（发酵工程专业论文）exoβdglucosaminidas产生菌的筛选及酶学性质的研究.pdf

惝y 1 8 1 1 7 3 7 1 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关 知识产权属广西大学所有本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研 究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为 获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在 论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：铢叫乖 川年“月功日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布臣懈密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) ：j ； 论文作者签名：际q 导师签名：壶型m 俨。幻讼日 l ， a 叠? j 义 j 分类号 u d c 硕士学位论文 密级 e x o b d - g l u c o s a m i n i d a s 产生菌的筛 选及酶学性质的研究 陈山岭 学科专业 筮醛工程 指导教师 梁蟹登数援 指导教师 奎湘莲量盟班究虽 论文答辩日期2 q q 2 生鱼且学位授予日期 答辩委员会主席芒明玄熬援级直王 论文评阅人周洹治教授 陵塞纳熬援一 o 食， p j 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关 知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研 究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为 获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在 论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 学位论文使用授权说明 年月日 本人完全了解广西火学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选抒发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名s导师签名：年月日 b o j 产 h 1 广西大掌硕士掌位论文 e x o 一口一d - - g l u c o s a m i n i d a s e 产生曹的筛选及酶掌性质的研究 e x o j 3 l - d - g l u c o s a m i n i d a s e 产生菌的筛选 及酶学性质的研究 摘要 e x o bd g l u c o s a m i n i d a s e 可从非还原性末端降解壳聚糖得到氨基 葡萄糖单体，可用其降解壳聚糖生产氨基葡萄糖，而氨基葡萄糖具有 多种生物活性。 本实验通过平板初筛和摇瓶复筛及t l c 和h p l c 检测，筛选到 一株产e x o - 1 3 d g l u c o s a m i n i d a s e 活力较高的菌株n p 3 4 。经过形态学 及分子生物学鉴定为半知菌纲曲霉属烟曲霉( a s p e r g i l l u s f u m i g a m s ) ， 初步命名为a s p e r g i l l u sf u m i g a m s n p 3 4 。 对菌株n p 3 4 种子培养基进行选择，确定种子培养基为：p d a 液 体培养基，培养时间为3 6 h 。通过单因素实验和正交实验，确定发酵 培养基的最佳组成为：壳聚糖1 5 、牛肉膏1 、f e s 0 4 7 h 2o o 0 1 、k 2 h p 0 4 3 h 2 0o 1 、m g s 0 4 7 h 2 00 0 7 5 、t w e e n8 00 1 ；最 佳的发酵培养条件为：起始p h5 o 、温度3 6 c 、转速1 8 0 r m i n 、装液 量5 0 2 5 0 m l 、接种量1 0 ( v v ) 、培养时间为4 8 h 。在最适条件下， 酶活达到4 2 9u m l 对该酶的部分酶学性质研究得出：酶的最适温度为5 5 ，最适 p h 为4 o ，在6 0 c 以下，p h 在3 0 - - - 5 5 之间，均能保持较好的稳定 性，说明该酶有一定的耐热性和耐酸性。一定浓度的m 9 2 + 和m n 2 + 对 l b 蕾j 歹 ， 舢 j 卜 k j 广西大掌硕士掌位论文 e x o 一口一v - g l u c o s a m i n i d a s e 产生菌的筛选及酶掌性质的研究 酶活有促进作用，h 9 2 + 、p b 2 + 对酶促反应有较强的抑制作用；该酶具 有较强的底物特异性。 关键词：壳聚糖氨基葡萄糖e x o - b d g l u c o s a m i n i d a s e 发酵条件 6 j 一 + j 广西大掌硕士掌位论文 e x o 一口一d - - g l u c o s a minid a s e 产生苗的筛选及酶掌性质的研究 s c r e e n i n go fe x o 1 3 d g l u o & 鲥m i n i d a s e p r o d u c i n ga n ds t u d yo ni t s c h a r a c t e r i z a t i o n a b s t r a c t e x o b - d - g l u c o s a m i n i d a s ec l e a v e sg l u c o s a m i n er e s i d u e sc o n t i n u o u s l y f r o mt h en o - r e d u c i n ge n d so ft h ec h i t o s a n ，a n dw i l lb eu s e dt op r o d u c e g l u c o s a m i n e ，w h i c hh a sm a n yb i o l o g i c a la c t i v i t i e s a s p e r g i l l u sf u m i g a t u sn p 3 4p r o d u c i n ge x o 1 3 - d g l u c o s a m i n i d a s e ( g l c n a s e ) h a db e e ni s o l a t e df r o ms o i ls a m p l e sb ys e l e c t i v em e d i u m ， t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y 皿c ) a n dh i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t h eo p t i m u ms e e dc u l t u r ew a sp d ac u l t u r ea n dt h ec u l t u r et i m ew a s 3 6h o u r s t h e o p t i m u mm e d i u md e t e r m i n e db ys i n g l e - f a c t o r a n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sw e r ec h i t o s a n1 5 ，b e e fe x t r a c t1 ，f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 1 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 00 1o a ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 7 5 ，t w e e n8 0o 1 ， p h5 0 t h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n sf o re n z y m ep r o d u c t i o nw e r e ： t e m p e r a t u r e3 6 c ，r o t a t i o ns p e e d 18 0 f f m i n ，5 0 m l m e d i u mi n 2 5 0 m l f l a s k ，i n o c u l a t i o na m o u n t1 0 ( v v ) ，a n dc u l t u r et i m e4 8 h u n d e r ，t h e s e c o n d i t i o n s ，t h ee n e y m ea c t i v i t yr e a c h e d4 2 9u m l 一一 卜 西大掌硕士学位论文e x o 一口一d - - g l u c o s a m i n i d a s e 产生苗的姊选及酶掌性质的研究 t h ep r o p e r t i e so fa s p e r g i l l u sf u m i g a t u sn p 3 4w e r es t u d i e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp h 、w e r e5 5 。0a n d4 0 r e s p e c t i v e l y t h eg l c n a s ew a ss t a b l ei nt h et e m p e r a t u r ea n dp hr a g eo f b e l o w6 0 。ca n d3 0 5 5 r e s p e c t i v l y m n 2 + a n dm g + c a l lg r e a t l ya c t i v a t e t h ee n z y m ea c t i v i t y ，w h e r e a sh 9 2 + a n dp b “c a u s e sd r a m a t i ci n h i b i t a t i o n t h eg l c n a s ew a sah y d r o l y z i n g s p e c i f i ce n z y m e k e yw o r d s ：c h i a t o s a n ；g l u c o s a m i n e ；e x o - 1 3 - d 一百u c o s a m i n i d a s e ； f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 拳 、 一 一 k j 广西大掌硕士学位论文 e x o 一口一d 9 1 u c o s a m i n i d a s e 产生菌的筛选及酶掌性质的研究 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 目录v 第一章前言1 1 1 壳聚糖与氨基葡萄糖1 1 2 骨关节炎与氨基葡萄糖1 1 2 1 骨关节炎( o s t e o a r t h ritis o a ) 。1 1 2 2 氨基葡萄糖治疗骨关节炎的作用机理。3 1 2 3 国内外氨基葡萄糖类药物治疗0 a 的研究进展4 1 3 氨基葡萄糖的其他应用5 。1 3 1 氨基葡萄糖在治疗白血病中的应用。5 1 3 2 氨基葡萄糖的抗肿瘤作用。6 1 4 氨基葡萄糖及其衍生物的制备：7 1 5 氨基葡萄糖外切糖苷酶( e x o - p 巾g i u c o s a m i n i d a s e ) 7 1 5 1 氨基葡萄糖外切糖苷酶的理化性质8 1 5 2 氨基葡萄糖外切糖苷酶的作用方式8 1 5 3 氨基葡萄糖外切糖苷酶的分离纯化。9 1 6 本课题的立题背景及意义9 1 7 主要研究内容1 0 第二章e x o - b d - g i u c o s a m i n i d a s e 产生菌的筛选与鉴定1 l 2 1 材料与方法l l 2 1 1 主要仪器。1 l 2 1 2 主要材料。1 2 2 1 3 实验方法1 3 2 2 结果与讨论1 4 2 2 1 氨基葡萄糖( gi c n ) 标准曲线的确定。1 4 2 2 2 筛选结果1 5 2 2 3 菌株的鉴定结果1 7 2 3 本章小结2 2 2 3 1 产g i c n a s e 菌株的筛选：o 2 2 2 3 2 菌种鉴定2 2 第三章产酶条件的优化2 4 3 1 材料与方法2 4 3 1 1 主要仪器。2 4 3 1 2 主要材料厶2 4 3 1 3 实验方法2 5 3 2 结果与讨论2 7 3 2 1 种子培养基的选择。2 7 3 2 2 菌株n p 3 4 在种子培养基中的生长曲线2 7 3 2 3n p 3 4 产gic n a s e 的诱导性。勰 3 2 4 发酵产酶培养基的优化。2 9 v j l ， 一 广西大掌硕士掌位论文 e x o 一口一i - g l u c o s a m i n i d a s e 产生菌的筛选反酶掌性质的研究 3 2 5 发酵产酶条件的优化3 5 3 3 本章小结4 0 第四章酶学性质的初步研究4 l 4 1 材料与方法4 1 4 1 1 材料4 1 4 1 2 方法4 1 4 2 结果与讨论4 2 4 2 1 酶的最适作用温度4 2 4 2 2 酶的最适p h 4 3 4 2 3 酶的热稳定性4 3 4 2 4 酶的p h 稳定性4 5 4 2 5 金属离子对酶活的影响4 5 4 2 6 酶的底物特异性。4 6 4 3 本章小结4 7 第五章结论与展望4 8 5 1 结论4 8 5 1 1 菌株的筛选与鉴定4 8 5 1 2 培养条件的优化4 8 5 1 3 酶学性质的初步研究4 8 5 2 展望4 8 参考文献5 0 附录1 5 7 致谢5 8 攻读硕士学位期间发表的学术论文5 9 0 e x o 一口一d - g l u c o s a m i n i d a s e 产生曹的筛选及酶掌性质的研究 第一章前言 1 1 壳聚糖与氨基葡萄糖 甲壳素( c h i t i n ) 又叫甲克质、几丁质，广泛存在于虾、蟹等甲壳动物，部 分植物，细菌以及真菌等生物中，是仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物， 年平均产量超过十亿吨，是一种巨大的可再生资源n 1 ，被誉为人体所必需的第六大 生命要素。壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素经脱乙酰化的产物，是由b 一( 1 ，4 ) - 2 - 氨 基- 2 - 脱氧一b d - 葡萄糖单元和b - ( i ，4 ) - 2 - 乙酰胺基- 2 - 脱氧一b d - 葡萄糖单元 组成的共聚物，是膳食纤维中唯一的一种含有阳离子的高分子基团。一般而言，甲 壳素的n 一乙酰基脱去5 5 以上就可以称为壳聚糖乜1 。壳聚糖广泛存在于甲壳动物 外壳，昆虫外壳和真菌细胞壁中，具有丰富的理化性质和优越的功能活性：但壳 聚糖分子量很大，并且有紧密的晶体结构，不溶于普通的溶剂，只能在某些酸性介 质中溶解，这使得壳聚糖的应用受到很大的限制。而壳聚糖水解的最终产物氨基 葡萄糖为壳聚糖的应用找到了一个制高点。 氨基葡萄糖是一种天然的氨基单糖，广泛存在于人的软骨、肌腱和韧带等组 织中，是合成氨基聚糖的基本物质，也是关节软骨中蛋白多糖的组成成分。同时氨 基葡萄糖以”糖蛋白的形式存在于细胞、血液、粘液、荷尔蒙、酵素及免疫物质 中，维持著我们的生命。 大量的研究表明氨基葡萄糖及其衍生物具有预防治疗骨关节炎，抗肿瘤，抑 制白血病细胞的生长，抑菌、吸湿保湿等生物活性，在生物医药，精细化工及农 林畜牧等方面具有独特的应用价值。 1 2 骨关节炎与氨基葡萄糖 1 2 1 骨关节炎( o s t e o a r t h r i t i s o a ) 骨关节炎( o s t e o a r t h r i t i s ，o a ) 是指关节的症状和体征与关节软骨的完整性 受损，软骨下骨板及关节边缘骨病变有关的一组异质性疾病，即关节软骨的退变和 继发性骨质增生的一种慢性关节病d 1 ，是关节软骨蛋白多糖生物合成异常而呈现退 广西大掌硕士掌位论文 e x o 一口一d - g l u c o s a m i n i d a s e 产生苗的筛选及酶掌性质的研究 行性变的结果。国际医学界将骨关节炎定义为“早期关节软骨变黄、粗糙、失去 光泽，继之出现裂缝，软化或剥落，软骨下骨裸露，以后软骨下骨周围组织增生， 骨赘形成( 即骨质增生) ，软骨下骨硬化，关节肥大，畸形及发生运动障碍 。在 美国7 5 岁以上的老年人中大约8 5 都受到不同程度关节炎的困扰，而我国骨关节炎 的发生率在农村为9 6 ，在城市退休人群中为4 9 h 1 。 病理研究发现，骨关节软骨受损到一定的程度可出现裂缝，引起肉芽组织的增 生，从而使病情恶化，软骨受损不能恢复啼1 由于骨性关节炎发生病因不清楚，发病 又较为隐匿，给预防和治疗带来了一定的难度嘲。美国风湿病学会( a c r ) 和欧洲抗风 湿联盟( e u l a r ) h 1 将治疗o a 的药物分为症状改善药( s y m p t o m m o d i f y i n gd r u g s ) 和 结构改善药( s t r u c t u r e 2 m o d i f y i n gd r u g s ) ，症状改善药要求能减轻疼痛和改善关 节功能，结构改善药要求能够延缓关节间隙变窄。止痛药和非甾类抗炎药( n s a i d s ) 是目前临床上治疗o a 最常用的非特异性的症状改善药，其作用机理是抑制中枢前 列腺素( p g ) 的合成，减弱p g 对缓激肽等致炎介质的增敏作用。其作用是减轻疾病的 疼痛，但并不能减慢和阻止疾病的发展砸们。这类药对老年人其不良反应及副作用更 为突出，胃肠出血为最常见并发症。而且有证据表明，口服水杨酸制剂可使骨关节 炎患者的关节软骨蛋白多糖和透明质酸的合成减少，关节软骨易发生表面纤维化。 使骨关节炎的病理损伤加重。目前，有人认为对骨关节炎更合理的治疗是应用关节 软骨保护剂，它不仅能刺激软骨组织合成蛋白多糖和胶原蛋白，抑制胶原酶和蛋白 多糖降解酶的活性，还能减少关节软骨形态学的改交。 目前对o a 的治疗缺乏有效的手段，如何延缓0 a 早中期关节软骨的退变和促进 其修复成为治疗的关键n 们。无论是何种原因( 创伤、感染、免疫等) 引起的骨关节 炎，关节软骨是该疾病的核心，炎症过程中弹性蛋白酶、溶酶体酶等水解酶的释放 形成了对软骨基质的水解破坏，从而形成免疫反应的恶性循环对关节软骨的不断 破坏。骨性关节炎在其病理改变中，构成软骨基质的主要成分聚氨基葡萄糖的生物 合成障碍是清楚的。 氨基葡萄糖( g l u c o s a m i n e ) 是一种天然的氨基单糖存在于人体特别是关节软 骨中，是合成氨基聚糖的基本物质，也是关节软骨中蛋白多糖的组成成分。它可以 特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞j 下常的代谢功能，刺激软骨细胞产生有正 常多聚体结构的蛋白多糖，维护软骨基质的形态结构1 ；还能抑制损伤软骨基质i i 2 e x o 一口一1 ) - g l u c o s a m i n i d a s e 产生苗的筛选及酶掌性质的研究 型胶原的超氧化自由基、胶原酶和磷脂酶a 2 的生成；抑制前列腺素的合成，保护 皮质激素等各种有害物质对软骨细胞的破坏，从而延缓骨性关节退变的病理过程 和疾病进展，改善关节活动，缓解疼痛。目前虽然大多数的氨基葡萄糖药物实验是 短期的，但是结果却令人振奋。总的趋势表明氨基葡萄糖可改善骨关节炎的症状， 可促进关节软骨的代谢活动加强，胶原、糖氨聚糖及其他结构蛋白的合成代谢增加， 对关节软骨的保护和修复具有十分重要的意义n 幻。 1 2 2 氨基葡萄糖治疗骨关节炎的作用机理 近年来临床应用氨基葡萄糖治疗骨性关节炎，研究观察到一定剂量氨基葡萄 糖及其衍生物( 主要是盐酸氨基葡萄糖、硫酸氨基葡萄糖、对乙酰氨基酚氨基葡 萄糖n 3 1 ) 可抑制肉芽组织增生、抑制血管渗出和细胞游离、抑制迟发性变态反应， 提示盐酸氨基葡萄糖对骨关节炎作用可能通过上述多种机制进行并且临床效果较 好1 。氨基葡萄糖以硫酸盐或盐酸的形式存在，分子单一，分子量小，在细胞外基质 中以弥散的方式接近软骨细胞，通过葡萄糖转运载体进行转运，在软骨细胞内合成 氨基葡萄糖多聚糖，并进一步合成蛋白聚糖，蛋白聚糖胶体复合物附着在基质胶原 网架上，与胶原网架结构共同构成一个弹性体，起着承载压力、传导和缓冲应力、 保护软骨结构和软骨下骨的作用n 司。在o a 软骨细胞发生迟变后，这种蛋白多糖的合 成发生了变化，引起了细胞外基质的性质，导致o a 的进一步进展。补充外源性氨基 葡萄糖可以较好地刺激软骨细胞合成蛋白多糖，增加蛋白多糖m r n a 的水平，能显著 降低软骨细胞磷酯酶a 2 ( p l a 2 ) 和胶原酶的活性，增加p k c 的产生，抑制金属蛋白酶 活性，从而可以较好地预防o a 的进一步发展和修复软骨。氨基葡萄糖可以抑制因免 疫而造成的蛋白多糖降解、修复受损的关节软骨的作用：研究表明，氨基葡萄糖可 抑制弹性蛋白酶、溶酶体酶等水解酶的释放，减少其对软骨基质的水解破坏，从而 阻碍因免疫反应的恶性循环对关节软骨的不断破坏。尤其对于骨关节炎病人，其关 节软骨的代谢活动加强，胶原、糖氨聚糖及其它结构蛋白的合成代谢增加，及时给 以氨基葡萄糖对关节软骨的保护和修复具有十分重要的作用。氨基葡萄糖还具有 微弱的抗炎效果，但其机制与非f ； 体类抗炎药物不同，氨基葡萄糖是通过刺激软骨 细胞产生具有j 下常多聚体结构的蛋白多糖，稳定细胞膜，从而起抗炎作用n 们。 研究人员揭示：氨基葡萄糖具有以下药理作用：治疗与修复结缔组织；消 炎止痛：构成软骨细胞的主要成分；防止软骨组织退化引发的各种疾病( 如腰 3 e x o 一口一d - g l u c o s a m i n i d a s e 产生苗的筛选及酶掌性质的研究 膝酸软、关节炎等) ，适当补充氨基葡萄糖则能相应降低骨关节炎或风湿性关节炎 引起的关节肿胀、关节僵硬等症状，并大大改善关节炎患者的生活质量。氨基葡 萄糖类药物将逐渐成为治疗关节炎的最主要的药物，给骨关节炎的治疗带来一片 曙光。 1 2 3 国内外氨基葡萄糖类药物治疗姒的研究进展 补充外源性氨基葡萄糖治疗o a 源于上世纪7 0 年代，但一直存在很激烈的争议。 直到8 0 年代初，才开始应用于临床试验治疗o a 。1 9 8 2 年，v a z a l n 刀发表文章认为口 服氨基葡萄糖后对o a 患者的症状缓解明显，随之对氨基葡萄糖在o a 中的应用日趋 盛行。近年特别在欧洲，大量临床试验结果显示其对症状性骨性关节炎有明显的效 果。r e g i n s t e r n 8 1 等对应用硫酸氨基葡萄糖治疗的2 1 2 例骨关节患者进行了长达3 年 的临床试验观察，根据结构改善性和症状改善性联合疗效评估标准，治疗组患者的 症状和影像学表现得到明显改善，同时p a v e l k a k n 町等的研究也表明这一点。 r e i c h e l t 啪1 等评价1 5 5 例膝o a 患者，对肌注硫酸氨基葡萄糖与注射安慰剂进行比较， 结果用l e p u e s n e 指数判断，分别有5 5 和3 3 的患者有治疗效果。1 9 9 8 年r e g i n s t e r 和同事随机抽取2 1 2 例患者做了3 年的双盲安慰剂对照组研究，结果发现氨基葡萄 糖可以有效地控制关节炎症状及延缓病情发展，用西安大略省和m c m a s t e r 大学 ( w o m a c ) 的关节炎指数测量证实退变的关节腔不再明显变窄，关节炎症状转好。 t h i e 等用布洛芬和氨基葡萄糖药物做颞下凳关节炎的对比实验发现氨基葡萄糖药 物在止痛方面效果更加优越一些旺订。f o e r s t e r 等报道了一项r c t 。应用g s 治疗颈椎和 腰椎0 a 的病人1 6 0 例，治疗6 周，随访4 周，与安慰剂作对照，结果表明：g s 组可以更 有效地改善症状、提高脊柱的活动度2 。m c a l i n d o n 等在国家卫生研究院( n i h ) 的 资助下回顾性研究6 项氨基葡萄糖试验，并评估氨基葡萄糖和硫酸软骨素治疗骨 关节炎的安全性和有效性，结果发现氨基葡萄糖对骨关节炎的症状有中等程度的 缓解效应，治疗4 周以上者效果更加明显2 。另一项报告的结论是，氨基葡萄糖治 疗骨关节炎是安全而有效的k 。第三项荟萃研究分析10 2 0 例进行硫酸氨基葡萄 糖临床试验的病人数据，分别评估了硫酸氨基葡萄糖和硫酸软骨素的有效性和安全 性结果都表明硫酸氨基葡萄糖有明显的缓解关节结构破坏的作用2 。r e g i n s t e r 等结果表明，硫酸氨基葡萄糖缓解关节结构破坏的效应可以维持较长的时间b 1 。 国内学者李智莉等f 2 7 i 研究发现，氨基葡萄糖用于治疗膝关节炎患者，与芬必 4 广西大掌硕士掌位论文 e x o 一口一d - g l u c o s a m i n i d a s e 产生笛的筛选及酶掌性质的研究 得一样有效，两者都能显著改善患者的临床局部症状但在停药4 周后，氨基葡萄 糖组的疗效明显优于芬必得组，提示其具有显著的遗留效应。而且安全性高，病人 对氨基葡萄糖的耐受性优于芬必得。胡大佑等关于氨基葡萄糖筋骨素片改善膝骨 关节炎患者膝关节功能的人体试食试验表明：氨基葡萄糖筋骨素片能降低膝关节 退行性骨关节炎患者的症状积分，同时又具有改善膝关节骨关节屈曲功能和行走 能力的作用汹1 。罗从风等 2 9 1 研究发现长期服用硫酸氨基葡萄糖3 年以上者能够防 止膝关节骨关节炎的关节结构发生改变，使症状明显改善。杨南萍等1 3 0 l 进行的临 床观察也表明氨基葡萄糖片治疗骨性关节炎疗效确切，不良反应少，患者耐受性好， 服用方便，为安全有效的治疗骨性关节炎药物。邱贵兴等关于盐酸硫酸氨基葡萄 糖治疗骨关节炎的平行对照临床研究表明：盐酸氨基葡萄糖治疗骨关节炎的疗效 和安全性与硫酸氨基葡萄糖相似，是一种治疗骨关节炎的安全、有效的药物b 1 1 。罗 娟等关于盐酸氨基葡萄糖改善膝骨性关节炎症状的效果评估表明：盐酸氨基葡萄 糖胶囊是一种有效改善膝骨性关节炎症状且应用较为安全的药物b 2 】。查振刚等关 于硫酸氨基葡萄糖预防兔膝骨关节炎的实验研究表明：硫酸氨基葡萄糖可以较好 的预防o a 的发生发掌，同时对兔膝o a 软骨退变有较好的修复作用b 3 】。 尽管氨基葡萄糖的安全性还需要进一步的研究，但研究人员认为氨基葡萄糖 是一种病人耐受性极好的新型医药产品，医学研究人员建议：氨基葡萄糖可作为各 种骨关节炎的一线治疗剂。对于需要长期服药治疗的骨性关节炎患者，都应当尽可 能避免应用非甾体类消炎镇痛药，而应考虑把氨基葡萄糖作为骨性关节炎治疗的 首选药物1 。在欧洲氨基葡萄糖硫酸盐已经作为一种处方药用于骨关节炎的治疗 1 3 53 6 ，在北美，则被当作饮食补充的“营养品一。虽然美国风湿病学会( a c r ) 2 0 0 0 年骨关节炎治疗指南中并没有建议使用硫酸氨基葡萄糖洲，但是到目l j i 为止，所有 的临床资料都提示氨基葡萄糖类药物能够长期而安全地服用；它能缓解症状，减少 关节结构破坏，减缓疾病的发展，给骨关节炎的治疗带来一片曙光。 1 3 氨基葡萄糖的其他应用 1 3 1 氨基葡萄糖在治疗白血病中的应用 抑制白血病细胞增殖、诱导其凋亡和分化是治疗白血病的重要手段1 3 73 8 l 。梁蓉， 王哲等学者1 3 9 j 研究了氨基葡萄糖硫酸盐对白血病细胞k 5 6 2 增殖的影响，表明氨基 5 e x o 一口一d - g l u c o s a m i n i d a s e 产生菌的筛选反酶掌性质的研究 葡萄糖硫酸盐能抑制k 5 6 2 细胞增殖，诱导其凋亡，其分子机制可能与细胞周期受 阻、c a t h e p s i n d 蛋白前体蓄积有关。同时王哲，乔岩等【柏i 还对n 一乙酰氨基葡萄 糖诱导白血病细胞k 5 6 2 向巨噬细胞分化进行了研究，结果表明n 一乙酰氨基葡萄 糖对髓系来源的k 5 6 2 细胞的分化在低浓度下有良好的诱导效果，很可能成为新的 高效、低毒的白血病治疗候选药物；董宝侠等【4 1 l 研究了氨基葡萄糖硫酸盐抑制白 血病细胞h l 6 0 增殖并诱导其分化的作用，结果表明g s 能抑制白血病细胞h l 6 0 的增殖，并诱导其向成熟单核、粒细胞分化。b r i e f a a 等1 4 2 i 报道了g s 对淋巴造血系 统肿瘤的作用。以上的报道表明g s 很可能成为新的高效、低毒的白血病治疗候选 药物，有望成为一种新的有效的抗白血病治疗药物。 1 3 2 氨基葡萄糖的抗肿瘤作用 氨基葡萄糖可抑制癌细胞生长，诱导癌细胞向正常细胞转化，是合成抗癌药 物的主要原料1 4 3 1 。 李运曼等m l 研究了伊氨基葡萄糖盐酸盐的抗肿瘤的作用，结果表明伊氨基葡 萄糖盐酸盐对小鼠移植肉瘤1 8 0 ( s 8 0 ) 、肝癌腹水瘤( h e p s ) 和艾氏腹水实体瘤( e c ) 有显著的抑制作用，尤其是对小鼠移植肉瘤1 8 0 ( s 1 8 0 ) 和肝癌腹水瘤( h e p s ) 抑制 作用最强：同时高、低剂量对e c 腹水实体瘤小鼠外周血白细胞、骨髓粒细胞与红 细胞比值及荷瘤小鼠体重无明显抑制作用，说明氨基葡萄糖盐酸盐具有抑瘤效果 好，毒性低的优点，故推测其将会具有较好的新药开发前景：吴静1 4 5 l 等研究了d 一氨 基葡萄糖衍生物对人胃癌细胞系s g c - 7 9 0 1 增生的影响，结果表明d 一氨基葡萄糖衍 生物通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制人胃癌s g c - 7 9 0 1 细胞增生，同时还有下调c d 4 4 的作用他们对沪氨基葡萄糖衍生物抑制h e p g 一2 细胞生长及诱导凋亡的研究表明 d 一氨基葡萄糖衍生物在体外可显著抑制人肝癌细胞株生长，其作用机制主要是诱 导肿瘤细胞凋亡i 矧。吴静等还对d 一氨基葡萄糖衍生物对人食管癌e c a 一1 0 9 细胞影 响，结果表明：氨基葡萄糖明显的诱导人食管癌ee c a - 1 0 9 细胞的凋亡1 4 7 1 。谢秋玲 等研究了氨基葡萄糖盐酸赫对黑素瘤细胞分化的诱导作用，结果表明经氨基葡萄 糖盐酸盐处理的黑素瘤细胞有向正常细胞转化的明显趋势l 删。张莉等对d 一氨基葡 萄糖及其衍生物抗肿瘤活性进行了初步的研究，结果表明氨基葡萄糖及氨基葡萄 糖盐酸盐体外能明显抑制肝癌细胞sm mc 7 7 2 1 的生长，且存在剂量依赖性，体 内可能是通过直接杀伤肿瘤细胞的细胞毒作用和提高si 鲫肉瘤小鼠细胞免疫水平 6 e x o 一口一d - - g l u c o s a m i n i d a s e 产生苗的筛选及酶掌性质的研究 来发挥抑瘤作用【4 9 1 。f r i e d m a n 研究发现g l c n h 2 和一些具有膜活性的药物相结合具 有较好的抗癌活性，特别适用于治疗神经系统的癌症；他还发现一定浓度范围内的 g l c n h ：对正常细胞无影响，但能选择性的杀伤癌细胞1 5 0 1 。 另外有文献报道氨基葡萄糖有独立的抗氧化、抗细菌的特性【5 15 2 1 ，同时还有保 鲜的功效【5 3 1 。对氨基葡萄糖进行有关的化学修饰后，在生物医药领域还有其他的 重要作用瞰5 5 1 。 1 4 氨基葡萄糖及其衍生物的制备 氨基葡萄糖及其衍生物难以用化学法合成，通常是甲壳素经酸水解制得i 删。 氨基葡萄糖盐酸盐的制备主要是通过一定浓度的盐酸溶解甲壳素来完成，产品的 得率及纯度与酸得浓度，水解的时间、温度及原料的前处理有密切的关烈5 7 - 6 5 1 。 氨基葡萄糖硫酸盐的制备一般是以氨基葡萄糖为主要原料的：耿作献等陋以氨基 葡萄糖盐酸盐为原料，通过甲醇钠方法制备氨基葡萄糖硫酸钠盐氨基葡萄糖 盐酸盐先与甲醇钠反应生成氨基葡萄糖碱，再与三氧化硫反应制备氨基葡萄糖硫 酸钠盐的；李继等【6 刀以d 一氨基葡萄糖盐酸盐和浓硫酸为原料制备d - 2 氨基葡萄糖 硫酸盐；涂书霞等【删利用氨基葡萄糖赫酸毓和硫酸镁为起始物制备氨基葡萄糖混 合盐。n 一己酰氨基葡萄糖的制备也是以氨基葡萄糖盐酸盐为原料的l 删。以上有关 氨基葡萄糖及其衍生物的制备主要是化学的方法。m i n g - d ed e n g 等1 7 0 j 利用代谢工 程来改变e s c h e r i c h i ac o l 玳谢途径，使其氨基葡萄糖合成酶过量表达并钝化分 解酶的活力，进而使得氨基葡萄糖的产量提高了1 5 倍。该研究为利用微生物发酵 来生产氨基葡萄糖奠定了基础，提供了可能性。但利用生物酶法降解壳聚糖直接 来生产氨基葡萄糖却很少见有报道。 1 5 氨基葡萄糖外切糖苷酶( e x o - - 1 3 - d - g iu c o s a minid a s e ) 氨基葡萄糖外切糖苷酶( g l c n a s e ) 是一种外切氨基葡萄糖酶，它即可水解 氨基葡萄糖之间的糖苷键，也可水解氨基葡萄糖与乙酰氨基葡萄糖之间的糖苷键。 该酶从非还原性末端降解壳聚糖( 完全脱乙酰) 可以以恒定的速率得到氨基葡萄 糖单体。但到目前，有关氨基葡萄糖外切糖苷酶的研究报道不多。 l ， e x o 一口一d - g l u c o s a m i n i d a s e 产生苗的筛选及酶掌性质的研究 1 5 1 氨基葡萄糖外切糖苷酶的理化性质 1 5 1 1 分子量 就目前有关文献报道的来说，氨基葡萄糖外切糖苷酶的分子量相对较小，大多 数在9 3 1 3 5 k d a ，如a s p e r g i u sf u m n i g a t u ss 一2 6 所产酶分子量为1 0 4 k d a l 7 ， t r i c h o d e r m ar e e s e ip c 一3 7 所产酶的分子量为9 3 k d a l 7 2 1 ，n o c a r d i ao r i e n t a i s 所产酶的分子量为9 7 k d a i 7 3 1 ，只f u n i c u o s u m k y 6 1 6 所产酶的分子量为1 0 8 k d a l 7 4 1 ， a s p e r g i l u so r y z a ei a m 2 6 6 0 所产酶的分子量为1 3 5 k d a i 彻。但也有例外，如 彳f l a v u s i a m 2 0 4 4 产的外切酶其分子量为4 5 k d a l 7 6 1 ，7 1 k o d a k a r a e n s i sk o d l 所产 外切酶是由分子量为8 6 k d a 的亚基构成的二聚体1 7 7 1 。这些外切酶除 爿f l a v u s l h m 2 0 4 4 所产的适胞内酶外，其他的均为胞外酶。所有这些酶的作用位点 均是非还原性末端。 1 5 1 2 等电点与最适刚 关于氨基葡萄糖外切糖苷酶等电点的报道很少，其中a f l a v u s i a m 2 0 4 4 所产 酶的等电点位p h 8 8 。氨基葡萄糖外切糖苷酶的最适p h 一般在4 o 一6 0 ，如 a f l a v u s i a m 2 0 4 4 、n o c a r d i ao r i e n t a l i s 和a s p e r g i l l u so r y z a ei a m 2 6 6 0 所产酶 的均为5 5 ，a s p e r g i l j u sf u m n i g a t u ss 一2 6 所产酶的为6 0 ，t r i c h o d e r m ar e e s e i p c 一3 7 所产酶为4 o 。另外当同一个酶作用于聚合度不同的壳聚糖时其最适p h 会 有一定的差别。这些已报道的外切酶，其p h 的稳定性有一定的差异，n o c a r d i a o r i e n t a l i s 所产酶的稳定范围为3 5 8 0 ，a s p e r g i l l u sf u 扭n i g a t u ss 一2 6 所产 酶为2 o 1 0 0 。 1 5 1 3 酶的最适温度及其稳定性 已报道的氨基葡萄糖外切糖苷酶其最适温度一般在5 0 一6 0 ，a s p e r g i l l u s o r y z a ei a m 2 6 6 0 与t r i c h o d e r 院zr e e s e ip c 一3 7 所产酶的为5 0 ，n o c a r d i a o r i e n t a l i s 所产酶的为6 0 ，但也有例外，劢k o d a k a r a e n s i sk o d l 所产外切糖 苷酶的最适温度为8 0 。 1 5 2 氨基葡萄糖外切糖苷酶的作用方式 氨基葡萄糖外切糖苷酶是一种外切氨基葡萄糖酶，该酶只是水解氨基葡萄糖 之间的b 1 ，4 - 糖苷键及水解氨基葡萄糖与乙酰氨基葡萄糖之间的b 1 ，4 糖苷键， 从非还原性术端降解壳聚糖及其有关的衍生物进而得到氨基葡萄糖单体，而对乙 8 广西大学硕士掌位论文 e x o 一口一d - g l u c o s a m i n i d a s e 产生菌的筛选及酶掌性质的研究 酰氨基葡萄糖之间的糖苷键没有作用。各种底物相比较而言，壳聚糖脱乙酰度越 高，降解的就越彻底。另外，该酶只能水解壳聚糖的得到氨基葡萄糖，在酶促反 应的过程中，当壳聚糖的非还原性末端是乙酰氨基葡萄糖时，酶促反应将会终止。 另外，该酶还具有转糖基作用，如该酶在水解壳五糖时，也会有少量的壳六糖 产生。该酶在水系中降解壳聚糖时得到是氨基葡萄糖，但在醇系中反应时，得到 是烷基氨基葡萄糖【7 4 1 ，见下图： 1 5 3 氨基葡萄糖外切糖苷酶的分离纯化 g l c n a s e 的分离纯化主要是通过硫酸铵沉淀，然后将沉淀溶解在一定体积的 缓冲液中，再通过各种柱层析，进而得到一定量的纯酶。f i - 7 9 1 1 6 本课题的立题背景及意义 我国对几丁质和壳聚糖的研究起步较晚，始于2 0 世纪5 0 年代，8 0 年代受到 重视，近些年来发展迅速且重点在壳寡糖，但相对于我国丰富的几丁质、壳聚糖 天然资源和它们的广泛用途来说，其研究开发力度还远远不够。目前有关氨基葡 萄糖生产主要是化学法一通过强酸来降解几丁质或壳聚糖来生产，而利用酶降解 壳聚糖来生产氨基葡萄糖在国内很少见有报道。同时国内有关降解壳聚糖的酶一 壳聚糖酶的研究主要集中在内切酶上，该酶降解壳聚糖的产物主要是壳寡糖。作 为有关c x o b