（发酵工程专业论文）地衣芽孢杆菌pelbamyxyvdf基因的功能鉴定与表达.pdf

摘要 摘要 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 是芽孢杆菌中最具应用潜力的菌种之一，具有 酶系丰富，产酶量高等诸多优良特性。地衣芽孢杆菌基因组序列已于2 0 0 4 年被公布， 为利用基因工程手段开发其应用潜力提供了基础。本文从地衣芽孢杆菌基因组d n a 中 分别克隆了被标注为p e l b 、a m y ) ( 和y v d f 的基因，在大肠杆菌等不同宿主中表达出有活 性的重组酶并对重组酶表达情况及酶学性质进行了初步分析。 对地衣芽孢杆菌基因组序列分析后发现有两条基因可能编码果胶酶，分别被标注为 p p 阴和p e l b ，其中对p e l b 基因的研究迄今未见报道。本文从地衣芽孢杆菌c i c i mb 1 6 9 9 染色体d n a 中扩增出可能编码果胶裂解酶的基因即旧，插入启动子p q 下游，分别构 建了重组质粒p l a - p q - p e l b 和p h y - p q - p e l b 。重组大肠杆菌j m l 0 9 ( p l a p q - p e l b ) 表达出 有活性的果胶裂解酶，酶活力为0 6u m l ，上述实验证明了卵旧基因编码的蛋白具有 果胶裂解酶的功能。重组酶的酶学性质显示其最适反应温度为4 5 ，最适p h 为1 0 5 。 金属离子c a 2 + 对重组酶具有激活作用，其中6m m o l lc a 2 + 浓度激活作用最为明显，而 m 矿+ 、z n 2 + 、c u 2 + 能强烈抑制酶活。利用h p l c e s i m s 对重组酶酶解产物进行测定发 现，酶解产物含有不饱和二聚半乳糖醛酸和不饱和三聚半乳糖醛酸。将重组质粒 p h y - p q - p e l b 导入地衣芽孢杆菌c i c i mb 1 6 9 9 ，获得重组菌后进行发酵实验，发酵液中 果胶裂解酶酶活达到4 2u m l ，与原始菌株相比产酶水平提高了6 0 。 对地衣芽孢杆菌1 4 5 8 0 基因组序列分析显示基因组中有两个基因a m y ) ( 和y v d f ，其 编码的蛋白均具有典型的普鲁兰酶保守区，而有关其基因功能的研究均未见实验研究报 道。以地衣芽孢杆菌c i c i mb 1 6 9 9 染色体d n a 为模板通过p c r 方法扩增获得a m y x 和 y v d f 编码区，分别构建了表达载体p h y - p 4 3 a m y x 和p h y - p 4 3 - y v d f 。含重组质粒 p h y - p 4 3 a m y ) ( 的重组枯草芽孢杆菌1 a 7 1 7 细胞内酶活有明显提高，但细胞外没有检测 到明显酶活，该基因可能编码胞内普鲁兰酶。重组枯草芽孢杆菌1 a 7 1 7 ( p h y - p 4 3 - y v d f ) 表达出有活性的胞外普鲁兰酶，发酵液中酶活力达到4 6u m l ，对其重组酶水解性质分 析显示该酶可能为i 型普鲁兰水解酶。重组酶酶学性质分析显示该两种重组酶的最适反 应温度都为4 5 ，最适p h 为6 5 ，其中重组酶a m y x 在3 0 8 0 热稳定性较好，而重组 酶y v d f 在5 5 以上时迅速失活。重组酶反应不需要金属离子的参与，但是很多离子如 m g z 十、m n 2 + 、l i + 、n a + 对酶活性有不同程度的促进作用；z n 2 + 、c f + 、c 0 2 + 、e d t a 、 s d s 对该酶有不同程度的抑制作用。将重组质粒p h y - p 4 3 - y v d f 导入地衣芽孢杆菌c i c i m b 1 6 9 9 ，测得重组菌的发酵上清液酶活力约为6 8u m l ，较原始对照菌株丑l i c h e n i f o r m i s c i c i mb 1 6 9 9 酶活力水平高出2 倍。 关键词：地衣芽孢杆菌果胶酶普鲁兰酶酶学性质克隆表达 a b s t r a c t a b s t r a c t b 1 i c h e n i f o r m l sw a st h o u g h ta ni n d u s t r i a lo r g a n i s mw h i c hh a ss u c hg o o dc h a r a c t e r sa s a n t i h e a t , n o n p a t l l o g e n i c ，a b u n d a n te n z y m es y s t e m t h eg e n o m es e q u e n c eo fbl i c h e n i f o r m i s w a sp u b l i s h e di n2 0 0 4 ，w h i c hp r o v i d e da ni m p o r t a n tm a t e r i a lt ot h ed e v e l o p m e n to fi t s p o t e n t i a la p p l i c a t i o n s i nt h i sp a p e r c l o n i n ga n de x p r e s s i o no ft h eg e n ep e l b ，a m y xa n dy v d f i i ld i f f e r e n th o l s t sw e r ei n v e s t i g a t e da n de c o m b i n a n te n z y m e sw e r ec h a r a c t e r i z e d r e s p e c t i v e l y a c o m p l e t es t r u c t u r eg e n e p e l bw h i c hp r o b a b l ye n c o d e dp e c t i n a s ew a sc l o n e df r o mb 玩惋观彻铆括c i c i mb 16 9 9b yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d s p l a - p q - p e l ba n dp h y - p q - p e l bw e r ec o n s t r u c t e dw i t hp e l bu n d e rt h ec o n t r o lo fp qp r o m o t e r t h ep e c t i n a s ew a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l ij m10 9v i at h em e d i a t i o no f p l a s m i dp l a - p q - p e l b n eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r eo fr e c o m b i n a n tp e c t i n a s ew e r ep h l0 5a n d4 5 。c 1 1 1 ea c t i v i t yo fe n z y m ew a se n h a n c e db yc a 十a n ds t r o n g l yi n h i b i t e db yi o n s o fm e 2 + ，z n 2 + a n dc u 2 十u n d e rt h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fc a 2 + t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o n w a s6m m o l l 1 1 1 ep r o d u c t sf r o mp o l y g a l a c t u r o n i ca c i dd e g r a d e db ye n z y m ew e r ea n a l y z e d b ye l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ( e s i m s ) u n s a t u r a t e db i g a l a c t u r o n i ca c i da n d u n s a t u r a t e dt r i g a l a c t u r o n i ca c i dw e r ef o u n d al i c h e n i f o r m i sc i c i m816 9 9c a r r y i n g p h y - p q - p e l bp r o d u c e d4 2u m lp e c t i n a s e ，w h i c hw a sa b o u t6 0 h i g h e rt h a nt h a to fp a r e n t s t r a i n a n a l y s i so ft h ec o m p l e t eg e n o m es e q u e n c eo fb 1 i c h e n i f o r m i s14 5 8 0r e v e a l e dt h a tt h e r e w e r et w og e n e sa m y ) ( a n dy v d f , w h i c hp r o b a b l ye n c o d e dp u l l u l a n a s e t h er e c o m b i n a n t p l a s m i d so fp h y - p 4 3 - a m y ) ( a n dp h y - p 4 3 - y v d fw e r ec o n s t r u c t e da n de x p r e s s e di nb a c i l l u s s u b t i l i s1a 717 n ea m y xa si n t r a c e l l u l a re n z y m ew e r ed e t e c t e da n dt h ey v d fs h o w e dt h e e n z y m ea c t i v i t yo f4 6u m li n 丑s u b t i l i s1a 717 1 1 1 eh y d r o l y t i cc h a r a c t e r so fy v d fw e r e o b s e r v e dt h a tt h er e c o m b i n a n tb e l o n g e dt o t y p e i p u l l u l a nh y d r o l a s e s t h ee n z y m a t i c p r o p e r t i e so ft h er e c o m b i n a n te n z y m e sw e r ea n a l y z e ds y s t e m i c a l l yi nt h es t u d y p u l l u l a n h y d r o l y s i sa c t i v i t yw a so p t i m a la tp h6 5a n d4 5 m e t a li o n sw e r en e e d l e s si nt h e e n z y m a t i cr e a c t i o n , h o w e v e lt h ep u l l u l a n a s ea c t i v i t yw a si m p r o v e dm o r eo rl e s sb yt h e a d d i t i o no f s o m ei o i l ss u c ha sm g 十、m n 2 十、l i 十a n dn a 十a n dw a si n h i b i t e db yt h ea d d i t i o no f z n z + 、c u z 十、c 0 2 十、e d t aa n ds d s t h er e c o m b i n a n t 丑l i c h e n i f o r m i sc i c i mb16 9 9w i t h p h y - p 4 3 - y v d fp r o d u c e d6 8u m l ，w h i c hw a s2 - f o l dh i g h e rt h a nt h a to f t h ec o n t r o ls t r a i n k e y w o r d s ：b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sp e c t i n a s ep u l l u l a n a s ec h a r a c t e r i z a t i o nc l o n i n g a n de x p r e s s i o n i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：7 么露霉盈丝l 日期：二心禾旦l 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留，使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：z 淞 导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 地衣芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 属于厚壁菌门( f i r m i c u t e s ) 的芽孢杆菌属 ( b a c i l l u s ) ，是一种革兰氏阳性的腐生性微生物，广泛分布于土壤和其它自然环境中。具 有耐热，酶系丰富，产酶量高，安全等诸多优良特性，是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌 种之一。与枯草芽孢杆菌相比，地衣芽孢杆菌生长温度高，不仅能节省生产能源，而且 也使某些酶对结合在胞壁上的蛋白酶敏感性降低；其次，其生长速率慢，容易使刚跨膜 的未合适折叠的蛋白充分折叠。地衣芽孢杆菌是目前高温淀粉酶和蛋白酶的主要生产菌 株，能够在生产规模上分泌2 0m g m l 的蛋白质，其广泛用于大规模工业生产酶、抗生 素、生化用品和其他消费产品等。近年来，国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道 也日益增多，在植物病害防治、饲料加工、医药开发、环境污染治理等方面，都取得了 较好的研究成果1 1 】。 把分子生物学技术应用于地衣芽孢杆菌的研究，也将成为热点。目前对于地衣芽孢 杆菌基因组的认识还比较有限，其基因的克隆也很少。据文献报道，所克隆的基因主要 是一些酶基因，如张江等【2 】从地衣芽孢杆菌中克隆了植酸酶基因并在大肠杆菌中进行了 表达，牛丹丹等【3 】克隆了a 淀粉酶基因，唐雪明等【4 1 克隆了碱性蛋白酶基因，刘永生f 5 l 等克隆了纤维素酶基因，马骏双等t 6 j y 礁y p 甘露聚糖酶基因等，但其大部分基因的功 能还不清楚。随着生物信息学的发展，大规模测序已成为揭示细胞基因表达谱、发现新 型分子的有效手段。鉴于地衣芽孢杆菌的生物技术重要性，m i c h a e l 等i _ 7 】于2 0 0 4 年对地 衣芽孢杆菌a t c c l 4 5 8 0 全基因组序列完成了解析，为其基因功能的研究提供了大量的 基因组信息。因此，对地衣芽孢杆菌基因组中未知功能基因鉴定的研究有着极其重要的 意义。 另外，地衣芽孢杆菌对于工业生产异源蛋白也非常重要。作为高表达外源基因的宿 主细胞，地衣芽孢杆菌提供了外源基因高效稳定的细胞微环境，表达产物较稳定，适合 大规模工业化生产目的，且在酶产量方面，其比枯草芽孢杆菌更具优势，有成为生产工 业用酶宿主菌的巨大潜力。 1 2 果胶酶 1 2 1 果胶酶的分类 果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以a 1 4 糖苷键聚合而成的多糖链，常带有 鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或 全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起。同其它植物多糖一样，果胶也 是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的，也具有一定的相对分子质量分 布【8 1 。果胶结构简图如1 1 所示： 江南大学硕士学位论文 l i - ”7 0 x 口i4 1h “jn l n o -、 一 。一、t - 一n - 囤1 - i 果腔结构简圈 f i g1 - 1s t r u c t u r e o f p e c t i n 果胶酶分为”】：原果胶酶( p r o t o p e c t i n a s e s ) 、果胶酯酶( p e c t i n e s t e r a s e ，p e ) 和果胶解聚 酶( d e p o l y m e f i z i n ge n z y m e ) 。其中果胶解聚酶又分为果胶水解酶( p e c t i n h y d r o l a s e s ) 和果胶 裂解酶( p e c t i nl y a s e s ，p l ) 。原果胶酶根据其作用机理分为两种类型：a 型原果胶酶与b 型原果胶酶。前者主要作用于原果胶的内部的多聚半乳糖醛酸区域。而后者主要作用于 外部的连接聚半乳糖醛酸链和细胞壁组分的多糖链。果胶酯酶是一种羧酸酯酶，属于水 解酶类。它的作用是催化果胶分子水解生成多聚半乳糖醛酸和甲醇。果胶水解酶又称为 多聚半乳糖醛酸酶( p o l y g 出a c t u r o n a s e s ，p g ) ，是在有水环境下促进聚半乳糖醛酸链水解的 一种果胶酶，应用最为广泛。根据水解作用机理不同，它可以分为内切聚半乳糖醛酸酶 和外切聚半乳糖醛酸酶。外切酶又可阻划分两种类型：一种是真菌外切聚半乳糖醛酸酶， 它的终产物是单体半乳糖醛酸；另一种是细菌外切聚半乳糖醛酸酶，它的终产物是二聚 体的半乳糖醛酸。果胶裂解酶又称碱性果胶酶，是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的 一种果胶酶，裂解酶在c 一4 位置上断丌糖苷键，同时从c 5 处消去一个h 原子从而产生 一个不饱和产物，其作用模型如图l 一2 。 队【i 、n dm i 。n f j i j mr o n p 图l o 果胶裂解醇作用机理 f i g1 - 2m e c h a n i s mo f t h ep e c t i nl v a s e 1 2 2 果胶酶的应用 目前，在大部分的原果汁、浓缩果汁的生产过程中，都在使用果胶酶。由于各种水 果中果胶的含量差别较大，而且果胶质的成分也略有差异，因此要根据不同品种、不 同加工目的来确定果胶酶的酶组成。由于p g 的专一性对果胶的酯化度要求不如p l 高， 在澄清果汁方面往往注重以p o 为主的酶组成，而在提高浸出汁，特别是自流汁方面往 往注重使用以p l 为主的酶制剂_ 】。 饲料中一般含有较多的阿拉伯木聚糖、b 葡聚糖、a 半乳糖苷、果胶、纤维素等非 淀粉多糖。因单胃动物不能分解非淀粉多糖，在非淀粉多糖结合大量的水后使采食动 物消化道中的食糜体积增大，黏度增加，并形成凝胶，从而干扰消化酶的功能，影响食 一 第苹绪论 糜在小肠中的滞留，引起微生物异常繁殖，造成动物代谢功能受到抑制，生长受阻，饲 料的转化率降低。在饲料中加入果胶酶添加剂，与纤维素酶、半纤维素酶一起破解植物 饲料细胞壁，使细胞中的营养物质释放出来，能明显提高饲料利用率，因而越来越受到 全球范围内饲料行业的高度重视1 1 0 】。 在棉纺织工业应用碱性果胶酶处理，代替碱对棉、麻等织物进行煮练加工和整理工 艺，以去除初生胞壁中的果胶物质，在比较缓和的p h 值和温度条件下使处理后的织物 手感柔软，强度高，取代了耗能大、污染严重的传统热碱脱胶工艺。另外，可避免因微 生物处理造成的纤维素的降解【1 1 】。 造纸工业中的生物制浆与纺织品的生物脱胶类似，都是通过果胶酶等酶处理降解植 物纤维原料中的果胶、半纤维素及木质素，使其分散成满足造纸工业不同要求的束纤维 或单纤维，以生产柔软、均一、有弹性的高品质材料。由于纸浆中高分子果胶带负电荷， 经酶降解至六糖以下即可将其除去，避免了成品纸的静电现象【l2 1 。 1 2 3 果胶酶的研究进展 果胶酶可以由多种细菌和一些致病性的真菌产生。如棘孢曲霉( a s p e r g i l l u s a c u l e a t u s ) ，黄曲霉( a s p e r g i l l u s f l a v u s ) ，米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) ，寄生曲霉( a s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u s ) ，塔宾曲霉( a s p e r g i l l u st u b i n g e n s i s ) ，伊文氏杆菌( e r w i n i ac a r o t o v o r a ) ，苜蓿 根腐病菌( f u s a r i u ms o l a n o ，短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u sb k ) ，嗜碱芽孢杆菌( b a c i l l u s a l c a l o p h i l l u sn t t 3 3 ) ，菊欧文氏菌( e r w i n i ac h r y s a n t h e m i ) ，炭疽病菌( c o l l e t o t r i c h u m l i n d e m u t h i o n u m ) ，多形拟杆菌( b a c t e r o i d e st h e t a i o t a o m i c r o n ) 等【1 3 。1 7 1 菌株中可以分离到此 种酶。近年来，果胶酶分子生物学研究取得了重大进展，已从许多种属微生物中克隆了 果胶酶基因，对果胶酶基因的结构、功能、调控等方面进行了深入探讨。已被克隆的果 胶酶基因如表1 - 1 ： 表1 1 已被克隆果胶酶基因 t a b 1 - 1m i c r o o r g a n i s m sf o rc l o n i n gt h eg e n ef o rp e c t i n a s e 江南大学硕十￥位论义 克隆的果胶酶基因以多聚半乳糖醛酸酶基园和果胶裂解酶基因为主。果胶酶d u 体一 般都含有n 端信号区和糖基化位点，n 端信号区一般山1 6 2 7 个氨基酸组成”“。果胶酶 多为糖蛋白，低聚糖以糖苷键的形式与酶蛋白的n 端结台。g a i n v o r s 等p 4 1 研究发现， s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 的基困p g l i 1 编码的聚半乳糖醛酸酶有两个糖结台位点，并 且经d _ n 一乙酰葡糖胺精苷酶h 作用于该酶蛋白后，酶分子量由4 2k d 减小到3 7k d 。 n e u r o s p o r ac g a s s a e x o 一1 突变株”1 分泌的三种果胶酶都为糖蛋白，台糖量为1 85 3 9 。 1 _ 3 普鲁兰酶 1 3 1 普鲁兰酶的分类 淀粉质原料是迄今应用最为广泛的工业原料，淀粉是由直链淀粉和支链淀粉构成的 混合物，其中直链淀粉只有葡萄糖通过叶i ，4 - 糖苷键连接形成，而支链淀粉还含有分支 链，连接分支处的是洳1 6 糖苷键。能够分解淀粉中a - l ，6 葡萄糖苷键的酶，通称为 解支酶( 淀粉脱支酶，d e b r a n c h i n ge n z y m e ) ，如寡i ，6 - 葡萄糖苷酶、普鲁兰酶、异淀粉酶、 支链淀粉一6 - 葡聚糖水解酶以及植物来源的“r - 酶”( 植物支链淀粉脱支酶) 等阢“ 。解支 酶束源不同，性质上也会有较大差别。其中普鲁兰酶是一种能够专一性切开支链淀粉 分支点中的1 - 6 一糖苷键，从而剪下整个侧支，形成直链淀粉的解支酶。它可以将最小 单位的支链分解，虽大限度地利用淀粉原料，因此是一种工业上有重要应用价值和需求 量火的酶类1 3 9 1 。 国外学者肘细菌来源的普鲁兰酶进一步的深入研究发现其包括i 型普鲁兰酶、i i 型 普鲁兰酶、i 型普鲁兰降解酶( 额普鲁兰酶) 、1 1 型普鲁兰降解酶( 异普鲁兰酶) 、i i i 型普 鲁兰降解酶几大类【州。普鲁兰酶相互之间结构上具有相当的保守性，几乎所有的普鲁兰 酶其结构上都含有朋个高度保守的区域。但是几类酶之间的水解特性有所不同，具体作 用机制见图i 3 ： 。脸：弋 o 一 、一 = = r 。一“ ：1 一，f r 盖曩： 图1 3 普鲁兰酶作用支链淀粉厦普鲁兰糖机制 f i g1 - 3 a c t i o np a t t e r no f p u l l u l a n a s e o np u l i u l a na n da m y l o p e c l i n 第一苹绪论 1 3 2 普鲁兰酶的应用1 3 6 , 4 0 , 4 1 j 由于普鲁兰酶能够专一地切开支链淀粉的甜1 ，6 糖苷键，剪下侧支，形成直链淀粉， 所以该酶可以单独使用于直链淀粉的生产。直链淀粉具有容易形成结构稳定的凝胶的特 性，所以可作为食品包装薄膜。直链淀粉还适合于淀粉软糖的制造，用作果酱增稠剂等。 豆类的直链淀粉含量较高，因此绿豆制成的粉丝相对韧性较好，而利用普鲁兰酶处理后 的谷物淀粉制成粉丝，可以提高粉丝的质量。 另外普鲁兰酶与其他淀粉酶配合使用在生产上也有应用的例子，如饴糖的制造。目 前饴糖的生产过程包括液化和糖化两个过程。液化过程使用细菌的a 淀粉酶，然后利用 d 淀粉酶进行糖化过程。但是d 淀粉酶对于支链的水解到达分支点附近时就中止。当同 时加入普鲁兰酶时就可以水解分支点的叶1 ，6 糖苷键，从而提高淀粉的水解度，降低糊 精的含量，提高麦芽糖的产率。 普鲁兰酶可作为啤酒酿造过程的外加酶制剂用于啤酒外加酶糖化过程。啤酒生产过 程中麦芽中的酶是仅淀粉酶、d 淀粉酶以及r 酶。d 淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用， 可使淀粉分解成麦芽糖( 也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖) 和低分子糊精，使麦 芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化， 即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进 行糖化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加0 【淀粉酶和分解q 1 ，6 糖苷键的 普鲁兰酶制剂等。单独使用o 淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三糖是很不完全的。又若分解 淀粉a 1 ，6 糖苷健的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制 成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解a 1 ，4 和a 1 ，6 糖苷键的糖化型淀粉酶其反应 产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与0 【淀粉酶协同，效果良好，其分解产 物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。 普鲁兰酶在酒精工业中应用可以提高淀粉出酒率。我国目前以淀粉为原料生产酒 精，大多以甘薯为原料，其主要成分是由2 0 的直链淀粉和8 0 的支链淀粉组成，因此 在酒精发酵的过程中添加普鲁兰酶，可以大大提高淀粉利用率，出酒率也相应提高。 1 3 3 普鲁兰酶的研究进展 1 9 6 1 年，b e n d e r 等【4 2 l 通过产气气杆菌( 典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 发酵获得普鲁兰酶；1 9 7 5 年，日本的y o s h i y u k i 等【4 3 】发现蜡状芽苞杆菌覃状 变种( b a c i l l u sc e r e u sv a r m y c o i d e s ) 可同时产生两种淀粉酶：b 淀粉酶和普鲁兰酶；1 9 8 3 年，丹麦n o v o n o r d i s k f “l 公司获得嗜酸性分解普鲁兰多糖芽孢杆菌( b a c i l l u s a c i d o p u l l u l y t l c u s ) ，经过投入巨资开发研究，并在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品 名为p r o m o z y m e1 9 8 6 年，日本的y o s h i y u k i 等1 4 5 】报道了一株能产生耐热、耐酸普鲁兰 酶的枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，被命名为b a c i l l u ss u b t i l i sr r u 。此菌种所产生的为 普鲁兰酶和淀粉酶的混合酶，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽糖，水解普鲁兰糖为麦芽三 糖；1 9 8 7 年，德国的m a d i 和a n t r a n i k i a n 等【4 6 】报道了一株能同时产仅淀粉酶、普鲁兰酶 和葡萄糖淀粉酶的菌种：耐热产硫梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ) 。其实，产普鲁 5 江南大学硕士学位论文 兰酶的菌种还有很多，像中间埃希氏杆菌( e s c h e r i c h i ai n t e r m e d i a ) ，缓和链球菌 ( s t r e p t o c o c c u sm i t i s ) 以及链霉菌( s t r e p t o m y c e s 踱) 等【4 7 4 9 1 。 近年来人们开始从不同来源的基质中筛选产普鲁兰酶的菌株，筛选到了各种类型的 菌株，特别是耐热酶的筛选越来越受到人们的关注。如嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) ，热硫梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ) ，热纤梭菌( c l o s t r i d i u m t h e r m o c e l l u m ) ，黏性硫球菌( d e s u l f u r o c o c c u sm u c o s u s ) ，激烈火球菌( p y r o c o c c u s f u r i o s u s ) ， 伍斯氏火球菌( p y r o c o c c u sw o e s e i ) ，厌氧杆菌属( t h e r m o a n a e r o b a c t e rs p ) ，热球菌属 ( t h e r m o c o c c u s 够) 等等【跏5 2 】。但是这些嗜热菌的最适温度达到1 0 0 ( 2 ，对于发酵工艺非 常困难，而且大多数酶是胞内酶，不分泌到细胞外。所以直接采用这些菌株生产普鲁兰 酶的工业化困难很大。 随着重组基因技术的发展，深入基因工程手段就越来越受到人们的关注。目前已经 用于克隆和表达普鲁兰酶基因的微生物见表1 2 ： 表1 2 用于克隆和表达普鲁兰酶基因的微生物 t a b 1 - 2m i c r o o r g a n i s m sf o rc l o n i n ga n de x p r e s s i n gt h eg e n ef o rp u l l u l a n a s e 1 4 本课题的立题意义及研究内容 经过国内外科研人员的不懈努力及发酵工业的不断发展，酶制剂的原料来源已几乎 全为微生物所取代，其特点是种类多、繁殖快、质量稳定、成本低。然而，传统发酵生 产酶制剂存在以下问题：1 、原始宿主蛋白分泌量少；2 、生产菌株难培养或发酵周期长； 3 、有的生产菌株不是安全生产菌。故无法用于大规模工业酶制剂生产和食品工业领域。 国内外依靠基因工程手段改造原始菌株，使菌株改变生物代谢途径，阻断副产物或有毒 产物形成，促进目的产物积累。同时，通过增加目的基因的拷贝数、在目的基因上游连 入强启动子等手段提高目的蛋白的分泌表达。从而解决了上述问题【3 6 1 。目前，基因工程 菌已经代替了原始菌，成为酶制剂生产的新来源。生物技术已成为以基因工程技术为核 心的新兴学科和产业。 6 第一章绪论 另外，随着计算机技术生物信息学的发展，大规模测序已成为揭示细胞基因表达谱、 发现新型分子的有效手段。鉴于地衣芽孢杆菌的生物技术重要性，m i c h a e l 等【| 7 j 于2 0 0 4 年对其全基因组序列完成了解析，为其基因功能的研究提供了大量的基因组信息。地衣 芽孢杆菌1 4 5 8 0 基因组由4 2 2 2 7 4 8 碱基对的单链染色体组成，其含有4 2 8 6 个开放阅读 框，7 2 个t r n a 基因，7 个r r n a 操纵子，并且其编码2 0 个推测转移酶。该基因组与 枯草芽孢杆菌有极具相同之处，有功能性的插入区域，其能够在序列及功能水平上得以 识别。 然而，目前国内外对于地衣芽孢杆菌蛋白基因表达的研究报道却很少，其大部分蛋 白基因均未被实验研究，我们将以工业酶制剂生产菌株地衣芽孢杆菌c i c i mb 1 6 9 9 为 出发菌株，结合地衣芽孢杆菌1 4 5 8 0 的全基因组序列，分析其部分功能蛋白基因序列， 力图为我国工业酶制剂的基因工程研究进行有益的探索并打下一定的基础。因此本课题 拟在下面三个方面研究： ( 1 ) 地衣芽孢杆菌班馏基因的克隆鉴定与表达 ( 2 ) 地衣芽孢杆菌a m y x 基因的鉴定及其在枯草芽孢杆菌中的表达 ( 3 ) 地衣芽孢杆菌y v d f 基因在芽孢杆菌中的分泌表达 7 江南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌株和质粒 地衣芽孢杆菌僻l i c h e n i f o r m l v ) c i c i mb 1 6 9 9 ，大肠杆菌幔c o l i ) j m l 0 9 ，枯草芽孢 杆菌( 丑s u b t i l i s ) w b 6 0 0 和枯草芽孢( 丑s u b t i l i s ) 1 a 7 1 7 均由江南大学中国高校工业微生 物资源与信息中一l , ( h t t p ：c i c i m c u j i a n g n a n e d u e n ) 保藏。质粒p l a k r ，p m d p q 为本研究 室前期研究获得，其中p m d p q 含有人工合成启动子p q ，可以引导外源基因在大肠杆 菌或在芽孢杆菌中表达。质粒p h y 3 0 0 p l k 和p h y - p 4 3 为本研究室保藏，克隆载体 p m d 19 ts i m p l e 购自t a k a r a ( 大连) 公司。 2 1 2 工具酶和试剂 实验用d n a 限制性内切酶e c o r i 、b a m h i 、b g l l i 、s m a i 、n c o i 及t 4d n a 连接酶； 核酸分子量标准、蛋白分子量标准均为( 大连) 宝生物公司产品。 跏d n a 聚合酶、卡那霉素、氨苄青霉素、四环素购于上海生工生物工程公司。 p c r 产物( 小量) 纯化试剂盒、胶回收试剂盒均为q i a g e n 产品。 测序用试剂盒为美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司的b i g d y et e r m i n a t o rv 3 1 试剂盒。 胰蛋白胨和酵母浸提物均为o x o i d 产品。 丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺为f l u k a 公司产品。 底物果胶、聚半乳糖醛酸、普鲁兰多糖购自s i g m a 公司；s d s ( 十二烷基磺酸钠) 、 可溶性淀粉、环状糊精、葡萄糖、麦芽糖、考马斯亮蓝r 2 5 0 、还原型谷胱甘肽、氧化 型谷胱甘肽、脲、盐酸胍等其余试剂均为进口或国产分析纯。 2 1 3 常用溶液及试剂的配制 ( 1 ) 染色体、质粒提取常用试剂 r n a s e 溶液：r n a s e5m g ，于lm l 生理盐水中充分溶解，沸水浴1 0m i n ，缓慢冷 却后分装，2 0 保藏。 溶液i ：5 0m m o l l 葡萄糖，2 5m m o l lt r i s - h c i ( p h8 o ) ，1 0m m o l le d t a 。 溶液i i ：0 2m o l l n a o h ，l s d s 。 溶液：5m o l l 乙酸钾6 0m l ，冰乙酸1 1 5m l ，水2 8 5m l ，混匀。 c t a b n a c i 溶液：1 0 c t a b 一0 7m o l ln a c i 。 t e 溶液：2m m o l lt r i s h c l ，lm m o l le d t a ，p h8 0 。 p e g 溶液：2 5 p e g8 0 0 0 ，5 0m m o l l i r i s h c l ( p h8 0 ) ，5 0m m o l lc a c l 2 。 ( 2 ) s d s p a g e 电泳常用溶液 丙烯酰胺储备液：丙烯酰胺( 分析纯) 2 9 2g ，甲叉双丙烯酰胺0 8g ，溶于6 0m l 去 离子水中，然后定容至1 0 0m l ，用0 4 5l a i n 滤器过滤除菌，置棕色瓶中保存于4 c 备用。 8 第二章材料与方法 1 5m o l l 分离胶缓冲液( p h8 8 ) - 1 8 1 5gt r i s ( 分析纯) ，用lm o l lh c i 调节p h 至 8 8 ，加水定容至1 0 0m l ，4 c 存放。 0 5m o l l 浓缩胶缓冲液( p h6 8 ) ：6g i r i s ，用1m o l lh c i 调节p h 至6 8 ，加水定 容至1 0 0m l ，4 。c 存放。 5 x t r i s 甘氨酸电泳缓冲液：在9 0 0m l 去离子水中溶解1 5 1gt r i s 碱和9 4g 甘氨酸 ( p h8 3 ) ，然后加入5 0m l1 0 ( w v ) 的电泳级s d s 储存液，用去离子水补至ll 。 1 0 s d s 溶液：将1 0gs d s 溶于水中，定容至1 0 0m l ，室温存放。 1 0 过硫酸铵：将o 1g 过硫酸铵溶于水中，定容至lm l ，4 。c 存放。 5 样品缓冲液：0 6m l1m o l l i r i s h c l 缓冲液( p h6 8 ) ，5m l5 0 ( v ) 甘油，2m l 1 0 s d s ，0 5m l1 3 - 巯基乙醇，lm l1 ( w v ) 溴酚蓝，0 9m l 蒸馏水，4 存放。 1 2 分离胶的配制：蒸馏水3 5m l ，3 0 丙烯酰胺储备液4m l ，分离胶缓冲液2 5 m l ，1 0 s d s0 1m l ，1 0 过硫酸铵0 0 4m l ，t e m e d0 0 0 4m l 。 5 浓缩胶的配制：蒸馏水2 3m l ，3 0 丙烯酰胺储备液0 6 7m l ，浓缩胶缓冲液1 0 m l ，1 0 s d s0 0 4m l ，1 0 过硫酸铵0 0 3m l ，t e m e d0 0 0 5m l 。 s d s p a g e 蛋白染色液：考马斯亮蓝r - 2 5 01g ，甲醇4 5 0m l ，冰醋酸1 0 0m l ，蒸 馏水4 5 0 m l 。 s d s p a g e 蛋白脱色液：甲醇1 0 0m l ，冰乙酸1 0 0m l ，加超纯水至1 0 0 0m l 。 2 1 4 培养基和培养条件 ( 1 ) 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的培养用培养基 l b 液体培养基：胰蛋白胨1 、酵母浸提物0 5 、n a c l1 。添加1 5 琼脂粉为 l b 固体培养基。需要时a n z 2 0i _ t g m l 卡那霉素用于重组大肠杆菌的筛选，添加3 0i _ t g m l 或5r t g m l 四环素分别用于重组枯草芽孢杆菌或重组地衣芽孢杆菌的筛选。 ( 2 ) 枯草芽孢杆菌转化用培养基 1x s p i 盐溶液：( n h 4 ) 2 s 0 40 2 、k 2 h p 0 4 3 h 2 01 4 、k h 2 p 0 40 6 、二水合柠檬 酸钠0 1 、m g s 0 4 7 h 2 00 0 2 。 1 0 x c a y e 溶液：酪蛋白水解物o 2 、酵母浸提物1 加超纯水至终体积1 0 0m l 。 s p i 培养基：l x s p i 盐溶液1 0m l 、1 0 x c a y e 溶液1 0m l 、葡萄糖0 5g 加超纯水至 终体积1 0 0 m l 。 s p i i 培养基：s p i 培养基1 0m l 、5 0m m o l lc a c i r 2 h 2 00 1m l 、2 5 0m m o l l m g c l 2 6 h 2 00 1m l 。 1 0 0 x e g t a ( 乙二醇双四乙酸) 溶液：1 0m m o l le g t a 溶液溶解时以n a o h 调p h 8 u 。 ( 3 ) 地衣芽孢杆菌转化用培养基 生长培养基：胰蛋白胨l og 、 至终体积1 0 0 0m l 。 复苏培养基：胰蛋白胨1 0g 、 至终体积1 0 0 0m l 。 酵母浸提物5