（发酵工程专业论文）提高重组ecoli产胆固醇氧化酶水平的研究.pdf

摘要 摘要 胆固醇氧化酶( e c l 1 3 6c o d ) 在食品加工、医疗检测、生物抗虫等方面的作用 日益受到人们的重视，并且显示出巨大的应用潜力。本文主要研究产c o d 重组e c o l i 的发酵优化，目的提高产酶水平。 在摇瓶中优化了重组e c o l ij m l 0 9 的发酵培养基、诱导条件以及环境条件。结果表 明，起始甘油浓度1 0 m l l ；起始胰蛋白胨和酵母粉浓度分别为1 0 9 l 和5 9 l ；并在早 期添加0 3 m m o l l 的i p t g 诱导6 h ；以摇床转速1 8 0 r m i n 、装液量1 5 、起始p h 7 5 、 培养温度3 7 以及5 的接种量为培养条件；使得摇瓶中产酶水平达到1 6 8 6 5 7 u l 。为 优化前7 0 0 u l 的2 4 倍。 研究不同的底物流加方式，实现重组e c o l i 的高密度培养。研究发现恒p h s t a t 法 虽然可以获得较高的菌体干重4 2 6 8 9 l ( d c w ) ，但是其发酵周期长( 3 6 h ) ，不利于生 产强度的提高；分段指数流加策略，实现了短时间内菌体的高密度培养，d c w 在第1 4 h 达到4 0 1 3 9 l 。对高密度培养中诱导时机的优化中发现，均在发酵中期诱导效果佳，使 得菌体产酶水平达到6 4 3 6 5 6 u l ，生产强度达到4 5 9 7 5 u ( l h ) ，实现了重组e c o l i 产 c o d 的高效表达和高效生产的统一。为优化前7 0 0 u l 的9 2 倍。 研究以廉价无毒的乳糖代替昂贵有毒的i p t g ，诱导重组e c o l i 表达c o d 的实验中 发现，乳糖一方面可以作为碳源供菌体生长，另一方面又可以诱导外源基因的表达。研 究中还发现在添加乳糖诱导时，菌体对乳糖有个大约1 0 h 适应期。以复合流加碳源基质 ( 甘油和乳糖) ，诱导重组e c o l i 表达c o d 的研究中发现该方法并没有消除菌体对乳糖 的适应期，但是采用恒p h s t a t 法的流加策略，克服了因适应期的长期饥饿而产生的负 面影响，使得产酶水平达到6 0 0 5 6 6 u l ，为i p t g 诱导的9 3 3 ，生产强度为 2 0 0 19 u ( l h ) ，为i p t g 诱导的4 7 4 。 关键词：胆固醇氧化酶，重组e c o l ij m l 0 9 ，高密度培养，乳糖诱导 a b s t m e t a b s t r a c t t h es i g n i f i c a n tf u n c t i o n so fc h o l e s t e r o lo x i d a s e ( e c1 1 3 6 ，c o d ) i nf o o dp r o c e s s i n g ， m e d i c a l a s s a y a n db i o l o g i c a l p e s t r e s i s t a n c e w e r er e c o g n i z e dg r a d u a l l ya n ds h o w e d p o t e n t i a l l yu s e n l i sr e s e a r c hi sm a i n l yf o c u s e do no p t i m i z i n gf e r m e n t a t i o no fr e c o m b i n a n t ec o l it oi m p r o v et h el e v e lo fe n z y m ep r o d u c t i o n t h ep r o d u c f i o no fc h o l e s t e r o lo x i d a s ew a ss t u d i e du s i n gr e c o m b i n a n tec o l ij ml0 9 o p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m ，i n d u c i n gc o n d i t i o n sa n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s o p t i m i z a t i o no f c u l t u r em e d i u mi sg l y c e r o l1 0 9 l ，t r y p t o n e1 0 e g l ，y e a s tp o w e r5 e d l ，a n dt h e b e s ti n d u c t i o nt i m ei si n t e r m e d i a t ec e l ld e n s i t y o p t i m i z a t i o no fi p t gc o n c e n t r a t i o ni s 0 3 m m o l la n dt h ei n d u c i n gt i m ei s6 h t h ee n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n si si n c o l a t i o ns i z e 5 ( v n ) ，i n t i a lp h7 5c u l t u r e da t3 7 o nr o t a r ys h a k e ra t1 8 0 r m i na n dt h es u i t a b l e v o l u m eo fm e d i u mw a s10 0m li n5 0 0m lf l a s k u n d e rt h eo p t i m i z e dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s t h ee n z y m ea c t i v i t yr e a c h e d16 8 6 5 7 u l w h i c hi s2 4t i m e so f7 0 0 u lb e f o r eo p t i m i z a t i o n t h r o u g hr e s e a r c ho nd i f f e r e n ts u b s t r a t e s f e d b a t c h r e c o m b i n a n tec o l i sh i g hd e n s i t y c u l t u r ew a sr e a l i z e i ti sf o u n dt h a tt h o u g hp h - s t a tm e t h o dc a l lg e tr e l a t i v e l l yh i g hd r yc e l l w e i g h t4 2 6 8 e g l ( d c w ) ，i t sf e r m e n t a t i o nc y c l ei sl o n g ( 3 6 h ) ，w h i c hi sn o tb e n e f i c i a lf o r p r o d u c t i o ni n t e n s i t y si m p r o v e m e n t e x p o n e n t i a lf e e d i n gs t r a t e g yt h a tt h es p e c i f i cg r o w t hr a t e w a sc o n t r o l l e da td i f f e r e n tt i m e sh a sr e a l i z e ds h o r tt e r mh i g hd e n s i t yc u l t u r e ，w i t hd c w r e a c h i n g4 0 13 9 la tl4 t hh o u r i t sa l s of o u n dt h a ti n d u c i n gr e c o m b i n a n te c o l it oe x p r e s s c h o l e s t e r o lo x i d a s ea ti n t e r m e d i a t ec e l ld e n s i t yi sg o o d a n dt h eh i g h e s tc h o l e s t e r o lo x i d a s e a c t i v i t y ( 6 4 3 6 。3 5u l 。w h i c hi s9 。2t i m e so f 7 0 0u | lb e f o r eo p t i m i z a t i o n ) a n dh i g h e s t c h o l e s t e r o lo x i d a s ep r o d u c t i v i t y ( 4 5 9 7 5u ( l h ) ) w e r ea c h i e v e d t h r o u g ht h ee x p e r i m e n tt h a tc h e a pa n di n n o x i o u sl a c t o s ei n s t e a do fd e a ra n dn o x i o u s i p t gi n d u c er e c o m b i n a n tec o l it oe x p r e s sc o d i tw a sf o u n dt h a t1 a c t o s ec o u l di n d u c e f o r e i g np r o t e i ne x p r e s s i o na n de n h a n c ec e l lg r o w t hd u r i n gt h ei n d u c t i o np e r i o d i t sa l s o f o u n dt h a td u r i n gt h ei n d u c e ro fa d d i n gl a c t o s e ，e c o l ih a sa b o u t10 h sa d a p t i o np e r i o dt o l a c t o s e t h r o u g hr e s e a r c ho nc o m p o u n di n t e r f l o w 谢t l lc a r b o ns u b s t r a t e ( g l y c e r i n ea n dl a c t o s e ) t oi n d u c er e c o m b i n a n tec o l it oe x p r e s sc o d i tw a sf o u n dt h i sm e t h o dd i d n te l i m i n a t e ec o l iia d a p t i o np e r i o dt o1 a c t o s e w h i l ep h s t a tm e t h o d sf e d b a t c ho v e r c o m e dn e g a t i v e e f f e c td u et ol o n gt e r m ss t a r v a t i o no fa d a p t i o np e r i o d i t se n z y m ep r o d u c t i o nr e a c h e d 6 0 0 5 6 6 u l 9 3 3 o fi p t g si n d u c i n g1 e v e l ；c h o l e s t e r o lo x i d a s ep r o d u c t i v i t y2 0 0 19 u ( l h ) ，4 7 4 o f i p t g si n d u c i n gl e v e l k e y w a r d s ：c h o l e s t e r o lo x i d a s e ，r e c o m b i n a n te c o l ij m10 9 ，h i g hd e n s i t yc u l t u r e ， i n d u c i n go fl a c t o s e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：至查邀 日 期： 呈! 颦：墨：丝 ， 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名： 互蛰。越 导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 现代生物技术是当今国际上重要的高技术领域，是生物科学基础知识和工程技术相 结合形成的综合性的技术体系，它包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生化 工程等几个组成主体，这几个技术体系相互依赖、相辅相成。但在这些技术体系中，基 因工程起着主导作用，只有基因工程改造过的生物细胞才能赋予其它技术体系以新的生 命力；发酵工程是生物技术产品产业化的必经之路，只有完成工程菌的发酵优化以及生 物反应器的放大，基因工程发酵产品才能真正的走向市场。现代生物技术的研究和应用 是从医药开始的，生物制药是现代生物技术开发的前沿，是生物技术研究与应用开发中 最活跃、发展最快的一个高新技术产业，具有十分有人的广阔前剽1 2 j 1 1 胆固醇氧化酶的研究背景 胆固醇氧化酶( c h o l e s t e r o lo x i d a s e ，e c1 1 3 6 ) 简称c o d ，是胆固醇降解代谢过程 中的第一个酶，能专一性地催化底物胆固醇生成胆甾一4 一烯一3 一酮。微生物是c o d 最为主要的来源。c o d 广泛应用于临床血清中胆固醇含量的检测，是一种重要的诊断 用酶，近年来发现它在生化制药、食品加工、抗虫基因工程等方面也具有良好的应用价 值。 1 1 1c o d 的来源和分布 动植物来源的c o d 研究较少，而微生物是c o d 最主要的来源。目前的研究主要集 中在微生物来源上。1 9 4 8 年t u r f i t t 首次分离鉴定了一株能分解胆固醇的红平诺卡氏菌 ( n o c a r d i ae r y t h r o p o l i s ) 【3 】。1 9 5 4 年s t a d t m a n 的研究阐明了胆固醇分枝杆菌 ( m y c o b a c t e r i u mc h o l e s t e r o l i c u m ) 氧化分解胆固醇的产物是胆甾4 烯3 酮和h 2 0 2 ，确 定了c o d 在其中的作用，并对c o d 的性质做了初步研究【4 】。1 9 7 3 年u w a j i m a 5 1 首次获 得了胆固醇短杆菌( b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u ma t c c 2 1 3 8 7 ) 的c o d 的结晶，通过光谱 分析检测到c o d 具有黄素蛋白的特征吸收峰，首次发现了c o d 是核黄素腺嘌呤二核苷 酸( f a d ) 依赖型辅酶。随着生化技术的发展，通过分析反应产物，在更多种的微生物 中分离纯化和鉴定了c o d ，这些微生物都能够利用胆固醇作为唯一碳源，主要包括诺 卡氏菌属( n o c a r d i a ) 、链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 、短杆菌属( b r e v i b a c t e r i u m ) 、假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 、裂殖菌属( s c h i z o p h y l l u m ) 、链轮丝菌属( s t r e p t o v e r t i c i l l i u m ) 、红球菌属 ( r h o d o c o c c u s ) 、芽胞杆菌属( b a c i l l u s ) 、棒状杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 等，其中链霉 菌属中产生c o d 的菌种最多。近年来国内外研究较多的是来源于短杆菌属和链霉菌属 的c o d ，它们已被日本的t o y o b o 公司和k y o w a - h a k k o 公司用于工业化生产。 除诺卡氏菌n o c a r d i ar h o d o c h r o u s 产的c o d 以外【6 】，其他微生物来源的c o d 以f a d 作为辅基，接受电子进行氧化磷酸化，提供微生物细胞所需的能量。根据酶与f a d 的 结合方式，可将c o d 分为非共价结合( i 型) 和共价结合( i i 型) 两种形式。链球菌 s t r e p t o m y c e ss p s a c o o 产生的c o d ( s c o ) 和来源于短杆菌b r e v i b a c t e f i u ms t e r o l i c u m 江南大学硕士学位论文 的c o d ( b c 0 1 ) 属于i 型酶；来源于另一株短杆菌b r e v i b a c t e r i u m 的c o d ( b c 0 2 ) 属于i i 型酣7 1 。g a d d a 等人【8 1 对这两种酶的性质进行比较发现，i 型酶和i i 型酶都具备 黄素蛋白氧化酶特性，即具有与亚硫酸盐形成黄素加合物的能力以及光还原形成热动力 学稳定的红半醌阴离子的能力。但i i 型酶产生黄素加合物的速度是i 型酶的5 0 倍，i i 型酶的氧化还原电势中点比i 型酶的高+ 1 0 0 m v ；另外，两类酶中f a d 的氧化型、半醌 型以及全还原型的光谱特性均有差异。 1 1 2c o d 酶活力的测定 常用的测定c o d 酶活力的方法有胆甾酮分析法和过氧化氢分析法。其原理是通过 检测该酶氧化底物胆固醇生成产物胆甾4 烯3 酮和过氧化氢( h 2 0 2 ) 的量，从而计算 出c o d 的酶活力。 反应产物之一胆甾4 烯3 酮由于含有羰基，在波长2 4 0 n m 处有特征吸收峰。通过 测定胆甾4 烯3 酮的生成速率，得出胆固醇消耗的速率，计算得到c o d 的酶活力。但 是该方法要求将生成的胆甾一4 烯3 酮用有机溶剂从反应体系中萃取出来，操作程序繁 琐，检测结果误差比较大，因此现在该方法已经使用的比较少。 目前主要应用的是检测另一个反应产物h 2 0 2 的方法。该方法利用h 2 0 2 在过氧化物 酶作用下与一些色素元形成生色物质，在特定波长下有特征吸收峰。如季文明等【9 】利用 h 2 0 2 在过氧化氢酶的作用下将4 氨基安替比林、苯酚转化为红色的醌亚胺，其在5 0 0 n m 处有最大吸收峰，通过比色就可以测定h 2 0 2 的生成量，获得胆固醇的消耗量，从而计 算出c o d 的酶活力，此方法不仅简化了检测过程，而且提高了检测的稳定性。 1 1 3c o d 的基因克隆和表达研究 c o d 的分子生物学研究开始于上个世纪8 0 年代。1 9 8 6 年y o s h i k a t s um u r o o k a 等【l o j 表1 - 1c o d 基因的类别 t a b l e 1 2g e n eo fs o m ec o d 分离出链霉菌s a c o o 的c o d 基因( c h o a ) 并测定了核苷酸序列；1 9 9 0 年k i n y af u j i s h i o 等开始研究甾短杆菌a t c c 2 1 3 8 7 的c o d 的基因( c h o b ) 。近年来，随着分子生物学技 2 第一章绪论 术的快速发展，新的c o d 基因不断被发现( 表1 1 ) ，为基因的表达、调控方式等研究奠定 了基础。 目前国内外研究较多的c o d 基因是c h o a 和c h o b ，两者的核苷酸序列同源性为6 4 ， 含有六个与酶结构和功能相关的高度保守序列。c h ob 只有一个c y s l 0 2 ，而c h o a 贝, l j 有四 个半光氨酸( c y s 9 3 ，c y s 3 1 9 ，c y s 4 8 2 ，c y s 4 8 9 ) ，其中c h o a 的c y s 9 3 和c h o b 的c y s l 0 2 与酶活力密切相关。两基因在5 端有很大差异：c h o b 的上游没有发现原核微生物启动子 所具有的1 0 和3 5 的保守序列，而c h o a 的上游不但具有此保守序列，还具有一个编码细 胞色素蛋白p 4 5 0 的基因c h o p , 它与c h o a 串联在一起，共用一个启动子；c h o a 和c h o b 起始 密码子上游与宿主r r n a 结合的位点也存在很大差异。研究发现，在野生菌株中，c h o b 的表达水平高于c h o a ，这可能与两者的基因结构不同有密切联系【1 2 】。 野生菌株产c o d 的量比较低，一般为3 0 0u l 左右，并且产酶过程中大都需要底 物胆固醇的诱导，而胆固醇不溶于水，很难均匀、稳定地分散到水相培养基中，不便于 上罐发酵和下游的分离提取，因此给c o d 的工业化生产带来了很多困难。研究者期望 通过基因工程来提高c o d 的产量和改善c o d 的特性。m o l n a r 等i l3 j 将含有链霉菌 s a c o o 的c h o a 基因克隆到穿梭载体上，转化变铅青链酶菌1 3 2 6 后发现，转化子的酶 产量比野生菌株提高了7 0 倍，但酶活力性只有野生菌株的3 0 。由于c h o a 基因表达产 物酶活力不高，o h t a 等【1 4 】将c h o b 基因在变铅青链霉菌t k 2 3 中表达，酶活力达到1 6 8 u m l ，为原来的1 0 0 0 多倍。s a m p s o n 等人【l5 】将c h o b 基因n 端2 1 个氨基酸密码子更 换成在e c o l i 中使用频率高的同义密码子，再将突变后的基因连接到t 7 l a c 启动子的下 游，使c h o b 在e c o l i 中的表达量提高了6 0 倍。2 0 0 6 年台湾的刘文雄等i l6 j 尝试将含有 信号肽和去除信号肽序列的e h o a 分别转入毕赤酵母，发现信号肽的去除有利于c h o a 在毕赤酵母中的表达，甲醇诱导7 2 个小时，产量可达到1 , 0 0 0 u l 。这些表达过程中避 免了胆固醇作为诱导物所带来的难题，为c o d 的工业生产奠定了基础。 1 1 4c o d 的应用研究 微生物来源的酶在很多领域都有广泛的用途，如淀粉酶、蛋白酶等。c o d 由于在 来源方面受限，其应用一直比较有限。近年来，随着高产菌种的选育以及基因工程方面 的研究取得了很大进步，c o d 的应用前景被广大学者关注。目前c o d 在日本、美国等 国家已进行商品化生产，它的应用范围已从最初的临床诊断试剂扩展到食品加工、制药 工业、生物化学和生物抗虫等领域。 ( 1 ) 临床诊断：临床证明，血清中胆固醇浓度和冠心病等心脑血管疾病的发病率呈 正比关系，因而测定血清中胆固醇的含量就成了临床诊断中一个重要的参考指标。c o d 可将胆固醇氧化为胆甾4 烯3 酮和h 2 0 2 ，通过检测产物的量可以计算出底物胆固醇的 量。将c o d 、胆固醇脂酶和过氧化氢酶三酶合一的分析方法已被广泛应用于血浆总胆 固醇含量的临床诊断。还可将这三种酶做成酶电极，能反复使用且方便。目前国外研究 的热点是酶固定化生物传感器，与微电子技术相结合，开发可以反复使用的微量检测仪 器或家庭使用的简便检测试剂【1 7j 。 江南大学硕士学位论文 ( 2 ) 食品加工：利用微生物及其产生的c o d 可以有效地降低乳、肉、蛋等食品中 的胆固醇含量，预防心脑血管疾病的发生。如本实验室的吕陈峰【1 8 1 9 l 等优化了c o d 转 化蛋黄胆固醇的工艺，产物单一且对身体无毒害，此方法用于生产低胆固醇且具有保健 功能的蛋黄制品具有较大的潜在经济效益。目前研究的热点是将产c o d 的基因工程菌 株直接用于奶制品生产来控制胆固醇的含量，如将c o d 基因c h o a 转化奶酪乳酸杆菌 ( l a c t o b a c t e r i ac a s e i ) 和嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) ，使这些奶制品生产菌具 备氧化胆固酶的能力 2 0 2 。研究不限制饮食、不干扰人体正常代谢、不影响食品风味、 经济实用的减少胆固醇吸收的食品及其加工方法，已成为当前重要的研究课题。 ( 3 ) 制药工业：c o d 氧化胆固醇的产物胆甾4 烯3 酮可以作为治疗肝炎、抗肥胖、 防止皮肤角质化的药物，同时可以作为前体物质合成激素类药物。本实验室曾初步探讨 了胆甾4 烯3 酮的生物转化方法，在正辛烷作为有机相的两相反应体系中，以c o d 催 化氧化胆固醇制备胆甾4 烯3 酮【2 2 】，此方法具有转化率高，产物单一，反应条件简单 等优点，利用合适的反应器可以尝试较大规模的制备。最新研究表明，编码c o d 的基 因能触发抗生素多马霉素的合成，c o d 是多马霉素合成的信号蛋白【乃j ，在抗生素的生 产中具有重要的作用。 ( 4 ) 工具酶：c o d 可作为一种工具酶，用于探测3 d 羟固醇的空间结构以及作为 细胞膜或其他结构胆固醇的探针。例如，c o d 作为不可渗透膜的探针，有选择地作用 于线粒体外膜的胆固醇，用于研究肾上腺细胞线粒体的胆固醇的结构，以便深入研究肾 上腺皮质激素的体内合成过程【2 4 2 5 1 。通过c o d 作用，还可确定生物膜胆固醇的分布以 及胆固醇与其它膜脂的相互作用。 ( 5 ) 新型杀虫剂：c o d ( c h o m ) 可使鳞翅目昆虫内消化道的上皮细胞破裂，抑制 昆虫的生长发育特别是对棉籽象鼻虫的幼虫，是非常有效的杀虫剂。通过将c o d ( c h 0 m ) 基因转入植物中，在植物体内产生c o d ，从而使得转基因植物具有抗虫的能力。c o r b i n 等【2 6 】通过改变c h o m 基因n 端的核苷酸序列，使其抗虫活性更强，并将其克隆到烟草 细胞表达载体p m o n l 0 8 7 9 上，电转化烟草细胞，获得了抗鳞翅昆虫的转基因新植株。 目前c o d ( c h o m ) 已经成为一种重要的抗虫基因。 综上所述，c o d 是一种多功能酶，在食品、医药、和农业等方面具有广泛的应用 前景和很大的开发价值。 1 2 重组大肠杆菌的高密度发酵 高密度培养是现代发酵工业的研究的目标和方向，与传统的常规的密度发酵相比， 实现高密度培养可以使单位体积的生产能力提高几倍甚至几十倍，相应地缩小发酵培养 所需的体积，降低下游产物的分离纯化的费用，从而缩短生产周期，减少设备投资，降 低生产成本。 大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌，近年来，不少基因工程药物、疫苗、酶制剂 及某些检测试剂，如人( 牛、猪) 生长激素、仅一( d 一，丫一) 干扰素、链激酶、凝乳酶、 葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肤、降钙素、仔 第一章绪论 猪腹泻疫苗、乙型肝炎检测试剂等许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行 了表达【1 2 1 ，表达水平有些高达细胞总蛋白的3 0 以上。为了提高基因工程产品的产量， 除了提高外源蛋白在重组大肠杆菌中的表达水平和构建重组菌本身的表达性质外，还需 要为重组菌的生长和外源基因的表达提供最适的环境条件，采用高密度发酵技术，提高 单位体积的菌体密度，最终提高产物的比生产率。大肠杆菌高密度培养的早期研究主要 是以宿主菌为模型进行研究的。但近年来，重组大肠杆菌高密度发酵的研究已经有了较 大进展。 1 2 1 限制高密度发酵的主要因素 关于大肠杆菌的高密度培养，r i e s e n b e r 2 7 】从理论上计算，如果大肠杆菌细胞紧密排 列，充满整个发酵罐德体积，大肠杆菌最高发酵菌体密度为4 0 0 9 l ( d c w ) ，而m a r k f 瞄j 等假定培养基占发酵罐体积2 5 ，其余的体积由长3 u m ，宽l u m 菌体所充满，按照菌体 干重为湿重的2 0 2 5 计算，最高发酵密度为2 0 0 9 l ( d c w ) ；而s h i l o a c h 和b a u e r 等【2 州 则认为理论值应在2 5 0 9 l ( d c w ) 以内；根据l e e 的报道【3 0 j ，当菌体密度超过2 2 0 9 l ( d c w ) 时，培养液基本上没有了流动性。但是迄今为止，报道最高是通过透析发酵技术培养重 组ec o i lk 1 2 发酵密度达到1 9 0 9 l 川( d c w ) ；而通过分批补料策略培养重组大肠杆菌 报道的最高发酵密度为1 8 3 9 l t 3 2 j 。研究发现限制大肠杆菌高密度发酵的主要原因是营 养、溶解氧供给限制、代谢副产物积累和发酵液流变学特性等许多因素。 ( 1 ) 发酵培养的成分和底物抑制作用，大肠杆菌高密度发酵培养基一般采用半合 成培养基，营养组成成分包括c 、h 、o 、n 、s 、p 、f e 、m g 、k ，以及微量元素等， 培养基浓度和各营养组分的比例是影响高密度培养主要原因之一。尤其是培养基中的碳 源和氮源是菌体生长的限制性营养基质。营养充足的条件下，如果碳氮比偏小，可以导 致菌体生长旺盛，造成高密度发酵过程中菌体提前衰老自溶，碳氮比偏大，菌体繁殖数 量少，代谢不平衡不利于产物积累【3 3 】。一般而言，大肠杆菌培养时各种营养物质的抑制 浓度为：葡萄糖5 0 9 l ，氨3g l ，f e2 + 1 1 5g l ，m 9 2 + 8 7g l ，p 0 4 孓1 0g l ，z n 2 + 0 0 3 8 g l t 3 4 1 。 在分批培养中，为了得到高密度的菌体，多采用加大起始培养基中碳源、氮源和盐 浓度的办法，但这样往往会抑制菌体生长，并使菌体得率下降。因此高密度培养一般采 用分批补料培养技术，使培养基中的各种营养成份低于抑制浓度。 ( 2 ) 代谢副产物的抑制作用，乙酸是大肠杆菌菌体生长时产生的代谢副产物，在 厌氧、供氧不足，或者培养基中葡萄糖含量过高的条件下，都会通过t c a 循环，产生 乙酸【3 5 】。h a l l l 3 6 】认为，细菌在低比生长速率的条件下，通过氧化代谢作用产生的能量 足以满足生长代谢的需要，大肠杆菌就不会产生乙酸；而在高生长速率时，大肠杆菌仅 靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备a t p 和n a d h 2 ，即使在 供氧充足的情况下也会产生乙酸。m e y e r 3 7 】等通过恒化培养研究发现，在含葡萄糖的基 本培养基中比生长速率大于0 3 5 1 1 1 ，或在含葡萄糖的复合培养基中的比生长速率大于 0 2 h 。1 时，便有可测到的乙酸积累。而且乙酸的产生量随比生长速率的增加而快速增加。 江南大学硕士学位论文 高浓度的乙酸对菌体的生长有明显的抑制作用，当乙酸( 根) 浓度超过5 9 l 时，对菌体生 长速率、生物量和最大密度都会产生抑制作用【3 5 】。e k o n s t a n t i n 3 8 1 等报道发酵液中乙酸浓 度大于1 5 l 时菌体生长就停止。乙酸的积累不仅会抑制重组大肠杆菌的生长，还会抑 制外源基因的表达，尤其是在高密度培养过程中，随着菌体密度的增加和培养时间的延 长，抑制作用更为严重【3 9 4 0 。因此高密度发酵中控制乙酸浓度低于抑制浓度是高密度培 养成功的关键。 ( 3 ) 溶解氧的供给问题，大肠杆菌是好氧微生物，菌体生长临界氧浓度【4 1 4 2 j 为 0 2 6 2 4 9 l ( 3 7 。c ) 。随着菌体密度的增加，单位体积培养物的摄氧率增加。有文献报道【矧， 当培养液中的菌体密度达到3 0 9 l 、5 0 9 l 、1 5 0 9 l 时，需要的氧传递率分别应为 2 0 0 m m o l l h 、3 7 5 m m o l l h 、9 0 0 m m o l l h 。而现在生物反应器的氧传递速率上限多数 为3 0 0 m m o l l h 。而且在具体生长过程中，大肠杆菌会分泌一些蛋白质等表面活性物质， 导致表面张力降低，发酵液的粘度逐渐增高，导致氧气在发酵液中的传递和扩散更加困 难，使发酵液中溶氧水平逐下降，当溶解氧浓度低于临界氧浓度时就会抑制菌体生长。 因此，溶解氧的供给问题是一个关键限制因素。 ( 4 ) 发酵条件控制问题，包括大肠杆菌培养温度、培养基的p h 值、二氧化碳浓度、 诱导剂的浓度、诱导时间以及流加培养过程中培养基的扩散程度等因素都会对大肠杆菌 细胞生长产生影响。当然，目前环境因素随着设备和发酵软件的发展其优化也变得容易 多了。 1 2 2 高密度发酵的方法 为了实现大肠杆菌高密度培养，人们采用补料发酵技术克服高浓度基质对菌体生长 的抑制作用；根据细胞代谢反馈信息，配合在线或离线检测手段，发展了许多可行的减 少代谢副产物乙酸生成的技术；改进发酵设备性能，提高发酵罐的氧传递速率上限；优 化发酵软件使发酵条件的控制能更好的适应菌体的生长状况。 ( 1 ) 分批补料培养，补料培养技术是实现大肠杆菌高密度培养的关键，它不仅影 响菌体生长的最大生物量，而且影响细胞中目的产物的产量。大肠杆菌高密度发酵过程 中一般采用限制性营养物质( 一般是采用葡萄糖或甘油) 控制技术进行，如恒速流加、变 速流加和指数流加等技术已经成功应用于分批补料发酵过程之中。 p a n 等【3 4 】通过恒速流加培养，生产人生长激素，菌体浓度达到1 2 0 ( o d 5 2 5 ) ；j u n g 等【3 4 】采用该技术生产干扰素，菌体浓度达到4 6 9 l ( d c w ) ；李民】等采用三阶段式流加 葡萄糖的方式，高密度培养重组菌y k 5 3 7 p d h 2 8 2 m 生产骨形成蛋白( b m p 2 2 a ) ，发酵 密度达5 3 ( o d 6 0 0 ) ；k o r z 4 5 】等采用指数流加葡萄糖和甘油的形式其最终生物量分别达 到1 2 8 9 ( d c w ) l 和1 4 8 9 ( d c w ) l 。但是s u a r e z l 4 6 j 的研究结果认为，即使在很低的比 生长速率条件下，大肠杆菌生长过程中也会积累乙酸。 y ek i a m i n 9 1 4 7 j 等采用计算机模糊控制流加速度的方法，控制残糖量，得到7 2 9 l ( d c w ) 的菌体量；e p p s t e i n t 4 8 】等把溶氧突然回升1 0 以上作为判断培养基中营养缺乏的 标志，确定补糖时间，使菌密度达到3 0 9 l ( d c w ) ，用相同的方法并在培养后期采用富 6 第一章绪论 氧培养，得到8 0g l ( d c w ) 的菌密度。沈林南【4 9 】等使用“d o s t a t 控制策略使得发酵密 度从1 5 2 9 l ( d c w ) 提高到3 0 2 9 l ( d c w ) ，而乙酸的产量由1 5 6 9 l 降低到2 6 9 l 。 s h a o y a r t g h u 3 2 】等采用恒p h s t a t 法培养重组e c o l i 生产类胰岛素生长因子( i g f 2 ) ，发 酵密度达到1 8 3 9 l 。 另外，为了拟合细菌在发酵罐中的实际生长情况，进一步减少有害代谢物的生成， 根据细胞代谢反馈出的信息，配合在线或离线的检测手段已经发展了许多可行的补料技 术，如表1 2 所示。 袁1 2 大肠杆菌高密度发酵中补料分批培养的流加技术 t a b l e1 - 2h i g h d e n s i t yec o l if e r m e n t a t i o ni nf e d b a t c hc u l t u r et e c h n i q u e s 分批补料技术是高密度发酵的核心技术，高的菌体密度必然需要更多的营养来维持 菌体生长和代谢，同时补料技术也是克服底物抑制的良好方法，补料策略的优化也是发 酵优化的核心内容。 ( 2 ) 降温培养，降温培养是通过降低发酵培养温度，控制细胞代谢速度的变化， 从而控制代谢副产物的产生，降低细胞生长速度和需氧量。l i 掣5 0 】摇瓶实验说明，表达 阶段温度降低与细胞生长和细胞活性呈正相关。j a h i c 等【5 l 】通过分析，pp a s t o r i s 表达融 合蛋白的降解，发现低温对减轻目的蛋白降解有利。而c u r v e r s 等【5 2 j 说明低温能减少目 的蛋白降解是由于减少发酵液中蛋白酶的比活引起的。j a h i c 等1 5 3 j 进一步说明降低诱导 温度可减少细胞的死亡率，从而减少了宿主细胞蛋白酶的释放。重组e c o l i k s 4 6 7 3 4 诱 导产生p r o a p o a i 的温度从3 7 降低到3 0 ，可将乙酸的浓度从1 0 9 l 降到5 9 l ；另一 方面，重组大肠杆菌的低温培养可以减少包涵体的形成 3 5 】，主要原因是温度能影响蛋白 质的正确折叠途径和成熟效率【5 4 。 7 江南大学硕士学位论文 ( 3 ) 富氧培养，最常用的是采用通纯氧与空气的混合气来代替单纯通空气，从而 提高通气中的氧分压c ，因为设备的最大供氧能力o t r = k t a x ( c c m i n ) ，其中c m i n 为允 许的最低溶氧浓度，这个浓度应大于临界氧浓度。由于使用纯氧不安全、不经济，同时 在大规模发酵罐中可能局部混合不均，易使重组e c o l i 产生氧中毒，反而抑制了菌体生 长，工程科技人员最近已开发出了多种提高溶解氧供应的方法：通过提高发酵罐的压力来 提高氧分压，i c i 公司的压力循环罐已试验成功；向培养液中添加过氧化氢，在细菌过 氧化氢酶的作用下，释放出氧气供菌体使用；有人采用和小球藻混合培养方法，使藻细 胞进行光合作用所产生的氧气直接供工程菌吸收；在培养基中添加血红蛋白或氟化烃乳 剂，将其作为氧载体，可提高培养基中氧的含量，培养基中添加7 5 氟化烃乳剂，培养 2 4 h ，菌体密度可达1 5 5 ( d c w ) g l d 4 3 1 ；在大肠杆菌工程菌中表达血红蛋白，既可促进 菌体的生长又能超量表达重组异源蛋白。 ( 4 ) 控制恒定的比生长速率，根据尾气分析或其它参数通过模型计算，反馈控制 补料速度以维持一个低于副代谢产物产生的比生长速率，或维持在对表达最有利的比生 长速率。r i e s e n b e r g 5 5 j 等用这种方法控制比生长速率为o 1 lh - 1 ，得到了1 1 0g l ( d c w ) 。 ( 5 ) 透析培养，通过透析去除培养基中小分子的代谢副产物，减少代谢副产物的 抑制作用，提高培养菌密度和产物的合成1 5 6 1 。杜鹏【57 】等采用藕合分离乙酸培养技术，得 到最终菌体密度2 4 7 9 l ( d c w ) ；c f u c h s 3 h 等采用透析发酵技术，得到最终菌体1 9 0 9 l ( d c w ) 。 不同的培养方法有不同的适应范围，对于不同的菌种需要在充分理解其生理特性以 及代谢机理的基础上进行实验，以求适合菌体培养的培养方法。 1 3 课题的研究意义及内容 美国和日本对c o d 研究开展较早，日本已经率先实现了基因工程菌，产c o d 的商 品化，美国主要集中在c o d 结构方面进行研究。目前国内研究产c o d 的微生物主要有 短杆菌、马红球菌、节杆菌、桔红诺卡氏菌等，对c o d 工程菌的研究较少。本实验室 桑吉等通过复合诱变使短杆菌产酶水平提高到1 2 1 0 u l 5 8 】，原始菌株必须在胆固醇的诱 导下产酶，而胆固醇不易溶于水，不利于下游的分离提取；为了解决此问题，王龙刚、 张玲等【5 9 6 0 构建了重组大肠杆菌产c o d ，产酶水平可达7 0 0 u l 。 本文对本实验室构建的重组e c o l ij m l 0 9 p t r c 9 9 a - c o d 进行发酵优化，目的提高菌 体的产酶水平。该重组大肠杆菌含有乳糖操纵子，菌体表达外源蛋白需要，异丙基p d 硫代半乳糖苷( i p t g ) 或乳糖作为诱导剂。主要研究任务： 1 、在摇瓶中对重组e c o l i 进行培养基、诱导条件和环境因素的优化，掌握菌体的 生长规律，为下一步的高密度发酵奠定条件。 2 、采用分批补料技术，对重组e c o l i 进行高密度培养，并优化诱导条件，以生产 强度和产酶水平为发酵指标。 3 、研究乳糖的诱导策略，与i p t g 诱导效果进行对比。 8 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 菌种 重组e c o l ij m l0 9 p t r c 9 9 a o c o d 本实验室构建并保存。构建方法参考文献 5 9 】 2 2 主要设备 冷冻高速离心机 超净