（物理化学专业论文）跨蟾蜍磅胱上皮细胞质子流的研究.pdf

摘要 ，质子跨膜运输在生物能学中有着极其重要的理论意义，由于通道模型 理论的提出，人们对通道内的高速、高选择性h + 传输已有所理解，但在 a t p 合成酶的研究中提出了向通道口供应质子的问题，至今尚未解决。 本论文认为，质子源问题应具有共性，除a t p 合成的f 。通道外，n 对，h + 交换、电压控制的h + 通道、荷尔蒙引导的水通道都存在同样的问题本 论文工作用蟾蜍膀胱膜为实验体系。首次用流动注射方法测定跨膜质子 流，运用电化学阻抗谱研究n a + i - i + 交换过程，提出了跨膜质子的可能来 源。这些工作和结论对于了解生物能学的质子传递机制和离子交换膜的广 泛应用，具有一定的理论和实际意义。 本论文的主要结果如下： 、采用荧光探针法测定了细胞p h 变化，并对n a + ，h + 交换的细胞内 d h 依赖性和n a + 浓度依赖性进行了研究。采用氨酸载方法研究 了n a + 1 4 + 交换。 设计了流动注射电解槽，建立了直接测定跨膜质子流的方法。结 合荧光方法，分析了蟾蜍膀胱膜粘膜上皮细胞顶部高的质子流的 原因。指出水通道和n a + h + 交换促进高的质子流。 运用：2 n a 同位素示踪方法。通过测量跨膜n a 流来表征跨膜质子 流，首次发现了p h i 为6 3 处出现强的质子流峰。对异常质子流 现象，排除了扩散和普通水解离两种可能性，从动力学和分子生 物学角度提出了可能存在的质子来源指出碳酸酐酶与n a + 小+ 交换的串联作用构成质子传输，推断可能的质子传输机制。 利用电化学交流阻抗谱方法，研究膜界面性质，通过研究n i g e r i c i n 对阻抗谱的影响，指出串联电阻表征亚上皮层的电阻，n a + 浓度 与其对顶膜的导纳谱，符合m a c h a l i e s m e n t o n 方程，与文献报导 的用2 2 n a 示踪方法和荧光光谱所得结果一致) 关键词：质子传导，细胞p h ，荧光探针，质子流，n a + h + 交换 a b s t r a c t p r o t o nt r a n s p o r ti sac r i t i c a lp r o c e s si np h y s i c a lb i o l o g y , i n c l u d i n ga t p p r o d u c t i o n ，v o l t a g e - a c t i v a t e d p r o t o n c h a n n e l si n e p i t h e l i a a n d l i g h t t r a n s d u c t i o n i ti s g e n e r a l l yb e l i e v e dt h a tt h e s ek i n d s 酊m e c h a n i s m s ，p u m p 、 c a r r i e ra n dc h a n n e l ，a t ei n v o l v e di ni t p r o t o nt r a n s m e m b r a n et r a n s p o r t i n gi ss o r a p i dt h a ti tr e q u i r e sa d e q u a t ep r o t o ns u p p l yt oc h a n n e l h o w e v e r , o n l y2 0h + p e rs e c o n dc o u l db ep r o v i d e db yd i f f u s i o na n dt h eg e n e r a lw a t e rd i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( 2 1 0 4 s ) i s a l s ot o ol o wt o s u p p o r t t h ew a t e r h y d r o l y s i s h y p o t h e s i s s o ，t h e r es h o u l d e x i s to t h e rp r o t o ns o u r c e s i nt h i ss t u d y , t o a du r i n a r yb l a d d e ri su s e df o rm a t e r i a l s f l o wi n j e c t i o ni s f i r s te s t a b l i s h e dt om e a s u r e p r o t o nf l u xa c r o s sm e m b r a n e s a n de l e c t r o c h e m i c a l l m p e d e n c es p e c t r u m ( e i s ) i si n t r o d u c e d t o s t u d yt h ep r o c e s so fn a + h + e x c h a n g e b a s e do nt h ee x p e r i m e n t sa n dt h ek n o w l e d g eo fm o l e c u l a rb i o l o g y , w e p u tf o r w o r das u g g e s t i o nt h a to n eo f t h ep r o t o ns o u r c e si sc o n c e r n e dw i t h c a r b o n i c a n h y d r a s e ，w h i c h i sk n o w na sa c a t a l y s t f o rc a r b o nd i o x i d e h y d r o l y s i s t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ： 1 af l u o r o p r o b e b c e c fp r o b et e c h n i q u ew a se m p l o y e dt om e a s u r e i n t r a c e l l u l a rp h t h em e t h o dh a st h ea d v a n t a g e ss u c ha ss u p e r v i s i o ni n t i m e ，h i g hs e n s i t i v i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y , e t c w ee m p l o y e dn h 4 c i a c i d l o a d i n go nt h es e r o s as i d eo f b l a d d e ri sf e a s i b l ea n dt h a to nt h em u c o s a s i d en o t t oi n v e s t i g a t et h ep r o c e s so f n a + h + e x c h a n g e w es u g g e s tt h a t n a + h + e x c h a n g ed e p e n d sg r e a t l y o nn a + c o n c e n t r a t i o na n d i n t r a c e l l u l a rp h 2 a sa na l t e r n a t i v em e t h o di nt h ec a s eo ft h et m s u c c e s s f u la c i d l o a d i n g ，f l o wi n j c t i o ni s f i r s te s t a b l i s h e dt om e a s n l ep r o t o nf l u x ，w h i c h i sc h a r a c t e r i z e db ym e a s u r i n gd i r e c t l y , p e r f o r m i n ge a s i l ya n da ne x a c t r e s u l t t oe x p l a i nt h ef a c tt h a tl m ma m i l o r i d ed o e s n ti n h i b i tp r o t o n f l u x c o m p l e t e l y , m a n ye x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u t w es h o wt h a t w a t e rc h a n n e lc o n d u c t sp r o t o ni np a r t 3 b a s e do nt h et e c h n i q u e s i n c l u d i n g2 2 n ai s o t o p et r a c e ra n db c e c f p r o b e ，t h er e l a t i o nb e t w e e np r o t o nf l u xa n dp h ii s i n v e s t i g a t e da n d c h a r a c t e r i z e db ya ni n t e r g r a lp e a ka b o u tp h i l 6 3 ，w h i c he l i c i t sp r o t o n s o u r c e s m e a n w h i l e ，t h e c a r b o n i c a n h y d r a s e ( c a ) ，a n e n z y m e w h i c h c a t a l y z e sc 0 2h y d r o l y s i s ，c a np r o d u c e av e r yh i g hh + f l u xd u r i n gr a p i d t u m o v e r ( i 0 6c ai i 、o nt h eb a s i so fe x p e r i m e n t s ，w es u g g e s tt h a t n a + ，h + e x c h a n g ea n dc a t h a tf u n c t i o ni ns e r i e st oc o m p l e t et h ep r o t o n c o n d u c t a n c e w es u g g e s tt h a tt h ep r o b a b l ep r o t o ns o u r c eo fh i g bp r o t o n ， f l u xj sc o n n e c t e dw i t hc a r b o n i ca n h y d r a s e 4 e l e c t r o c h e m i c a li m p o d e n c es p e c t r u m ，w h i c hi so f t e nu s e df o rs t u d y i n g t h ei n t e r f a c e ，i si n t r o d u c e dt os t u d yi o nt r a n s p o r ta n de i s as i g n i f i c a n t d i f f b r e n c ei sf o u n d o nt h es e r i sr e s i s t a n c eb e t w e e nt h ea d d i t i o no f n i g e r i c i na n dn o n - a d d i t i o n 0 1 m ma m i l o r i d eb r i n g sa b o u ta d d i t i o n a l s e m i c i r c l eo nt h e h i g hf r e q u e n c yd o m a i n w h i l ei m ma m i l o r i d ei s a d d e d t h i sp h e n o m e n o nc a l ln o tb ee x p l a i n e de x a c t l y t h i ss e m i c i r c l e m a yn o t b ee l i c i t e d b yt h e r e l a x a t i o n p r o c e s s e s b u t b y t h eo t h e r f a c t o r s a l s o ，a d m i t t a n c ep l o t t e d a sn a + c o n c e n t r a t i o ni sa c c o r d a n c e w i t hm i c h a l i e s - m e n t o ne q u a t i o n ，w h i c hi sc o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l t s r e p o r t e dp r e v i o u s l yb ye m p l o y i n g2 2 n ai s o t o p et r a c e ra n df l u o r o p r o b e t e c h n i q u e s k e y w o r d s ：p r o t o nc o n d u c t a n c e ，i n t r a e e l l u l a rp h ，p r o t o nf l u x ，f l u o r o p m b e ， n a - h e x c h a n g e 第1 章绪论 a b s t r a c tp r o t o nt r a n s p o r ta c r o s sb i o l o g i c a lm e m b r a n e ，w h i c h e x i s t si n a l m o s ta l lc e l l s ，i so f g r e a ti m p o r t a n c ei nb i o e n e r g e t i c s i nt h i si n t r o d u c t i o n ，w e d e s c r i b et h em e c h a n i s mo fp r o t o nt r a n s p o na c r o s sb i o l o g i c a lm e m b r a n ea n d g i v e as h o r tr e v i e wo nt h em o d e lo fp r o t o nt r a n s p o r ta n dt h em e t h o d sf o r m e a s u r i n g i t 生物膜具有多种功能，它是维持生命活动所不可缺少的。细胞与环境 发生的一切联系和反应都必须通过细胞膜来完成。其中重要功能之一就是 通过细胞膜和周围环境进行物质交换，这种功能被称之为跨细胞膜物质输 运。其显著特点是选择性，通过选择性输运，维持细胞内离子成分与其 周围环境的差别，保持细胞内生理条件的相对稳定。 质子跨膜运输是物质跨膜运输的一种，它是生命活动中必不可少的， 在a t p 合成等生物能过程【23 1 ，细胞内p h ( p h 。) 调节【4 1 ，以及光感等神 经过程【5 1 中起着很重要的作用，是物理化学和生物学中非常关键的过程。 质子传导和质子泵广泛存在于生物质膜上，与生物能学密切相关。 质子传导通常是质子沿着能量梯度运行( 质子被动输运) ，因此，在谈及 质子传导时，主要是涉及质子运行的途径。在质子泵过程中，质子是逆电 势梯度运行的( 质子主动输运) ，它除了必须有转运质子的通道外，还必 须有将光能或化学能转换为质子电化学势的过程。 在关于生物能学的几种基本理论中，均将质子转运放在中心位置。 化学渗透学说要求质子必须跨膜输运( 被称为非定域化质子) ，而w i l l i a m s 学说则要求质子在膜上作一定距离运行( 被称为定域化质子) f 6 j 。因此弄 清楚质子转运和质子泵的分子机理将有助于解决生物能学中的一些基本课 题，包括m i t c h e l l 学说还是w i l l i a m s 学说更符合生物能转换规律问题。 1 1 质子跨膜运输机制 跨膜质子运输与膜上运输蛋白密切有关，到目前为止，比较公认的三 种质子跨膜运输机制：泵、转运蛋白及通道【7 i 。 11 1 泵机制 很多细胞器，如胞内小泡( 包括网格蛋白( c l a t h r i n ) 覆盖的小泡) 、溶 酶体、内质网和高尔基体的被膜中有一种转移质子的a t p 酶( p r o t o n t r a n s l o c a t i n ga t p a s e ) ，亦称为a t p 水解驱动的质子泵( p r o t o n - p u m p ) 。这 种质子泵广泛分布在突触小泡、嗜铬颗粒和白细胞的第三种颗粒上，骨组 织中的破骨细胞、胃脉中的泌酸细胞及肾单位中某种上皮细胞等泌酸的细 胞也具有h + a t p i “。 嗜盐菌( b r ) 是迄今为止研究得最清楚的膜蛋白之- - f ”，是一种质 子泵，其质子跨膜转运的机制有代表性。现已知道b r 的质子转运有六个 主要步骤【”】。 ( i ) 光激发使b r 生色团异构化，s c h i 仃碱基的位置变化弱化了与 t y r l 8 5 、a s p 2 1 2 、a r 9 8 2 、a s p 8 5 等的相互作用，蛋白质构象出现扭曲力： ( 2 ) s c h i f f 碱基将一个质子传递给去质子状态的a s p 8 5 ，细胞内侧螺 旋f 和g 附近，c d 和e f 的连接肽发生构象变化，改变了s c h i f f 碱基 的取向，增强了质子通道细胞内侧一半的亲水性，也因此提高了s c h i f f 碱 基的p k a ： ( 3 ) 质子经过一未知基因释放到胞外侧； ( 4 ) 蛋白质构象的扭曲力被松弛，质子从质子化状态的a s p 9 6 传递 s c h i f f 碱基( 可能亦通过未知基因，包括一些水分子) ： ( 5 ) a s p 9 6 从胞内侧重新获取质子： ( 6 ) 蛋白质驱动生色团由1 3 一顺再异构化为全反形式，b r 回复到 基态。 h “a t p 酶不是电中性的，泵被驱动时必须与阴离子通道( 如c l 通道、 i 通道和s c n 通道等) 活性偶联，或k + 通道反偶联】以抵消形成的膜电 位，同时也影响胞浆p h 。 h “a t p 酶有三种类型l ”l ，第一类为e 1 e 2 型a t p 酶，主要存在于原 核细胞中，结构最简单，仅由一或两个亚基组成：第二类为f i f 。型a t p 酶，结构较为复杂，主要位于线粒体、叶绿体和细菌质膜；第三类为v a t p 酶即液泡型a t p 酶，结构类似于第二类，已被发现存在于肾小管上 皮细胞、破骨细胞和肺泡上皮细胞。v a t p 酶参与多种细胞器如溶酶体 的酸化，也参与p h 的调节】。 1 1 2 跨膜蛋白转运机制 质子通过跨膜蛋白转运，主要参与调节细胞p h 。目前，最活跃的研 究集中在n a + h + 交换蛋白，研究也相当深入。早在1 9 6 1 年，m i t c h e l l 提 2 出化学渗透假设时，曾认为存在阳离子，h + 交换i “】，而且从实验上证实 了线粒体中这种交换现象的存在m 】。1 9 7 2 年，h a r o l d 等6 】首次在类链球 菌中证实了n a + ，h + 交换现象。1 9 7 6 年，m u r e r i ”i 在哺乳动物肾和小肠刷缘 膜制备物中证明有电中性的n a + 小+ 交换蛋白存在。此后发现几乎在一切 原核细胞、真核细胞中都有n a + ，h + 交换蛋白。n a + h + 交换蛋白除了调节细 胞内d h 外，还参与细胞体积的调节，存在肾、小肠上皮细胞顶膜的n a + h + 交换蛋白对n a + 重吸收和酸分泌起重要作用。 1 1 2 1n a + h + 交换的宏观特性 n a + , i l l + 交换过程由质膜两侧的n a + 与h + 梯度联合驱动。n a + h + 交换 不需要a t p 作为能量，但n a + h + 交换的激发过程需要a t p t ”1 。化学计量 学和热量学研究表明，n a + 、h + 交换为l ：1 ，即n a + 的摄入和h + 排出比率 相等。因而n a + h + 交换是电中性的。膜电位改变不影响n 矿、h + 交换过程。 l i + 可替代n a * ，影响n a + 、h + 交换。l i 十是n a + 的竞争性抑制剂【”2 “2 1 ”i 。还 有证据表明n a + h + 交换蛋白还能转运n h 4 + 1 2 啦! 1 。但n a + h + 交换蛋白是有 选择性，除n a + 、h + 、l i + 和n h + 外，其它一价阳离子不能通过。实验证 明1 2 ”，n a + h + 交换作用有一设定值，胞内p h 高于此设定值时，n a + h + 交 换系统无活性；当h + 积累到一定程度，低于设定值时，n a + h + 交换便被 激活。n a + h + 交换的设定值也受调控，细胞状态改变时，如被生长因子诱 发细胞分裂、细胞分化、受精或细胞生长受抑制时等都伴有p h 设定值的 变动。 一般认为氨氯吡咪( a m i l o r i d e ) 是n a + h + 交换的抑制剂1 2 4 , 2 5 1 。 a m i l o r i d e 为临床使用的利尿药，其p k a = 8 7 ，在生理p h 范围内，它以一价 阳离子形式存在，可与n a + 在n a + h + 交换蛋白的结合位点发生竞争而抑制 该交换过程。抑制效应与胞外n a + 浓度有关 2 0 , 2 1 , 2 6 , 2 7 , 2 8 1 ，当胞外n a + 浓度低 时，a m i l o r i d e 抑制效应增大。a m i l o r i d e 可作为研究n a + h + 交换的工具。 n a + h + 交换能被有丝分裂原或非有丝分裂信号激素 2 7 , 2 8 i ，如表皮生 长因子、癌基因产物、精子、神经递质、激素、凝激素、渗透压改变等信 号迅速激活。 1 1 2 2 分子水平上的n a + h + 交换蛋白 1 9 8 9 年，s a r d e t 等【2 9 l 首次分离出人类的n h e c d n a 由此n a + h + 交 换分子水平研究取得了突破性进展。由j ：它首次被分离，因此称之为n h e l 型。目前，已分离出n h e 2 、n h e 3 、n h e 4 、1 3 n h e 等亚型交换蛋白。n a h + 交换蛋白家族成员在氨基酸序列及基因结构上有较高的同源性，但是它们 的结构、分布及调节有所不同【z ”。 人类n h e l 由8 1 5 个氨基酸所组成，分成两个不同区域( 结构示意 图1 1 ) ： ( 1 ) 约5 0 0 个氨基酸构成的跨膜区域，两亲性n h 2 基为末端，h + 变构部位存在于该区域，该区域具有催化a m i l o r i d e 敏感的n a + h + 交换活 动和确定p h 设定值的功能。 ( 2 ) 高度亲水性的c o o h 基末端位于细胞内区域，该区域与n h e l 的激素调节有关。 与n h e i 类似，所有其它的n h e 亚型也由1 2 个跨膜部分组成1 3 1 l 。 而且具有上述相同的两个功能区域，只是各区域的氨基酸数目有所不同。 图1 1n h e i 的结构示意圈 1 1 3 通道机制 关于质子通道的报道以往大多集中在h * - a t p a s e 的f o 部分口1 ，近年 来，人们发现存在一种电压激活的质子通道1 3 2 , 3 3 1 。目前对这种通道的结构 报道不多。 d e c o u r s e y 等1 3 4 1 认为上皮细胞上存在高的质子流归因于质子通道。 两栖动物皮肤和膀胱上皮细胞存在水通道，对质子有相当高的通透性，尽 管顶膜和底侧的通透特性不同，但水和质子的通透性显示同样的激素响应 和对抑制剂的敏感度，因而可能受相同的分子集合体调节。 1 2 质子跨膜运输的理论模型 4 质子跨膜输运可用两种模型来描述，即载体模型和通道模型【6 】。载体 模型认为：一跨膜蛋白在膜一侧以待定部位接受一质子，然后以一很大的 构象变化将质子运载至另一侧释放出来。通道模型则认为：膜蛋白的活性 部位与质子通道相关联，活性部位起着定向泵的作用，使质子在通道内定 向输运。后一模型与前者相比，它要求蛋白的构象变化要小得多，活性部 位也远比膜层厚度( 4 0 t ) 要薄。转运模型适合于n a + h + 交换蛋白的质子 输运，而通道模型对于解释质子泵和质子通道的输运机制更为合理。人们 对通道模型研究得更为深入。 n a g ej ”1 等人认为，在膜蛋白中可由极性氨基酸侧链如s e r 、t h r 、t y f 、 g l u 、a s p 、g i n 、a s n 、l y s 、a r g 和h i s 等的极性基因在膜上形成一个亲 水环境的氢键网络( h b c ) ，这种网络中也可能有一定的水参加。由于每 一氢键长度约为2 5 3a ，故约需2 0 个氢键的线性排列才能形成一个跨膜 的氢键链。这种氢键链又被称为质子链( p r o t o nw i r e ) ，因为它有类似于 一根金属导线传导电子那样来传导质子的性质。图1 2 是这种质子链的图 不。 圈1 2 质子传递链示意图；虚线表示氢键 在氢键链中质子的传导有特殊机制。首先，质子的传导一定要在氢 键体内完成，质子不可能从一个极性基因直接跳至另一个极性基因，因为 裸露的电荷不但进入蛋白很困难，而且在蛋白内的跳跃需要很大的活化 能，从而无法实现。质子在氢键链中的转运是通过两种互相交替的机制， 即跳跃翻转而实现的。 然而，不论采取哪种模型进行质子输运，质子输运的速率都非常大。 1 3 研究跨膜质子输运的几种方法 1 3 1 模型膜 为了模拟生物膜上的质子输运，弄清质子传导的分子机制，人们采 取了多种方法，一种是早期使用的制备磷脂双层膜i m ”l ，直接测定跨膜 质子流；另一种方法是将具有质子传导特性的短杆菌肽嵌入脂双层膜【3 “ ”】，测定跨膜流，从而来研究质子传导的分子机制。 纯的磷脂膜上h + 的通透系数大约为1 0 一c m s 比其它单价无机阳离 子的通透系数大4 个数量级。这种异常高的选择类似于生物膜上的电压门 控h + 传导。关于磷酸脂膜上质子传导机理，主要存在两种假设：g u t k n e c h t ”】 等认为水的解离或磷脂的氧化产生的少量弱酸，充当传递质子载体。另一 种假设是以n a g e l 等i 为代表的暂态氢键链( t h b c ) 学说他们认为水 分子间氢键链暂态形成为h + 跳跃式传递提供了途径。 尽管这些机制也许涉及生物膜上的质子传输，但是磷脂双层膜上的 质子传输机制不可能完全解释电压控制的质子现象。首先，它不能说明神 经元、吞噬细胞等细胞上所观察到的调制现象。特别是磷脂双层膜h + 传 导几乎与p h 无关【2 1 ，而细胞膜上h + 传导时p h 非常敏感。其次磷脂双 脂膜的h + 通透能力比细胞上的低2 - 3 个数量级。 短杆菌肽( g r a m i c i d i n ) a 能够在脂双层上形成传导质子的通道m i ， 两单体分子形成头碰头的氯键跨于膜上。该通道内包含l o 1 2 个水分子， 对单价阳离子具有高度选择性。h a y d o n 】等首次测量了短杆菌肽通道的 阳离子传导，而且发现质子传导远远大于其它阳离子因此。人们认为质 子可能沿氢键水分子传递类似于冰上质子传递机制以短杆菌肽为研究质 子传导，大大地推动了质子输运机制的研究。d e a m e t 4 ”l 等通过对模型膜 和生物膜上质子运输结果的比较，提出了质子来源问题。l r e v e l lp h i l l i p s 等| 4 6 4 7 认为，由于通道输运口附近非接触偶极子的调节，使水链定向排列。 因而前半部分与后半部分传递速率显然不同。 1 3 2 几种现代的测定方法 1 3 2 1 膜片钳技术 膜片钳( p a t c h c l a m pr e c o r d i n g t e c h n i q u e s ) 是1 9 7 6 年n e h e r 和s a k a m r n n 共同创立的，它是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单 一的( 或多个) 离子通道分子活动的技术m 】。其基本原理是：当测量用 6 微管电极同细胞膜表面接触时，通过管腔旌以一定负压，于是膜的极少部 分吸着在电极尖端开口处，这部分膜可能只包含了一个通道蛋白质分子， 而且开i 处边缘和膜接触处密接，可以形成亿兆欧姆封接，记录到的电流 变化只反映r 离子单一通路的数量i ”i 。膜片钳技术广泛应用到质子泵和 质f 通道的研究【4 ”，能够记录单个通道的电流，以而可以对通道的电导 及其动力学特性、药理学特性，以及通道的调节机制开展深入的研究。 13 2 2 放射性同位素示踪方法 该方法是较传统的方法，但由于其测量准确、灵敏，因而在现代生 物研究中是一种不可缺少的手段l ”j 1 i 。被测定的放射活性可以居里( c i ) ( 1 c i 是2 2 2 + 1 0 ”次衰变m i n ) 或以b e c q u e r e l s ( b q ) ( 1 b q ) 是1 次衰变s ) 表示。 实际上，放射活性的衰变是采用普通的同位素，h 、“c 、2 2 n a 、3 5 s 和，z p ， 通过一种液体闪烁计数器来测量每分钟的计数。这些同位素衰变时发射出 p 射线( 电子) 。该射线可采用一种液体闪烁剂来测量，后者能将射线转 变为光量子，然后由光电倍增管将其计数记录f 来。无论在模型膜和生物 膜上该方法都能表现其巨大的优越性。利用：2 n a 示踪方法可以研究 n a + h + 交换蛋白的动力学过程，获得n a + h + 交换过程不同阶段的特征 5 2 , 5 3 1 。 1 3 2 3 荧光探针法 荧光探针或荧光染料与被测物质特异性结合，不仅可以观察固定的 细胞、组织、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态 地观察和检测。特别是激光扫描共聚焦显微镜的使用，大大地拓宽其研究 领域1 5 4 1 。荧光探针法能够定性或定量地进行测量，而且特异性强。研究 跨膜质子运输主要使用b c e c f i ”l 、s n a r f 1 t 矧、b o d i p y l 5 9 1 类探针， 前二种主要指示p h 值，第三种探针主要用于标记蛋白质、核苷酸、葡糖、 酶类、脂肪酸、各类受体、细胞骨架蛋白等活细胞动态方面的研究。 上述三种技术只是诸多方法中较常用的方法。对于质子传输机制的 研究往往需要多种方法的结合，特别要利用现代生物技术一基因克隆技术 ”o “1 ，更好地从分子水平上了解质子传导机制。 1 4 细胞内p h 调节 质子跨膜运输伴随着细胞p h 的改变，而细胞内p h 值( i n t r a c e l l u l a r p h ，简称p h ) 的变化又与诸多生命过程密切相关，如细胞分裂、酶活性、 通道活性及蛋白质去质子化所导致的构型变化等f 6 2 i 。细胞内p h 调节作用 7 保证了细胞的内环境稳定，与细胞的代谢活动密切有关。有的交换蛋自本 身就是多功能蛋自，在调节细胞p h 同时也完成了其它功能；有的交换的 活化是细胞应答刺激或细胞本身程序性变化的一个环节。细胞p h 主要调 节细胞体积，促进离子跨膜运输，调节离子通透和细胞内离子浓度，同时 对细胞增殖也产生一定的影响i 6 3 l 。胞浆p h 总是被严格控制在一定的范围 内，真核细胞胞浆p h 被控制在7 0 7 4 ，这是由于一套离子交换机制和胞 浆的有效缓冲作用的结果。胞浆的缓冲能力经测定为每p h 单位1 0 5 0 r a m 之间，因细胞类型不同而异；当然也与测定方法有关。参与p h 调节的离 子转运系统主要有：1 ) n a + h + 交换系统；2 ) 依赖n a + 的c i h c 0 3 - 交换系 统；3 ) 不依赖n a + 的c i h c 0 3 - 交换统；4 ) 其他( 如a t p 依赖的h + - a t p 酶) 。 前二者的作用主要在于升高胞内p h 和矫正酸中毒；后者在于降低胞 内p h 和缓解碱中毒。四种离子转运系统参与调节细胞p h ( 图1 - 3 ) i t t 。t t p a s e 盥外 旷 一 c l 图l 一3 调节细胞p h 的主要离子转运系统 1 5 本课题研究的主要内容 质子从细胞胞浆传递到胞外，可以想象成下列三个步骤：第一步，质 子从体相至通道e l ；第二步，质子跨膜转运；第三步，质子从膜上排至胞 外。三个步骤串联进行，可以想象成图的所示过程。 8 滋e 前几话中已经阐述过，质子无论采取哪种机制跨膜运输速度均很快， 对于n a + h + 交换过程而言，构象翻转数高达2 5 0 0 s ，a t p 驱动的线粒 体和叶绿体每秒每个通道产生1 2 0 0 个质子1 6 ”。这样高的质子流需要足够 快的质子提供，因此，决速步骤可能是h + 从胞浆至通道口的第一步过程。 然而，通过计算估计，h + 从p h = 75 的细胞质中扩散到通道口大约只有 2 0 h + s 1 4 5 i ，这不能完全补偿n a + h + 交换；普通的水解离常数只有2 + 1 0 4 s 。 扩散和水解离不能完全满足跨膜质子输运，因此可能存在其它质子源。 本论文拟综合利用荧光探针技术、2 2 n a 同位素示踪法、流动注射电解、 电化学交流阻抗、核磁共振等方法和手段从动力学特征、电化学性质等方 面加以研究，以期寻找质子来源问题。 参考文献 1 张志鸿，刘文龙，膜生物物理学，高等教育出版社( 北京) ，1 9 8 7 2 g i r v i n ，m e ，v _ k r a s t o g i ，e a b i l d g a a r d ，j l m a r k l e y , a n dr h f i l l i n g a m e ， s o l u t i o ns t r u c t u r eo ft h et r a n s m e m b r a n eh + - t r a n s p o r t i n gs u b u n i tco ft h e f l f o a t p s y n t h a s e ，b i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 ，3 7 ：8 8 1 7 8 8 2 4 3 b o y e le t h ea t ps y n t h a s e - - as p l e n d i dm o l e c u l a rm a c h i n e a n n u r e v b i o c h e m 1 9 9 7 6 6 ：7 1 7 - 7 4 9 9 4 m a r x ，jl ，i n v e s t i g a t o r s f o c u so ni n t r a c e l l u l a rp h ，s c i e n c e ，1 9 8 1 ，2 1 3 ，7 4 5 5 l a n y i ，jk ，b a c t e r i o r h o d o p s i n a sam o d e lf u rp r o l o n p u m p s n a t u r e ，1 9 9 5 ，3 7 5 ：4 6 1 4 6 3 6 李庆国，质子在膜上传导和质子泵分子模型研究进展，生物化学与生物 物理进展，1 9 8 8 ，1 5 ：2 - 7 7 g e r g e l y l l u k a s e t a 1 p r o t o nc o n d u c t a n c eo ft h ep l a s m am e m b r a n e ： p r o p e f l i e s ，r e g u l a t i o n ，a n d f u n c t i o nr o l e a m j p h y s i 0 1 1 9 9 3 ，2 6 5 ：c 3 - c i 4 8 a i - a n q a t i ，q ，p r o t o n - t r a n s l o c a t i n ga t p a s e s ，a n n u r e v c e l lb i 0 1 ，1 9 8 6 ，2 ： 1 7 9 9 k h o r a n a ，h g ，b a c t e r i o r h o d o p s i n ，am e m b r a n ep r o t e i nt h a t u s e s l i g h t t o t r a n s l o c a t ep r o t o n s ，j b i 0 1 c h e m ，1 9 8 8 ，2 6 3 ( 1 6 ) ：7 4 3 9 10 m a t h i s ，r ，l i n ，s w ，a m e s j e t a 1 ，f r o m f e m t o s e c o n d st o b i o l o g y ：m e c h a n i s mo fb a c t e r i o r h o d o p s i n 。sl i g h t - d r i v e n p r o t o np u m p ，a r mr e v b i o p h y s c h e m ，1 9 9 1 ，2 0 ；4 9 1 11 b o y d c a r e ta 1 j p h y s i o l ( l o n d ) ，1 9 9 0 ，4 2 3 ：4 8 12 f o r g a c ，m ，s l r u c t u r ea n df u n c t i o no fv a c u o l a rc l a s so fa t p - d r i v e np r o t o n p u m p s ，p h y s i 0 1 r e v 1 9 8 9 ，6 9 ( 3 ) ：7 6 5 - 7 9 6 13 蒋秋兴，胡坤生，菌紫质的研究进展，生物化学与生物物理进展，1 9 9 7 ，2 5 ( 5 ) ： 3 9 7 4 0 3 1 4 m i t c h e l l ，p ，c o u p l i n go f p h o s p h o r y l a t i o n t oe l e c t r o na n d h y d r o g e n t r a n s f e rb y a c h e m i o s m o t i c t y p eo f m e c h a n i s m ，n a t u r e ( l o n d ) ，1 9 6 1 ，1 9 1 ：1 4 4 - 1 4 6 15 m i t c h e l l ，p ，a n dj m o y l e ，r e s p i r a t i o n - d i r v e np r o t o nt r a n s l o c a t i o ni nr a tl i v e r m i t c h o n d r i n ，b i o c h e m j ，1 9 6 7 ，1 0 5 ：1 1 4 7 - 1 1 6 2 1 6 h a r o l d ，f m ，a n dd p a p i n e a u ，c a t i o nt r a n s p o r ta n de l e c t r o g e n e s i sb y s t r e p t o c o c c u sf a e c a l i s ，j m e m b r b i o l ，19 7 2 ，8 ：4 5 6 2 17 m u r e r ，h ，e ta 1 ，s o d i u m h y d r o g e na n t i p o r t i nb r u s hb o r d e r - m e m b r a n ev e s i c l e si s o l a t e df r o mr a ts m a l li n t e s t i n ea n dk i d n e y ，b i 0 1 c h e m j ，1 9 7 6 ， 1 5 4 ：5 9 7 - 6 0 4 1 8 g o s s ，g g ，e ta l ，a t pd e p e n d e n c eo fn h e - 1 ，t h eu b i q u i t o u s i s o f o r mo f n a + h + a n t i p o r t e r , j b i 0 1 c h e m ，1 9 9 4 ，2 6 9 ( 1 2 ) ：8 7 4 l 一8 7 4 8 19 f o s t e r ，e s ，e t a l n a + h + e x c h a n g e i nr a tc o