r o d u c t i o n t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nd o a n dr qw a ss t u d i e d ， t h ed a t as h o w e dt h a tw h e nd ow a sc o n 订o l l e da th i g hl e v e lt h er qv a l u ew a sl l i g ha i l dv i c e v e r s a ac o n t r o ls t r a t e g yb a s e do nr qm e a s u r e m e n tw a su s e dt or e g u l a t et h eg d h a c t i v i t y a i l dt c ar e a c t i o n sn u x e sa i m i n gf o ri m p r o v e m e n to ft h ef e m e n t a t i o np e r f o h 】1 a n c e a c o n c e p to f “b a l a n c e dm e t a b o l i cc o n t r o l ”w a st l l u sp m p o s e d b ya n a l y z i i l gt 1 1 et i m e r e s p o n s eo fr qt os t e pc h a n g e si na g i t a t i o nm t e ，w ef o u i l dt h a tr qw a sc o n t r o l l a b l eu s i i l g t i l ea g i t a t i o nr a t ea st h eo p e r a t i n gv “a b l e ap if e e d b a c kc o n 仃d l i e rw a sd e s i g n e df o r r e g u l a t i n gr qa n dm a i n t a i n i n gm et c a m e t a b o l i cf l u xa tt h ea p p r o p r i a t el e v e l ，t oo p t i m i z e t i l eg l u t 锄a t ef e n n e n t a t i o np r o c e s s t h er e s u l t ss h o w e d 山a tb yr e d u c i n gr qs e t p o i n t s t e p w i s e ，t h em e t a b o l i cb a l a i l c eb e 抑e e ng l y c o l y s i sa 1 1 dg l u t 踟a t es y n t h e s i s t c ac y c l e c o u l db er e a c h e da n dt h el a c t a t ea c c u m u l a t i o nb er e p r e s s e d w i t ht h i sc o n t r 0 1s t r a t e g y ，t h e n n a lg l u t 柚a t ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d1 3 a n dt h e1 a c t a t ea c c u m u l a t i o nw a so n l y6 4 o f t h eb e s tr e s l l l t sj nt h ec o n s t a n t 【) oc o n t r d 】c a s e s k e yw o r d s ：g l u t 锄a t ef b m l e n t a t i o n ；m e t a b o l i cn e t w o r km o d e l ；g l u t 锄a t ed e h y d m g e n a s e 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ；f e m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n i i 独创性声明 y9 6 8 2 5 9 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：盗丝日期：炒婢，月) g 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 发酵工业的特点及其研究对象特征 发酵工业有着悠久的历史，它和人类关系密切，涉及到人们生产和生活的方方面 面。发酵工业是指通过对微生物的培养，利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有 用物质的工业。在1 9 世纪以前的发酵主要是指天然发酵，其应用对象仅限于酒精饮 料和醋酸等嫌气培养产品的作坊式生产，非纯种培养。凭经验传授技术，易受杂菌污 染，产品质量不稳定等是这个时期的特点。随后经过漫长的发展历程才形成了一门产 业，发酵工业技术的发展经历了纯培养技术、通气搅拌发酵、代谢控制发酵和基因工 程发酵等重要的转折时期。近年来随着研究手段的日新月异和学科交叉融合的发展， 发酵工业已经渗透到包括食品、化工、医药、环境等诸多方面，在国民经济中占有很 大的比重。 发酵工程包括两个主要方面的内容，其一是如何改变细胞的遗传组成和细胞的代 谢生理特性，即细胞的“内部控制”；另一主要方面就是“外部控制”，包括营养成分、 细胞体及代谢产物在内的细胞生长和产物形成的物理和化学环境条件控制，达到过程 的最优化。然而，由于不同发酵条件下细胞所处环境的影响，各种酶都会受到诱导、 阻遏、激活、抑制等复杂的调控，加上微生物本身的变异，通常使代表为生物反应的 生化反应极其复杂，因此，生物过程具有迥然不同的特征：1 ) 动力学模型呈高度的 非线性；2 ) 随着发酵过程的进行，或者发酵批次的不同，过程的动力学模型参数往 往变化不定，呈现强烈的时变性特征，对于某些生物过程甚至无法用数学模型来对动 力学特性进行定量的描述；3 ) 除了某些简单的物理和化学状态变量，如温度、p h 、 压力、溶氧浓度外，绝大多数生物状态变量( 如生物量、底物浓度、代谢产物浓度等) 很难在线测量；4 ) 由于涉及到许多物理和化学变化，其相互之间的作用和影响必然 造成了生物过程的响应速度慢、在线测量带有大幅时间滞后的特性。 但是，与传统的过程控制相比，生物过程的控制和优化又具有自身的特点【2 】：1 ) 不需要太高的控制精度，控制指标不需要也不可能完全准确地控制在某一水平上，只 要不影响生物过程的整体最优指标，各控制指标在一定范围内的波动是可以接受的： 2 ) 生物过程的各状态变量之间往往存在一定的连带关系，难以在线测量的生物量在 一定程度上是可以通过简单易测得物理和化学量而间接测量得到；3 ) 相当数量的工 业规模或实验室规模的生物过程，由于没有合适的定量数学模型可循，其控制和优化 操作必须完全依靠操作人员的经验和知识来进行。 可见，发酵工程不仅需要在已有的“高产菌株”的基础上，进一步考察其生理生 化特征，稳定或者改进工艺过程，还需要运用工程学的技巧才能充分发掘和利用生物 体系的潜力。同时，计算机技术的高度发展也在客观上为分析和优化控制发酵过程提 为发酵过程优化与控制的发展趋势。 1 1 2 发酵过程优化与控制的研究现状和发展趋势 控制和优化是两个不同的概念，但是彼此之间又是紧密关联的，在很多情况下， 过程的优化就是靠把某些状态变量控制在某一水平或者程序控制在某一时间轨道上 才实现的。 以发酵技术进行产品生产时，为了提高生产水平，人们首先考虑的是菌种选育或 采用基因工程技术构建新菌株，往往忽视了生物反应器中工程问题所必须加以考虑的 工艺变化和过程优化。随着过程动力学在发酵技术的应用，以此为基础的数学模型的 建立成为研究的热点，同时还引入了一系列现代控制理论，如系统识别、自适应控制、 专家系统、模糊控制、神经网络等等，这些方法的引入为发酵技术的进步起了很大的 推进作用。 在2 0 世纪，随着现代控制技术、智能控制技术、计算机技术和集散控制系统( d c s ) 的不断发展，使得大宗发酵产品生产过程控制取得了飞速的发展。1 9 5 9 年l u e d e k i n g r 和p i r e l e l _ 口j 提出了乳酸发酵过程动力学模型，并采用常规p i d 控制器设计了一种发 酵过程p h 控制器。1 9 7 0 年f r e d r i c k s o na g ，m e g e er d 和t s u c h i y ah m 1 4 1 提出了 发酵过程的数学模型，并利用系统识别和状态估计对模型参数进行了估计。1 9 7 1 年， f u k s 1 5 j 提出了一种发酵过程人工智能控制和自学习控制系统。1 9 8 3 年，g u s t a s s o n k 【6 l 给出了p h 过程动态模型的控制器，并对模型进行反馈控制和参数自适应控制。 1 9 8 5 年d i m i t a rp e t m vf i l e v ，m k i s h i m o t o 等i7 1 提出了模糊理论在发酵仿真中的应用， 首次将模糊理论思想应用到了发酵过程中。c h a r l e s 等【8 】给出了生化工业反应原理、规 律和应用。1 9 9 0 年，1 k b a u l t 等【9 】采用神经网络给出了发酵过程参数的在线预测。1 9 9 2 年，s h i 等【1 0 】提出了发酵过程的模糊神经控制方法。s i i m e s 等j 提出了生物过程在线 诊断和控制的面向对象的专家系统，将专家系统应用于生化过程。1 9 9 3 年，p a l a n k i s 等| l2 | 提出了发酵过程优化的状态反馈控制。1 9 9 4 年，s h a 等【13 j 提出了发酵过程中细菌 培养的p h 控制的模糊控制策略。n ”t l e 等【1 4 j 提出了发酵过程的模糊控制策略。 k u n a j l i e k 等给出了基于人工神经网络的生化过程模型和控制策略。1 9 9 5 年，s i i e m s 等【l6 j 提出了发酵产品的模糊控制方法。但是，由于发酵过程十分复杂，特别是数学建 模十分困难，再者许多生物参数无法测量，所以大部分的控制方案仍处在初级阶段， 采用手动或半自动方式。 近年来代谢工程研究的兴起，有关代谢流分布，基因水平和细胞水平研究代谢流 的研究文献有大量报道，但是一到发酵罐实际操作时，由于发酵过程酶学研究的困难 以及发酵过程数据采集和处理的困难，发酵工艺优化研究的基本思路仍是寻求最佳培 养及配方等，而忽视了发酵过程优化中的细胞代谢流的变化。 近年来代谢工程研究的兴起，有关代谢流的分布的研究文献大量报道，代谢网络 第一章绪论 模型克服了传统建模方法中参数意义不明，输入输出关系难以解释等缺点，充分利用 了现存的生物化学的知识和理论，具有通用性强、模型物理意义明确、建模相对容易 等特点。代谢网络模型广泛应用于分析代谢网络的流量分配信息、确定代谢网络的流 量分配关系1 8 ，19 1 、寻找目的产物流向中的颈瓶所在2 0 之”、识别发酵过程状态【2 2 ，2 3 】和 计算最大理论产量【2 4 ，25 j 等方面。但是，由于代谢网络模型一般是由几十上百个的代谢 流的线性方程式所组成的，直接用来计算求解发酵过程状态变量的经时变化，乃至用 于过程的控制和优化有很大的困难，因此，迄今为止代谢网络模型的研究和应用几乎 全部停留在分析发酵过程在不同阶段的代谢流分布，为过程的离线优化和调控提供依 据和数据等方面。 1 1 3 谷氨酸发酵的历史与现状 l 一谷氨酸是蛋白质的主要构成成分，谷氨酸盐在自然界是普遍存在的。谷氨酸是 构成蛋白质的氨基酸之一，虽然它不是人体必需氨基酸，但它可以作为碳氮营养参与 机体代谢，有较高的营养价值。 l 一谷氨酸是目前世界上产量最大的氨基酸，大约占世界氨基酸产量的5 3 。谷氨 酸的研究和发展已有百余年的历史。早在1 8 6 1 年，德国人r i t t l l a u s e n 用h 2 s 0 4 水解 小麦面筋最先分离出谷氨酸。1 8 7 2 年w o l f r 利用酮戊二酸经溴化合成消旋谷氨酸。 1 9 0 8 年日本东大教授池田菊苗( k i k i 】n a ei k e d a ) 从呈味成分的海带煮出汁提取得到谷 氨酸钠，创造了新的人工调味料，获得专利。1 9 0 9 年池田与铃木合作获得了蛋白质酸 水解法生产谷氨酸的专利权，并进行了工业化生产，味之素公司的商品味精问世，从 此诞生了味精工业。1 9 3 6 年美国国际化学药品公司以甜菜废糖液( s t e 虢n 废液) 为原 料，用提取法发生产味精。1 9 4 6 年，美国农业部研究所l o c k w o o d 等发现在葡萄糖培 养基中的好气培养荧光杆菌有a 一酮戊二酸的积累，并发表了采用酶法或化学方法转化 酮酸为谷氨酸的研究报告。1 9 5 7 年木下等发明了利用微生物发酵法生产谷氨酸，从而 使谷氨酸发酵实现工业化的大规模生产。 国内自1 9 6 4 年上海工业微生物研究所与上海天厨味精厂协作，采用黄色短杆菌 以发酵法生产谷氨酸获得成功以后，1 9 6 5 年在上海天厨味精厂5 0 m 3 发酵罐首先投产， 完成了以蛋白质原料水解法向发酵法生产味精的转变。根据原轻工业部规划，首先在 沈阳味精厂与天津味精厂推广。1 9 6 4 年，由中国科学院微生物研究所与杭州味精厂合 作，与1 9 6 6 年采用北京棒杆菌发酵法生产谷氨酸在杭州味精厂投产，此后利用微生 物发酵法生产谷氨酸在国内各味精厂相继推广有力地推动了我国味精工业的崛起。迄 今为止，国内已全部采用发酵法生产味精，多数厂家的生产菌株是t 6 _ 1 3 、f m 4 1 5 、s 9 1 1 4 和c m t c 6 2 8 2 等。4 0 多年来，全国味精总产量已由水解法生产的4 2 0 0 吨发展到1 2 0 万吨，占世界味精总产量的6 0 以上，居世界味精产量首位。 江南大学硕士学位论文 1 1 4 谷氨酸发酵的生物合成途径 谷氨酸生产菌中谷氨酸的生物合成途径目前已经研究的十分清楚，其代谢途径包 括糖酵解途径( e m p ) 、磷酸己糖途径( h m p ) 、三羧酸循环( t c a 循环) 、乙醛酸循 环、伍德一沃克曼反应( c 0 2 固定反应) 等。葡萄糖经过e m p 和 l m p 途径生成丙酮 酸，其中一部分氧化脱羧生成乙酰c o a 进入t c a 循环，另一部分固定c 0 2 生成草酰 乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰c o a 在柠檬酸合成酶催化下，所合成柠檬酸，在经 过氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。同时，在谷氨酸生产菌中，丙酮酸可以被 乳酸脱氢酶催化生成乳酸。 1 1 5 谷氨酸发酵中关键酶的研究现状 1 1 5 1 谷氨酸脱氢酶的研究现状 谷氨酸发酵是氮素同化的过程，氮的同化是关键步骤。实验证明，在谷氨酸生产 菌中，谷氨酸脱氢酶( g d h ) 的活力很强，氮的同化主要是以谷氨酸脱氢酶催化的，谷 氨酸脱氢酶是谷氨酸合成中的关键酶。谷氨酸脱氢酶以n a d p h 作为辅酶催化q 一酮戊 二酸转变成谷氨酸，这个反应是可逆的。 旺一酮戊二酸+ n h 3 + n a d p h 铮谷氨酸甘j a d p 谷氨酸脱氢酶( g 1 u t 锄a t ed e h y d m g e n a s e ，g d h ) 是一种依赖辅酶的脱氢酶，它分为 n a d h 依赖型( e c 1 1 4 1 1 1 2 ) 、n a d ( p ) h 依赖型( e c 1 1 4 1 1 1 3 ) 和n a d p h 依赖型 ( e c 1 1 4 1 1 1 4 ) 。它广泛存在于动物、植物和微生物中，在氮代谢中具有重要作用。g d h 在植物中分布广泛，而且浓度比较高。同一组织中往往有数种同源异构体存在，有些 是诱导型的，和营养状况，环境因素有关。真菌中主要的氮素利用循环是g d h 和g s 两种途径，其中g d h 更为主要，这与植物不同。真菌g d h 主要以可溶形式存在于细 胞质中。粗糙脉胞霉( p “，o 印d r dc r 骶，口) 的g d h 被广泛研究。脉胞酶g d h 在含有 铵离子和碳源的环境中诱导表达。n a d p g d h 主要催化谷氨酸的合成，而n a d g d h 催化谷氨酸的分解。 几十年来，谷氨酸棒杆菌在氨基酸生产中广泛地应用于生产谷氨酸、谷氨酰胺和 赖氨酸等重要的产品。大量研究报道了不同操作条件下其代谢网络中的各种关键酶在 目标代谢产物大量合成过程中的酶学性质。宋香等【2 6 j 做了c e c l 3 对谷氨酸棒杆菌s 9 1 1 4 生长和谷氨酸脱氢酶的影响的研究；张克旭等1 27 j 做了不同温度、p h 对谷氨酸脱氢酶的 影响的研究；z h u a l l g 等【2 8 j 做了镧系金属离子对谷氨酸脱氢酶活性的影响机理的研究。 c o e l l e 等1 2 9 j 研究了n 1 4 + 浓度对c d ，) e 6 口c ，p r f “卅州h ，口m f c “m 生长和谷氨酸脱氢酶 ( g d h ) 活性的影响；t e s c h 和w e n d i s c h 等”j 研究了在c 可“，d m f c “m 合成赖氨酸中不 同流加速度对氨基化反应中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的影响；u y 等1 32 】研究了在不同流 加速度以及不同温度激发条件下g d h 的酶活性质。另一方面，构建了c 州“f d m f c “m 在 第一章绪论 不同发酵阶段以及不同操作条件下的代谢网络模型用来分析在目标产物大量合成和 底物有效利用情况下的代谢流分布盼3 5 1 。 1 1 5 2 乳酸脱氢酶的研究现状 谷氨酸发酵中，一些代谢副产物会有不同程度的产生和积蓄，从而造成谷氨酸产 量和产率的低下。造成产量和产率低下的主要原因是乳酸的大量积蓄，这与发酵过程 控制的好坏密切相关。一般认为，乳酸可能是在供氧不足的条件下所产生的。据文献 报道，丑刀鲫“m 分批发酵结束时乳酸占总酸的比例达1 5 左右1 37 ”】。因此研究谷氨酸 发酵过程中乳酸脱氢酶的酶活变化情况有助于更深一步地了解发酵的本质过程。 乳酸脱氢酶( l a c 诅t ed e h y d r o g e a l l a s e ，l d h ) 广泛存在于动物组织和各种微生物 细胞内，它催化糖酵解的最后一步反应，即丙酮酸向乳酸的转化。无论是在高等动物 还是低等动物中，l d h 均是借助辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d + n a d h ) 的作用 可逆地催化丙酮酸与乳酸的转化反应，其反应方程式如下： 丙酮酸+ n a d h + h + 乳酸神4 a d + 在细菌中，l d h 主要位于细胞质中， 关键酶，主要用于催化丙酮酸生成乳酸， 是e m b d e nm e y e r h o f p a t l l w a y 产能过程中的 其活力受菌体的供氧量的影响【3 6 】。 1 2 立题意义 1 2 1 生物反应过程优化与控制直接影响工业生物经济效益 发酵生产涉及的产品主要涵盖生物化工、生物医药、生物农药、生物环境和生物 海洋五大方向。全国范围内，传统发酵产品方面，味精、柠檬酸、啤酒等大宗发酵产 品的产值已逾2 3 0 0 亿元，在国民经济中占有可观的份额。另外，在新型发酵技术方 面，发酵应用于疫苗、激素、醇、酸、酮等有机物，多糖、聚酯等大分子材料，红曲 等功能食品、细胞蛋白饲料和生物肥料等发挥着巨大的作用。在如此巨大的产业背景 下面，发酵过程的优化与控制是实现生物技术产品工业化的重要环节之一。 1 2 2 味精工业发展的需要 我国的味精工业发展速度非常快，产量已经达到了年产1 2 0 万吨，居于世界的第 一位。几年前国内味精生产成本比国外味精要高出许多，虽然目前现在国产味精生产 成本大幅下落，先进水平厂与国际市场价格逐步接近，但还有差距。特别是我国加入 世贸组织对国内味精行业的冲击力不能低估，关税调低后，市场必受冲击，味精行业 将受到国外同行的巨大威胁，迫切需要生产水平有一个较大的提高，只有这样才能与 国外的企业进行竞争，获得生存发展的空间。 江南大学硕士学位论文 表1 1 国内外味精生产技术水平比较 1 a b l e1 1t b ec o m p a r i s o no f t h ep e r f o h n a n c eo f g l u t a m a t ep r o d u c t i o nl e v e l 在味精生产中，谷氨酸发酵是整个生产的关键，发酵成败直接影响经济效益。我 国味精行业的主要生产技术水平仍能比国外的有较大的差距，因此我国味精行业在提 高产酸方面进行了大量研究与实践，在选育优良生产菌，开发味精生产新原料，改革 空气系统，研究发酵新工艺新技术方面等方面都取得了明显效果，再进行这方面的研 究提高产率的可能性很小。但是，目前国内生产厂家所采用的控制方法大多依靠生产 技术人员积累的经验而不是系统化的控制系统，所以迫切需要在现有的菌种条件下， 找到一条提高谷氨酸发酵水平的途径。 1 3 本论文的主要研究内容 ( 1 ) 跟踪分析谷氨酸发酵过程中两种与谷氨酸和代谢副产物生成有关的关键酶 ( 谷氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶) ，结合使用代谢工程的基本原理，为谷氨酸发酵进行 优化和控制提供重要依据。 ( 2 ) 根据利用代谢网络模型分析不同操作条件下代谢流的分布，提出了谷氨酸 发酵平衡代谢控制的策略；并分析不同操作条件下的呼吸商( r q ) 的变化规律，建 立了简单易行的r q 在线实时控制方法和平衡代谢控制策略，对谷氨酸发酵进行实时 在线的优化和控制。 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 谷氨酸棒杆菌s 9 1 1 4 ，本实验室提供。 2 1 2 实验试剂 牛肉膏 蛋白胨 乙酸 氯化钠 氢氧化钠 盐酸 苯酚 亚硫酸钠 酒石酸钾钠 葡萄糖 硫酸镁 硫酸亚铁 硫酸锰 磷酸二氢钾 尿素 浓氨水 丙酮酸 a 一酮戊二酸 琼脂 玉米浆 乳酸 n a d h n h d p h 牛血清蛋白 a r a r b r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r b r b r b r u l t r ap u r eg r a d e 上海长阳生化制药厂 北京红星生化化学制品厂 国药集团化学试剂有限公司 上海试四化工有限公司 中国医药( 集团) 上海试剂公司 中国医药( 集团) 上海试剂公司 中国医药( 集团) 上海试剂公司 中国医药( 集团) 上海试剂公司 中国医药( 集团) 上海试剂公司 中国医药( 集团) 上海试剂公司 上海化学试剂总厂 宜兴市化学试剂总厂 上海化学试剂总厂 上海恒信化学试剂有限公司 中国医药( 集团) 上海试剂公司 国药集团化学试剂有限公司 上海曹杨第二中学化工厂 上海试剂三厂 上海医药集团医药试剂公司 无锡酶制剂厂 a m r e s c o 分装 s i g m a s i g m a 上海华美试剂公司 江南大学硕士学位论文 2 1 3 培养基 2 1 3 1 斜面培养基( g ，1 0 0 m l ) ： 无糖斜面培养基：牛肉膏1 0 ，蛋白胨1 o ，氯化钠o 5 ，琼脂2 o ，d h7 0 有糖斜面培养基：葡萄糖0 1 ，牛肉膏1 0 ，蛋白胨1 o ，氯化钠o 5 ，琼脂2 o ， p h7 o 一7 2 。 2 1 3 2 种子培养基( 1 0 0 m l ) ： 葡萄糖2 5 ，k 2 i p 0 4 o 1 5 ，m g s 0 4 o 0 6 ，f e s 0 45 m g l ，m n s 0 45 m l ， 玉米浆2 5 ，尿素0 2 5 ( 分消加入) ，d h7 o 一7 2 。 2 1 3 3 发酵培养基( 1 0 0 m l ) ： 流加糖发酵培养基：葡萄糖1 4 ，k 2 h p 0 4o 1 ，f e s 0 42 m l ，m n s 0 42 m l ， m g s 0 4o 0 6 ， 硫胺素5 0 肛l ，玉米浆1 5 ，尿素o 5 ( 分消加入) ，p h7 o 一7 _ 2 。 2 2 培养方法及条件 2 2 1 斜面培养条件 3 0 培养2 4 h 2 2 2 种子培养条件 将菌株斜面活化后，接两环于装有1 2 0 m l 种子培养基的5 0 0 m l 三角瓶中，置摇 床上于转速为2 0 0 r m i n ，温度为3 2 条件下培养，菌体在6 h 左右进入对数生长期， 8 1 0 h 左右进入稳定生长期。考虑p h 值因素在内，确定种龄为8 一l o 小时左右。 2 2 3 摇瓶培养条件 温度控制前期为3 2 3 4 ，中期为3 4 3 6 ，后期为3 7 。通风控制为前期2 0 0 “m i n ， 中期2 5 0 r m i n ，后期2 3 0 r m i n 。发酵过程中流加1 0 尿素进行p h 的控制。当残糖浓度 降至一定值时开始流加5 0 葡萄糖溶液，加至最终糖浓度为2 4 左右，流加总时问为 1 0 小时左右。 2 2 4 发酵罐培养条件 在5 l 的发酵罐中，根据需要将溶氧浓度控制在各种不同水平( o 一5 0 ) ，罐压保 持在o 0 7 m p a ：通过与搅拌转速联动来控制溶氧；接种量为8 ，温度控制为：菌体 生长期为3 2 ，产酸期为3 5 ，p h 控制为7 1 。当发酵液中的残糖浓度低于1 5 l 时流加5 0 的葡萄糖。 第二章材料与方法 2 3 分析方法 2 3 1 葡萄糖的测定 用s b a 一4 0 b 生物传感仪测定： 将待测液稀释到5 0 1 2 0 m 2 1 0 0 m l 的范围；开启s b a 一4 0 b 生物传感反应仪，用标 准液进行标定，待进样指示灯不再闪烁，用微量进样器吸取2 5 血的稀释液，快速进 样，读数稳定时机器显示值即为样品的浓度，单位为m 1 0 0 m l 。 将从发酵罐取出的样品发酵液，在高速离心机中，以1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，上 清液适当稀释后用s b a 一4 0 b 型葡萄糖一谷氨酸测定仪测定。 2 3 2 谷氨酸、乳酸的测定 s b a 一4 0 b 生物传感仪测定，同葡萄糖测定方法。 2 3 3h p l c 测定丙酮酸、伍一酮戊二酸的浓度 样品的处理：先把发酵液稀释l o 倍，经过o 2 5 岬的微孔滤膜过滤，再经过 o d s c 1 8 预柱处理，然后直接进样。 色谱条件：色谱柱：z 0 r b a x 柱s b c l 82 5 0 4 6 m m ，柱温3 0 ，流动相： 0 1 mk h 2 p 0 4 ( h 3 p 0 4 调p h 值2 5 ) ，紫外检测器，检测波长2 1 5 1 1 1 1 1 ，进样量：5 此。 2 3 4 铵氮的测定 铵氮的测定采用靛酚蓝反应法测定【3 9 】 溶液a ：5 0 9 l 苯酚，o 2 5 9 l 硝普钠( 亚硝基五氰合铁酸钠， f e ( n o ) ( c n ) 5 】2 溶液b ：2 5 9 l n a 0 h ，4 2 m l l 次氯酸钠 5 m l 溶液a 与2 0 皿样品充分混合，加入5 m l 溶液b 、5 m 1 磷酸盐缓冲液( p h = 7 o ) ， 3 7 水浴2 0 m i n 后，测定o d 6 2 5 ，由标准曲线即可计算出n 1 4 + 含量。 2 3 5 菌浓的测定 用分光光度计于6 2 0 m 下测定。 2 3 6 菌体干重的测定 将一定量体积的发酵液在高速离心机以1 0 0 0 0 r p m 离心后，用纯水洗涤两次，每次 洗涤后以5 0 0 0 r p m 离心，将菌体放于1 0 0 的恒温箱中烘干，直到恒重。再称量菌体 和离心管的重量，减去离心管的重量( 之前已称重) 。据此得到o d 6 2 0 和细胞干重之 问的标准校正曲线。 9 江南大学硕士学位论文 3 1 0 马 u o 5 0 o 2 0 o d 6 2 。 4 06 0 图2 1o d 6 2 0 和菌体干重之间的标准校正曲线 f i g 2 1t h er e l a t i o n so f d c wa n do d6 2 0o f c e u 2 3 7 氧消耗速度( o u r ) 和二氧化碳生成速度( c e r ) 的计算 2 3 7 1 尾气中c 0 2 ，0 2 分压的测定 使用k l m 2 0 0 0 在线尾气分析仪，自动采样间隔为一分钟，记录尾气中的c 0 2 和 0 2 分压值。 2 3 7 2o u r ( m o l ，m 3 h ) 和c e r ( m o l ，m 3 h ) 的计算 = 志卜一畿j 一志l 袁老飞，叫 o 0 2 2 4 y l1 一”。，f 一 c 0 ，2 。“j f 。空气流量，m 3 m ：v 发酵液体积，m 3 ；i 1 0 2 。进入发酵液空气中氧的 体积分数；n n 2 。进入发酵液空气中氮的体积分数；n 0 2 。尾气中氧的体积分 数；l l c 0 2 。尾气中二氧化碳的体积分数；i l c 0 2 m 进入发酵液中二氧化碳的 体积分数。 2 3 8 代谢网络模型 2 3 8 1 代谢网络模型的建立 本研究所采用的代谢网络模型是又上一届已毕业的研究生所建立的，并且她也给 出了模型的求解方法。代谢网络模型形式如图2 2 所示。 第二章材料与方法 e m pg l v c o l v s i sp a t h w a v r 1 ：g 1 u c o s e + a t p = g l u 6 p + a d p n ：g l u 6 p = f m 6 p h ：f r u 6 p + a t p ：2 g 3 p + a d p h ：g 3 p + n a d 十a d p = p e p + a t p + n a d h k ：p e p + a d p = p y r + a t p p e n t o s ep h o s p h a t ep a t h w a v h ：3 g l u 6 p + 6 n a d p = 2f r u 6 p + g 3 p + 6 n a d p h + 3 c o ， t c ac v c l e r ，：p e p + c o ，+ a t p = 0 a a + a d p n ：p y r + n a d = a c - c o a + n a d h + c o ， n o ：a c c o a + o a a = i s o r l l ：i s o + n a d = a k g + n a d h + c 0 2 r 1 1 ：0 l k g + n a d + a d p = s u c + n a d h + a t p + c 0 2 n 4 ：s u c + f a d = m a l + 2 ，3 n a d h ns ：m a l + n a d = o a a + n a d h m e t a b o l i cp r o d u c t sf o r m a t i o n h ：p y r + n a d h = l a c t a l e + n a d n 2 ：a k g + n h 3 + n a d p h = g l u t 锄a t e + n a d p g l v o x v l a t es h u n t o 】6 ：i s o = s u c + g l y r 1 7 ：a c c o a + g l v = m a l r e s p i i 翟t o i 了c h a i n o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t j o n n 8 ：0 2 + 2 n a d h + 2 ( p o ) a d p = 2 ( p o ) a t p + 2n a d + 2h 2 0( a s s u m ep ，o = 2 ) n 9 ：a t p = a d p + p ， r 2 0 ：0 2 + 2 ( 1 + a ) n a d p h + 2 a n a d = 2 a n a d h + 2 ( 1 + ) n a d p + 2 h 2 0 ( a s s u m eo l = 1 ) 图2 2 谷氨酸发酵代谢网络图和代谢反应方程式 f 蟾2 2m e t a b o cn e t w o r ka dm e t a b o l i cr e a c t i o n si g l u t a m a t ef e 珊e t a t i o 江南大学硕：l 学位论文 2 3 8 1 代谢网络模型的求解 根据得到的o u r 和c e r 的数据，利用线性规划法求解代谢网络模型可以求解得 到发酵过程中不同时刻代谢网络中各个反应的代谢通量【4 ”。 我们可以用下列矩阵来描述整个代谢网络模型( 模型中各矩阵在附录中列出) ： 爿r = 以，二+ 爿。= 0 ( 2 ) 本研究中，可在线测量的状态参数只有两个( o u r 和c e r ) ，未知变量的个数为 2 3 个，方程个数为2 0 个，所以此代谢网络为一个不定系统，必须通过线性规划法来 求解。其中采用的目标函数是n a d h 总生成速度最小，其物理意义就是细胞经济学 的原理和假说1 4 2 j ，换句话说，细胞要以高效率、最少的n a d h 量来循环再生a t p 以 维持代谢，过量的氧化反应的存在对细胞自身不利。这样，代谢网络模型的求解就可 以通过式3 进行优化计算，优化计算使用m a t l a b ( v e l 7 o ，美国t h em a t hw o r k s 公 司) 软件中的线性规划最优计算程序包“l i n p m g ”进行，即： 目标函数：m 砌( m d h 生成速度) = m 矾+ b + 1 。 限锘0 条件： 彳。k + 爿。0 = o ( j ) 0 ( f = 1 ，- - ，| j 一埘) 2 3 9 酶比活力的分析原理及方法 2 3 9 1 粗酶液的制备 菌悬液的制备：发酵过程中按一定时间间隔采集发酵液，1 8 0 0 甲m 离心1 0 m i n 去 除沉淀，再经8 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 收集菌体。用p h 7 5 、5 0 m m o l lt r i s h c l 缓冲液( 内 含d t t 、e d t a 等) 于4 洗涤菌体两次后震荡得菌悬液。菌悬液置冰浴，进行超声波 破碎，破壁条件为：工作时间与暂停时间比为1 ：3 ，破壁工作时间为l o m i n 。处理液在 4 经1 0 0 0 0 r p m 离心2 0 m i n ，上清液即为粗酶液。 2 3 9 2 谷氨酸脱氢酶 利用谷氨酸脱氢酶( g d h ) 催化一酮戊二酸生成谷氨酸的反应所导致的n a d p h 的减少引起的o d 3 4 0 降低而测定的2 6 】： a 酮戊二酸+ n h 3 + n a d p h 谷氨酸+ n a d p 表2 1g d h 测定的反应体系的组成 1 h b l e2 1c o m p o e n to fg d hr e a c t i o m i x t u r e 成分 浓度( m m o l ，l ) a 一酮戊二酸 n h a c l n a d p h 1 3 _ 3 1 5 1 6 7 ) 1 j ( o 2+ 5 + 4_ 76o+ 31 + 第= 章材料