（环境科学专业论文）白腐真菌降解酶系及活性黑knb生物毒性研究——暨对一种担子菌变异株的初步探讨.pdf

上述结果提示：黄孢原毛平革菌能够降解染料r bk n b ，降解过程主要依 赖关键酶m n p ；作为具有生物毒性的外源性化学因子，r bk n b 能够影响黄孢原 毛平革菌m n p 活性，损伤菌丝细胞结构。黄孢原毛平革菌对r bk n b 的反应在酶 活水平上表现为类似于机体在不良环境条件下的应激反应，经历了诱导、抑制直 至衰退的过程；r bk n b 对黄孢原毛平革菌菌丝细胞超微结构的损伤效应随r b k n b 剂量升高而增强；r bk n b 所致的菌丝细胞结构损伤与m n p 活力降低密切相 关，提示m n p 的产生可能是白腐真菌响应外界不良刺激的应激反应之一。1 2 # 诱变菌在拭生条件下能够产生木质素降解酶，该菌生物反应器具有一定的降低复 配染料生物毒性的能力。 关键词：黄獠原毛平革菌活性黑k n b锰过氧化物酶 超微结构急性毒性致突变性 s t u d y o n l i g n i n o l y t i ce n z y m es y s t e mo f w h i t er o t f u n g i a n dt h e b i o t o x i c i t yo f r e a c t i v eb l a c kk n b a n da p r e l i m i n a r ye x p l o r i n g i n t oam u t a n to f b a s i d i o m y c e t e a b s t r a c t w h i t er o tf u n g ia r ec a p a b l eo f d e g r a d i n gm a n yp e r s i s t e n tp o l l u t a n t s t h ed e g r a d a t i o np r o c e s s r e l i e so nt h ee x t r a c e l l u l a r l i g n i n o l y t i ce n z y m es y s t e m t h ep a p e rf o c u s e so nt h el i g n i n o l y t i c e n z y m es y s t e mo fb a s i d i o m y c o t ep h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r u ma n dt h eb i o t o x i c i t yo fr e a c t i v e b l a c kk n b 【r bk n - b ) o npc h r y s o s p o r u m t h e b i o d e g r a d a t i o n o fr bl ( n bb v 户 c h r y s o s p o r u m w a s a s s a y e d a n d t h et o x i ce f f e c t so fr bk n - bo n m a n g a n e s e - d e p e n d e n t p e r u x i d a s e ( m n p ) a e t i v i t y a n dc e l l u l a ru l l r a s t r u e t u r e o fpc h r y s o s p o r u mw a ss t u d i e d f u r t h e r m o r e ，w eo b s e r v e dt h el i g n i n o l y t i ce n z y m eo fan e wb a s i d i o m y c e t ea n di t sd e t o x i c a t i v e e f f e c t so nm i x t u r eo f r e a c t i v ed y e s t h er e s u l t sa r ea sf o i l o w s ： 1 u n d e rt h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o no f o u rl a b t h ea c t i v i t yo f m n pa n dl a c c a s e ( l a c ) o fp c h r y s o s p o r w nc o u l db ed e t e c t e da f t e r4d a y sc u l t i v a t i o na n di n c r e a s e dt oap e a ko f ft h es e v e n t h d a y o f c u l t i v a t i o n t h ea c t i v i t yo f l i pc o u l dn o tb cd e m c 旭d d u r i n gt h e c u l t i v a t i o np e r i o d 2 a b s o r b a l i c es p e c t r u mo fc o c u l t i v a t i v es o l u t i o no fp 、c h r y s o p o r u mw i mr bk n b s h o w e dt h a kw ；t ht h et r e a t m e n t o f ，c h r y s o p o r u m ，t h ea b s o r b a n c ea t5 9 8n md e c m a s e d s i g n i f i c a n t l y , w h i c hi n d i c a t e d t h ee l i m i n a t i o no fr bk n b ，m e a n w h i l e t h e w a v e l e n g t ho f m a x i u ma h s o r b a n c eo ft i ec o c u l t i v a t i v es o l u t i o ns h i f t e df r o m5 9 8 n mt o5 2 5 n ma n d5 5 6 n m a n d t h ea b s o r b a n e es p e c t r u ml nn i t r a v i o l e tb a n da l s op m s e n m ds i g n i f i c a n tc h a n g e s t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tb i o d e g r a d a t i o no f r b k n - be x i s t e du n d e rt h ei r e a t m e n to f p c h r y s o p o r u m 3 a tt h ec o n c e n t r a t i o no f5 0m g l ，r bk n bc o u l di n d u c eh i g h e rm n p a c t i v i t y a t2 0 0 ， 3 5 0a n d5 0 0m g l ，a c t i v i t yo fm n pw a sr e m a r k a b l yd e c r e a s e dd u r i n gt h ew h o l eo b s e r v a t i o n p e r i o d ，a n dt h ei n h i b i t i o ne f f e c te n h a n c e dw i t ht h ei n c r e a s eo fr b k n bc o n c e n t r a t i o n i nt h e r a n g eo f l o w c o n c e n t r a t i o n o f r b k n - b ( 2 0 - 8 0 m g l ) ，m n p a c t i v i t yu n d e r w e n t a t i m e c o u r s e o f i n c r e a s i n ge a r l ya n dd e c r e a s i n gl a t e r , 4 a c u t et o x i c i t yt e s tp e r f o r m e do nl u m i n e s c e n tb a c t e r i aa n dm i c r o n u c l e u st e s to nv f a b a r o o tt i p si n d i c a t e dt h a tr bk n - bw a sa c u t et o x i ca n dm u t a g e n i c 5 a f t e re x p o s u r et or bk n bf o r1 0 d a y s ，t h eu l t r a s t r u c t u r e o fh y p h a lc e l l sw a s e v i d e n t l yd a m a g e d t h ec h a n g e si n c l u d e dp l a s m am e m b r a n es e p a r a t i n gf r o mc e l l u l a rw a la n d c y t o p l a s mc o a g u l a t i n g t h eo b v i o u sc e l l u l a ra u t o l y s i sw a so b s e r v e da t5 0 0m g ，l t h ea b o v e a d v e r s ee f f e c t sb e c a m em o r ee v i d e n tw i t ht h ei n c r e a s eo f r bk n bc o n c e n t r a t i o n a b 日r 6 an e wb a s i d i o m y e e t e ( n a m e d 曲1 2 # m u t a n t t e m p o r a r i l y ) w a sp r e l i m i n a r i l ye x p l o r e di n t h i s p a p e r n ol i g n i n o l y t i ce n z y m ea c t i v i t y w a sd e t e c t e dw h e n1 2 # m u t a n tw a sc u l t i v a t e di n d i 行e r e n tc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s h o w e v e rl i p m n pa n dl a co n z y m ea c t i v i t yc o u l db ed e t e c t e d w h e n1 2 # m u t a n tw a sc u l t i v a t e dw i t hm i x t u r eo fr e a c t i v e d y e s i nt h eb i o r e a c t o r t h e m u t e g e n i c i t yo fm i x t u r eo fr e a c t i v ea y e sw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e da f t e rt h et r e a t m e n tb y1 2 # m u t a n ti nt h eb i o r e a c t o r w h e na tl o o m g l l ，t h ea c u t et o x i c n yo fm i x t u r eo fr e a c t i v ed y e sw a s d e c r e a s e db yt h et r e a t m e n to f1 2 # m u t a n ti nt h eb i o r e a c t o r , h o w e v e rn on o t a b l ec h a n g eo nt h e a c u t et o x i c t yw h e n 矗t4 0 0m g 儿 t h er e s u l t sa b o v es u g g e s tt h a tp h a n e r o c h a e t ee h r y s o s p o r u mi sc a p a b l eo f d e g r a d i n g e r bk n - ba n dm n p m i g h ts e l 3 ea st h ek e ye n z y m ei n v o l v e di nt h eb i o d e g r a d a t i o n a sat o x i c e x o g e n o u sa g e n t , r bk n - bm a yh a v eb i ta d v e r s ei n f l u e n c eo np e h r y s o s p o r u ma tt h ea s p e c t so f b i o c h e m i s t r ya n dm o r p h o l o g y c o c u l t i v a t e dw i t hr bk n - b p c h r y s o s p o r u mu n d e r w e n tas t r e s s r e s p o n s ew h i e hm a n i r e s t e a lt h r e es t a g e so fi n d u c e m e n t i n h i b i t i o na n de x h a u s t i o na tt h e1 e v e lo f m r i pa c t i v l t y r bk n bc o u l di n d u c eu n t r a s t r u c t u m ld a m a g ei np c h r y s o s p o r t o na n dt h e s e m o r p h o l o g i c a lc h a n g e sw e r er e l e v a n tt ot h ea l t e r a t i o no f m n p a c t i v i t y i ti ss u g g e s t e dt h a tt h e p r o d u c t i o n o fm r i pm i g h tb eo n eo fs t r e s s r e s p o n s e i n p c ，”d 印d r 研l u n d e rt h r e a t e n i n g e n v i r o n m e n t a lf a c t o r ss u c ha sr bk n - b 1 2 # m u t a n tc o u i dp r o d u c el i g n i n o l y t i ce n z y m ei nt h e s y m b i o t i cs y s t e mo fb i o r e a c t o r t h e r ew e r ee v i d e n c e st h a tt h eb i o r e a c t o ro f1 2 # m u t a n t h a dt h e p o t e n t i a lt or e d u c et o x i c i t yo f m i x t u r eo f r e a c t i v ed y e s k e y w o r d s ：p h a n e r o e h a e t ec h r ) * o s t m r u r a m e n g a n e s e - d e p e n d e n tp e r o x i d a s e a c u t e t o x i c i t y r e a c t i v eb l a c kk n - b u l t r a s t r u c t u r e m u t a g e n i c i t y 喻云梅硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 赵庆祥教授华东理工大学主席 臧维玲教授上海水产大学委员 吴志超教授圃济大学 委员 i朱文杰教授 华东师范大学委员 l l史家揉教授 华东师范大学委员 l 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名佥墨擅a 期：巡 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利i i 的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名：输云橘 日期：翌堕：! ：2 导师签名钿蹬 日瓤) 竺兰 前言 目前全世界工业用染料共有1 0 ，0 0 0 多种，年产量约为9 1 0 5 吨，其 中5 一l0 9 6 随工业废水排放，给环境带来极大的危害。染料废水具有“三高 低”的特点，即色度高、毒性高、盐度高、b o d c o d 低，难以进行生物降解， 而化学及物理法处理染料废水则存在着效率低、成本高等缺点。1 9 8 3 年 g l e n n 和g o l d 小组研究发现自腐真菌能够降解染料。此外，白腐真菌还能 降解多种难降解有机物质，例如氯酚、多环芳烃、t n t ( r e d d yc a ，1 9 9 5 ) 等，降解作用具有高效、广谱、适应性强等特点。白腐真菌在工业污水治 理方面有良好的应用前景，引起环境保护工作者的广泛关注。 白腐真菌( w h i t er o tf u n g i ) 为丝状真菌，系木腐真菌( w o o d d e g r a d i n g f u n g i ) 的一种，着生在木材上，以能降解木材中的木质素、纤维素和半纤维 紊获取自身生长和繁殖所需的养料和能量，并使木材呈现特征性的白色腐 朽状而得名，多属于担子菌纲( b a s i d i o m y c e t e ) ，其中黄孢原毛平革菌是其 代表性的种类。白腐真菌依赖木质素降解酶系降解有机物质，该酶系主要 包括木质素过氧化物酶( 1i g n i np e r o x i d a s e ，l i p ) ( t i e na n dk i r k ，1 9 8 3 ； t i c n a n d k j r k ，1 9 8 4 ；g l e a ne ta l ，1 9 8 3 ) ，锰过氧化物酶( m a n g a n e s e d e p e n d e n t p e r o x i d a s e ，m n p ) ( g l e n na n dg o l d ，1 9 8 5 ) 、漆酶( 1 a c c a s e ) ( e g g e r te ta l ， 1 9 9 6 ) 以及产生过氧化氢的氧化酶。不同种属的白腐真菌分泌的木质素降 解酶对染料具有不同的降解能力( c r i p p se ta l ，1 9 9 0 ) 。l i p 与m n p 是糖基 化的血红素蛋白，漆酶为多酚氧化酶。木质素降解酶为胞外酶，能催化自 由基反应，反应过程中不需要特异电子受体，因此反应具有非特异性的特 点，且具有较高的氧化还原电位，能降解各种类型的难降解有机物( k i r ke t a l ，1 9 9 8 ) 。 白腐真菌的木质秦降解酶主要由培养基的营养限制而启动合成，是在 次生代谢阶段产生的诱导酶，其产生对环境条件非常敏感，受到高度的外 源性调控，例如限碳或限氮条件、商氧水平有利于酶的产生( j e f f r i e sc ta t ， 1 9 8 1 ：f a i s o ne ta l ，1 9 8 5 ；s w a m ye ta l ，1 9 9 9 ；d o s o r c t ze ta l ，1 9 9 0 ) 。不同 的木质素降解酶对外源性因子的响应不同，m n ”对m f i p 的表达是必需的， 但一定浓度的m n 2 + 能抑制l i p 活力( p e r i ea n dg o l d ，1 9 9 1 ) ；m n p 对c a m p 和氧气均无l i p 敏感( b o o m i n a t h a l le t a l ，1 9 9 2 ) 。 2 0 多年来，虽然应用白腐真菌降解染料废水已有许多报导，但研究结 果不尽一致。尤其是关于酶活的形成和变化规律，尚遗留一些问题有待进 一步验证和澄清。例如外源性化学物质本身可能影响木质素降解酶活力 ( b a l d r i a ne ta l ，2 0 0 0 ) ，大多数染料具有生物毒性( c h a n ge ta l ，1 9 9 2 ； 前亩 w a l t h a l le ta l ，19 9 9 ：b a k s h ic ta l ，2 0 0 3 ) ，在应用白腐真菌降解染料废水 时，染料对白腐真菌本身是否具有毒性作用，进而影响酶活，显然构成了 自腐真菌对染料废水降解效应的制约因素。本工作主要以黄孢原毛平革菌 为对象，分析了黄孢原毛平革菌对染料活性黑刖一b ( r bk n b ) 的降解过程 中酶活的变化，探讨了r bk n b 的生物毒性，观察了r bk n b 对木质素降 解酶酶活力和菌丝细胞超微结构的影响。本工作还初步探讨了种白腐真 菌诱变株在处理染料废水方面的应用。 第一章黄孢原毛平革菌木质素降解酶的产生规律 木质素降解酶系是白腐真菌降解有机物的关键酶系( r e d d y c a ，1 9 9 5 ) ，该酶系主要包括l i p 、m n p 和l a c ( k i r ke ta l ，1 9 9 8 ) 。并非所 有的白腐真菌都能同时产生l i p ，m n p 以及l a c ，有的只能产生其中的种 或两种。木质素降解酶是在次生代榭过程中产生的诱导酶，对外界条件极 其敏感，培养条件直接影响木质素降解酶的组成类型及其水平( j e f f r i e se t a l ，1 9 8 1 ：f a i s o nc ta l ，1 9 8 5 ) 。自腐真菌在营养限制的条件下产生木质素 降解酶，自然状态下的白腐真菌生长于限氮环境，一般采用k i r k 的限氮培 养基培养黄孢原毛平革菌，因此本工作采用该培养基进行液态振荡培养， 观察该培养条件下黄孢原毛平革菌的木质素降解酶的产生规律。 1 材料与方法 1 1 菌种 黄孢原毛平革蔼( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r u m ) ，由华东理工大学 赵庆祥教授惠赠。 l _ 2 培养基 1 2 is p d a ( 合成马铃薯培养基) 斜面 基本成分( l ) ：马铃薯2 0 0 ，葡萄糖2 0 酵母膏5 ，k h 2 p 0 43 ，m g s 0 4 1 5 ，v b l0 0 1 ，琼脂2 0 。 马铃薯汁的制作：选择质量好的马铃薯，去皮，挖去芽眼，削掉青绿 部分，切成l 一2 m m 厚薄片。称取2 0 0 9 ，加蒸馏水1 0 0 0 m l ，煮沸，小火保 持3 0 分钟，然后八层湿纱布过滤，滤液中加入预先浸泡的琼脂，继续加热， 并不断用玻璃棒搅拌直至琼脂完全溶化，加入葡萄糖等其它成分，搅拌均 匀，最后加蒸馏水补至1 0 0 0 毫升。 1 2 2 限氮k i r k 培养基 参照t i e l le ta l ( 1 9 8 8 ) ，基本培养基成分为( g l ) ：葡萄糖1 0 ， 酒石酸铵o 2 ，苯甲醇o 5 4 ，m g s 0 4 0 7 1 ，吐温8 01 ，0 ，k h z p 0 4 2 5 6 ，v b l 0 0 0 1 ，乙酸缓冲液1 0m m o l l ，微量元素液7 0m 1 p h4 5 。 微量元素液( g ，l ) ：氨基乙酸0 6 ，m n s 0 4 h 2 0o 5tn a c i1 ，f e s 0 4 7 1 - 1 2 0 0 1 ，c o s 0 4 - 7 h 2 00 2 2 ，c a c l 2 2 h 2 01 s 6 ，z n s 0 4 7 h 2 00 1 ，c u s 0 4 5 h 2 00 1 ， a i k ( s 0 4 ) 2 ，1 2 h 2 00 o l ，h b 0 30 0 l ，n a 2 m 0 0 4 - 2 h 2 00 0 l 。 1 3 培养条件 孢予培养：于s p d a 斜面接种孢子，3 7 c 于s p d a 培养基培养5 天， 第一章木质囊降肆一的产生规律 用含0 1 吐温8 0 的蒸馏水洗孢子，获得接种的孢子液。 液体培养：5 0 0m l 三角瓶装液1 5 0 m l ，接种孢予l 1 0 6 个m l ，置于旋 转式摇床在空气条件下培养，培养温度3 7 ，转速l5 0 r m i n 。 1 4 酶活检测方法 于培养第3 天开始，取培养液。经滤纸过滤后，检测酶活。每天1 次， 取3 个平行样，连续检测7 天。酶活检测方法如下。 l i p ( t i e ne ta l ，1 9 8 8 ) ：10 m l 反应液含0 1 m 酒石酸钠溶液( p h 3 o ) ， o 4 m m 藜芦醇和适量酶液，加入o 2 m mh 2 0 2 启动反应，反应温度为3 0 0 c ， 分光光度计时程扫描，检测1 m i n 内反应液于3 1 0 n m 处吸光度的变化。一 个酶活力单位( u ) 定义为l m i n 氧化黎芦醇产生lg m o l 黎芦醛所需的酶量， 卣1 0 = 9 3 0 0m 1 c m 。 m n p ( a l i ce ta l ，1 9 9 7 ) ：1 0 m l 反应液含5 0 m m 醋酸钠缓冲溶液( p h 4 5 ) ， 终浓度为4 0m m 硫酸锰和适量粗酶液，加入终浓度为4 0 u m 的h 2 0 2 启动反 应，反应温度为3 0 0 c ，分光光度计时程扫描，检测1 分钟内反应液于2 4 0 r i m 处吸光度的变化。一个酶活力单位( u ) 定义为1 分钟氧化生成i u m o l m n ”所 需的酶量，e2 4 0 = 8 1 0 0 m 。c p a 。 l a c ( n i k u p a a v o l ae ta l ，1 9 9 0 ) ：3 m l 反应液中含0 i m 醋酸钠缓冲液( p h 5 ) ，0 0 3 ( w v ) a b t s 和适量酶液，反应温度为3 0 0 c ，分光光度计时程扫 描，检测1 分钟内反应液于4 2 0 n m 处吸光度的变化。酶活单位( u ) 定义为1 分钟氧化l u m o l a b t g 所需的酶量，e4 2 0 = 3 6 x1 0 4 c i i i 。 酶活计算公式：酶活= 1 0 6 ( v 总v 酶) ( a a a t ) v 总：反应体系的总体积 v 酶：反应酶液的体积 e ：摩尔吸光系数 a t ：单位时间吸光度的变化 2 结果 2 1 黄孢原毛平革菌木质素降解酶的类型及其活力随培养时间的变化 结果如图卜l 和1 2 所示，在培养5 天开始检测到 d n p 和漆酶酶活， 培养7 天两种酶活均达到峰值，随后下降，二者的变化趋势卜分相似，但 m n p 酶活较高，培养7 天可达4 5 1 u l ，漆酶酶活较低，7 天时为2 1 u l 。 在本实验条件下，未能检测到l i p 酶活。 曼= !查堕童堕! 苎些兰竺塑苎 6 0 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 0 3456 7 c u l t iv a l 品删m e 9d a y ) 图l l 黄孢原毛平革菌m n p 酶活随培养时间的变化 f i gi 一1 f l u c t u a t i o no f e x t r a c e l l u l a rm n p a c t i v i t yo f p c h r y s o s p o r u m 宝25 一 誊 毫2 。 3 三 15 10 0 5 0 0 d u r i n gc u l t i v a t i o np e r i o d 345 67 89 c u t i v a t i o nt i m e ( d a y ) 圈1 - 2 黄孢原毛平革菌胞外漆酶酶活随培养时间的变化 f i g1 2 f l u c t u a t i o no f e x t m c e l l u l a rl a c c a s ea c t i v i t yo f 尸c h r y s o s p o r u md u r i n gc u l t i v a t i o np e r i o d 5 一壬一l!3m乱c菩 第一章本质量降* 奠的产生规律 2 2 黄孢原毛平革菌培养液p h 值随培养时间的变化 黄孢原毛平苹落培养液p h 值随培养时间的变化见图l 一3 。培养4 天时 培养液的p h 值从培养开始时的5 6 5 显著降至4 6 l ，此后培养液的p h 在 4 6 1 5 1 4 间波动。 3 讨论 3456789 c u t i v a t i o nt i m e ( d a y ) 图1 - 3 黄孢原毛平革菌培养液p h 随培养时间的变化 f i gl 一3p ho f c u l t i v a t i o nb r o t h 尸c h r y s o s p o r u md u r i n g c u l t i v a t i o np e r i o d 木质素降解酶降解酶包括l i p 、m n p 和漆酶( k i r ke ta l ，1 9 9 8 ) 。黄孢 原毛平革菌于k i r k 培养基培养时，产生的木质素降解酶系主要包括l i p 和 m n p ( t i e na n dk i r k ，1 9 8 3 ：t i e na n dk i r k ，1 9 8 4 ；g l e n ne ta l ，1 9 8 3 ：g l e n na n d g o l d ，1 9 8 5 ) ，也有文献报道黄孢原毛平革菌能产生漆酶，但只是在以葡萄 糖为碳源的培养基生长时产生的漆酶水平很低( s f i n i v a s a ne ta l ，1 9 9 5 ) 。本工 作采用k i r k 的限氮培养基培养黄孢原毛平革菌，检测到的木质素降解酶主 要为m n p ，漆酶活性较低，仅偶尔能够检测到较低水平的l i p 。这可能与我 们通气量有关。我们曾经尝试将三角摇瓶置于摇床通风口处以增加氧气量， 该摇瓶中的菌球在培养4 天后颜色转变成褐色，此时便能够检测到低水平 的l i p 活力，与李华钟等( 李华钟等，2 0 0 2 ) 的报道结果相互印证。菌球 上沉积的褐色物质为m n o ：，m n 0 。能够清除h 。o 。，避免h 。o ：导致的l i p 失活( k e r n h w ，1 9 8 9 ) 。这表明l i p 比m n p 对氧气更敏感。增加氧的生物利用率能提高 8 6 4 2 0 8 6 4 2 0 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 工a 第一章木质素降解一的产生规律 术质素降解酶活力( d o s o r e t ze ta l ，1 9 9 0 m i c h e le ta l ，1 9 9 2 ) ，向不产生 木质素降解酶的培养液中充纯氧能诱导l i p 的产生( z a c c h ie ta l ，2 0 0 2 a ) ， 证明l i l 9 的产生依赖于高浓度的氧。 早期对黄孢原毛平革菌的研究结果表明，木质素降解系统的形成受到 高度调控，主要由培养基中的营养限制而启动合成( k e y s e re t a l ，1 9 7 8 ：k i r k e ta l ，1 9 8 7 ：j e f f r i e se ta i ，1 9 8 1 ) 。当培养液中的营养因子，如碳、氮或硫耗竭 后，真菌的生长由初生代谢向次生代谢转变，随后出现木质素降解酶活力， 故木质素降解酶的产生时间与培养液中的营养水平有关。本实验采用限氮 培养基，m n p 和漆酶活力均在培养5 天时出现，暗示在此时培养液中氮源已 接近耗竭。培养7 天时m n p 和漆酶活力均达到最大，随后均降低，可能是 因为在营养限制的条件f ，菌丝难以获得足够的能量维持基础代谢和高水 平的木质素降解酶的产乍。 在以后的工作中，我们将三角摇瓶随机放置于摇床中部，以尽量减少 因摇床通风条件差异造成的试验误差。在本实验条件下，黄孢原毛平革菌 产生的木质降解酶主要为m n p 因此以后章节有关酶活力的工作将以m n p 为主。 第二章黄孢原毛平革菌对活性黑k n b 的 降解效应 染料废水具有“三高一低”，即色度商、毒性高、盐度高、b o d c o d 低等特点，因而难以被生物降解。黄孢原毛平革菌能够降解染料( g l e n ne ta l ， 1 9 8 3 ) ，实现其降解功能的是术质素降解酶。有理由认为，后者系白腐真菌 胞体合成后分泌至胞外，含本质素降解酶的粗酶液在离体条件下也具有降解 染料的能力( c r i p p s e ta l ，1 9 9 0 ) 。 染料活性黑k n 。b ( r bk n b ) 在工业上应用广泛用量大，普遍存在 于多种染料废水中。本工作将选用r bk n b ，采取共培养的方式，即在黄 孢原毛平革菌培养至胞外m n p 酶活达到峰值之前，向培养液中加入r bk n - b 染料，采用紫外可见全波段扫描方法对处理前后的培养液进行测试，以分析 黄孢原毛平革菌对r i bk n b 的降解效应。 1 材料与方法 1 1 菌种及培养：同第一章。 1 2 实验分组：共分为5 组，即在培养6 天，m n p 酶活力达到峰值前加入0 、 5 0 、2 0 0 、3 5 0 、5 0 0 m 【g lr bk n b ，加入r bk n b 的当天记为0 天。 1 3 仪器与试剂 仪器：同立u 一2 8 1 0 紫外一可见扫描分光光度计 试剂：r bk n b ，c i r e a c t i v eb l a c k5 ( 2 0 5 0 5 ) ，其分子式为c 2 6 h 2 l n s n a 4 0 1 9 s 6 。 最大吸收峰在5 9 8 n m 。结构式如下： s o ! c h ! c h 2 0 s o ，n a 1 4 紫外一可见波段扫描：每日取培养液5 m l ，经定性滤纸过滤，取滤液，适 当稀释后利用日立u 一2 8 1 0 紫外可见扫描分光光度计扫描，可见光波段波 长为7 0 0 3 5 0 r i m ，紫外波段波长为3 5 0 2 0 0 n m 。以蒸馏水调基线。5 0 m g l 组培养液未稀释，2 0 0 m g l 组、稀释4 倍，3 5 0 m g l 组和5 0 0 m g l 组分别稀 释4 、7 和l o 倍。从0 天开始，连续检测4 天。 第二簟黄饱原毛平革曹对话性k n - b 的悼辫效应 2 结果 2 1 黄孢原毛平革菌处理对r bk n b 溶液色度的影响 r bk n b 在5 9 8 n m 处具有最高吸收峰，因此以5 9 8 n r n 处吸光度变化指 示染料溶液的色度变化。将黄孢原毛平革菌处理的染料溶液倍比稀释，检测 其在5 9 8 n r n 处吸光度的变化。结果显示，与黄孢原毛平革葭共培养1 天后， 不同浓度r bk n b 染料溶液5 9 8 r t m 处吸光度均明显降低( 如图2 1 ) ，表明 黄孢原毛平革菌对不同浓度的r bk n b 溶液均具有较强的脱色效应，共培 养l 天的脱色效果非常显著。 圈2 一l 黄孢原毛平革菌处理对r bk n b 溶液的脱色效应 5 0 m e d lr bk n b 溶液未经稀释，2 0 0 m g l 、3 5 0 m g l 和5 0 0 m g lr bk n - b 溶 液分别经4 、7 和i 0 倍稀释 f i g2 - 1 d e c o l o r i z a t i o no fd i f f e r e n tc o n e e n t r a t i o no f r bk n bb y c o c u l t i v a t i o nw i t hpc h r y s o s p o r u m 5 0 m g lr bk n bd y es o l u t i o nw i t h o u td i1u t i o i l ：2 0 0 m g l ，3 5 0 m g l a n d5 0 0m g l r bk n - b s o l u t i o nw e r ed i l u t e du pt oi ：4 1 ：7a n d1 ：1 0r e s p e c t i v e l y 一o 一 第二章冀饱原毛平革菌对活性幂k n b 的降解撤应 2 2 黄孢原毛平革菌处理对r bk n b 溶液可见光波段吸收峰特征的改变 r bk n - b 与黄孢原毛平革菌共培养后可见光波段的吸收光谱发生了 明显变化。不仅表现为5 9 8 n m 处的吸收峰大幅度下降乃至基本消失，还表现 为可见光波段最大吸收峰蓝移，在5 2 5 r t m 和5 5 6 r t m 分别出现两个吸收峰。 随着培养时间的延长，可见波段的吸光度均下降。各r bk n b 剂量组可见 光吸收峰的变化趋势一致，见图2 2 ，2 3 。 瑚4 0 0 4 5 05 0 05 5 06 6 5 07 0 0 ；2 w m d _ 州m ) 3 5 04 0 0蝴s 0 05 5 0e 0 06 印7 0 0 2 。 肭6 g t hc 帆1 m 3 2 6 * l 哪 4 0 04 s 0 s 目m o “_ ( m 图2 2 与黄孢原毛平革菌共培养过程中r bk n b 染料溶液可见波段扫描图 2 2 a ：5 0 m b ，l l r bk n - b ，未经稀释： 2 - 2 c ：3 5 0 r r i g lr bk n - b ，稀释7 倍 2 - 2 b ：2 0 0 m g lr bk n - b ，稀释4 倍； 2 - 2 d ：5 0 0 m g lr bk n b ，稀释1 0 倍 f i 9 2 - 2 v i s i b l es p e c t r ao fc u l t i v a t i o ns o l u t i o n sc o n t a i n i n gd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no f r bk n bd u r i n gc o c u ll iv a t i o n w i t h 3 c h r y s o s p o r u m 2 - 2a ：5 0 m g lr bk n b ：2 - 2b ：2 0 0 m g lr bk n b ，d i l u t e du pt o1 ：4 ：2 - 2c ： 3 5 0 m g lr bk n b d i l u t e du pt o1 ：7 ：2 - 2d ：5 0 0m g lr bk n b ，d i l u t e d u pt ol ：1 0 1 0 一 念一 茹 f ，= 一 脚撕撕 、。i 一 麓警 公一 嚣m ，_ 一 一_ ， ， k 一 嚣m 一 一一 i叫刊1叫剖1习“1 第二章t 孢原毛平革对活性黑k n - b 韵降解触应 3 5 04 0 05 05 0 05 5 06 0 06 5 07 0 0 w a v e l e n g t h ( r i m i 图2 3 共培养2 天不同浓度r bk n b 溶液可见波段扫描图 f i g2 - 3 y is i b es p e c t r ao fc u l t i v a t i o ns o i u t i o n sc o n t a i n i n gd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no fr 1 3k n ba f t e r2d a y sc o cl 1 1 t i v a t i o nw i t hpc h r y s o s p o r u m 2 3 黄孢原毛平革菌处理对共培养液綮外波段吸收峰特征的改变 r bk n b 染料与黄孢原毛平革菌共培养后，紫外波段光谱也发生了有 规律的变化。2 2 5 2 7 5 n m 处波段出现吸光值升高，3 0 0 3 2 5 n m 处波段吸光值 降低。各浓度组变化趋势类似，图2 - 4 为5 0 0 m i ，r bk n b 组经l o 倍稀释 后紫外波段扫描的实例。 将空白对照组培养液过滤，经2 5 倍稀释后进行紫外波段扫描( 如图2 5 ) 。 小分子物质在紫外段具有较高的吸收值从图可见