（发酵工程专业论文）大规模生产冰核蛋白制品及冰核活性基因的扩增研究.pdf

中文摘要 中文摘要 研究的意义：由于冰核细菌在许多方面都有着广阔的应用前景，因此大规模 生产冰核活性蛋白，扩增冰核活性基因，用于含冰核基因检测，能够具有很好的 经济前景和社会效益。 研究的方法：( 1 ) 使用发酵法依次在摇瓶水平、孔罐及3 0 l 罐水平上，对完 善培养基配方，提高冰核活性细菌生物量进行了研究，并且使用机械破碎和化学 抽提的方法实现较大量的提取冰核活性蛋白。( 2 ) 使用p c r 扩增技术对冰核细菌 冰核活性基因的体外扩增体系和扩增条件进行了初步的研究。 本沧文分别使用物月f 由伽。月a sa 印e j 月a t s 2 0 6 和府胪砌妇 p 而j c o a ( a 2 5 ) 作为实验用菌种，主要研究内容有以下几个方面：( 1 ) 在摇瓶水平的实验中发现 转速是获得较高生物量和较低副产品黄原胶的关键因素，对于细菌生物量来浇， 影响程度大小的顺序依次为转速 装液量 培养基的糖浓度。对细菌的产黄原胶 量来说，影响程度大小的顺序依次为转速 培养基的糖浓度 装液量。在调整后 的培养基条件下，菌体发酵粘度有大幅度下降，且产黄原胶能力不强，虽然发酵 结束后，菌体生物量有所下降但胶量菌量的值较大幅下降，且降低了发酵液 处理的难度。( 2 ) 采用超声波破碎和t r i t o n x 1 0 0 抽提相结合，建立了适合大规 模提取肠仃拍鲫册a s a 印e ，j 仃刃s 2 0 6 中冰核活性蛋白的实验路线。经过该实验可 以得到，每1 0 克当天得到的新鲜菌体，可以抽提所能得的冰核蛋白制品湿重约 为1 2 克，即得率为1 2 左右。( 3 ) 建立了本实验室提取打如j a 自e ，6 ，c 。，a ( a 2 5 ) 细菌全基因的实验方法；摸索确立了较适合本实验室菌种厅如，a 厅d 西j c d a ( a 2 5 ) 细菌全基因序列为模板的5 0ul 反应体系的各组成量和最佳扩 增条件。经过实验，建立了以打砌妇疗p 而j c 。，a ( a 2 5 ) d n a 为模板，使用k o dd a s h 酶作为扩增酶，获得4 2 k b 目的片段的方法，这在国外报道的纡盯月肠 方e 肋，c 。妇g r 。细菌冰核活性基因p c r 扩增产物片段大小范围内。 关键词：冰核活性细菌 大规模生产冰核活性蛋白提取 p c r 扩增 a b s t r a c t b e c a u s eo ft h ef o r e g r o u n do ft h ei c en u c i e a t i o na c t i v eb a c t e r i a ( i n ab a c t e r i a ) ，a m a s so fi c en u c i e a t i o na c t i v ep r o t e i na n dt h ei c en u c l e a t i o ng e n eh a db e e nd e m a n d e d ， t h e yw e r ed i s p l a y e df a v o r a b l ee c o n o m i ct r e n da n ds o c i a lb e n e n t t h em a i nm e t h o d s ：( 1 ) t h ez y m o t e c h n i c sh a db e e nu s e di ns h a k i n ge x p e r i m e n t ，5 l p o t ，3 0 lp o tt oc o n s u m m a t et h ec u l t u r em e d i u ma n di m p r o v et h ey i e l do fi n ab a c t e r i a u l t r a s o n i ca n dc h e m i ce x t r a c th a db e e nu s e dt o 譬e tam a s so fi c en u c l e a t i o na c t i v e p r o t e i n ( 2 ) t h et e c h n i q u eo fp c rh a db e e nu s e dp r i m a r y l yt oc o n f i r mr e a c t i o n s y s t e ma n de x p a n d i n gc o n d i t i o n i n ab a c t e r i a 。) r 矗圩f 矗d ，竹。盯盘s 日，驴p ，f 门盘( t s 2 0 6 1a n d 。f w f 盯f 盯向e r 6 七。如( a 2 5 1 w e r e u s e di nt h i sr e s e a r c h t h em a i nr e s e a r c h e sf o c u so nt h r e e 矗e l d s ：f1 ) r o t a t es d e e dw a s t h ek e yf a c t o ri ng a i n i n gm o r eb i o l o g i c a lc a p a c i t ya n dl e s sb y p r o d u c tx a n t h a ng u m d u r i n gt h ee x p e r i m e n t t h ei n n u e n c ed e g r e es e q u e n c et ob a c t e r i ab i o l o g i c a lp r o d u c e i nt u mw a sr o t a t es p e e d l i 小l i dc a p a c j t y s u g a rc o n s i s t e n c yi nc u l t u r em e d i u m 1 nt h e c o n d i t i o no ft h ea d j u s t e dm e d i u m ，t h ev i s c o s i t yo ft h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mh a db e e n d e c l j n e dg r e a t l ya n dt h ec 印a b i j “yo fp r o d u c i n gx a n t h a ng u mw a sk e e p i n gi na 1 0 w l e v e l a l t h o u g ht h eb a c t e r i aq u a n t i t yh a db e e nd r o p p e da r e rt h ef 色r m e n t ，b u tt h e n u m e r i c a lv a l u eo ft h ex a n t h a ng u mq u a n t i t y b a c t e r i aq u a n t i t yh a db e e nd e s c e n d e d r a p i d l ya j l dt h ed i m c u j t yi nd e a l i n gw i t hl h ef e r n l e n t a t i o nm e d i u mh a db e e nr e d u c e d a l s o ( 2 ) 1 、h ee x p e r j m e n tf i t t i n gf o rc o s m i c a l l ye x t r a c t i n gi c e n u cj e a t j o na c t i v e 舀r o t e i n i n 鼢 腩。卅。盯盘5 日p p f 加口t s 2 0 6w a st h ec o m b i n a t i o no ft h ec r u s h i n 2b vu i t r a s o n i c a n de x c r a c t i n gb y 丁r i t o 豇x - 1o o a 丘e rt h ee x p e r i m e n t ，i tw a sk n o w nt h a ti c e n u c l e a t i o n p r o t e i nc o u l db ee x t 阳c t e d1 g r a mf r o m1og r a mf r e s hb a c t e r i a s ot h ep r o d u c ey i e l d w a sa b o u t12 ( 3 ) t h ee x p e r i m e n tm e t h o df o re x t m c t i n gt h ew h o l eg e n eo f 点l l ，f 盯曲 向p r 6 i ki nt h e1 a b o r a t o r yh a db e e ne s t a b l i s h e d m a t e r i a lc o m p o s i t i o na n do p t i m a l d n ae x p a n d i n gc o n d i t i o ns u i t a b l ef o r5 0 r e a c t i o ns y s t e mh a db e e ne s t a b l i s h e d t h e e x p e “m e n t sw a su s i n ga 2 5 sd n a a st h et e m p l a t e ，u s i n gk o dd a s he n z y m ea st h e e x p a n d i n ge n z y m ea n df i n a l i yg a i n i n g4 2 k ba i m e dd n as e g m e n t ，w h i c h 、v a s i n c l u d e di nt h es i z er a n g eo f t h ea 2 5 si c e n u c l e a t i o na c t i v eg e n ec o n f i r m e db ya b o a r d r e p o n s 脚，口陆：i c e n u c l e a t i o na c t i v eb a c t e r i a ； s c a l ep r o d u c t i o n ； i c e - n u c l e a t i o na c t i v ep r o t e i n ； e x t r a c t i n g ； p c re x p a n d i n g 天津商学院硕十学位论文 第一章前言 第一章前言 ( 一) 引言 1 1 冰核活性细菌及其冰核蛋白的研究现状 1 1 1 冰核细菌简介 冰核活性细菌( i c e n u c l e a t i o na c t i v eb a c t e r i a ，简称i n a 细菌) 是一类能 在一5 一2 的条件下催化诱发植物体内水分产生冰核而引起植物霜冻的细菌。 1 9 7 4 年，lr m a k i 等i 1j 从腐烂的赤杨树叶中分离出丁香假单孢菌( 丹出竹。口a s s j ，增r 臼p ) ，并发现该细菌可在过冷却水( s u p e rc o o l e dw a t e r ，低于o 时仍呈 液态的水) 中诱导催化形成冰晶，其后s 1 ：l in d o w | 2 1 和h k k i m 等1 3 j 分别又 发现了欧文氏菌属( 厅叮门j a ) 和黄单孢菌属( 肋n 斤d 月a s ) 中的一些种也具有 成冰核活性( 【c e n u c l e a t i o na c t i v i t y ，i n a ) 。研究表明，冰核活性细菌的形 态和生理生化特征是：均属于革兰氏阴性细菌，其中假单孢菌属( 胎“出胛d 月a s ) i n a 细菌菌落呈白色，细菌杆状、极生鞭毛，接触酶阳性，根据在k r 培养基上 能否产生荧光分为荧光假单孢菌类群与非荧光假单孢菌类群：欧文氏菌属 ( 毋叮，7 妇) i n a 细菌菌落呈黄色，杆状，周生鞭毛，在k b 培养基上不产生荧光： 黄单孢菌属( ，括，7 f 扫凸月a s ) i n a 细菌菌落为黄色、杆状、极生鞭毛，不发酵葡 萄糖，不还原硝酸盐，氧化酶阴性，在k b 培养基上不产生荧光。 冰核活性细菌广泛附生于植物表面，尤其是叶表面上。正常情况下植物细胞 中虽然存在着游离水，但即使处于一8 一7 的低温下也不会结冰，称为“过冷 却”现象，它使得植物能够耐受一定的低温，然而当冰核活性细菌存在时，这种 微生物作为最强的异质冰核因子，能诱发冰晶的生成，使植物组织失去过冷却作。 用，进而引起对宿主植物组织的冻伤损害。i n a 细菌来源多，分布广，从小麦， 白菜，黄瓜，胡麻，大麻，苹果，大豆，林蛙等多种动植物身上都能分离得到i n a 细菌。其中丁香假单胞菌( a o “如o 日s5 i n 譬口p ) 是分布最广，活性最强的i n a 细菌之一，这种菌在世界不同地区的许多植物上都有分布，它的许多菌株在2 就能形成冰核。i n a 细菌的种类和数量受地理纬度、气候条件、植物种类及不同 季节的影响和制约，在地球上的分布存在着明显的差异。我国幅源辽阔基本涵盖 天津商学院硕士学位论文 第一章前言 了冰核活性细菌的种类，目前在我国发现的冰核活性细菌共有3 个属1 9 个种或 变种【4 j ，其中，p 胎增抽，j s ，b p “出a ss p ( 非荧光菌) ，p 置y r ，丑卵pp v s ， e b e r b i c o i a w s 。e a m y l o v 01 a p n s ，x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s p c e r e a i i s 这六个种为国内外首次记录具有冰核活性的细菌，而a 册占和ps j 丑明日 为我国优势种类其中咫e “出啪船s 砂厂棚即日具有较高的冰核活性，并且为华 北地区植物霜冻损害的主要致病冰核活性细菌。 1 1 2 冰核活性蛋白的分类及冰核活性蛋白的结合方式 1 9 8 1 年y a n k o f s k y l 5 j 等将冰核细菌产生的冰核蛋白物质分为三种类型：一型 冰核( t y p e i ) ，在一2 以下有冰核活性，这种类型的冰核活性是最强的；二型冰 核( t y p e l i ) ，在一5 以下有冰核活性，它的冰核活性要弱于一型冰核；三型冰 核( t y p e i i i ) ，在一7 以下有活性，冰核活性是最弱的。1 9 9 0 年1 1 u r n e r 【6 】更精 确的划分了三种冰核的活性温度范围，分别是一4 4 以上：一4 8 、5 7 和 7 6 以下。在国外的研究中【7 j 还采用了两个重要的参数来表示冰核活性的大 小，即成核温度与产冰核频率。成核温度( n u c 】e a t i o nt e m p e r a t u r e ) ：是指相 同浓度的冰核活性细菌在指定的时间内可以产生冰核的最高温度。指定时问一般 为2 分钟，临界温度越高冰核活性就越强。产冰核频率( f r e q u e n c y ) ：即在一定 温度下一个细胞表达的冰核活性蛋白形成冰核的几率。例如：一5 时每滴菌悬 液l oul 中含有1 0 i 个细胞刚好可以形成一个冻滴，而过少的细胞则不能形成冻 滴，那么在此温度下该菌的产冰核频率为1 0 ，产冰核频率越高它的冰核活性就 越高。l i n d o w 【2 j 关于冰核活性的公式为： 式中：n ( t ) 是在温度t 下的产冰核频率，f ：未冻滴的百分比，v ：液滴的 体积。 冰核活性蛋白是一种膜结合蛋白，其表达形式一般有四利，：冰核活性蛋白分 布在天然冰核活性细菌的外膜上( 如尸叫r 加g d e ) ；以无细胞冰核( c f n ) 的形式 自发分泌到培养基中( 如e 矗e r 6 f c o 如，但它产生的冰核活性蛋白主要分布在外 膜上) 【8 】；l n a z 基因克隆后在大肠杆菌中表达的冰核活性蛋白有的结合在内膜上， 天津商学院硕士学位论文第一章前言 有的则以包含体的形式存在。根据1 9 9 1 年t u m e r 和k o z l l o 任的研究报导【9 j ，冰 核活性细菌表达的强冰核活性物质，仅仅靠细菌的冰核活性蛋白成分是不够的， 实验发现了磷脂酰肌醇、磷脂是冰核蛋白复合物的主要成分，而且是必要成分。 到9 0 年代，i n a 基因的克隆工作有了一定的进展，实现了以包含体形式的 口，? d h 娜i n 1 0 的i n a a 基因在ec o f f 中大量表达，并经2 t r i t o nx 一1 0 0 抽提四次， 以不溶性沉淀的形式得以纯化，分子量为1 3 0 k d a ，在5 以上保持冰核活性， 甚至在脂类等膜组分缺乏时还有冰核活性，但活性比天然蛋白差的多。而尸 s y ，咖w ps 2 0 3 的i n a z 基困在巨c o ，i 中大量表达的冰核活性蛋白，只有在i32 才有冰核活性。基因工程的实验结果显示，以包含体的形式获取的冰核活性物质， 其冰核活性得到了较好地保留。陈庆森等人i l l 】采用差速离心法分离出有活性的冰 核活性蛋白组分，经过s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，冰核活性蛋白是一 种由高保真的4 8 肽的单体形式装配而成的多聚体，这一结果与w a t a n a b e 和 a r a i l l l o 】所获得的结果是一致的。 1 2 冰核活性蛋白表现冰核活性的结构基础 1 2 1 冰核蛋白基因特征及其冰核蛋白的一级结构 冰核细菌之所以具冰核作用，是由于冰核细菌具有j ，7 a 基因，这对表现其冰 核活性是必需的。近年来，冰核活性基因序列已陆续披分析克隆得到。1 9 8 5 每队p s e u d o 砸o n a ss y r i n g a e 日j j 导李q i n a zu3 、，、9 8 黾年状p f j u o r e s c e n s 中 得到j 刀a w ；1 9 8 9 年从咫p “咖。月a ss ”j ，7 羽e 中得到j ，7 击【1 5 】，同年从，砌，a 自e 而a 中得到j ，7 a e ；且j 门a a 也从日月a 朋s 巾得到：1 9 9 0 年，从 肠门拍伽伽a 5c 目印e 5 f ，印nf 憎，7 s ，c o 门s 中得到j 门碳； 1 9 9 4 年，从 e p 如阳瑚中得到j 加u 1 1 9 】；1 9 9 5 年，从眙p “如册n a s 置盯j ，坫饵。中得到j 几a v f 2 0 】； 这些基因都有一个丌放的阅读框，大小约3 6 0 0 k b 到4 0 0 0 k b 【2 1 】，研究结果发现，对 冰蛋白基因的序列分析表明，冰蛋白基因问同源性为6 5 8 6 8 6 【2 2 j 。 目前，研究已经证实冰核活性基因是由三个完全独立的结构域组成，n 一末端 结构域、c 一末端结构域、中间重复序列r 一结构域。冰核基因的显著特点是中间部 分碱基周期性重复，每个重复区含保守的2 4 个碱基对序列，但并非完全保守， 天津商学院硕士学位论文 第一章前言 g c c g g t t a t g g c a g c a c t g a c c ，即在所有的这些基因中发现了重复的八肽a g y g s t l t 相对应的不完整的重复d n a 序列 2 3 】。另外，g r e e n 等人对来自尸掣r j 螂ps 2 0 3 的，加冰核基因进行了系列的基因重排，在不改变其阅读框前提下，破坏了 j n a z 基因重复区域的1 6 肽的周期性，结果发现细胞的冰核活性降低，尤其较高温 度下的冰核活性损失最严重【2 “。只要保持4 8 氨基酸单位的重复的周期性，缺失对 冰核活性影响较小，甚至可以去掉6 8 个8 氨基酸重复单位仍不完全丧失冰核活性， 证明冰核基因重复区的肽段对冰核的形成作用是独立的【2 “。中间重复序列对冰核 活性的表达起着重要作用| 2 。c 、n 两端结构区域对冰核活性蛋白的稳定表达也有 不可忽视的作用1 2 3 】。1 9 8 9 年， k e i k o 等人发现冰核活性基因在n 一结构域切除之 后，表达蛋白的冰核活性要低于野生型冰核蛋白的活性，但降低的程度并不太明 显；当从n 一末端进一步切除r 一重复区某一部分序列时，表达的冰核蛋白的冰核 活性进一步得到丢失，但其仍保有一定活性，只有当冰核基因的n 一端结构域以 及r 一重复区域的大部分都丢失时，冰核蛋白的活性爿。完全丧失l ”l 。对j 门a ，进行 缺失分析表明：n 一端结构域缺失会导致i 型冰核( 冰核活性为2 5 ) 失活，但 细胞仍可产生活性较低的i i 、i i i 型冰核( 冰核活性为一5 一7 、一7 9 ) 1 2 3 】。 而c 一末端结构相对亲水，1 9 9 5 年，m i c h i g a f f 【i 进一步通过检测了c 端氨基酸残基的 对冰核活性的影响，用毋叮月妇“，e 面r o ，a 的如a d 蛋白作材料，对它的c 一末端 作出了精确的突变分析，冰核活性分析表明位于c 末端的1 2 个氨基酸残基并不 是必需的。但是，如把包括m e t 2 9 在内的c 一末端的1 3 个氨基酸全部剔除，将会导 致冰核活性几乎完全丧失。且逐步缺失c 一端序列会造成各种类型冰核的完全丧失 【2 5 】。1 9 9 8 年w a t a n a b ek 1 2 3 】等人利用p c r r l f p 对2 0 种源于植物和昆虫的打砌妇 力e 而，c o 矿g r o u p 细菌进行了分析，研究发现其n 一末端结构域和c 一术端结构域的 p c r 产物具有相似的大小；而对包含中间重复序列r 一结构域整个基因进行扩增的 p c r 产物有显著的变化，变化范围在3 8 4 4 k b 之问，进一步刘冰核基因的r f l p 分析揭示了中间重复序列r 一结构域，9 川i i 位点到锄i 位点区矧是变化的，并将 2 0 种i n ( i c en u c l e a t i o n ) 基因分为1 2 类。该研究证实了冰核蛋白基因中间重复 序列r 一结构域是表现冰核蛋白活性差异的主要片段。 通过对冰核活性细菌基因的分析研究表明，冰核活性基因具有高度的同源 性，保持基因的完整性是表达i 型冰核活性蛋白的基础。 天津商学院硕十学位论文第一章前言 从n “如珊o n 卯炒j n 朋p 预测的i n a z 可表达一个含有1 2 0 0 个氨基酸的蛋白 质，其分子量约为1 2 0 k d a ，而实际克隆到大肠杆菌中得到的冰核活性蛋白的分 子量为1 5 3 k d a 。e 口开口 船的l n a a 基因克隆后表达的冰核活性蛋白的分子量 为1 3 0 k d a 【7 2 】，p “o 陀s c e 瑚的腑订基因克隆后表达的蛋白分子量为1 8 0 k d a 【7 3 】。 n d t 船滴n艮a 帅。勘c 卅a m b i n 图卜1 冰核基因的基本结构 f i g 1 一lt h es t r u c t u r co fi c en u c l e a t i o ng e n e 自冰核活性细菌被发现以来，研究者们一直关注冰核活性基因以及冰核活性 蛋白的结构，近期报道了冰核活性基因的一些研究的新进展。a n g e l ar e d w a r d s 等人研究冰核细菌冰核活性基因进化时发现，用长度为8 0 0 b p 的来自肋月 伽o n a s ca 1 1 p e s t r is 瓠 i n j j r j j ；鱼竞段，武e r w i n i ah e r b i c o l a 、p s e u d o m o n a ss y r i n g a e 、 船门拍彻d 加s 。舢p e s ，拈、p 仃“o ，p s c e ，7 s 菌属的共4 9 株菌株进行杂交实验，各 菌属均有一部分j 门a + 、j 门a - 菌株出现杂交现象；用3 末端片段杂交，各菌属j ，才 和，门日。均有杂交；说明冰核活性基因j ，7 a 存在二态。进而解释存在这种现象可能 的三种假说：( 1 ) 持久存在二态形式，所谓二态，即具有冰核活性的一种或多种 细菌增殖过程中，冰核活性基因缺失而造成的j 厨现象。( 2 ) j 门a 基因存在水平 转移现象，在进化过程中活性基因可以转移至一种或多种不同的菌种中而使其具 有冰核活性。( 3 ) 冰核基因具有来源不依赖性。因此，a n g e l ar e d w a r d s 等人 推测，冰核活性基因是由共同的古基因分化来的。w o l b e r 等人推测这种基因的 水平转移可能是通过附生植物群体成员之间相互结合而完成的。1 9 9 8 年， h e u n g c h a ej u n g 等人将来自p 置圹，培a pk c t c l 8 3 2 的用国川和肪卯i 消化后 的具有冰核活性的基因片段p g i n p 2 1 连接到用相同的这两种限制性内切酶消化过 的质粒载体p u c l 9 上，该质粒上连有可表达出c m c a s e 活性的基因片段，将重组子 转入ec d j 中表达融合蛋白，发现8 5 的c m c a s e 活性在外膜上，说明该融合蛋白 表达之后，进一步锚定在细菌的外膜上，从而证实冰核活性基因本身具有指导分 泌和锚定的信号肽序列，且发现冰核活性基因的中间重复序列对于冰核活性蛋白 锚定于膜上并不是必须的。研究结果显示，冰核基因的中间r 一结构域表达的重 复肽段在冰核蛋白组装方面的作用也不容忽视。该重复序列富含芳香族氨基酸和 天津商学院硕士学位论文第一章前言 甘氨酸，这些特征性的氨基酸队冰核蛋白的折叠具有重要作用。2 0 0 0 年，m i l l e r l 2 9 j 等人发现当培养基中蔗糖、果糖或山梨糖是厅勘妇力p 而j c d 妇中的j 月a 正表达冰 核活性所必须的，同时，还发现，同是作为报告基因，j 加辟e ，a c 研口占仂灵敏度 高，且对蔗糖这类信息分子作出反应应答所需的量也少。在蔗糖浓度相同的条件 下，如c 夙e 灵敏3 0 0 倍，但当蔗糖浓度同为l _ 4 5um 时，j 门a 珀q 灵敏度比厶露 高3 0 倍；当蔗糖浓度同为2 9 1 0 3 um 时，j 册拍q 灵敏度比肠g 缟6 l o o 倍。且总结 出在，朋z 、儿c z 、占劫三种报告基因中，7 a z 是最有效最灵敏的，其次是妇c z ， 最后占仞。且还总结出一个完整细菌细胞生物传感器包括打j n 妇疗p 肋j c o ，a 细 胞，在其内部有一个对蔗糖和果糖都有应答的启动子s 盯只启动子后面连上j 门a z 或者占纠艮告基因均可，其表现就是在糖依赖条件下表达冰核活性蛋白或g f p 蛋 白。2 0 0 2 年，e h u dg a z i t 【3 0 】对含有芳香族氨基酸的八肽重复序列的研究表明，苯 环的平面特殊构象使得它与生物大分子自我组装过程中形成超分子结构有关，而 由r 甘氨酸不含手性碳原子的特点，使得它在碳链【 j 获得最高的构象自由度，这 种结构不是偶然的，它在冰核蛋白组装过程中帮助形成0 一折叠起着重要的作 用。2 0 0 4 年，m a r i o nb r o d h a g e n 川等人发现，将j 门a z 作为报告基因分别和表达滕 黄绿脓菌素三种基因p 坩、卢f f 、p f 脚成合成基因，外源藤黄绿脓菌素的存在 可以增强合成基因的转录活性，且与生产+ 藤黄绿脓菌素的细胞共同培养可以诱导 此种合成基因的表达。2 0 0 5 年，h e l e n ef e i 一2 】等人在做份p u 出m o 月a s 置r ，j ，7 船p p r s y ，培a 吕b 7 2 8 a 和咫e “d b 胛。门a s 置盯聊pp n 凸册f dd c 3 0 0 0 两种菌株全基因比 较时，发现眙_ 5 8 7 2 8 a 中冰核活性基因咫r ，1 6 0 8 的存在有着与众不同的特征，它是 插入在一个可交换位点。该菌同时还具有编码抗冻蛋白的基因咫r 加9 3 l ，该基因 和另外一个包含两个糖基转移酶的操作元基因愚y 加9 2 9 一0 9 3 0 偶联在一起。在与 这个偶联基因元相对的另一条链上是编码i 型分泌系统复合物的三个基因 墨r 加9 3 3 一0 9 3 5 。据推断，这些基因共同参与抗冻蛋白的糖基化和分泌，且p 置盯j ，珊p 菌属所表现出来的冰核活性之所以数量上繁多，是由于这种抗冻蛋白的 调节所至。 2 0 0 5 年，刘静、陈庆森等人设计合成了适合冰核活性基因j 月a 别率 外扩增的上下游引物，并对本实验室保减的菌种府如妇卉e m j c d 妇( a 2 5 ) 全基 因进行p c r 扩增，成功获得了长度为4 2 k b 的扩增片段，在1 9 9 8 年国外报道的 丘抽妇 日而j o o ，矿g r o u p 细菌p c r 扩增产物长度范围内。 天津商学院硕十学位论文第一章前言 冰核活性细菌之所以具有生冰核活性是因为含有特异性的冰核活性蛋白 ( i c e n u c l e a t i o na c t i v ep r o t e i n s ，i n p s ) ，研究发现【3 3 1 各种i n a 细菌的冰核 活性蛋白具有相似的一级结构( 如图1 ) ，这种蛋白质由三个可区别的结构域组 成：一个是独立的n 一末端结构域( 占整个序列的1 5 ) ，该结构域是相对疏水 的：一个是独立的c 一末端结构域( 占整个序列的4 ) ，因为该结构域富含碱性 氨基酸残基而高度亲水：中心高度重复的四十八肽构成的结构域( 占8 l ) ，四 十八肽中特异地富含a l a ，g l y ，t h r 和s e r ，因此具有显著的亲水性：同时也观 测到该重复区域在结构上表现出高度保真性，是表现冰核活性最重要的模板。 容易断裂的部位 g甲g 中心重复 i 独特的c 一末端l 结构域( 1 5 ) r _ 一i 结构域( 8 1 ) il 结构域( 4 ) 牟w ( 4 8 肽) 图卜2 典型的细菌冰核活性蛋白的一级结构示意图 f i g 卜2a s c h e m a t i cr e p r e s e n t a 廿o no ft h ep r i m a r ys t r u c t u r eo f l 帅i c a l b a c t e r i a ll c e - n u c i e a t i o na c t i v ep r o t e i n s 习 天津商学院硕士学位论文第一章前言 1 2 2 冰核蛋白的二级结构预测 当从氨基酸序列预测蛋白质二级结构的g a r n i e r 规则系统用于冰核蛋白质 时，发现冰核蛋白的非重复的n 一和c 一末端结构域是由n 一螺旋和b 一链组成的球 状蛋白质组成，其中心重复区域由交替的b 一链和无规则卷曲组成【3 4 1 。另外，高 级结构模型的预测也表明在冰核蛋白结构中存在b 一链。因为( 1 ) 在预测结构 b 一链的每一个转点处都含有一个最适合肽链弯曲的氨基酸残基保守性甘氨 酸残基。2 0 0 2 年e h u dg a z i t 对含有芳香族氨基酸的八肽重复序列的研究表明， 苯环的平面特殊构象使得它与生物大分子自我组装过程中形成超分子结构有关， 而由于甘氨酸不含手性碳原子的特点，使得它在碳链中获得最高的构象自由度， 这种结构不是偶然的，它在冰核蛋白组装过程中帮助形成b 一折叠起着重要的作 用【3 。而高度保守性的苏氨酸和丝氨酸仅在b 一链的中间出现，它们可能是作 为冰似模板行使功能( 2 ) 在每六个八肽的转点处( 甘氨酸应该出现的位置) 出现 了h 氨酸残基的缺失，防止了在这个位置的弯曲，从而产生了4 8 肽的重复单位。 ( 3 ) b 一链的长度也与已知的具有0 一链( 通常6 至8 个残基) 蛋白质的0 一 链平均长度相符【3 5 】。下面是来自咫p “豳册月a s 占盯如卵p 菌株中的尼e ，7 c 船，鲫 d p 如仃加的中间区域4 8 肽单元的结构示意图。 图卜34 8 肽重复单元折叠结构 f i g 1 3 t h ef o l d i n gs t l i c t l i r eo f4 8r e p e a tp e p t i d e 1 2 3 冰核蛋白三维结构研究的现状： 在冰核活性蛋白一级结构有了深入的研究后，科学家们把目光投向了它的三 天津商学院硕士学位论文第一章前言 维结构的研究。但是还是遇到了好多难点，如：大的膜结合蛋白诸如冰核蛋白 很难获得结晶：既然氨基酸序列表明多数类型冰核蛋白并不是球形的，所以冰核 蛋白不符合x 一射线分析的要求。因此，导致直接的实验方法如x 一射线结构分析 不够能应用于冰核蛋白三维结构的研究。人们对其的研究只能是探索性和理论性 的研究。 在1 9 8 6 年【3 6 1 ，w a r r e n 等人首先提出了冰核蛋白的结构模型，其认为在分子 水平上冰核蛋白的结构在很大程度上是由b 一链组成，以4 8 肽单位为结构单元， 具有类似于冰的三棱柱形或六棱柱形结构。但是该模型与蛋白构成原理存在明显 的分岐，例如模型中所提到的b 折叠结构是扁平的，而蛋白质实际结构往往是 立体的而且有卷曲的。随后m iz u n o ( 1 9 8 9 ) 又对冰核蛋白的结构提出了新的假 说，认为浚模型只具有近似于六棱柱的一种排列。但其仍具有一些缺点，如模型 结构中缺少用于稳定冰样模板所需的紧密折叠结构：模型空穴中的水分子并不能 形成冰核所必须的氢键。 基于此，1 9 9 3 年k a j a v a 和l 。i n d o w f 3 8 】从全新的角度推测了冰核蛋白的三维结 构，他们提出冰核蛋白的二级结构是由p 链构成的类似于冰晶的结构，反向平 行b 链通过彼此的的侧链结合在一起，形成类似于棱柱的三维结构，而冰核蛋 白的n 一和c 一末端结构域是球形的，被中心高度重复的冰晶状结构连接起来。此 外冰核蛋白的中心高度重复区域由于缺少非极性氨基酸残基，不能形成疏水中 心 这样冰核蛋自在溶液中可能没有固定的三维结构。 1 2 4冰核蛋白高级结构的模型 通过以上对冰核活性蛋白研究的结果以及推测，我们认为1 9 9 3 年k a j a v a 和l i n d o w 提出的冰核蛋白结构模型比较符合事实和理论推测。如图1 4 ： 天津商学院硕士学位论文第一章前言 图卜4 三个冰核蛋白单体所形成的低聚体平面结构图 我们可以看出，中心重复区域中的8 肽首先形成一个p 一链状结构，随后 4 8 肽重复单位中任意的两个8 肽单位要形成个发夹结构，共形成三个这样的 结构单位，从而进一步组成了以4 8 肽基本的重复单位。图如左下边，宽的箭头 代表b 一链，连接这些箭头的细线代表氢键。大写字母对应于最保守的氨基酸 残基。整个分子中具有高度保守性的八肽在图中以黑色表示。右下图是2 个4 8 肽为基本的重复单位所组成的空间折叠。高度保守性区域( 黑色箭头) 都处于 4 8 肽预测结构的同一面。另外，在膜平面，冰核蛋白单体所形成的低聚体的如 图所示，图中为3 个i n a z 冰核蛋白的单体所组成的简单低聚体，黑色的区域为 二个连续的4 8 肽重复单位。 1 3 冰核活性细菌发酵生产冰核活性蛋白的研究现状 人们为了获得大量并具有高冰核活性的细菌对于冰核细菌的发酵条件做了 大量的研究。结果表明影响冰核细菌发酵结果的因素有很多，其中最重要的因素 有：培养基组成，培养时间，培养温度，p h 等。 天津商学院硕士学位论文第一章前言 1 3 1 培养基组成对于冰核活性细菌发酵的影响 培养基的组成对于冰核活性细菌的发酵结果有很大的影响。即使是同一种菌 株在不同的培养基上培养所得到的结果也是有很大差距的。要获得高产量的冰核 活性细菌就要选择或优化出一种合适的培养基。培养基中所含c 源，n 源和一 些营养因子对于冰核活性细菌的发酵情况有很大的影响。 不同的菌利，所需要的c 源是不相同的，即便是相同的菌株，如果选用不同的 培养基培养，那么所需要的c 源也是不相同的。一般来讲在培养基中添加甘油或 蔗糖作为c 源就会提高细菌的冰核活性。本实验室刘健等人以勘 砌。 d 5 册2 p p ，f n 日t s 2 0 6 为实验菌利，研究得出，以乳糖为c 源发酵生产j 白”腩o o 月d s d ，印p ，j 月口t s 2 0 6 可以获得较高的冰核活性和生物量。本实验室的高秀芝等人又 对草生欧文氏菌a 2 5 ( 口砌妇厅e 砌j c d 拍，该菌株来自中国科学院微生物研 究所) 的发酵条件进行研究发现，如果以m p d a ( 马铃薯蔗糖培养基) 为发酵基 本培养基，那么以半乳糖为c 源所得的菌体生物量最大，相对应的冰核活性最高。 但是若以l 培养基( 一种组合培养基) 为基本的培养基，那么山梨醇则为最佳的 c 源。m i c h e l e 对于p s p “出胛a ss ”砌船甜1 的培养条件研究发现，山梨醇为 最佳的c 源。在c 源缺乏，c 源和p 源，c 源和n 源，c 源、n 源和p 源的联合缺 乏的条件下并不能诱导冰核活性细菌表达出较高的冰核活性。 培养基中的n 源和一些微量元素是冰核活性细菌生长所必需的 4 2 1 。但当细菌 对数生长期结束进入稳定生长期时，n 、p 、s 、f e 的分别缺乏和n 与p 的联合 缺乏均可以诱导细菌表达较高的冰核活性，尤其是低n 和低p 水平能最有效的诱 导a 型冰核( 一种活性最强的冰核) 的表达。m i c h e l e 研究报道：在培养基中 某些营养因子的缺乏可以诱导冰核活性细菌表达较高的冰核活性。1 9 9 2 年， l a w l e s s 【4 3 j 通过化学计算限制培养基中n 源的含量，利用液体培养基培养 卢s p “口锄伽a s 妙，j 韶。获得了较高的冰核活性，并申请了专利。中困林业科学 研究院晁龙军1 4 2 】等人研究发现，如果用化学合成的培养基培养冰核活性细菌，通 过化学计算限定培养基中n 源的用量，可以在一5 获得最大的冰核量，但是无机 氮没有有机氮利于丁香假单胞菌( p s 刚砌册。仃a s 掣r j ，u 弭e ) 生长。所以冰核细菌 发酵必须解决生物量和生物活性之间的矛盾，以便可以在高产量的条件下使细菌 保持较高的冰核活性。实验证明这种矛盾可以通过流加发酵的途径解决。另外 天津商学院硕士学位论文第一章前言 本实验室高秀芝【8 2 1 等人对草生欧文氏菌a 。这一菌种研究发现，在发酵过程中， 当p 的浓度在1 m o l 几一1 0 m m o l l 变化时，有可能适当的提高发酵产物的冰核 活性和生物量，但是当p 的浓度高于1 0 m m o l l 的时候就会抑制菌体的产生和冰 核物质的形成。 除了培养基中的c 源，n 源，p 源的含量可以影响冰核细菌的发酵情况，还 有许多的因素电可以影响冰核细菌的发酵情况。w a t a n a b e 等研究( 1 9 9 4 ) 报道： 用热水抽提的方法从菜籽中得到一种物质，经鉴定是4 一羟基一3 一硝基苯乙酸。如 果用微量的这种物质加到黄单胞菌( 勋 ， o m o n sc o ，印p s ，“x c 一1 ) 的培养基 中则会大大的提高细菌的冰核活性。w a t a n a b e 等f 4 5 1 研究还发现，在培养黄单胞 菌( 勋n ， o m o 月甜c 臼p p s ，r 括l n x c 1 ) 的时候在培养基中加入适量的乳酸可以有 效的抑制黄单胞菌在发酵过程中产生黄原胶，从而在不影响细菌冰核活性的丽提 下提高细菌发酵所得的生物量。l i n d o w 4 6 1 总结报道：用玻璃器皿柬培养冰核细菌 可以提高冰核细菌中有活性的细菌所占的比例，也可以提高冰核细菌作用的温 度。p o o l e y 和b r o w n 两个人均研究报道过，用固体培养基培养冰核活性细菌比 用液体培养基培养所得的冰核细菌的活性高。用化学限制培养基培养 眙日u 出册。月a s 砂r j ，t 驴e ，在培养到对数生长期的中后期时可以获得较高的冰核活 性。本实验室高秀芝【8 2 】等对于草生欧文氏菌a ：j ( 打砌妇卉p ，6 j c d 如，该菌 株来自中国科学院微生物研究所) 研究得出：在培养基中添加一定量的丝裂霉素 c 可咀有效的提高细菌的冰核活性，但是严重的抑制了细菌的生长。本实验室陈 庆森【4 8 】等人对p s e u d o m o n a ss y r in g a eq f 一9 5 一f 1 9 研究发现：选择性培养基有利 于该细菌生物量的积累，而诱导型培养基则有利于该细菌表达高活性的冰核蛋 白。 1 3 2 培养温度对于冰核细菌发酵情况的影响 一般来讲冰核活性细菌的最适生长温度在2 8 左右，但是较高的温度对于 细菌的冰核活性有较强的抑制作用。研究表明【42 j ：当温度超过2 5 的时候，随 着温度的升高，冰核细菌的冰核活性会逐渐丧失。如果用较低的温度去培养冰核 细菌，虽然可以获得较高的冰核活性，但是所得菌体的生物量却不尽人意。因此， 冰核活性细菌一般在2 0 下培养【3 9 】。研究发现，大部分的冰核细菌在发酵培养 天津商学院硕士学位论文第一章前言 的过程中冰核活性受低温诱导的作用。r o g e r s 研究发现丘毗打p 而j c 。厶在3 0 培养2 4 h ( 此时细菌的生长出于对数生长期的后期) ，然后在5 下贮存2 h ，细 菌的冰核活性有明显的提高。n e m e c e k 指出户s 功髓日在3 0 条件下培养只 能产生c 型冰核，若在细菌的稳定生长期，把细菌低温( 1 4 1 8 ) 处理3 0 m j n ， 能诱导a 型冰核的出现，大大提高细菌的冰核活性。a 型冰核低温诱导现