（发酵工程专业论文）孤崎肠杆菌脂多糖的结构分析及其相关基因czlpxl的研究.pdf

摘要 摘要 阪崎肠杆菌( c r o n o b a c t e r ) 是一种在婴儿配方奶粉中发现的食源性革兰氏阴性致病 菌。它能感染新生儿，导致脑膜炎、坏死性结肠炎和败血症，致死率达4 0 8 0 。脂多 糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ) 是革兰氏阴性细菌细胞外膜外侧重要的结构和功能分子。它的 组成部分类脂a ( 1 i p i d a ) ，俗称内毒素，是重要的毒力因子。但是，目前还没有关于阪 崎肠杆菌类脂a 结构及其合成途径相关基因的报道。 本课题首先研究了c r o n o b a c t e rs a k a z a k i ib a a 8 9 4 和c r o n o b a c t e rm u y t j e n s i ia t c c 5 1 3 2 9 的氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素的抗生素敏感性，并研究了具有不同复制子的 三种大肠杆菌质粒p w s k 2 9 、p a c y c l 8 4 和p e t 2 8 a 在cs a k a z a k i fb a a 8 9 4 和 cm u y t j e n s i ia t c c5 1 3 2 9 中的复制能力和转化效率。然后对cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 和 c m u y t j e n s i ia t c c5 1 3 2 9 的脂多糖组分进行了分析，并重点分析了cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 的类脂a 结构及其相关基因c s l p x l 的功能，得出以下结论：l 、通过脂多糖的提取与 s d s - p a g e 检测，发现了cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 能合成含0 抗原的脂多糖，而c 聊螂和珊豇 a t c c5 1 3 2 9 的脂多糖缺少o 抗原；2 、通过弱酸水解、d e a e 纤维素离子交换层析和薄 层层析，纯化后的cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 的类脂a 经电喷雾离子化质谱( e s i m s ) 解析， 发现有两种结构。并进一步通过e s i m s 和m s m s 解析类脂a 碱性水解产物，确定了 它们的差别在于c 27 位上次级脂肪酸链的长度。3 、根据cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 两种类脂 a 分子的结构差异，进一步研究了造成c 2 位次级脂肪酸链长度差异的相关基因c s l p x l ， 通过在ec o l iw 3 1 1 0 突变株m k v l 5 中表达，初步证明了该基因编码的蛋白质具有十 四碳脂肪酸转移酶活性。 本课题首次解析了阪崎肠杆菌的类脂a 结构，并且初步阐明了类脂a 合成途径中 的次级脂肪酸转移酶编码基因c s l p x l 的功能，为进一步研究阪崎肠杆菌的致病性奠定 了基础。 关键词：阪崎肠杆菌、生物学特性、脂多糖、类脂a 、c s l p x l 基因、e s i m s m s a b s t r a c t a b s t r a c t n e g r a m - n e g a t i v ef o o db o r n ep a t h o g e nc r o n o b a c t e r ，f o u n di np o w d e r e dm i l kf o r m u l a , c a l li n d u c en e c r o t i z i n ge n t e r o c o l i t i s ，s e v e r em e n i n g i t i sa n ds e p s i si nn e o n a t e s t h em o r t a l i t yi s 1 1 i 曲a n dr a n g i n gf r o m 4 0t o8 0 l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) ，a n c h o r si nt h eo u t e rm e m b r a n e o fg r a m n e g a t i v es t r a i n , i sa ni m p o r t a n ts t r u c t u r a la n df u n c t i o n a lm o l e c u l e a so n e c o m p o n e n to fl p s 1 i p i da a l s or e f e r r e dt oa se n d o t o x i n , i sa ni m p o r t a n tv i r u l e n c ef a c t o n h o w e v e r , t h e r ei s l i t t l ei n f o r m a t i o na v a i l a b l ef o rl i p i das t r u c t u r ea n dg e n e sr e l a t e dt oi t s b i o s y n t h e s i si nc r o n o b a c t e r w | ef i r s t l ys t u d i e dt h ea n t i b i o t i c s s e n s i t i v i t y o fa m p i c i l l i n , c h l o r a m p h e n i c o la n d k a n a m y c i nt oc r o n o b a c t e rs a k a z a k i ib a a 8 9 4a n dc r o n o b a c t e rm u y t j e n s i ia t c c513 2 9 a n d t h er e p l i c a t i o nc a p a c i t ya n dt r a n s f o r m a t i o ne 伍c i e n c yo ft h r e eec o l iv e c t o r sp w s k 2 9 p a c y c 18 4a n dp e t 2 8 a , w h i c hc o n t a i nd i f f e r e n tr e p l i c a lo r i g i n s ，h a v eb e e ns t u d i e d t h e nb y c h a r a c t e r i z a t i o no fl p si ncs a k a z a k i ib a a 8 9 4a n dcm u y t j e n s i ia t c c513 2 9 a n dm o s t l y a n a l y s i so fl i p i daa n dr e l a t e dg e n ec s l p x li ncs a k a z a k i ib a a 8 9 4 w ec o n c l u d e da s f o l l o w s ( a ) b ys d s - p a g ea n a l y s i so fi s o l a t e dl p s ，w ef o u n dt h a t0 - a n t i g e nc a nb e s y n t h e s i z e di nc s a k a z a k i ib a a 8 9 4 ，b u tn o ti ncm u y t j e n s i ia t c c513 2 9 ；( b ) b ym i l da c i d h y d r o l y s i s ，d e a e c e l l u l o s ea n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y a n dp r e p a r a t i v e t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y , t h ep u r i f i e dl i p i daw a sa n a l y z e db ye l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y t w ol i p i das p e c i e sh a v eb e e nd e t e c t e di nc s a k a z a k i fb a a 8 9 4 1 1 1 es t r u c t u r a l d i f f e r e n c e i d e n t i f i e df u r t h e rb ye s i m sa n dm s m so fa l k a l i n eh y d r o l y z e d1 i p i da i s s e c o n d a r yf a t t ya c i dr e s i d u ea tc 2 - p o s i t i o n ，w h i c hi sm y r i s t a t eo rl a u r a t e ；( c ) b a s e do nt h e s t r u c t u r a ld i f f e r e n c eo fl i p i dai ncs a k a z a k i ib a a 8 9 4 。t h eg e n ec s l p x l ，w h i c hi s r e s p o n s i b l ef o rt h ed i f f e r e n c eo fs e c o n d a r yf a t t ya c i dc h a i nl e n g t h sa tc 2 - p o s i t i o n , w a s s t u d i e d b ye x p r e s s i o no fc s l p x li ne c o l im u t a n tm k v l 5 ，w ef o u n dt h ep r o t e i n ，e n c o d e db y t h i sg e n e ，h a st h ea c t i v i t yo f m y r i s t o y la c y l t r a n s f e r a s e t l l i si st h ef i r s tt i m ef o rc h a r a c t e r i z a t i o no ft h es t r u c t u r eo fl i p i daa n dt h ef u n c t i o no f c s l p x lg e n ei ncs a k a z a k i i 1 1 l i si n f o r m a t i o nw o u l ds h e dl i g h to np a t h o g e n e s i sr e s e a r c ho f t h i sf o o db o r n ep a t h o g e n k e y w o r d s ：c r o n o b a c t e rs a k a z a k i i ；b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n ；l i p o p o l y s a c c h a r i d e ； l i p i da ；c s l p x lg e n e ；e s i m s m s 目录 目录 摘要i a b s t r a c t 。i i 目 录i 第一章引言1 1 1 脂多糖与类脂a 1 1 1 1 脂多糖的组成与功能1 1 1 2 类脂a 的结构与生物合成途径2 1 1 3 类脂a 的免疫学作用j 3 1 1 4 脂多糖的提取与检测4 1 2 阪崎肠杆菌的研究进展4 1 2 1 阪崎肠杆菌的致病性4 1 2 2 阪崎肠杆菌的生化特性及检测5 1 3 立题背景与意义5 1 4 课题研究内容和研究目标6 第二章实验材料与方法7 2 1 实验材料：7 2 1 1 菌株、质粒、引物及细菌培养。j 7 2 1 2 工具酶和试剂7 2 1 3 主要仪器8 2 2 实验方法8 2 2 1 阪崎肠杆菌的活化与鉴定8 2 2 2 生长曲线的测定9 2 2 3 最小抑菌浓度的测定9 2 2 4 阪崎肠杆菌感受态细胞的制备与转化9 2 2 5l p s 的提取与s d s p a g e 9 2 2 6 类脂a 的提取与纯化1 0 2 2 7 类脂a 的碱性水解1 1 2 2 8e s i m s 和m s m s 分析1l 2 2 9c s l p x l 基因的克隆与表达。1 1 第三章结果与讨论1 2 3 1 阪崎肠杆菌生物学特性研究1 2 3 1 1 阪崎肠杆菌的培养条件1 2 3 1 2 阪崎肠杆菌的鉴定1 2 3 1 3 生长曲线的绘制1 3 3 1 4 抗生素筛选浓度的确定1 4 江南大学硕士学位论文 3 1 5 阪崎肠杆菌的质粒兼容性及感受态细胞的转化效率1 4 3 1 6 阶段小结1 5 3 2 阪崎肠杆菌脂多糖的初步研究1 5 3 2 i 阪崎肠杆菌l p s 的检测15 3 2 2 阶段小结1 6 3 3cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 类脂a 的结构分析1 6 3 3 1 类脂a 的薄层层析检测1 6 3 3 2 类脂a 的e s i m s 解析1 6 3 3 3 类脂a 碱性水解物的e s i m s 解析1 7 3 3 4 类脂a 碱性水解物的串联质谱分析18 3 3 5 阶段小结。2 0 3 4cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 类脂a 合成相关基因c s l p x l 功能的研究2 l 3 4 1c s l p x l 基因的检索与克隆2 1 3 4 2m k v l 5 p w s k 2 9 c s l p x l 菌株的构建与类脂a 结构的解析2 2 3 4 3 阶段小结2 4 第四章结论与展望2 5 4 1 结j 沧2 5 4 2 展望2 5 j 女谢2 7 参考文献2 8 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文。4 0 第一章引言 第一章引言 1 1 脂多糖与类脂a 脂多糖( l p s ) 的研究始于1 8 世纪，被称为热源性物质、腐败毒素或毒烈1 1 。1 8 9 2 年，p f e r i f f e r 发现霍乱弧菌( v i b r i oc h o l e r a e ) 能产生一种热稳定性的非分泌型毒素，被 称为内毒素。后来发现内毒素正是脂多糖的组分，类脂a ( 1 i p i da ) 分子。 1 1 1 脂多糖的组成与功能 脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜外侧特有的结构和功能分子，约占外膜物质组 成的4 5 ，覆盖细胞表面的7 5 。 脂多糖一般由三部分组成，由内向外依次是疏水性的类脂a 、核心寡糖和由重复性 糖单元构成的o 抗原( 或称o 多糖) ( 图1 1 ) 。其中，类脂a 通过k d o 酮糖酸与核 心寡糖连接。每个大肠杆菌细胞表面约有1 0 6 个内毒素分子【2 1 。糖链部分从外膜外侧向 外延伸约1 0n m 。根据是否含有o 抗原结构，将脂多糖分为光滑型( s m o o t h - t y p e ) 和粗 糙型( r o u g h - t y p e ) 。另外，半粗糙型( s c m i r o u g ht y p e ) 脂多糖的o 抗原仅由一个糖 链单元组成。 图1 1 革兰氏阴性肠道细菌细胞壁结构示意图( 左) ；脂多糖结构示意图( 右) 3 1 f i g 1 - 1 s c h e m a t i cr 印r e n t a t i o n so ft h ee n t e r o b a c t e r i a lg r a m - n e g a t i v ec e l le n v e l o p e ( 1 e f t ) ，a l i p o p o l y s a e c h a r i d es t r u c t u r e ( f i g h t ) 凡s r , a n dsi n d i c a t et h es t r u c t u r eo fr o u g h - t y p e ，s e m i r o u g ht y p e ( w i t ho n l yo l l oo - c h m ns u b u n i t ) a n ds m o o t h - t y p el i p o p o l y s a c c h a r i d e s ，r e s p e c t i v e l y 江南大学硕士学位论文 菌膜的形成能力与脂多糖的结构密切相关【4 ，5 1 。细菌菌膜严重影响人类的健康，限 制抗生素的作用，高达8 0 的细菌感染是由菌膜引起1 拘1 6 1 。由菌膜导致的腐蚀和生物污 损问题，严重降低了工业生产产率，并成为致病菌传播的主要途径之一。此外，脂多糖 的组成与细胞结构的完整性，外膜的通透性，细菌的抗干燥能力和耐热性密切相关1 7 引。 阪崎肠杆菌能形成菌膜，并具有耐热性、渗透压耐受性和抗干燥的能力，但是还没有从 脂多糖角度研究的报道【9 - 1 1 】。 1 1 2 类脂a 的结构与生物合成途径 类脂a 是介导脂多糖锚定于细菌外膜的疏水性脂质分子。与o 抗原和核心寡糖相比， 类脂a 的结构较保守。ec o l 的类脂a 由葡萄糖胺双糖组成。在双糖的c 1 和c 4 位上各连 有一个磷酸基团，在c 2 、c 3 、c 2 7 、c 3 位上各连有一分子的3 羟基十四碳初级脂肪酸链。 再在c 2 、c 37 位上分别连有十二碳和十四碳次级脂肪酸链。不同种类的细菌类脂a 的结 构不同，包括脂肪酸链的数量、长度，磷酸集团的数量和修饰等【i 2 。 ec o l i 作为脂多糖研究的模式菌，其类脂a 的生物合成途径，又称r a e t z 合成途径， 需要九种酶的参与【1 3 1 ( 图1 2 ) 。首先，l p x a 以3 羟基十四碳脂肪酸酰基载体蛋白为供 体，催化脂肪酸与u d p 乙酰氨基葡萄糖( u d p g i c n a c ) 的酯化反应 1 4 - 1 6 1 ；接着，经l p x c 催化的脱乙酰基反应【1 7 ，1 8 】，由l p x d 催化第二条3 羟基十四碳脂肪酸的转移，形成u d p 二酰基氨基葡萄糖( u d p d i a c y l g l c n ) 1 9 】。然后，经l p x h 催化u d p 焦磷酸的水解反应， 生成1 磷酸2 。3 二酰基氨基葡萄糖( 1 i p i dx ) 【2 0 2 1 1 。l i p i dx 与其前体分子在l p x b 的催化 下形成1 磷酸双糖 2 2 , 2 3 】。再后，l p x p 激酶催化c 4 ，位的磷酸化反应，生成l i p i di v a 2 4 , 2 5 1 。 接着，两分子的k d o 酮糖酸在k d t a 酶的作用下，连接到c 6 位上，生成k d 0 2 1 i p i d a 1 2 6 ，2 。 最后，经l p x l 和l p x m 的作用，将十二碳和十四碳脂肪酸依次转移到远端氨基葡萄糖的 c 2 ，和c 3 ，位上【2 引。其中，l p x a 、l p x c 和l p x d 是胞质蛋白【1 5 ，1 7 , 1 9 1 。l p x a 和l p x n 是外周 膜蛋 2 0 , 2 1 , 2 3 】，l p x k 、k d t a 、l p x l 和l p x m 是整合型内膜蛋白【2 4 ，2 ”2 1 ，这些膜蛋白的 催化位点面向内膜内侧，从而作用于细胞质水溶性底物。 在ec o l k d 0 2 1 i p i da 合成途径中，次级脂肪酸酰基转移酶l p x l ，以十二碳酰基载体 蛋白为供体，催化十二碳脂肪酸与k d 0 2 1 i p i di v ac 2 位上初级脂肪酸链3 羟基的酯化反 应1 2 9 1 。在体外酶促反应中，大肠杆菌l p x l 也能以较低的反应速率，催化十二碳脂肪酸 在c 37 位上的酯化反应。l p x l 对k d 0 2 1 i p i di v a 具有底物专一性，其反应速率比l i p i d a 的高6 ，0 0 0 倍。l p x l 蛋白由3 0 6 个氨基酸残基组成，大小为3 5 5k d a ，氨基端能形成一个 跨膜螺旋结构域【3 2 1 。通过序列比较分析，发现l p x l 蛋白与3 磷酸甘油酰基转移酶 ( g p a t ) 家族蛋白具有同源性，在n 0 0 4 d e 基序中包含一个催化二元体。尽管反应速 率较小，与g p a t 蛋白家族一样，l p x l 能催化以酰基辅酶a 为供体的脂肪酸转移反应j 。 l p x l 被认为是一种热休克蛋白，其基因缺失突变株在高于3 3 的氮源培养基上不生长， 此时，细胞分裂停止，膜膨胀，细胞慢慢溶解1 3 0 。3 2 】。此外，十四碳酰基转移酶l p x m 与 l p x l 具有很高的序列同源性瞰，3 5 1 。另外，在2 0 下，为保证外膜流动性，脂肪酸酰基 转移酶l p x p 取代l p x l ，将棕榈烯酸连接到k d 0 2 1 i p i di v a 分子上【3 6 ，3 7 j 。 2 第一章引言 图1 - 2 大肠杆菌k d 0 2 - l i p i d a 的生物合成途径【l 3 】 f i a 1 - 2 t h ec o n s t i t u t i v ep a t h w a yf o rk d 0 2 - l i p i dab i o s y n t h e s i si ne c o l i e a c he n z y m eo ft h ec o n s t i t u t i v el i p i dap a t h w a yi se n c o d e db yas i n g l es t r u c t u r a lg e n e t h eg l u c o s a m i n e d i s a c c h a r i d eb a c k b o n eo fl i p i dai sb l u e t h er e dn u m b e r si n d i c a t et h eg l u c o s a m i n er i n gp o s i t i o n so fl i p i d a t h eb l a c kn u m b e r ss p e c i f yt h ep r e d o m i n a n tf a t t ya c i dc h a i nl e n g t h sf o u n di nec o l il i p i da t h ec 2 7 s e c o n d a r yl a u r a t ec h a i ni n c o r p o r a t e db yl p x l i ss h o w ni nr e di nt h ec o n t e x to ft h el i p i dap a t h w a y t h e s i n g l em o l e c u l a rs p e c i e ss h o w n a tt h eb o t t o ml e f tr e p r e s e n t sa b o u t9 0 o ft h et o t a ll i p i dai nec o l i w i t h m o s to f t h er e s tb e a r i n gac 1 2s e c o n d a r ya c y lc h a i na tc 3 7 p o s i t i o n 1 1 3 类脂a 的免疫学作用 类脂a 是一种重要的毒力因子，它能被t o l l 样受体4 复合物蛋白( t l i m d 2 ) 识别， 刺激动物细胞先天免疫应答反应【3 8 4 0 1 。少量的内毒素分子能诱导巨噬细胞合成引发炎症 的细胞因子，如肿瘤坏死因子a ( t n f 0 【) 和白细胞介素d ( i l 1 1 3 ) 4 1 , 4 2 】，并进一步合成 激活获得性免疫所需的共刺激因子 4 3 1 。这些免疫反应能有效的清除原位感染，保护细胞。 然而，当内毒素结构发生改变或修饰，引起细胞因子过量表达时，免疫系统引发的炎症 会破坏微血管，引发高热，加快心率，导致脓毒性休克，甚至死亡1 4 4 。 与完整的类脂a 分子相比，缺少次级脂肪酸链的类脂a 前体分子l i p i di v a 能减少 人体细胞免疫原性的产生，达1 0 3 ，并且与人体t l r 4 m d 2 的识别发生拮抗作用【4 5 。4 8 1 。 其减毒作用在流感嗜血杆菌( h a e m o p h i l u si n f l u e n z a e ) ，鼠伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m ) ，脑膜炎奈瑟氏菌( n e i s s e r i am e n i n g t i d i s ) 和淋病奈瑟菌( n e i s s e r i a g o n o r r h e a e ) 中得到了证实【4 5 ，4 9 ，5 0 1 。因此，阻止次级脂肪酸链与类脂a 前体的酯化反应， 江南大学硕士学位论文 能有效抑制由细菌引起的脓毒性及炎症反应，使活菌疫苗的开发成为可能h 5 ，5 0 1 。另外， 由于次级脂肪酸链的缺失，细菌外膜对抗生素、去垢剂和阳离子抗菌肽的敏感性增强【3 0 ， 4 5 ，5 1 ，5 2 1 1 4 脂多糖的提取与检测 脂多糖的提取与检测技术在其结构和功能研究中起着举足轻重的作用。 不同细菌因脂多糖结构和亲水性的不同，一般采用不同的提取方法。目前为止，有 两种方法被广泛应用，一种是适合于s 型脂多糖的酚水法【5 3 5 4 。另一种是适用于r 型 脂多糖的酯抽提法【5 5 】。这两种方法都能用于脂多糖的大量和微量提取。另外，三氯乙酸 提取法、水抽提法、吡啶抽提法、异丁醇抽提法和s d s 抽提法，用于不同结构脂多糖 的提取5 6 6 0 。由于实验的要求，脂多糖微量提取方法也得到了开发和完善【6 m 3 1 。 对类脂a 分子的提取有两条途径。一是酸性水解脂多糖，再用氯仿甲醇( 2 ：1 ，v ) 溶液萃取类脂a 。这条途径耗时耗材。因此，氯仿甲醇水混合相萃取法被广泛用于类 脂a 的提取2 0 ，6 4 , 6 5 1 。对类脂a 的微提取可采用s d s 辅助水解和异丁酸氢氧化铵微提取 法 6 6 - 6 引。此外，z h o u 等开发了一种针对单菌落的类脂a 提取方法，可用于比较不同菌 落类脂a 合成的差异【6 9 】。类脂a 的纯化主要有两种方法，一种是基于带电荷差异的 d e a e 纤维素离子交换层析陋7 ，7 0 1 。另一种是基于疏水性差异的硅胶板薄层层析 ( t l c ) 【鲫。此外，b i o s i l 柱和c 1 8 反相柱被用于菜豆根瘤菌( r h i z o b i u me t l i ) 和三叶 草根瘤菌( r h i z o b i u mt r i f o l i i ) a n u 8 4 3 类脂a 的纯化1 7 1 7 2 。 s d s p a g e 和银染技术是脂多糖检测的主要手段7 ”6 1 。此外，同位素标记( 3 h 一，1 4 c ， 3 3 p ) 7 3 , 7 7 】，荧光染料( e b ) 6 3 , 7 8 】，负染色( 锌咪唑盐) 7 8 , 7 9 用于脂多糖的检测。薄层 层析技术是常用的类脂a 快速检测方法。与荧光标记技术结合，可以提高样品的检测限 度【3 4 ，鲫。类脂a 结构的解析逐渐成为脂多糖研究领域的热点。目前，一般采用e s i m s 和m a l d i t o 酬m s 解析，而多级质谱串联技术提高了类脂a 结构解析的效率1 8 。 1 2 阪崎肠杆菌的研究进展 1 9 8 0 年前，阪崎肠杆菌被称为黄色阴沟肠杆菌( y e l l o wp i g m e n t e de n t e r o b a c t e r c l o a c a e ) 8 2 1 。1 9 8 0 年，被归为新的菌种e n t e r o b a c t e rs 口尹3 1 。2 0 0 7 年，重新归为一 个新的菌属，即c r o n o b a c t e r 。b a a 8 9 4 和a t c c513 2 9 分属于c r o n o b a c 纪rs a k a z a k i i 和 c r o n o b a c 纪rm u y t j e n s i i 菌种【州。 1 2 1 阪崎肠杆菌的致病性 阪崎肠杆菌是一种食源性致病菌，主要以婴儿配方奶粉为传染源【8 5 髂】，也能通过食 品、婴儿用品及仪器设备传播【8 9 , 则。它主要感染婴儿和新生儿，导致坏死性结肠炎、败 血症和脑膜炎，具有较高的致死率，达4 0 8 0 1 9 1 躬】。1 9 6 1 年报道了首例新生儿感染阪 崎肠杆菌，并导致脑膜炎的病例 9 4 1 。此外，阪崎肠杆菌也能感染免疫力低下的成年人， 引发菌血症和骨髓炎等疾病9 7 j 。 阪崎肠杆菌的毒理学研究刚刚起步。近几年的研究发现，阪崎肠杆菌对上皮和内皮 4 第一章引言 细胞具有粘附和侵染作用，它也能侵染巨噬细胞【9 8 - 1 0 1 1 。最近，人们发现o m p a 外膜蛋 白与细菌侵染内皮和上皮细胞，感染基体肠道细胞，引发细胞凋亡和突破血脑屏障有 关【1 0 2 ，1 0 3 1 。此外，由z p x 基因编码的金属蛋白( z n 2 + ) 也与阪崎肠杆菌的致病性有关【1 0 4 。 1 2 2 阪崎肠杆菌的生化特性及检测 阪崎肠杆菌是一种短杆菌。具有较强的耐热性、渗透压耐受性和抗干燥能力【lo 1 1 1 。 研究发现细胞内的海藻糖与阪崎肠杆菌的抗干燥能力有关【1 0 5 】。另外，通过对阪崎肠杆 菌蛋白质组学的研究，发现了与m e t h y l o b a c i l l u s f l a g e l l a t u sk t 耐热蛋白的同源蛋白f 1 0 6 。 阪崎肠杆菌耐热性、渗透压耐受性和抗干燥能力的研究，对于婴儿配方奶粉及其他食品 的生产、加工和灭菌处理具有理论指导意义。 阪崎肠杆菌的检测方法主要有基于细菌生化特性，如针对a 一葡萄糖苷酶活性的培 养基鉴定技术【1 0 7 j ，和基于特异性基因的p c r 检测技术。此外，针对细菌脂肪酸组成不 同，开发了阪崎肠杆菌脂肪酸指纹图谱鉴定技术【1 0 8 】。同样，基于l p s 组成的不同，我 们也可以建立阪崎肠杆菌的l p s 和类脂a 指纹图谱快速检测技术。 1 3 立题背景与意义 脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜外侧重要的结构和功能分子。它的组成和结构 与细胞完整性、外膜通透性、菌膜的形成能力及细菌抗干燥能力密切相关。更重要的是， 脂多糖的组成部分类脂a ，俗称内毒素，是重要的毒力因子，它与细菌的致病性密切相 关。它能刺激动物细胞，引发先天的免疫应答反应，诱导细胞因子的产生，从而有效的 清除原位感染，保护细胞。由于致病菌类脂a 结构的改变和修饰，动物细胞能被诱导产 生过量的细胞因子，引发炎症反应或脓毒性休克；或者，帮助细菌逃逸免疫系统的攻击， 导致疾病，甚至引起死亡。另外，作为一种锚定于外膜外侧的疏水性组分，类脂a 的结 构对细菌的外膜通透性及生化特性同样重要。 阪崎肠杆菌是一种重要的食源性革兰氏阴性致病菌，它以婴儿配方奶粉为主要传染 源，感染婴儿，引发疾病，致死率达4 0 8 0 。但是，目前还没有关于阪崎肠杆菌类脂 a 及其相关基因的报道。因此，我们希望通过研究脂多糖的组成，解析类脂a 结构，分 析类脂a 合成途径相关基因功能，为阪崎肠杆菌的进一步理论研究和实际控制奠定基 础：l 、细菌菌膜严重影响人类健康和工业生产产率。它的形成能力与脂多糖的组成和 结构密切相关，如缺少o 抗原会阻止菌膜的形成，类脂a 的脂肪酸链组成会影响菌膜 的形成能力。因此，研究脂多糖组成和类脂a 结构对菌膜形成能力的影响，对抑制阪崎 肠杆菌菌膜的形成，防止人类感染，降低细菌抗药性能力，避免生产损失，阻止致病菌 传播，具有重要的理论指导意义和实践价值；2 、阪崎肠杆菌能通过婴儿配方奶粉传播， 是因为它具有较强的耐热性、渗透压耐受性和抗干燥能力。这些特性与脂多糖的组成和 类脂a 的结构有关；3 、通过解析阪崎肠杆菌的类脂a 结构，分析类脂a 合成途径相关 基因的功能，研究类脂a 的免疫学机制，改造类脂a 分子结构，使阪崎肠杆菌疫苗佐 剂的开发成为可能，具有重要的医学价值。 江南大学硕士学位论文 1 4 课题研究内容和研究目标 由于阪崎肠杆菌是本实验室新启用的研究菌株，因此，首先对阪崎肠杆菌 cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 和cm u y ( j e n s i ia t c c513 2 9 进行了活化鉴定、生长特性和分子生 物学操作可行性研究。然后，初步分析了阪崎肠杆菌b a a 8 9 4 和a t c c5 1 3 2 9 的脂多糖 组成。并将课题重心放在b a a 8 9 4 类脂a 结构解析和相关基因功能的研究上。 本课题的主要研究内容和目标包括： ( 1 ) 分析阪崎肠杆菌b a a 8 9 4 和a t c c5 1 3 2 9 的脂多糖组成：通过脂多糖提取和 s d s p a g e 的银染检测，发现两种菌株脂多糖组成的差异。 ( 2 ) 解析cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 的类脂a 结构：首先对提取的类脂a 进行d e a e 纤 维素离子交换层析和薄层层析纯化，经e s i f m s 解析，发现两种结构的类脂a 分子。然 后通过e s i m s 和m s m s 解析类脂a 碱性水解产物的结构，确定两种类脂a 结构的差 异。 ( 3 ) 研究cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 类脂a 合成相关基因c s l p x l 的功能：通过基因序列 同源比对，在b a a 8 9 4 基因组中钓取造成两种类脂a 结构差异的相关基因c s l p x l 。然 后，构建m k v l 5 p w s k 2 9 c s l p x l 菌株，i p t g 诱导c s l p x l 基因的表达。最后，用e s i m s 解析m k v i 5 p w s k 2 9 c s l p x l 菌株的类脂a 结构，初步研究c s l p x l 基因的功能。 6 第二章实验材料与方法 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 茵株、质粒，引物及细菌培养 本课题所用的菌株、质粒和引物列于表2 1 中。cs a k a z a k i ib a a 8 9 4 、cm u y t j e n s i i a t c c5 1 3 2 9 和ec o l i 的培养用l b 培养液或琼脂平板( 0 5 酵母膏，1 蛋白胨， 1 n a c i ，固体培养基中加入2 琼脂) ；b a a 8 9 4 和a t c c5 1 3 2 9 的活化用胰蛋白大 豆肉汤培养基( t s b ) 或胰蛋白胨大豆琼脂( t s a ) ，鉴定用t s a 或肠道菌计数培养基 ( v r b d a ) 。cs a k a z a k i fb a a - 8 9 4 和ec o l i 于3 7 培养，cm u y t j e n s i ia t c c5 1 3 2 9 于3 0 培养。m k v l 5 p w s k 2 9 c s l p x l 的抗生素筛选浓度为：氨苄青霉素1 0 0p g m l 表2 - 1 茵株、质粒与引物 t a b l e2 - 1 s t r a i n s ，p l a s m i d sa n dp r i m e r su s e di nt h i ss t u d y d e s c r i p t i o n s o u r c e s t r a i n cs a k a z a k i i b a a - 8 9 4 c m u y t j e n s i i a t c c5 1 3 2 9 ec o l i w 3 l l o ec o l i 皿订1 0 9 m k v l 5 m k v l 5 p w s k 2 9 c s l p x l p l a s m i d p a c y c l 8 4 p e t 2 8 a p w s k 2 9 p w s k 2 9 - c s l p x l p r i m e r ( 5 一t o37 - ) c s l p x l ( + ) e c o r i c s l p x l ( 一) s a i l w i l d - t y p es t r a i n w i l d - t y p es t r a i n w i l d - t y p es t r a i n r e e a1e n d a1g y r a 9 6t h i - 1h s d r l7s u p f a 4r e l a1 a ( 1 a c - p r o a b ) f t r a d 3 6 p r o a b + l a c i q i a c z a m l 5 w 3 11 0l p x l ：t n l 0 ，l t x c m ：f l c a m ，l p x p ：k a n p w s k 2 9 - c s l p x l c l o n i n gv e c t o r e x p r e s s i o nv e c t o r e x p r e s s i o nv e c t o r e c o r i s a i lc s l p x lc l o n e di n t op w s k 2 9 c g 鱼丛i 丛銎t g a c g c a t t t t a c c g c a a t t ( c s l p x ls e n s e ；e c o r is i t eu n d e r l i n e d ) a c a c g t c g a c a a g g a t t t a g t a