（发酵工程专业论文）固相萃取—高效液相色谱法分离并测定食品中多种生物胺的研究.pdf

摘要 摘要 在生命体内通常把除了氨基酸、多肽、蛋白质以外的带有氨基基团的生物活性物质 称为生物胺，其中包括多胺和单胺。最受学术界关注的生物胺是多胺类，其中包括腐胺、 精胺、精脒、尸胺等。动物实验和临床研究都发现肿瘤生长程度和局部组织、体液内多 股浓度t t i h 关，认为测定组织和体液中多胺浓度可作为诊断、监视肿瘤及评价治疗效果 的有效手段。多胺还是植物生长、发育的调节物，影响着植物细胞的分裂、形态形成和 衰老。食品中含有高浓度的多胺可引起中毒。 腐胺还可见于腐败食物中，腐胺浓度高低也常常是判断食物是否新鲜的重要指标。 蕾股中的组胺常见于水产品之中，当鱼制品中组胺含量达到4 m g g 时即可引起中毒。 生物胺的检测方法主要有生化法、纸层析、薄层层析、气相色谱法、放免法、放射酶法、 毛细管电泳法、离子色谱法和高效液相色谱法。其中高效液相色谱法由于具有高效、准 确、快捷等优点成为目前最受推祟的生物胺测定方法。衍生物的制备，可分为柱后和柱 前衍生。前者包括茚三酮法、邻苯二甲醛法、荧光胺法；后者包括甲苯磺酰法、荧光胺 法、丹酰氯法、苯甲酰氯法、笏酰氯法、二苯二乙胺法等。 本文研究的是用柱前衍生_ 固相萃取一反相高效液相色谱一荧光检测器方法测定 红酒和黄油中七种生物胺( 色胺、酪胺、组胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺) 的残留量的 方法。 实验探讨了检测食品中七种生物胺的色谱条件、衍生化条件和固相萃取条件，对方 法的线性关系、回收率、最低检出限、重现性进行了研究，并对方法进- t 5 - t 验证。研究 结果表明在被测样品中加入9 m l m l 丹酰氯衍生剂，然后加入p h 值为l1 5 的缓冲溶液， j 二6 0 。c 水浴1 5 m i n 条件下完成衍生。生物胺的衍生物经o d s c 1 8 固相萃取净化柱净化 后t - 机检测，在激发波长= 3 4 0 n m 发射波长= 5 1 5 n m ，柱温2 5 条件下，采用o d s 3 色 谱柱，流动相用乙腈和水梯度洗脱，在2 0 m i n 内七种生物胺衍生物得到完全分离，色谱 分离效果好，分离度高。本方法测定红滔中七种生物胺的平均回收率分别为： 7 6 2 9 7 7 ；变异系数( c v ) ：o 5 2 4 3 7 5 ；测定低限( 1 a m 1 ) 为：4 4 8 x1 0 - 5 1 6 1 0 。黄油中七种生物胺的平均回收率分别为：8 0 4 8 9 1 ；变异系数( c v ) ： 3 5 2 6 7 5 ；测定低限( m g k g ) 为：2 7 1x1 0 - 51 3 6 x1 0 。方法的检测低限、回收率、 摘要 精密度均满足残留分析要求。 本方法具有操作简单、检测时间短、多组分检测、检测限低、易于掌握和推广等优 点，可用于酒类、饮料和黄油、奶酪中多种生物胺的测定，也可以作为富含蛋白质而又 容易变质的肉类、水产品及奶制品品质监控和建立肿瘤疾病早期化验诊断方法的参考。 关键词：固相萃取；高效液相色谱；测定生物胺；丹酰氯；红酒；黄油 i nt h el i f eb o d y ，t h el i f ea c t i v es u b s t a n c ew i t ha m i n og r o u pe x c e p to fa m i n oa c i d 、 p o l y p e p t i d e 、p r o t e i n i sn a m e db i o g e n i ca m i n e ，i n c l u d i n gp o l y a m i n ea n dm o n o a m i n e ， p o l y a m i n ei n c l u d i n gp u t r e s c i n e ，s p e r m i n e ，s p e r m i d i n e a n dc a d a v e r i n ei st h em o s t a t t e n t i o n g e t t i n g d i r e c t i o ni nt h ea c a d e m i c s o c i e t y i t i sd i s c o v e r e df r o ma n i m a l e x p e r i m e n t a t i o na n dc l i n i c a ls t u d i e st h a tt h eg r o w t ho ft u m o u ri sp o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t ht h e c o n c e n t r a t i o no ft h ep o l y a m i n ei na na r e ao ft i s s u ea n db o d yf l u i d s oi ti sc o n s i d e r e dt h a tt h e c o n c e n t r a t i o no fp o l y a m i n ei na na r e ao ft i s s u ea n db o d yf l u i dc a r ls e r v e ra st h ee f l k c t i v e m e a n sf o rt h ed i a g n o s i s 、m o n i t o r i n ga n de s t i m a t i o no f t r e a t m e n tf o rt u m o u r t h ep o l y a m i n ei s a l s ot h eg r o w t hm o d e r a t o rf o rt h ep l a n t ，w h i c he f f e c t st h ep l a n tc e l ld i v i s i o n 、m o r p h o g e n e s i s a n da g e i n g i tc a r la r i s ea l i m e n t a r yt o x i c o s i sw h e nt h e r ei sh i g hc o p c e n t r a t i o np o l y a m i n ei n f o o d t h ec o n c e n t r a t i o no fp u t r e s c i n et h a ti su s u a l l ys e e ni nt h er o t t e nf o o di st h ei m p o r t a n t v a l u en u m b e rf o rt h ef l e s hf o o do rn o t t h eh i s t a m i n ei nt h em o n o a m i n ei su s u a l l yf o u n di n t h ea q u a t i cp r o d u c t i tc a l la r i s ea l i m e n t a r yt o x i c o s i sw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fh i s t a m i n e c o m e st o4 m g g t h eb i o g e n i ca m i n e sd e t e c t i o nm e t h o d si n c l u d eb i o c h e m i c a lp r o c e s s ，p a p e r c h r o m a 孵a p h y , t h i n - l a y e rc h r o r o a t o s r a p h y ( t l c ) ，g a sc h r o m a t o g r a p h y , c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) 、 i o nc h r o m a t o g r a p h ya n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) l h eh p l ci s t h i n ko ft h er o u t i n em e t h o di na c a d e m i cs o c i e t yb e c a u s ei th a sm a n ym e t r i t ss u c ha st h eh i g h e f f i c i e n c y ，v e r a c i t ya n ds h o r t c u ta n d s oo n t h ep r e p a r a t i o no fr a m i f i c a t i o n i n c l u d e s p r e c o l u m nd e r i v a t i o na n dp o s t c o l u m nd e r i v a t i o n t h ep r e c o l u m ni n c l u d e st h em e t h o do f n i n h y d r i n ，o p h t h a l a l d d d i a l d e h y d ea n df l u r e s e a m i n e t h ep o s t c o l u m nd e r i v a t i o ni n c l u d e st h e m e t h o do ft o l u e n e s u l f o n y l ，f l u r e s c a m i n e ，d a n s y l c h l o r i d e ( d a n s c 1 ) ，b e n z o y lc h l o r i d e ， 9 - f l u o r e n y l m e t h y lc h l o r o f o m a t ea n dd i p h e n y l e t h y l e n e d i a m i n ea n ds oo n i nt h et h e s i s ，w es t u d yt h ed e t e r m i n em e t h o do ft h ea m o u n to fs e v e nk i n d so fb i o g e n i c a m i n e ( t r y p t a m i n e ，t y r a m i n e ，h i s t a m i n e ，p u t r e s c i n e ，c a d a v e r i n e ，s p e r m i d i n ea n ds p e r m i n e1 r e s i d u ei nt h er e dw i n ea n db u t t e r t h eb i o g e n i ca m i n e si s s e p a r a t e db yp r e c o l u m nd e r i v a t i o n s o l i d p h a s ee x t r a c t i o na n di sd e t e r m i n e db yh p l cw i t hf l u o r e s c e n c ed e t e c t o r i nt h et h e s i s ，w em a i n l ys t u d yo nt h ec o n d i t i o no fh p l c d e r i v a t i o na n ds o l i dp h a s e 垒! ! ! 竺! ! 一一 e x t r a c t i o n ，a n dt h el i n e a rr e l a t i o n s h i p ，t h er a t eo fr e c o v e r y , t h el o w e s td e t e c t i o nl i m i ta n dt h e r e p r o d u c t i v i t yo ft h em e t h o d t h er e s e a r c hr e s u l t sl n d i c a t et h a tt h ec o n d i t i o no fd e r i v a t i o n i n v o l v e sa d d i t i o no f9 m g m ld a n s y lc h l o r i d e ( d a n s c 1 ) t ot h es a m p l e ，t h e na d d i t i o no ft h e b u t t e rl i q u o ro f p h = 1 1 5i n6 0 。cw a t e rb m hf o r1 5 r a i na n ds u b s e q u e n ts o l i d p h a s ee x t r a c t i o n o t t h ed e r i v a t i v e st h r o u g ho d s c i 8c a r t r i d g e sb e f o r ed e t e r m i n a t i o n t h ed a n s y ld e r i v a t i v e sa r e s e p a r a t e dt h r o u g hi n e r t s i l o d s 3c o l u m nu s i n gg r a d i e n te l u t i o nw i t hab i n a r ys y s t e mo l a c e t o n i t r i l e w a t e ra t2 5 w i t hf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o na te x c i t a t i o na n de m i s s i o n w a v e l e n g t h so f3 4 0 r i ma n d515 n m ，r e s p e c t i v e l y t h es e v e nk i n d so fb i o g e n i ca m i n e sh a v e b e e nc o m p l e t e l ys e p a r a t e di n2 0 - m i n t h es e p a r a t i n ge f f e c ti sg o o da n dt h er e s o l u t i o ni sh i g h r i 、h ed e t e r m i n a t i o no ft h ea v e r a g er a t eo fr e c o v e r yo f7b i o g e n i ca m i n e si nr e dw i n ei s 7 6 2 - 9 7 7 ；t h ec o e f f i c i e n to f v a r i a t i o n ( c v 1i so 5 2 4 - 3 7 5 ；t h el o w e s td e t e c t i o nl i m i t ( u 譬，m 1 ) i s4 4 8 1 0 - 65 1 6 xl o t h ed e t e r m i n a t i o no f t h ea v e r a g er a t eo fr e c o v e r yo f 7 b i o g e n i ca m i n e si nb u t t e ri s8 0 4 - - - 8 9 1 ；t h ec o e f f i c i e n to f v a r i a t i o n ( c v 1i s3 5 2 - 6 7 5 ： t h e l o w e s t d e t e c t i o n l i m i t ( m g k g ) i s2 7 1 x 1 0 - 51 ，3 6 1 0 、t h e t o w e s t d e t e c t i o n l i m i t t h e r a t eo fr e c o v e r ya n dt h ep r e c i s i o na l lc a nd ow i t ht h er e q u i r e m e n to fr e s i d u ea n a l y s i s t h em e t h o dh a sal o to fm e r i t s ，s u c ha st h es i m p l eo p e r a t i o n ，t h es h o r t e rd e t e r m i n a t i o n t i m e ，t h el o w e rd e t e r m i n a t i o n ，e a s yc o n t r o la n dp o p u l a r i z a t i o nt h eo v e r a l l p r o c e s si s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt oi d e n t i f ya n dq u a n t i f yb i o g e n i ca m i n e si nw i n e ，b e v e r a g ea n db u t t e r , c h e e s e ，a l s ou s e di nt h ed e g e n e r a t i v em e a t ，a q u a t i cp r o d u c ta n dm i l kf i l l e dw i t ht h ep r o t e i na s t h eq u a l i t yc o n t r o l ，a l s oc o u l ds e r v e ra st h ee f f e c t i v em e a n sf o rt h ed i a g n o s i s 、m o n i t o r i n ga n d e s t i m a t i o no f t r e a t m e n to f t u m o u r k e y w o r d ：s o li d p h a s ee x tr a c ti o n ：h i g hp e r f o r m a n c eiq u i d c h r o m a t o g r a p h y d e t e r m i n a t i o no f b i o g e n i ca m i n e s ：d a n s y ic h i o r i d e ( d a n s c i ) ：r e dw i b e ：b u t t e r 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：固相萃取高晓液相色谱法分离并测定食品中多种生 物胺的研究 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 是) ，保密期至2 0 0 5 年1 2 月3 1 日为止。 名：斟翩慧簪 第一章文献综述 1 1 生物胺简介 第一章文献综述 生物胺是在生命体内，通常把除了氨基酸、多肽、蛋白质以外的一类含氨基基团的 脂肪族或杂环化合物。生物胶广泛存在于生物界，是重要的生物活性物质，具有多重功 效和作用。生物胺分为单胺和多胺两大类。最受学术界关注的生物胺是多胺类，其中包 括：腐胺、精胺、精脒、尸胺等。早在1 9 5 7 年就有人研究多胺在体内的作用，但直到 1 9 7 1 年r u s s e l l 提出了体液中多胺浓度升高和肿瘤有关后，动物实验和临床研究都发 现肿瘤生长程度和局部组织、体液内多胺浓度正相关，认为测定组织和体液中多胺浓度 可作为诊断、监视肿瘤及评价治疗效果的有效手段，多胺才逐渐成为临床医学关注的热 点。t a b o r 综述了大量的文献讨论了多胺结构、代谢、功能及与肿瘤的关系口l ，s e i l e r 亦对多胺测定方法进行了总结i = ”。肝硬化患者血浆中某些生物胺的变化与门静脉高压症 有密切关系。有人在实验中发现肝硬化患者门静脉压力与其血浆中某些生物胺特别是组 胺的含量里正相关，临床中采用生物胺拈抗剂治疗门脉高压症取得很好的疗效1 4 i ，而多 胜则对肝脏有明显的保护作用。另外，医学研究人员还证实了组胺是参与荨麻疹病理生 理过程的主要介质之一，测定患者血中组胺水平可反映机体对组胺的释放情况，有利于 临床观察病情、判断疗效，解释其发病机理【5 l 。 多胺还是生物生长、发育的调节物，能促进d n a 、r n a 和蛋白质的合成，加速生 物的生长发育，影响着生物细胞的分裂、形态形成和衰老【6 1 。食品中台有高浓度的多胺 可引起中毒。腐胺还可见于腐败食物中，腐胺浓度高低也常常是判断食物是否新鲜的重 要指标。单胺中的组胺常见于水产品之中，当鱼制品中组胺含量达到4 m g g 时即可引 起中毒。本文主要研究的是食品中常见的七种生物胺( 色胺、酪胺、组胺、腐胺、尸胺、 精脒、精胺) 。 生物胺广泛存在于富含蛋白质而又易于变质和采取发酵工艺生产的食物及饮料中 一即存在于水产品( 主要是青皮红肉的鱼类) 、肉制品、乳制品、蔬菜制品和各种酒类 中i7 1 。胺的类型取决于生产、酿造过程中所采用的原料、辅助配料、菌种、工艺条件、 酿造方法，以及酿造或储存过程中发生的微生物污染。食品和饮料中的生物胺是由蛋白 酶作用于蛋白质生成氨基酸后，相应的氨基酸经细菌( 乳酸菌、小球菌、霉菌) 脱羧而 来的：组胺是由组氨酸、酪胺是由酪氨酸、色胺是由色氨酸、尸胺是由赖氨酸分剐形成 的：腐胺由鸟氨酸或精胺形成；精脒和精胺可以在精脒合成酶和精胺合成酶催化下，通 过腐胺与氨丙基的生化反应形成i 。下图是几种常见生物胺的结构： c h 2 n h 2 h 2 n v v n h 2 第一章文献综述 112 生物胺物理化学特性 ( 1 ) 分子量和溶解度”j 生物胺分子量都不大，一般在3 0 0 以下。多胺易溶于水，但随分子量增加溶解度略 降低。因而一般用有机相直接萃取的不完全，此类物质性质不稳定，在碱性条件或见光 后易分解，只有在酸性溶液中才较稳定。 ( 2 ) 酸碱性 多胺的烷基结构有斥电子性，氮原子与质子结合较强，芳香胺( 单胺) 由于p n 共轭效应，氮原子和质子结合能力降低。脂肪胺( 多胺) 碱性较芳香胺( 单胺) 强，且多胺 的碳链越长，碱性越强，精胺的p k 。为8 9 0 1 1 5 0 ；精脒的p k ，为9 5 2 1 1 5 6 。 ( 3 ) 疏水性 疏水性是由氨基基团附着的脂肪链所决定的，所以脂肪胺链越长疏水性越强。 ( 4 ) 生色基团 由于多胺的结构特点，因而本身即无紫外生色基团，也无法激发产生荧光。 11 3 生物胺来源 图1 2 多胺的生物台成 f i g 1 2t h es y n t h e s i z a t i o no fp o l y a m i n ei nt h el i f eb o d y 生物体内非蛋白质的含氮化合物，几乎除了维生素以外，都可由氨基酸转变而产生 第一章文献综述 ( 维生素p p 也可来自色胺酸) 。不少含氮物质是通过氨基酸脱羧作用而产生的。组织中 含有多种氨基酸脱羧酶。在肥大细胞、肝、肾等组织中，组胺酸脱羧产生组胺；鸟氨酸 脱段产生多胺。食品和饮料中的生物胺是由蛋白酶作用于蛋白质生成氨基酸后，相应的 氨基酸经细菌( 乳酸菌、小球菌、霉菌) 脱羧而来的：组胺是由组氨酸、酪胺是由酪氨 酸、色胺是由色氨酸、尸胺是由赖氨酸分别形成的；腐胺由鸟氨酸或精胺形成；精脒和 精胺可以在精脒合成酶和精胺合成酶催化下，通过腐胺与氨丙基的生化反应形成。此外， 甲硫氨基酸( m e t h i o n i n e ) 也可经复杂途径转化为多胺1 1 9 i ，变化过程见图1 2 。 1 1 4 生物胺的代谢 氨基酸脱羧产生二氧化碳和胺，胺可以直接从尿中排出，也可以在酶的催化下转变 为其它物质，如体内胺含量增加，胺氧化酶雏催化胺生成醛和氨，继而醛氧化生成脂肪 酸，再分解成二氧化碳和水，r c h 2 n h 2 + 0 2 + h 2 0 r c h o + h 2 0 2 + n h 3 或转化成氧化三甲 胺排除。而氨的排出由于动物种类不同，可以直接排出，也可转化成尿酸、尿素排出1 2 “。 大部分多胺在体内通过转酰酶使多胺n 和n 8 位接上乙酰基( 乙酰化) 而失活，再从尿中 排出，小部分转化为异腐胺酸( i s o p u t r e a m i n e ) 、精酸( s p e r m i ca c i d ) 、羟腐胺 ( h y d l o x y p u t r e s c i n e ) 、y 氨基丁酸( y - a m i n o b u t y r i ca c i d ) 而失活。 11 5 生物胺的生理活性 多数生物胺类物质作为神经递质，影响机体内分泌系统，在机体中起不同作用。细 胞快速生长，促使多胺合成增加；而多胺生成增加，又为细胞快速生长提供条件。多胺 特别是精胺是促进细胞增殖的重要物质。 ( 1 ) 多胺能调节d n a 和r n a 的合成，精胺和精脒在细胞核内和d n a 形成松散 的复合物，保护d n a 不受热、干燥、射线照射影响而导致破坏。同时多胺也可阻断三 磷酸腺苷酶和核糖核酸酶分解d n a 的作用1 2 ”。 ( 2 ) 多胺在体内能和转运核糖核酸( t r n a ) 特殊部位结合，使t r n a 稳定，在核小 体r r n a 上的多胺可以帮助蛋白质合成【2 ”。 ( 3 ) 在正常情况下，体内的氨基合成尿素主要途径是鸟胺酸循环。乌氨酸通过脱 氨基生成尿素，当细胞快速生成时，在脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) 明显增 加前，即可发现，伴随着多胺增加鸟氨酸脱羧酶活性大大增加1 2 “，将鸟氨酸转化为多胺， 排出体外。在r n a 合成增加时，鸟氨酸脱羧酶活性一般增加1 0 2 0 0 倍，在有些组织 第一章文献综述 中( 如大鼠肾脏) 可高达1 0 0 0 倍。 上述机理揭示了生长旺盛组织( 常见肿瘤) 和多胺的相互关系。动物实验和临床研究 都发现肿瘤生长程度和局部组织、体液内多胺浓度正相关，认为测定组织和体液中多胺 浓度可作为诊断、监视肿瘤及评价治疗效果的有效手段 2 8 、3 0 ，癌症病人多胺浓度，特 别腐胺浓度，明显高于非肿瘤患者，在有效治疗后下降。腐胺还可见于腐败食物，腐胺 浓度高低也常常是判断食物是否新鲜的重要指标。多胺还是植物生长、发育、的调节物， 影响着植物细胞的分裂、形态形成和衰老。 1 1 6 食品中生物胺对人的影响 尽管生物胺有重要的生理功能，如：促进生长、增强代谢活力、加强肠道免疫系统， 并在神经系统中有活性，控制血压，在消除自由基方面也有定的作用等等。但是，在 人体内积累到较高数量时，就会产生毒害。在自然界中广泛存在一些脱羧酶和微生物( 大 肠杆菌、变形杆菌、摩根氏菌、克雷伯氏菌、赫夫那菌，以及气单胞菌、假单胞菌、乳 酸菌、链球菌、葡萄球菌等) 均能使氨基酸脱羧生成生物胺“。过量摄入生物胺会出现 一些症状，其风险完全取决于解毒效率，这在个体之间差异显著，同时受到其他一些因 素的影响。正常摄入的生物胺在消化道中被元胺氧化酶和二元胺氧化酶的高效解毒系 统代谢掉了。 胺类生成于食品中一般会引起两种不良后果：一是组胺在食品中浓度达到1 9 k g 时， 人食用后会引起食物中毒；酪胺的摄入量如果4 h 内达到6 m g ，或其含量超过i o m g k g 就会危及到一些特定的病人( 用抑制一元胺氧化酶的药物进行治疗的精神病人) 1 3 2 1 。二 是些胺类，如：色胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺、异丁胺等存在于火腿、咸鱼、香肠、 培根肉中时，会和能还原硝酸盐的细菌所生成的亚硝酸盐类结合而形成各种亚硝基胺， 它们具有显著的致癌性能。 1 6 1 食品中由生物胺所弓i 起的食物中毒 生物胺广泛存在于富含蛋白质而又易于变质和采取发酵工艺生产的食物及饮料中 一即存在于水产品( 主要是青皮红肉的鱼类) 、肉制品、乳制品、蔬菜制品和各种酒类 中。饮食中过度摄入生物胺能造成一些有害影响。生物胺既是精神活性物质又是血管活 性物质：作用于神经的胺能影响中枢神经系统的神经递质；作用于血管的胺能以血管收 缩剂( 如酪胺) 或扩张荆( 如组胺) 的形式直接或间接作用于衄液循环系统。导致些 第一章文献综述 症状的发生，如：外部血管膨胀、高血压、心悸、头痛、腹部痉挛、肠道平滑肌的收缩、 腹泻、呕吐、荨麻疹等p 。 组胺的中毒症状：面部、胸部或全身潮红：头痛、头晕、胸闷、呼吸促迫：部分病 人出现结膜充血，口唇肿或口、舌、四肢发麻；以及恶心、呕吐、腹泻、荨麻疹等。有 的可出现支气管哮喘、呼吸困难、血压下降。病程大多为1 2 天，预后良好。其它生物 胺，如：尸胺、腐胺、酪胺等可与组胺发生协同作用，使毒性增强。 多胺的中毒症状：厌食、恶心、呕吐和蛋白尿，红细胞溶解、抑制促红细胞生成素 的生成，抑制n a + a t p 酶和m 9 2 + a t p 酶活性，还能增m n 微循环的通透性，严重的将导 致尿毒症、急性肺水肿、腹水及脑水肿。 生物胺的毒理作用与许多因素有关，如：某些物质的存在、肠道的解毒功能、其它 胺的存在。因此，很难确定一个标准来衡量它的毒性l j 。 1 1 62 食品中生物胺的限量标准 七种生物胺中只有组胺在食品中残留对人的危害研究比较成熟，组胺常见于水产 品中，一些国家的政府建议用组胺作为鱼和水产品中微生物腐败的指标。当鱼类产品中 组胺含量达到4 m g g 时，即可引起中毒。人体摄入组胺达1 0 0 m g 以上时，即易发生中 毒，同时这也与个人体质的过敏性有关。在出1 2 1 贸易中欧美国家对水产品中的组胺含量 提出严格要求：美国f d a 限量标准为5 0 m g k g ：欧盟限量标准为1 0 0 m k g 。 腐胺、尸胺还可见于腐败食物，腐胺、尸胺浓度的高低也常常是判断食物是否新鲜 的重要指针。食品中含有高浓度的多胺可引起食物中毒。但具体的限量标准还未建立起 来，只有少量研究：e e r o l a 等人认为发酵香肠中生物胺含量安全性标准为每于克干物质 产品中的组胺和酪胺含量均小于1 0 0 m g 。根据t 0 1 0 0 r a g 酪胺含量的潜在毒理作用，一 个敏感的人食用5 0 - 5 0 0 9 这种储存在2 0 。c 的香肠，就会引发病症。酪胺的摄入量如果4 小时v - j 达到6 m g ，或其含量超过1 0 m g k g 就会危及到一些特定的病人( 用抑制一元胺氧 化酶的药物进行治疗的精神病人) 。l o r e t 等人建议啤酒中酪胺+ 组胺+ 尸胺+ 2 苯乙胺总 含量的安全范围不超过2 0 m g l 。因此，酪胺的含量被认为是在啤酒发酵过程中受到小 球菌污染的一个可靠的指示物。 1 1 7 检测生物胺的意义 综上所述，对生物胺进行定性、定量的检测具有如下意义 第一章文献综述 1 作为食品卫生指标，可对食品生产的各个环节进行质量评估。 2 确保食品安全、预防发达国家的技术贸易壁垒。 3 揭示生物胺的毒理、评估其风险方面：测定中毒生物肌体内生物胺的含量，可 为我们了解其毒理、毒性，研制新药提供思路；为制定生物胺在食品中限量标准做准备。 4 l 临床医学诊断方面：测定组织和体液中多胺浓度可作为诊断、监视肿瘤及评价 治疗效果的有效手段；测定荨麻疹患者血中组胺水平可反映机体对组胺的释放情况，有 利于临床观察病情、判断疗效，解释其发病机理：测定组织和体液中多胺浓度可为诊断、 评估肝硬化患者门静脉高压症进展作参考。 1 2 生物胺的分析与分离 生物胺检测在生命科学中有重要价值。 体液中许多物质带有氨基或有芳香环结构， 它们在组织体液中含量极低( n g l m g l 。) ： 检测时易干扰；生物胺类物质本身差异小3 种主要多胺差别仅个或几个甲基：既无紫外也无荧光生发基团，这些特点给分离和分 析带来了困难。近2 0 年来，曾试用过多种分离方法，如生物学法、化学法、荧光法、 薄层层析、气相色谱法、放射免疫分析法、酶免疫测定法、离子交换色谱法、毛细管电 泳法、氨基酸分析法和高效液相色谱法p “i ，实践证明就分离度和最低检测限而言 毛细管电泳法和高效液相色谱法比较理想，但前者仪器和技术要求较高，价格昂贵，目 前学术晃属意于高效渡相色谱法作为常规检查手段。经多年摸索，方法逐渐成熟，选择 最佳条件可在较短时间获得特异性和敏感性较好的满意结果。 1 21 生物胺的色谱分离 1 21 1 离子交换色谱 适用于柱后衍生生物胺的分离。在柱后衍生中多胺的极性基团会在色谱过程中产生 峰扩展，可采用阳离子交换色谱进行分离 3 叫0 1 ，阳离子交换色谱可将氨基酸、胺及肽与 多胺分离，由于离子交换树脂的高容量，在分析生物祥品时不需对祥品作复杂的预处理。 由于各种生物胺p k 。不同，因而早期在用高压液相色谱分析生物胺时，往往根据不 同生物胺的p k 。，选择相应离子交换柱。但离子交换柱分离度有限，峰常呈现拖尾现象， 分离时间较长( 常在l h 左右) ，目前使用较少。 第一章文献综述 121 2 反相色谱 适用于柱前衍生生物胺的分离。生物胺结构不同，疏水性有差异，在柱前衍生中生 物胺与衍生试剂生成疏水的有机大分子，因此柱前衍生的生物胺分离可用反相色谱。在 反相色谱中，物质的分离以其疏水结构的差异为基础极性越弱，疏水性越强，保留值 越大。选择适当流动相可使生物胺及其衍生产物分离开来。g e n n e r 和s k a a d e n 等分别试 验了l i c h r o s o r b ，r p 1 8 ，r p 一8 ，r p c n 和苯基、c 8 、c 1 8 柱，初步试检表明c 18 柱分离效 果最好【4 。n 。 121 3 反相离子对色谱 适用于柱后衍生生物胺的分离。反相离子对色谱是在反相色谱流动相中加入离子对 试剂，离子对试剂进入流动相后分解为对离子，和进入柱内的生物胺样品结合成新的离 予对，并被固定相表面吸附或分配，这样生物胺的疏水性和电荷性都在反相离子对色谱 中起到保留作用，也就提高了分离度，得到较好的分离效果，这一方法逐渐成为商效液 褐色谱分析生物胺的主要分离模式。 121 4 检测器 ( 1 ) 紫外检测器 众所周知紫外检测灵敏度较荧光检测器低几个数量级，就生物胺而苦，多胺本身无 紫外生色基团，即使能衍生产生紫外光，灵敏度也低，效果欠佳。 ( 2 ) 荧光检测器 足测定生物胺主要使用的检测器。多胺必须在拄前或柱后衍生后_ 才能测定。 ( 3 ) 电化学检测器 电化学检测器理论上灵敏度较荧光检测器高一至二个数量级，多胺本身无电化学活 性，仅其o p a 衍生物有电化学活性。缺点是电化学检测稳定性差干扰较多，操作费 嗣。 第一章文献综述 122 生物胺的预处理 1 2 21 水解 有入认为玻璃容器吸附生物胺( 多胺及儿茶酚胺) 4 3 4 5 1 , 对此虽来见有专门论文定 量讨论，但似乎已成共识。一般选用塑料或表面硅胶化处理过的玻璃器皿盛放多胺和儿 茶酚胺的生物样本。前文曾指出，多胺主要以n 1 和n 8 。乙酰化形式形成n 一乙酰化多胺 而失活排除体外。水解乙酰化的条件学术界意见大体一致，即用与样品等体积的6 m o l l 的盐酸加热( 温度1 0 0 1 2 0 ) ，时间1 2 1 8 h ，经酸解处理后，样品中乙酰基结合的多 胺变成了游离型( 或称自由型) 多胺。在实际工作中常遇到的一个问题是，生物样品是否 都需要水解以什么作为可资比较的标准( 游离多胺还是水解后的全部多胺) 。这一问题 即涉及到多胺的代谢研究，也涉及到方法问题，得到许多学者关注1 3 “。目前，至少已实 现以下共识；在组织中仅有少量乙酰腐胺，几乎没有乙酰精胺和乙酰精脒，故不需要水 解。而有不少人认为，乙酰多胺的变化甚至于比自由多胺更能说明问题【4 ”4 ”。长期研 究多胺的a b d e l m o n e n 就提出n l 乙酰精脒和n l 乙酰精脒比率升高比其他多胺升高对 肿瘤诊断价值更高h 。当前学术界有这么一种倾向性意见：随着分析技术改进，检测限 降低，高效液相色谱已可以检测出所有游离多胺和结合多胺，酸解这一耗时的步骤可有 可无。但对尿样、血样如何使测定方法统一，便于结果比较，尚待进一步讨论。测定食 品中生物胺时不需要水解。 12 2 2 衍生 ( 1 ) 衍生方法 测定多胺必需进行荧光衍生，对此学术界已有共识，早期用氨基酸分析仪或柱后衍 生装置，检测灵敏度差，难以在常规实验室使用。目前已用衍生物荧光强度较茚三酮强 数百倍的荧光物质代替茚三酮，使检测灵敏度大大提高。柱前衍生法增3 n - f 预处理步骤， 但衍生剂选择范围广，衍生后的多胺易被提取和浓缩，能提高分离度，以逐渐成为较常 用的方法。 ( 2 ) 衍生剂的选择 目前多胺分析中应用较广泛的荧光衍生剂有邻苯二甲醛( o p a ) 4 9 1 、荧光胺( f a ) 、 月酰n , ( d n s c 1 ) 5 0 1 、苯甲酰氯等刚。邻苯二甲醛( o p a ) 常用于柱后衍生，它反应速度 快( 5 m i n ) ，但衍生物分解也快，一定程度上影响重复性；荧光胺衍生胺类反应快，多余 的衍生剂在水中能很快分解成非荧光物质，但它只能衍生伯胺；其中的丹酰氯更具选择 第一章文献综述 性、衍生反应迅速、衍生物稳定性好、灵敏度高是比较理想的生物胺衍生试剂。各种荧 光衍生法基本原理相同。下面是生物胺同丹酰氯衍生过程的反应式： r l r 2 n h 2 + c i o = s = 0 r 2 n h o = s = o 一 h3 c 7 n 、c h3 丹酰氯 下表总结了几种衍生剂的使用特点 h 3 c ，n 、c h3 衍生物 表1 - 1 不同荧光衍生剂的比较 t a b l e l 1t h ec o m p a r a t i v el i s to f d i f f e r e n e tf l u o r e s c e n c ed e r i v a t i s i o na g e n t 第一章文献综述 1 3 食品中生物胺的提取与浓缩 1 3 1 食品中生物胺的提取 测定食品中的生物胺时提取剂的选择要满足两个条件：一是生物胺在该溶剂中有很 好的溶解度；二是能够沉淀蛋白。在所有检测食品中生物胺的方法中不外乎两种提取剂： 酸和有机溶剂。德国人l a n g e 、t h o m a s 和w i t t m a r m 对提取各种食品中生物胺的提取 剂做了研究发现：三氯醋酸对鱼类、肉类、香肠、火腿、罐装泡菜提取时除蛋白效果好 净化结果理想：盐酸对各种奶酪提取时除蛋白效果好净化结果理想i i 2 1 表l 一3 提取不同食品中生物胺所选用的提取剂 t a b l e1 3b i o g e n i ca n m i n e se x t r a c t i o na g e n tf o rd i f f e r e n tf o o d 第一章文献综述 1 3 2 食品中生物胺衍生物的净化与浓缩 食品中的生物胺经提取液提取后与衍生试剂进行衍生化反应，分离生物胺的衍生物 的方式不外乎传统的液液萃取法和最近比较流行的固相萃取法。 表1 4 液一液萃取中不同萃取剂的比较1 6 i t a b l e l _ 4t h ec o m p a r a t i v el i s to f d i f f e r e n e te x t r a c t i o na g e n t 萃取荆名称特点 a 乙醚 bj - 醇 c ) 醇：氯仿= i ：j d01 mb e h p a 的氯仿溶液 存在试剂污染，对组胺和尸胺峰有干扰 除了上面的原因外，萃取过程中还要加入盐溶液使其饱和，来 提高萃取系数，使得萃取效果不稳定 同上但比b 稍好 能够提高净化效果和回收率，试剂污染小，干扰少。唯一不足 是耗时 汀：；b e i t p a ：b i s - 2 c 【h y i h e 。y i p h 0 5 p h a l e ( a i d r i c h ) 样品浓缩是提高灵敏度的成熟方法，对许多生物活性物质分析来说，样品浓缩包括 在提取之后的溶剂蒸发，这会产生大量的废溶剂，且大大增加了样品的制备时间。近来 科学的发展，比如固相萃取( s p e ) 、超临界萃取( s f e ) 、固相微萃取技术等，可避免使 用液液萃耿，但是这些方法仍然要增加样品的处理时间。通过降低系统的本底和干扰 可以降低检测限，使用高选择性高灵敏度检测器也可咀降低检测限。 笙= 兰壅堕簦垄一一 国内外文献所报道的在提取食品中生物胺的前处理中所用的固相萃取柱有：硅胶预 处理小柱”i 、阳离子交换柱”t 、c 1 8 柱。 133 固相萃取( s p e ) 13 31 固相萃取概述 圃相萃取( s p e ) 是种用途广泛而且越来越受欢迎的样品i i i 处理技术，它建立在传 统的液一液萃取基础之上，结合物质相互作用的相似相溶机理和目前广泛应用的 h p 。c 、g c 中的固定相基本知识逐渐发展起来的。 大多数用来处理液体样品，萃取、浓缩和净化其中的半挥发性和不挥发性化合物， 也可用于固体样品，但必须处理成液体。目前国内主要应用在水中多环芳烃( p a h s )和 多氯联苯( p c b s ) 等有机物质分析，水果、蔬菜及食