（发酵工程专业论文）热休克蛋白对产乙醇的基因工程大肠杆菌抗逆性影响.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 随着石油价格的日益增长，燃料酒精有望成为未来代替汽油燃料的能源，但在 燃料酒精发酵过程中的各种不利因素如高温、高糖、高渗透压等，限制了燃料乙醇 的工业化生产而热休克蛋白可识别变性蛋白表面的疏水区域，加速它们的重新 折叠，防止不可逆的凝聚反应发生有效地保护细胞在不利条件下不受伤害 本研究运用基因工程技术，以z y m o m o n a sm o b i l i s 和p y r o c o c c u sf u r i o s u s 基因组d n a 为模板通过p c r 扩增，乙醇脱氢酶基因a d h b , 丙酮酸脱梭酶基因p d c 和热休克蛋白基因h s p ，通过p 。启动子构建3 个基因可在大肠杆菌中表达的操纵 子，分别构建表达质粒p l a p 、p l a p h 。将质粒p l a p h 导入宿主菌l a c l 中，获得工程 菌l a c l l a p h ，经过热适应处理后获得工程菌l a c h - l a p h 分别在高糖、高渗透压、酸性以及高温高糖的发酵条件下，利用气相色谱检测 发酵液中的乙醇含量。 ( 1 ) 在不同逆境条件下，热休克蛋白基因有利于基因工程菌乙醇产量的提高。 其中在1 8 葡萄糖发酵最明显，含有h s p 基因的细菌乙醇产量为8 3 8g l ，是不 含有h s p 基因的细菌的6 倍。 ( 2 ) 热休克处理有利于提高细菌的生长速率和乙醇产量。经过4 5 连续传代培 养3 0 次后的细胞，不论在细菌生长速率还是乙醇产量都稍高于仅含有h s p 而未经 热适应的对照菌。其中在高糖、高渗透压、酸性以及高温高糖的产量分别是对照 菌的1 2 倍、2 1 倍、3 1 倍和2 1 倍。 实验结果表明，在逆境下通过热休克蛋白的表达，有利于产乙醇的基因工程大 肠杆菌在逆境下的生存，特别是在1 8 的葡萄糖条件下最为明显，证实热休克蛋白 对细菌有保护效应。 本研究成功地将a d 协，p d c 和h s p 基因引入大肠杆菌中，在大肠杆菌中建立了 一条可以抗逆境的代谢葡萄糖生存乙醇的途径，同类研究在国内尚无报道 关键词：热休克蛋白：乙醇产量；生长速率：高糖；热适应； 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ed e p i c t i o no ff o s s i lf u e lr e s e r v e s h a si n c r e a s e di n d u s t r i a lf o c u st o w a r d a l t e m a t i v ef l l e ls o u r c e sa n de n c o u r a g e dt og e tt h en e ww a yt oa t r a i nt h ef u e lf o rt h e f u t u r e e t h a n o li st h eb e s tc h o i c e b u tw eh a v et of a c em u l t i f a r i o u so ft r o u b l e s ，s u c hi t s h i g ht e m p e r a t u r e ，h i g hp r e s s u r e ，d e v i a n tm e t a b o l i z ew h e np r o d u c i n gt h ee t h a n 0 1 h e a t s h o c kp r o t e i n sa r ci n d u c e di nr e s p o n s et oa b r u p tt e m p e r a t u r ec h a n g e s t h es y n t h e s i so f t h e s ep r o t e i n sc a nl e a dt oa c q u i r e dt h e r m t o l c r a n c e ，a n dt h eo t h e rs t r e s s e s w ec o n s t r u c tt h er e c o m b i n eb a c t e r i u mw h i c hh a dh s pg e n e i nc o n c r e t e l yt h a t p a c a n da d h bw e r ea m p l i f i e db yp c rf r o mz y m o m o n a sm o b i f 妞l es m a l lh e a ts h o c k p r o t e i n ( s h s p ) f r o mt h eh y p c r t h c r m o p h i l ce y r o c o c c u $ 血r i o s u sw a sa m p l i f i e db yp c r t o o t h et h r e eg e n e sw e r ep l a c e du n d e rt h ec o n t r o lo fl a cp r o m o t e n t h er e c o m b i n a n t p l a s m i d s o l a p ，p l a p h ) w a st r a n s f o r m e di n t oe c o i l n er e c o m b i n a n te c o i lt h a th a dh s p g e n ew a s c u l t i v a t e db yh e a ts h e c ka t4 2 a n dt h e nt o4 5 e a c ht e m p e r a t u r ef o r3 0 t i m e s t h ee t h a n o lf e r m e n t i o nt e s t n ef e r m e n t i o nc o n d i t i o a si n c l u d eh i g ht e m p c r a t u 豫 h i g hs u g a r s ，h i g hp r e s s u r et h e nt h ee t h a n o lw a sd e t e c t e db yo c ( 1 ) i nd i f f e r e n ta d v e r s i t y ，t h ec e l lw h i c hh a v eh s p sg e n e se t h a n o lp r o d u c t i o nw e r e b e t t e rt h a nt h ec o n t r o l s ，e s p e c i a l l yw i t h1 8 0g lo ft o t a ls u g a r si n3 7 c ，t h ee t h a n o l p r o d u c t i o no ft h eb a c t e r i u mi s8 - 3 8 如a l m o s ts i xf o l d st h a nt h a th a sn oh s p s g e n e s t h a te t h a n o ip r o d u c t i o ni s1 4 1 l 但) h e a ts h o c kt r e a t m e n tc a nl e a dt oa c q u i r e db e t t e rc e l lg r o w t hr a t ea n dt h ee t h a n o i p r o d u c t i o nt o o a l l o w i n gt h eo r g a n i s m st os u r v i v ea te v e n h i g h e rt e m p e r a t u r e sa n dt h e o t h e ra d v e r s i t y s ot h er e s u l tt e s tt h a tt h eh e a ts h o c kp r o t e i nc a nr a i s ec e l ls u r v i v a lr a t ei np a r t i c u l a r w i t h1 8 0 叽o ft o t a ls u g a r si nt h ec u l t u r e a n dt h ee t h a n o lp r o d u c t i o nh a v em o r e p r o d u c t i o nt o o t h i sr e s e a r c hs u c c e s s f u l l yi n t r o d u c et h en o v e lp a t h w a yf o rf e r m e n t i n gg l u c o s et o e t h a n o li ne c o l ib ye x p r e s s i n gz y m o m o n a sm o b i h sg e n e s ，c n c o d i n g p d ca n da d h ba n d h s pf r o mp y r o c o c c u s f u r i o s u s w h i c hw a sr e p o r t e df o rt h ef l r s tt i m e k e y w o r d s ：h s p s ；e t h a n o lp r o d u c t i o n ；c e l lg r o w t hr a t e ；h i e , hs u g a r s ；h e a ts h o c kt r e a t m e n t 讯嘉亡工茔失港 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：盼纠l 日期：y 伸1 年r 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人 权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：犀撵恤 日期：z ，o 年譬月日 指导教师签名：耋秒错勇 日期：础s 月。加日 湖北_ t - 业大学硕士学位论文 1 1 燃料乙醇的现状 第一章引言 目前，以能源为发展引擎的全球经济正在持续增长，对有限的石油资源构成了 严重的威胁。据国内专家预 测，目前地球里的石油贮藏量，只可开采4 0 6 0 年。 随着世界g d p 的与日增长，开采年限还将大大缩短。中国通过改革开放近三十年 的迅速发展，已成为继美国之后的第二大能源消费国。2 0 0 0 年中国石油消费总量2 亿吨左右；2 0 0 4 年则突破3 亿吨。按目前的能源需求增长势头，预计至1 j 2 0 1 0 年中国 石油消费总量将达4 亿吨。然而中国探明的石油总储量严重不足。为此，中国长期 以来采取进口原油的方法来缓解经济发展速度与能源的矛盾，2 0 0 4 年中国进口石 油1 2 3 亿吨，为总消耗量的4 0 以上。然而这种竭泽而渔的方法，既波及全球经济 的可持续性发展，又不能从根本上持久解决经济发展对能源不断增长的需求。能 源供应安全问题，也成为制约中国乃至全球经济发展和社会进步的主要障碍之一。 为此，各国均在争先恐后地寻找可替代石油的新能源，中国制订的国民经济和 社会发展第十个五年计划纲要提出，要“开发燃料乙醇等石油替代品，采取措 施节约石油资源”。将玉米秸秆、苎麻、芦苇、甘蔗渣、柠檬酸渣、酒糟、谷壳等 木质纤维素含量高原料，通过生物转化得到液态燃料酒精可作为石油的能源替代 产品。 6 0 0 0 0 5 0 0 0 0 4 00 0 0 3 0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 00 0 0 2 0 0 12 0 0 22 0 0 32 0 0 42 0 0 52 0 0 6 f 图1 12 0 0 1 2 0 0 6 中国乙醇汽油的消耗量( 单位：万吨) f i g1 1t h ec o n s u m eo ft h e2 a si nc h i n af r o m2 0 0 1t o2 0 0 6 ( m t ) 湖北工业大学硕士学位论文 近几年来，世界各国燃料乙醇的增长非常迅速，其中晟有代表性是巴西、美国、 亚洲与欧盟等地区和国家，美国0 4 年燃料乙醇产量增长2 4 ，巴西0 4 年产量达1 2 7 2 万吨，欧盟、日本、中国、印度等国加大扶持力度，燃料乙醇业也大幅度增长。 2 0 0 4 年，全球乙醇生产总量已占到世界汽油消费总量的2 。( 图1 2 ) 堡 蘸 面 盎 门 2 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 姜墨量星萎墨器昌拳甍罱霉s 窖g 兽兽三尝 署0 霉22 霉霉000 霉霉呙。呙食霜葛。萄 年份 图1 21 9 7 6 年2 0 1 2 年世界乙醇消耗量 f i g1 2t h ec o i l s u m eo ft h ee t h a n o la l lo v e rt h ew o r l df r o m1 9 7 6t o2 0 1 2 传统生产酒精多是以甘蔗糖蜜和玉米、木薯等淀粉类物质为原料，但由于人 口的增长，可利用土地减少，因此，以粮食为原料生产酒精必将受到限制。而木 质纤维素物质是地球上最丰富的可再生物质，广泛存在于农副产业及林产业的木 质废弃物中，是巨大的再生资源。若能将其利用发酵成酒精，对解决未来能源短 缺问题有着巨大的潜力。 木质纤维素的主要成分为纤维素，半纤维素及木质素。能够直接以木质纤维 素为原料发酵生产乙醇的微生物在自然界中极少，或因产量太低无法用于工业化 生产。因此人们在一方面致力于寻求有效的水解方法，使木质纤维素完全水解成 其组成单元；另一方面则致力于构建可以高效转化木质纤维素水解产物为乙醇的 微生物菌种。半纤维素是多种糖的混合物，戊糖( 木糖和阿拉伯糖) 是最多的成分， 已糖( 葡萄糖、半乳糖和甘露糖) 次之，还有少量其他糖，如岩藻糖和鼠李糖。这样 的菌种要求具备以下几个基本特征f 5 6 5 8 】：( 1 ) 能利用广泛的碳源( 五碳糖和六碳糖都 能利用) ；( 2 ) 具有较高的乙醇发酵效率；( 3 ) 能耐受高浓度的乙醇；( 4 ) 对木质纤维素 水解液中存在的毒害物质有一定的抗性；( 5 ) 能承受发酵过程中环境酸度的变化； ( 6 ) 最小的副产物生成。 2 湖北工业大学硕士学位论文 1 2 乙醇工程菌国内外研究现状 。 在国外通过利用p d c 和a d h b 两基因i 卜射，构建了用于乙醇生产的人工操作予 p 酣操作子1 4 】，并由l a c 操作予的启动子控制，再将p c f 操作子引入e c o l i 并获得高 效表达，从而获得一系列e c o l i 工程菌如f b r i 、f b r 2 、k0 1 1 、s l4 0 等 9 j 实 现了利用多种糖生产乙醇的目的。降低添料率用来优化融合e c o l i 的产乙醇条件， 它在o h6 4 、3 4 ( 2 、1 2 5r m 的最适条件下可产生1 8 9 u h 的乙醇。s a u c e d oe ta l 用包含运动单胞菌基因( p d c 和a d h b ) 的重组大肠杆菌质粒p l o l 2 9 7 1 ”l 。证明了乙醇 生产的优化条件，重组大肠杆菌产量分别为3 8 ( f b r i 和4 4 ( f b r 2 1 ，用1 0 的葡萄糖培养基批量培养。实验还表明，基因工程菌kp l a n t i c o l a 导入运动单胞菌 的p d c 基因可以增加乙醇产量到木糖( 2 5 1 9 l ) ，同时相关的副产物明显减少，其中 包括甲酸，乙酸，乳酸等。在丙酮酸甲酸裂解酶缺陷型菌种中木糖的利用率甚至 是野生型的两倍以上【1 2 】。k l e b s i e l l a aa y t o c a 菌株p 2 染色体上整合z m o b i l i s 乙醇产 生途径的基斟捌，发酵蔗糖蜜或糖料生产乙醇分别为4 0 和3 3 3 。g o l de ta 1 用 质粒p r s g 0 2 把运动单胞菌基因转化进乳酸菌f 1 1 1 ，重组菌株可以产生乙醇。z h a n g 等进一步利用同源重组的方法，将木糖发酵有关的四个基因( x y a 4 ，聊毋、t a i b ， t k t a ) 整合至z m o b i l i s2 0 6 c 染色体上，得到菌株c 2 5 ：之后将阿拉伯糖利用有关 的三个基因 _ 叫叫唑：! ! 竺 s d q 啉t 峨，一 l a c l l 旺翌三： 卫五更j 戛二一 图1 5l a p 、l a t h 、l a c h 、l a c l 质粒的构建图 f i g1 5t h ec o n s t r u c to ft h ep l a s m i do fl a p 、l a p h 、l a c h 、l a c - l 1 1 湖北工业大学硕士学位论文 1 8 2 构建的三种基因工程菌 表1 1 三种基因工程菌 五b l e1 1t h r e er e c o m b i n e db a c t e r i u m 湖北工业大学硕士学位论文 i ii ii i1 第二章基因土程菌的构建 2 1 引言 p d c 和a d h b 都是细菌产乙醇的关键因子，热休克蛋白基因h s p 是我们目标产 物，分别将它们克隆进合适的载体，并在大肠杆菌中表达，对本课题研究的意义 十分重大。 完整的基因工程流程一般包括目的基因的获得、载体的制各、基因的转移、 基因的表达、基因工程产品的分离纯化等过程【6 3 1 。通过基因工程技术，在体外将 不同来源的d n a 片段，通过限制性核酸内切酶及d n a 连接酶等的作用，重新组 合成新的d n a 分子，通过能够独立自主复制的载体分子为媒介，将外源d n a 分 子引入到寄主细胞进行增殖，从而使得目的基因能够得到大量的表达l 鹋】。 本实验以z y m n n o n a s m o b i l i s 和p y r o c o c c u s f u r i o s u s 基因组为模板，从中扩增 p d c ，a d h b 和h s p 基因，并将其分别插入p 1 _ 酃载体中，以p l a z 启动进行调控，最 终得到含有热休克蛋白基因且能产乙醇的表达质粒。 2 2 材料与方法 2 2 1 材料： 2 2 1 1 菌株、质粒和载体 菌株 结构描述 来源 e c o l id h 5 a f f 8 0 d l a c z a m l 5 a ( 1 a c z y a a r g nu 1 6 9e n d a l r e c a lh s d r l 70 i m od e o rt h i 一1p h o as u p e 4 4 2 g y r a 9 6r e m l z y m n n o n a sm o b i l i s p y r o c o c c u s f u r i o s u s ec o l i 2 5 6 6 质粒 p l aa m p r ，大肠杆菌 p ka m p 8 ，大肠杆菌 p l a c - l c m “，大肠杆菌 本室保存 本室保存 本室保存 本室保存 本室构建 本室构建 本室构建 湖北工业大学硕士学位论文 2 2 1 2 主要试剂 。 试剂名称生产厂家 d e e pv e n td n a 聚合酶 t 4 d n a 连接酶和各种限制性内切酶 m a s s r u l e r t md n al a d d e r , 舞s m 0 3 9 3 引物合成 胰蛋白胨、酵母提取物 低熔点琼脂糖、琼脂糖 氨苄青霉素，四环素 琼脂粉、r n a 酶、蛋白酶k i p t g 、d n a m a r k e r 、d 1 叮r p 考马斯亮蓝g 5 0 、甘氨酸 丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 蛋白质m a r k e r t e m e d 、过硫酸铵 苯酚、氯仿、乙醇等其它试剂 n e b 公司 t a k a r a 公司 f e r m e n t a s 公司 上海英骏生物技术有限公司 ) x o i d 公司 ；p a n i s h 警北制药集团 口a l r n e r s o o 分装 赶连宝生物工程有限公司 ：p 国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 p r o m e g a 公司 华美生物工程公司 国药集团 2 2 1 3 仪器与设备 h h 一8 数显控温水浴锅 上海国华贸易发展有限公司 y x o s g 4 1 2 8 0 电热手提蒸汽消毒器 3 0 3 - - 2 恒温培养箱 5 b - t s 1 洁净工作台 h q 一4 5 b 恒温摇床 c s 5 0 1 超级恒温器 g g m d e 凝胶成像系统 m i n i p r o t c a ni i i 垂直电泳槽 p o w e r p a cb a s i c 电泳仪 v i s 7 2 3 分光光度计 a r 2 1 4 0 精密电子天平 p c r 仪 m e t r l e rt o l e d o 经济型台式酸度计 is 1 0 0 脱色摇床 上海医用核子仪器厂 上海市崇明实验仪器厂 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 中国科学院武汉科学仪器厂 重庆实验设备厂 u k g f 烈e 美国b i o r a d 公司 美国b i o r a d 公司 上海第三分析仪器厂 奥豪斯国际贸易有限公司 美国b i o r a d 公司 深圳市怡华新电子有限公司 北京市新技术应用研究所 1 4 湖北工业大学硕士学位论文 2 垒2 实验方法 2 2 2 1 大肠杆菌生长培养基和运动发酵单胞菌培养基的配制 ( 1 ) l b 液体培养基：蛋白胨l o g n , ，酵母提取物5 w l ，n a c il o g l ，琼脂( 固体 培养基加) 2 0 9 n ，调节p h 到7 o ，在1 2 1 c 灭菌3 0 m i n ( 2 ) s o b 培养基：9 5 0m l 去离子水中加胰蛋白胨2 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c io 5 9 ， 混匀后加入2 5 0m m o l lk c i 溶液1 0m i ，1 0m o i l n a o h 调p h 值至7 o ，定 溶至1 0 0 0 m l ，高压灭菌2 0 m i n ( 3 ) s o c 培养基：1 l s o b 培养基中加入2 0 m l l m o i l 葡萄糖溶液 ( 4 ) r m 液体培养基：葡萄糖l o g l 、酵母提取物1 0g e l 、m g s 0 4 1 9 l 、( n h 4 ) 2 s 0 4 2g a , 、k h 2 s 0 4 2w e 、琼脂( 固体培养基加) 2 0 9 l ，调节p h 到7 0 ，在1 1 5 c 灭菌3 0 m i n 2 2 2 2 主要溶液与缓冲液的配制 ( 1 ) 0 5 m o l le d t a ( p h 8 o ) ：在8 0 m l 水中加入1 8 6 1 9 二水乙= 胺四乙酸钠盐 ( e d t a - n a 2 8 2 0 ) ，搅拌，用n a o h 调p h 值8 0 ，定容至1 0 0 0m l ，1 2 1 ( 2 灭 菌2 0 r a i n ，室温保存。 ( 2 ) 1m o l i , t r i s h c h 在8 0 0m l 去离子水中溶解1 2 1 1gt r i s 碱，加入浓盐酸调 节p h 值8 0 ，定容至1 0 0 0m l ，1 2 1 灭菌2 0r a i n 。 ( 3 ) t e ( i ) 1 - 1 8 o ) 缓冲液：1 0 m m i r i s h c l 0 , h 8 o ) ，l m m e d t a ( p h ：8 o ) ，1 2 1 ( 2 灭 菌2 0 m i n 。 ( 4 ) 5 0 x t a e 贮存液( 电泳缓冲液) ：2 4 2gt r i s 碱、5 7 1m l 冰乙酸、1 1 3 0m l0 5m o l l e d t a ( p h ：8 m ( 5 ) r n a s e a ：r n a s e a l o m g m l ， i r i s c i ( p h 7 5 ) 1 0m m o l l ，n a c i 1 5m m o l l 在9 5 下温育3 0 分钟，2 0 c 存放，使用时按1 ：2 0 的比例加入。 ( 6 ) 磷酸缓冲液( p b s ) ：1 3 7 m m o l l n a c l ；2 7 m m o i l k c i i1 0 m m o l l n a 2 h p 0 4 2 m m o l l k h 2 p 0 4 ，完全溶解分装后，1 2 1 ( 2 灭菌2 0r a i n 。 ( 7 ) 1 0 m g m l 溴化乙锭：在1 0 0 m l 蒸馏水中加入1g 溴化乙锭，搅拌至完全溶解， 室温保存于棕色瓶中。 ( 8 ) 氨苄青霉素( a m p ) 贮存液：5 0 m g m l ，超纯水配制，过滤灭菌，2 0 c 保存。 工作浓度为：6 0 h g m l 。 ( 9 ) s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 a 3 0 聚丙烯酰胺：2 9 丙烯酰胺；1 甲叉双丙烯酰胺 b 上样缓冲液：5 0 m m o l l t r i s h c l ( p h 6 8 ) ；1 0 0 m m o l l 二硫苏糖醇； 湖北工业大学硕士学位论文 2 ( m v ) s d s ( 电泳级) ；l o ( v v ) 甘油；临用前加入二硫苏糖醇，二硫苏糖 醇糖醇：上样缓冲液= 1 ： 9 c i r i s 甘氨酸电泳缓冲液：2 5 m m o l l t r i s ；0 1 ( m v ) s d s ；2 5 0 m m o l l 甘氨 酸0 h 8 3 ) d 1 5 的分离胶：3 0 丙烯酰胺混合液5 0 m l ；1 5 m o l l t r i s ( p h 8 8 ) 2 5 m l 1 0 s d s0 1 m l ；1 0 过硫酸铵0 1 ml t e m e d 钆l ：蒸馏水2 3 m l e 5 的积层胶：3 0 丙烯酰胺混合液o 5 m l ；1 5 m o l l t r i s ( p h 8 8 ) o 3 8 m l ； f 1 0 s d s 3 叽l ；1 0 过硫酸铵3 毗l ；t e m e d 3 , u i ；蒸馏水2 1 m l g 染色液：2 5 异丙醇；1 0 7 酸；o 0 4 ( m v ) 考马斯亮蓝r 2 5 0 h 脱色液：5 乙酸；7 5 甲醇 2 2 2 3 运动发酵单胞菌的培养及保存 将o 5m lr m 液体培养基加到真空冻干菌中，充分振荡，使冻干菌悬浮，然后 取0 3 m l 悬液加到r m 液体培养基，3 0 培养。取对数生长期的菌液，加入己灭菌的 甘油，使终浓度达到1 5 ，- 2 0 c 可保存数月，8 0 ( 2 可保存一至两年。 2 2 2 4 分子实验操作 ( 一) 细菌基因组的制掣删 ( 1 ) 培养1 0m l 的细菌培养物至饱和状态，取3 m l 的培养物1 5 0 0 0 r m 离心2m i n ( 2 ) 沉淀物加入5 6 7 u l t e 缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬，加入3 0 u l1 0 的s d s 和3 u l2 0 m g m l 的蛋白酶k ，混匀，于5 5 c 温育2 0 r a i n 。 ( 3 ) 加入1 0 0 u l5 m o l l n a c l ，充分混匀，再加入4 0 u lc t a b n a c l 溶液，混匀，于 6 5 温育1 0 m i n ( 4 ) 加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，1 5 0 0 0 f m 离- f f 5 m i n ，将上清液转入另一 个管中。 ( 5 ) 加入等体积的酚氯仿异戊醇，混匀，1 5 0 0 0 r m 离, b 5 m i n ，将上清液转入另 一个新管中。 ( 6 ) 加入0 6 倍体积的预冷异丙醇，轻轻棍合直到d n a 沉淀下来，离心。 ( 7 ) 用7 0 乙醇洗涤沉淀，晾干。 ( 8 ) 将已干的d n a 溶于1 0 0 u lt e 中，一2 0 保存。 ( 二) p c r 反应 表2 1p c r 反应体系 t a b l e2 1t h es y s t e mo fp c r 1 6 湖北工业大学硕士学位论文 反应体系5 0 p l t e m p l a t e p r i m e r 2 m m o l ld n r p 1 0 p c rb u f f e r b s a v e n t 聚合酶 h 2 0 1 1 t l 上下游各2 5 u l 2 ul 5 pl o 5 p l 4 u l 加水到总体积为5 0 ui 在b i o r a dp c r 仪上进行，如有需要，按比例放大。反应程序如下： ( 1 ) 加样4 1 23 0 s ( t e m p l a t e l i t l ，p r i m e r 各2 5 l i l ，加h 2 0 至2 5 u 1 ) ； ( 2 ) 变性9 6 1 0 m i r a ( 3 ) 力样4 c3 0 s ( 1 0 p c r b u f f e r 5 l i l ，2 m m o l l d n t f 2 u i ，b s a 0 5 p l ，v e n t 聚 合酶4 1 1 1 ，加h 2 0 至2 5 | 1 1 ) ；变性9 6 c 3 m i m ( 4 ) 变性9 6 cl m i n ，复性5 0 l m i n ，延伸7 2 c 9 0 s ，共3 5 个循环； ( 5 ) 延伸7 t c l o m i n ；4 c 保存。 ( 三) 质粒提取 采用安比奥公司提供的d n a 少量快速提取试剂盒，操作步骤如下： ( 1 ) 将含有目的质粒的细菌培养液置于7 m l 离心管中，1 4 0 0 0 r m i n ，2 m i n ，收集细胞 ( 注意：离心时要先进行平衡) ； ( 2 ) 加入2 5 0 u lb u f f e r p b l ，涡旋震荡，转移到1 5 u l 的离心管中； ( 3 ) 加入2 5 0 u lb u f f e rp b 2 ，轻轻颠倒离心管4 到6 次，混匀，室温放置不超过5m i n ； ( 4 ) 加入3 5 0 u l b u f f e r n b 3 ，轻轻颠倒离心管4 到6 次，混匀，静置3 到5 m i n ； ( 5 ) 4 0 0 0 r ) m 离心1 0 m i n ，转移上清液到3 s 离心柱中，1 2 0 0 0 r m ，离心l m i n ，倒去 液体， ( 6 ) 加0 5 m l p b 4 ，1 2 0 0 0 r m 离心l m i n ，倒去液体； ( 7 ) 加7 0 0 u l 左右w b ，1 2 0 0 0r m 离心l m i n ，重置，重复一次； ( 8 ) 1 4 0 0 0 r m 离心2 r a i n ，将离心柱置于一干净1 5 m l 离心管内： ( 9 ) 加入1 2 0 u l e b ，注意加到过滤膜中央，静置1 到3 r a i n ，1 2 0 0 0 r m 离心l m i m ( 1 0 ) 将离心管做好标签，保存于2 0 c 冰箱中 湖北工业大学硕士学位论文 ( 四) d n a 片段的纯化回收 。 采用安比奥公司生产的d n a 少量快速纯化试剂盒，操作步骤如下： ( 1 ) 切下含有d n a 的琼脂糖胶，置于离心管中，称重： ( 2 ) 加入3 倍体积的b u f f e rq g ，5 0 c 温浴1 0 m i n 直到胶完全溶解，溶液若为橙色 或紫色时，需加1 0 u l3 m o i l n a a c p h 5 2 ，混匀； ( 3 ) 加1 倍胶体积的异丙醇混匀，转移溶液至3 s 离心柱中，1 2 0 0 0 r m 离心l m i n ， 弃收集管内的液体，并将离心柱重新放于收集管内； ( 4 ) 加0 5 m lb u f f e rq g 于离心柱内，1 2 0 0 0 r m 离心l m i n 。重置； ( 5 ) 加入7 0 0 u lb u f f e rw b 于离心柱内，放置5m i n ，1 2 0 0 0 r m 离心l m i n ，弃收集管 液体，重置，重复一次； ( 6 ) 将其放于1 5 m l 的离心管内，高速1 4 0 0 0r m 离心2 m i n ； ( 7 ) 加入1 2 0 u l 的b u f f e re b 于离心柱中央，静置3m i n ，1 2 0 0 0r m 离心2 m i n ，收 集d n a 片段；收集d n a 镕液，置于2 0 中保存。 ( 五) 酶切与连接 表z 2 酶切反应体系 t a b l e2 2t h es y s t e mo fd i g e s t i o n 1 0u l 双酶切反应体系1 0i l l 单酶切反应体系 d n a 1 0 b u f f e r 酶i 酶i i b s a h 2 0 ( 灭菌) 总计 5ul 1u l 0 2 5l l l o 2 5ul o 1 u l 3 4 u l 1 0i i i d n a 1 0 x b u f f e r 酶 b s a h 2 0 ( 灭菌) 总计 5i l l 1 | i l o 2 5p l o 1 p l 3 6 5 u l 1 0p1 混匀后，3 7 c 水浴2h 3h ，如有需要，按比列放大即可，不足部分用水补齐。 连接时，根据d n a 的量，使插入片段与载体的比列为：3 1 到5 1 之间。具 体操作如下。 湖北工业大学硕士学位论文 i 表2 3 连接反应体系 。 t a b l e2 3t h es y s t e mo fc o n n e c t i v i t y 一般的连接体系 1 0 x b u f f e r 插入片段 载体片段 t 4 d n a 连接酶 总计 2ui 5pi 1 2 | l l 1pl 2 01 1 1 混匀，瞬时离，t ：, ( 3 0 0 0 转左右) ，1 8 c 过夜连接( 至少1 6 h ) 。 ( 七) 感受态细胞的制备 感受态的制备具体操作如下：( 注：所有操作均在无菌条件下进行) ( 1 ) 在新鲜的l b 平板上划线活e c o l i d h 5 口，过夜培养； ( 2 ) 接种单菌落于无盐l b 培养液中，3 7 1 2 ，2 0 0 r i m 过夜培养： ( 3 ) 将活化菌液接种3 ( v v ) 到预热的2 l ( 无盐l b 5 0 0 m 1 ) 锥形瓶中，3 7 c ， 2 0 0 r m 培养； ( 4 ) 当o d 6 0 0 为0 4 0 5 时，迅速冰浴，冷却1 5m i n 一3 0r a i n ，缓慢摇匀： ( 5 ) 将细胞转移至冰冷的离心管( 5 0 0 m 1 ) q b ，4 ，4 0 0 0 r m 离心1 5r a i n ，收集细胞， 用3 0 0m l 冰冷的1 0 甘油重悬； ( 6 ) 4 1 2 ，4 0 0 0 r m 离心1 0m i n ，收集细胞，用2 5 0m l1 0 甘油重悬； ( 7 ) 重复6 ) ，收集细胞，1 0 甘油重悬( 甘油用量依次减少为：1 0 0 m l ，5 0m l ， 1m 1 ) ： ( 8 ) 将悬液按5 0 叫管分装到冷却的无菌的o 5 m l 微量离心管中，封紧管口，贮 存于7 0 c 备用。 ( 八) 转化与筛选 ( 1 ) 将质粒或连接产物1 # 1 5 z l ( 1 0p g - 2 5n 曲，加入感受态细胞中，混匀置于冰 上3 0s - 6 0s ： ( 2 ) 将感受态细胞与d n a 混合物加入预冷的电转杯中，确保混合液于电击杯底 部，擦干电击杯，放入电转仪： 1 9 湖北工业大学硕士学位论文 ( 3 ) 调节电转仪：2 5 0 0 v ，6 m s 。启动电脉冲； ( 4 ) 脉冲结束后，快速取出电转杯，加入1m l3 7 ( 2 预热的s o c 培养基； ( 5 ) 将细胞转至1 5m l 无菌离心管中，3 7 c 下复性培养1h ，不时晃动； ( 6 ) 取不同体积的电转化细胞，铺于含有适当抗生紊的l b 琼脂板上； ( 7 ) 室温放置，待悬液完全吸收后，3 7 ( 2 倒置培养1 2h 1 6h 。 ( 九) 克隆的鉴定 ( 1 ) 挑取单菌落接种于含有适当抗生素的5 m ll b 液体培养基中，3 7 下过夜培养 1 2 1 6 h ； ( 2 ) 按照2 2 3 2 3 提取质粒； ( 3 ) 按照2 2 3 2 5 加入合适限制性内切酶酶切； ( 4 ) 电泳后，对比插入片段大小和d n a m a r k e r ，确定阳性克隆，测序鉴定。 ( - t - ) 蛋白电泳 ( 1 ) 电泳槽的安装：干燥的两块玻璃板装入塑料夹套内，垂直固定于电泳槽上： ( 2 ) 样品处理：将标准蛋白质和待测样品按1 ：1 的比例与上样缓冲液混合，沸水 煮5 m i n ，冷却。 ( 3 ) 制胶：将配制好的分离胶沿长玻璃板加入两块玻璃板之间，加到距短玻璃板上 边缘3 c m 处，立即覆盖2 3 m m 水层，静止聚合约4 0 m i n ，吸取分离胶的水 分，将配制好的积层胶注入分离胶之上，立即插上有机玻璃的点样槽模板，待 。浓缩胶聚合好备用。 ( 4 ) 点样：用微量注射器吸取标准蛋白质样品液趴l 注入样品槽内的浓缩胶面上， 同时吸取待测样品液1 吼l 注入样品槽内，在样品上注入电极缓冲液。 ( 5 ) 电泳：加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源，调节电压为1 4 0 v ，当指 示剂进入分离胶后，电压加大到2 0 0 v ，约1 h 后，指示剂进行电泳缓冲液，终 止电泳。 ( 6 ) 染色：取出凝胶板，加入染色液染色1 5 r a i n 。 ( 7 ) 脱色：将胶放在脱色液中脱色，每隔0 5 h 换一次脱色液，至少换3 次，待蓝 色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止。 2 2 2 5 重组质粒p i a p 的构建 1 ) 根据文献报道和n c b i 基因编号设计合适引物【砷】。以z m o m o n a sm o b i l i s 基 因组为模板，p c r 扩增基因p d c 和a d h b ，选择d 尺j r 和x h oj r 位点将基因 2 0 湖北工业大学硕士学位论文 表达质粒中，得到产乙醇质粒p l a p 贝, t i g l 。 m c 和a d h b 基因序列分别设计两对p c r 反应的引物如下： p d c 基因的引物： p r i m e r - 1 一u p ：5 c g t g a a t t c c a t g g ( 玎t c ( 1 g a c r n r a = i ：f 蛆1 c 一3 p r i m e r d o w n ：5- g c a c 丌a a g g t a c c g a a g g a g c t c g a - 3 a d h b 基因的引物： p r i m e r - l - u p ：5 - t c i c g a g g t c t g a t c g i t a t a g a a t t c t g c t 3 p r i m e r - d o w n ：5 a g a g c t c c a g a c t a g a g g a g c i t a a g a a c - 3 图2 1 重组质粒p l a p 构建示意图 f i 9 2 1d e l i n e a t i o no fc o n s t r c t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i dp l a p ( 2 ) 回收p c r 产物； ( 3 ) 用2 2 2 4 中的质粒抽提的方法提取质粒； ( 4 ) 分别用适当的限制性内切酶酶切，将p 出和a d h b 基因分别插入p b r 3 2 2 载 体中。r 扣p d c 和a d h b 基因前均含有p k 启动子，形成双启动子的串联操 控。 ( 5 ) 按照2 2 2 4 中方法连接，转化，鉴定，得到重组质粒p l a p ，与国内研究一 湖北工业大学硕士学位论文 致。 2 2 2 6 含有热休克蛋白基因重组质粒p l a p h 的构建 根据文献报道设计合适引物，用p c r 的方法，以t r o c o c c u sf u r i o s u s 基因组 d n a