（发酵工程专业论文）碳源流加策略提高混合微生物体系对聚乙烯醇的降解能力.pdf

摘要 摘要 聚乙烯醇( p 、，a ) 是二种可降解的化工高分子化合物，但是自然界对它的降 解效率较低，在工业上它是由聚乙酸乙烯酯进行醇解反应得到的。它的主链仅由 碳原子构成，羟基是其官能团。由于它的特殊结构，p 、，a 具有许多优良的性能， 例如较好的热稳定性、较好的粘性和较强的抗溶剂性等。目前p 、，a 在工业上得 到了广泛的应用。然而废弃的p 、，a 在自然环境中导致了严重的污染。为了消除 p 、後的污染，有必要提高p 、，a 降解酶( p 、峨) 的产量和p 、，a 的降解效率。 本论文的研究主要集中在以下三个方面：混合微生物体系对p 、，a 的降解； 通过发酵优化提高p v a 降解酶的产量；通过1 ，4 丁二醇提高p 、，a 的降解效率， 具体研究结果如下。 ( 1 ) 通过凝胶过滤色谱法( g p c ) 、碘量法和红外光谱分析确证了混合微生 物体系对p 的降解能力。同其它p 、，a 降解微生物相比，此混合微生物体系具 有较高的p 、，a 降解速率，并且发现它能够完全降解p 、a 。通过检测发酵产物， 发现它的结构和p 、，a 类似，但它的羟基含量较少，并且其中含有c o c 化学键。 此混合微生物体系中存在妇砌所d ，姗s p 和励c 讲淞s p 。在p v r a 降解过程中， 微生物的相对丰度发生了显著变化，这反映了菌群结构的显著变化。在发酵上清 液中未检测到p 、，a 氧化酶，但是检测到了p 、，a 降解酶的总酶活和p 、，a 脱氢酶。 ( 2 ) 发现1 ，4 丁二醇能够提高p 、，a 降解酶的产量。用1 ，4 丁二醇作碳源使 p 、，a 降解酶的最高酶活达到了3 4 3u m l ，是对照( 0 7 5u m 1 ) 的4 6 倍。具体 分析发现，菌体的二次生长和p 降解速率的增加同时发生。基于这种现象， 设计了两阶段发酵策略，即在特定的时间添加额外的碳源( 此处可将策略写具体 些) 。通过采用这种发酵策略，取得了较高的生产强度( 6 0 8i 班，1 1 ) 。进一步通 过添加p 、，a 来提高p 、，a 降解酶的产量，将两阶段发酵延长为三阶段发酵。同两 阶段发酵相比，酶对细胞的产率系数合成量得到了显著提高，其最大增加量达到 了4 1 8u g 。 ( 3 ) 通过优化1 ，4 丁二醇的添加策略提高了细胞的活力，最终提高了p 、，a 的降解效率。具体分析，通过将1 。4 丁二醇的添加时间调整到2 lh ，使p 、，a 的 平均降解速率提高到了0 1 5 0g l m 。研究发现高浓度的1 ，4 丁二醇( 高于1 5g 几) 和p 、，a ( 高于3 0g l ) 对细胞具有毒性( 两者的作用可能不一样，1 ，4 丁二醇是毒 性，高浓度w r a 是抑制作用吧) 。基于以上结果，采用连续补料发酵将l ，4 丁二 醇的浓度控制在了5 0g l 之下。结果表明，细胞对p 、，a 的降解活力和细胞的生 长活力都得到了显著的提高。同时p 、，a 的平均降解速率达到了o 4 4 7g l l l 。 关键词：聚乙烯醇、混合微生物体系、p v a 降解酶、p v a 降解效率、l ，4 丁二醇 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t p o l y ( v i r l y la l c o h 0 1 ) ( p 、7 ：f 吣i sa k i l l do fb i o d e 蓼a d a b l e 驴m e t i cp o l y m e r ，b u ti l lt l l e n a t u r a le n v i r o n m e n tm ee 筋c i e n c yo fp v ad e 伊a d a t i o ni sl o w ，弛dp v ai sp r o d u c e d b yt l l eh y d r o l y s i so fp o l y ( v i n y la c e t a t e ) i i lm d u s 奶li t sm a i l lc h a i n sa r cm a d eu po f s o l ec a r b o na t o m s 锄di t s 觚c t i o n a lg r o u pi sh y d r o x y l o w i n gt 0i t ss t m c t u r e ，i ”v r a h a sm 锄yp r o m i l l e n tf e a t u r e s ，s u c ha s 吐l e 咖o s t a b l e ，a d h e s i v e ，t o l e m c et o w a r d s s o l v e 鹏c ta l 。n 0 w a d a y s ，p v ai sm a s s i v e l yu s e di ni l l d u s 略h o w e v e r ，d i s p o s e dp v a h a sc a u s e ds 矗o u sp o l l u t i o ni l ln a n l m le n v 的姗e n t t oe l i m i r i a t ep v a p o l l u t i o n ，i ti s c e s s a r y t 0e n h 锄c e p 、r a - d e 争a d i n ge n z y m e s 山e )p r o d u c t i o n 觚d p v a d e g m d i n ge 伍c i e n c y 1 1 l i ss t u d yw 勰m a 访l yf o c u s e d0 n 廿l r c e 嬲p e c t s ：p 、，ad e g r a d a t i o nb yt h cm i x e d m i c r o b i a lc u l t i 鹏；e n h 孤c e m e mo f啪eb yf e 咖e n t a t i o n o p t h i z a t i o n ； e n h 锄c 锄e n to fp k d e g r a d i l l ge m c i 髓c yb yl ，4 一b u t 锄e d i 0 1 n em a i l lr e s u l t sa 陀嬲 f o l l o w s ( 1 ) p 、，ad e 鲈a d a t i o nb ya l em i ) 【e dm i c r o b i a lc u l t u r ew 弱c o n f i n n e db yg p c ， i o d o m e 町肌d 瓜s p e c 舰c o m p 撒d 、) l ，i 廿l0 t h e rp v a - d e 酬i n gs t r a i l l s ，舭m i x e d m i c r o b i a lc u l t u r eh a dh i g h e rp 1 v r a d e g r a d i n g 阳t c i tw 懿f o u n d 也a t l em i 】【e d m i c r o b i a lc u l t i 玳c o u l dd e 伊a d ep 、厂ac o n l p l e t e l y - b yd e t e c t i n gf c 册e n t a t i o np r o d u c 魄 i tw 弱f 0 吼dm a ti t ss 缸i l c t u r e 、张ss i l t l i l 盯谢t l lp 、a ，b u t 廿1 c 锄0 u n to fh y d r 0 巧l g r o u p sw a s1 0 w 觚dan e w 啪eo f c h 锄i c a lb o n d ( c - o - c ) w a sf o m e d mm em i x e d m i c r o b i a lc u l t u r e ，觑砌忉d 麟s p a n d 勘c 甜船s p w e r ee x i s t e d d u r i l l gp v a d e g r a d a t i o n ，m er c l a t i v ea b u n d a n c eo f 也em i ) 【e dm i c r o b i a lc u l n l 托s i g n i f i c a i l 廿y c h 锄g e d t h e s er e 锄l t sr c n e c t e das i 弘i f i c a n ts h i f ti i lm i c r o b i a lc o l i l 】m 吼崎s 仃1 l c t u r e p v ao x i d a s e 、a sn o td e t e c t e di n l ep 、厂a d e g r a d 洫gs u p e m a t 跗t h o 、e v e r ，p 、- 山e a n dp v a d e h y d r o g e n a s ew e r ed e t e c t e d ( 2 ) h lt i l i ss t u d y ，i tw 硒f o u n dm a tl ，4 - b u t 锄e d i o lc o u l de r l i l 锄c ep 、厅e p r o d u c t i o n h 砷p 山e t m 眵( 3 4 3u m 1 ) ，w h i c h 、嬲4 6f o l d so fm ec o n 们l ( 0 7 5i j m 1 ) ，w a sa c h i e v e dw i t h1 ，4 - b u t a n e d i o la sc a r b o ns o u r c e s p e c i f i c a l l y ；d i a u x i c 铲o w 血c o u p l e d 谢也i i l c r e 鹊e dp 、厂a - d e g r a d m g 舱t cw 舔o b s e r v e d b a s e do n 也i s p h e n o m e n o n ，t w o s t a g ef i 锄e n 谢o n ，a d d i i l g 跹o m c rc a r b o ns o u r c ea tap r o p 盯缸e ， 阻sd e s i g n e d b ya p p l y i i l gn l i ss n 疵g y ；h i g hp 、孕衄p r o d u c t i v i t y ( 6 0 8u 】二1 1 ) 、a s a c h i e v e d f u “h e r ，t w o s t a g ef e n i l e n t a t i o nw 硒e x t c n d e d t 0t 1 1 r e e - s t a g ef e m e n t a t i o n b ya d d i l l gp v a t 0i m p r 0 v e 啪e p r o d u c t i o n t h ep d e t i v 时p e r 吼i tb i o m 弱s a b 捌t a c t ( 、啊丙嗽) w a ss i g n i f i c 锄t l ye n h 锄c e do v e r 钾旧- s t a g ef e 咖e n t a t i o n 锄d t l l em a x i m u m i n c r c m e n tw 私4 1 8 u g ( 3 ) p v a - d e g r a d i n ge m c i e n c yw a se 1 1 l l 锄c e db y0 p t i l l l i z 啦! ，4 - b u t a i l e d i o l f e e d i n gs 白暇t e g i e st 0i m p r o v ec e l lv i t a l i t i e s s p e c i f i c a l l y ，也ea v e m g ep v ad e 蓼a d i n g r a t ew a si m p r o v e dt o0 15 0g l hb ya d 5 u s t m g1 ，4 b u t a n e d i o la d d i t i o nt i m et o21h i t 、酗f o u n d 廿l a t1 ，4 b u t 觚e d i o l ( a b o v e1 5g l ) 弛dp 、，a ( a b o v e3 0g l ) a th i g l l c o n c e n t r a t i o nw e 聆t 0 】【i ct 0c e l l s b 舔e do n 廿l ea b o v e 托s u l t s ，c o n t i l l u o u sf e d b a t c h f e 册e n t a t i o nw 私a p i p l i e dt 0c o n 灯o l1 ，4 - b u t 粕e d i o lc o n c e n t 瑚t i o nb e l o w5 0g 几 c o r i s e q u e n t l y ，c e l lv 妇l i t i e sf o rp v ad e g r a d a t i o n 锄dc e l lg r o w 吐1w e 托s i 弘i f i c 趾t l y i m p r o v e d m e 觚w h i l e ，h i 曲a v e r a g ep v ad e g r a d i n gr a t c ( 0 4 4 7g l 彻w a sa c h i e v e d k e y 、0 r d s ：p 、厂a ，m i x e dm i c r o b i a lc u l t u r c ，p 、，a d e ，p v a - d e g r a d i n ge 伍c i e n c y ， 1 。4 一b u t 锄e d i o l l 目录 目录 摘要i a b s t r a c t 目录i 第一章引言。1 1 1 研究背景l 1 1 1 聚乙烯醇概述1 1 1 2p 、，a 的降解2 1 1 3p 、，a 降解酶3 1 1 4p 、，a 降解的机理4 1 2 立题依据5 1 2 1p 、，a 降解的国内外研究概况5 1 2 2 本课题的研究意义5 1 3 研究内容6 第二章材料与方法7 2 1 菌种和培养基7 2 1 1 菌种。7 2 1 2 培养基7 2 2 培养方法7 2 2 1 发酵条件7 2 2 2 单碳源对生产p 、，a 降解酶的影响7 2 2 - 3 混合碳源对生产p 、，a 降解酶的影响8 2 2 4 两阶段发酵和三阶段发酵8 2 2 5 单点补料发酵8 2 2 6 连续补料发酵8 2 3 末端限制性片段长度多态性( t - r f l p ) 分析8 2 4 静息细胞对p 、a 的降解能力9 2 5 混合微生物体系对不同碳源的耐受能力9 2 6 分析方法9 2 6 1p 、，a 浓度的检测方法9 2 6 2p v a 分子量的检测方法9 2 6 31 ，4 丁二醇浓度的检测方法9 2 6 4 细胞干重( d c w ) 的计算方法1 0 江南大学硕士学位论文 2 6 5 红外光谱分析( 瓜s p e c n - a ) 1 0 2 6 6p v a 降解酶酶活测定方法1 0 2 6 7p 、，a 脱氢酶的酶学性质分析。1 0 2 6 8 细胞提取液的制备。10 2 6 9 混合微生物体系对l ，4 丁二醇的降解能力1 0 第三章结果与讨论l l 3 1 混合微生物体系降解p v a 1 1 3 1 1 摇瓶发酵条件下混合微生物体系降解p 、，a 1 l 3 1 2 发酵罐发酵条件下混合微生物体系降解p 、，a 15 3 1 3 发酵体系中的产物15 3 1 4 混合微生物体系中的微生物1 7 3 1 5 混合微生物体系中的p 、，a 降解酶2 0 3 2 发酵优化提高p v a 降解酶的产量2 3 3 2 1 单碳源对混合微生物产p 、，a 降解酶的影响。2 3 3 2 2 混合碳源对混合微生物产p 、，a 降解酶的影响2 4 3 2 3 两阶段发酵2 4 3 2 4 三阶段发酵2 6 3 31 ，4 丁二醇提高p v a 的降解速率2 9 3 3 1l ，4 丁二醇对p 、，a 降解的影响2 9 3 3 2 优化l ，4 丁二醇添加时间3 1 3 3 3 优化l 。4 丁二醇的添加浓度。3 2 3 3 41 ，4 丁二醇连续补料发酵。3 4 3 4 结论3 7 j 改谢3 8 参考文献3 9 附录：攻读硕士学位期间取得的学术成果4 3 第一章引言 1 1 研究背景 第一章引言弟一旱ji 苗 1 1 1 聚乙烯醇概述 聚乙烯醇( p o l y ( v i n y l a l c o h 0 1 ) 口、，a ) ) 是一种可降解的化工高分子化合物【l 】。其 结构如图1 1 所示，它的主链仅由碳原子构成，它的主要官能团是羟基。可以将 p 、，a 的单体看成是乙烯醇【2 】。在工业上，p 、，a 是由聚乙酸乙烯酯与甲醇进行醇解 反应得到的，所以p 、，a 产品中的主要杂质是醇解产生的乙酸盐。描述p 、，a 的两 个基本参数是聚合度和醇解度。聚合度是指重复的聚合单位数，可以将聚合的单 体认为是乙烯醇，聚合度决定了p 、，a 的分子量；醇解度是指聚乙酸乙烯酯与甲 醇进行醇解反应的程度，这决定了p v a 分子中羟基官能团的含量。p v a 型号的 命名就是基于聚合度和醇解度，例如：p 、，a 1 7 9 9 是指p 、後的聚合度和醇解度分 别为1 7 0 0 和9 9 。 | - _ _ 擘啡 一严r p 删- 魄p 啡- i l illj 一 ”i 。 l ；铺 o h傩o h 棚6 i 誊睁巴p 鲋中毗f 伽硼o h 篙麓超始磊。矗一缸篙麓超支篷 。“” i 一甲f 一舛l oh o h |p h； 一舛一掣一c h ，一c h 一哦一铲+ 一伊情q 一9 立构墟麓虞婪萋分奄 图1 1p 、，a 的微观结构【2 】 f i g 1 - lm i c r o s 臼1 l c t i 鹋o f p v a p 、，a 具有很多优良的物化性能，例如：良好的水溶性、良好的热稳定性，良 好的粘性和抗溶剂性等。由于其优良的性能，在现代工业中p v a 得到了广泛的 应用。它可以作为纺织和造纸工业中的浆料、涂料中的添加剂、粘合剂、乳化剂 和分散剂等【3 】。由于p v a 具有生物可降解性( 很少的化工高分子具有这种特性) ， 它可以作为可降解塑料中的成分【4 ，5 1 ，近年来p v a 进一步受到了关注。 江南大学硕士学位论文 1 1 2p v a 的降解 在1 9 2 4 年由德国的科学家d r h e n i l 锄与d r h a e n e l 共同合成了p 、，a ，由 于它在自然环境中存在的时间较短，能降解p 、，a 的微生物种类是非常有限的。 许多研究都集中在筛选具有p 、，a 降解能力的微生物。目前报道的能降解p 、，a 的 微生物如表1 1 所示【6 j ，这些微生物主要存在三种模式：单菌、两种菌共生和混 合微生物体系。对于单菌降解p v a ，许多菌株需要向培养基中添加吡咯喹啉醌 哂孵o l o q u i l l o l i n eq u i n i n e ( p q q ) ) 。p q q 是一种p 、，a 脱氢酶( p v a d h ) 的辅因子。 在p 、，a 降解过程中，啪h 催化初始的氧化步骤【7 ，8 】。对于两种菌共生降解p 、，a ， 通常是一种菌为另一种降解p 、，a 的菌提供p q q 或者其它必需的营养因子【9 1 0 1 。 对于混合微生物体系降解p 、，a ，不同微生物之间常常存在协同效应【1 1 1 。目前研 究得最多的能降解p 、，a 的微生物是觑“幽研d 玎黜s p 7 9 ，1 2 ，13 1 。研究得最深入的菌 株是勋厅舰p 朋厶s p s 缸a 证1 1 3 p 3 【l 叫。 表1 1 降解p v a 的微生物f 6 】 t a b l e1 - 1m i c r o o r g a i l i s m sf o rp v ad e g r a d a t i o n 2 第一章引言 有报道也研究了p 、，a 的结构对其降解的影响，在p 、，a 的结构方面主要考察 了两个指标：聚合度和醇解度。c h i e l l i n i 曾报道p 、，a 的聚合度和醇解度对其降 解没有显著的影响【l5 1 。然而张颖曾报道一株菌只能部分降解p 、，a 1 7 9 9 ，因为低 聚合度的p v a 不能被这株菌降解【l l 】。对于菌株d 护耙办聊l 店册p 蒯妇凇，高聚合 度的p 、，a 分子不能被降解，因为这株菌产生的啪h 只能催化低聚合度的p 、厂a 分子l l6 1 。由以上结果可知，p v a 的结构对其降解的影响会因为所选微生物种类 的不同而不同。总的来说，p 、，a 的结构会影响p v a 的降解，同时环境条件、微 生物的种类和生理条件同样会影响p 、，a 的降解【1 5 ，1 7 1 。 1 1 3 p 、纨降解酶 目前主要报道了三种p v a 降解酶：p 、，a 氧化酶( e c l 1 3 3 0 ) 、p 、，a 脱氢酶 ( e c l 1 9 9 2 3 ) 和氧化型p 、，a 水解酶正c 3 7 1 7 ) 。 ( 1 ) p v a 氧化酶 p 、，a 氧化酶催化p 、，a 分子中的羟基官能团的氧化反应，反应中的电子受体 为0 2 。s u z u l 【i 纯化出的p v a 氧化酶的分子量大约是2 6l ，酶分子中含有铁元 素，酶活受c 0 2 + 、n i 2 + 、e d l a 、羟胺和水杨基羟肟的轻微抑制【1 2 】。m o r i t a 纯化 出的p v a 氧化酶是单肽链酶，分子量为5 0 如，等电点为p h1 0 3 ，酶分子中含 有非血红素铁，酶活受到h 矿、p b 2 + 、z n 2 + 、邻菲哕啉和e d l a 的轻微抑制【1 8 】。 s a k a i 纯化出的p 、，a 氧化酶的分子量约4 0i ，等电点为p h4 5 【1 9 】。硷1 w a g o s h i 纯化出的p 、，a 氧化酶的分子量约7 5l 8 5l ，等电点为p h5 7 【2 0 1 。由以上研 究结果可知，不同来源的p 、，a 氧化酶的分子量和酶学性质相差较大。大部分的 p 、，a 氧化酶是胞外酶，但也发现了膜结合的p 、，a 氧化酶【2 。 ( 2 ) p v a 脱氢酶 p v a 脱氢酶催化p 、，a 分子中的羟基官能团的脱氢反应。该酶属于膜结合酶 类，它是一类需要p q q 作为辅酶的脱氢酶。产生这类酶的微生物需要以p q q 作 为生长因子。现在已经报道了编码p v a 脱氢酶的基因，基于该基因的核苷酸序 列，推断出p 、，a 脱氢酶含有原血红素c 的结合位点，这说明原血红素c 有可能 参加了p v a 的脱氢反应【2 2 ，2 3 1 。 ( 3 ) 氧化型p 、，a 水解酶 从黜z 砌加d ，娜菌株发酵液中，分离出来的氧化型p 、，a 水解酶是单肽链酶， 其分子量约为3 8k d ，等电点为p h1 0 o ，酶活可受到h 9 2 + 的抑制，但用还原型 谷胱甘肽处理可恢复其活性【2 4 j 。 另外也有报道p v a 酯酶，它能催化p v a 长链上残存乙酸酯键的断裂【2 5 1 ，同 时也有报道催化p 、，a 降解的醛缩酣1 1 。 江南大学硕士学位论文 1 1 4p v a 降解的机理 基于目前已经报道的p v a 降解酶：p 、，a 氧化酶、p 、，a 脱氢酶、氧化型p v a 水解酶、p 、，a 酯酶和醛缩酶，s h i r i l a o 归纳总结了可能的p v a 降解机理，如图 1 2 所示。p 、，a 主链的断裂需要经过两步酶催化反应才能完成，第一步由p 、，a 氧 化酶以0 2 作为电子受体，或由p 、，a 脱氢酶以p q q 作为电子受体，将p v a 的羟 基氧化为酮基。对于第二步的反应，可能存在两种情况：( 1 ) 具有双酮结构的 p 、，a 被氧化型的p 、，a 水解酶催化水解断裂；( 2 ) 具有单个酮基的p v a 被醛缩酶 催化裂解断裂。在两步催化反应之后，会产生一些随机长度的片段，这些p 、，a 片段会被转运进入细胞，然后进一步被细胞利用【2 酬。 p r o 刚呻价埘灯p v 抽g 喇a d o 吣y v 薯 u 5 0 n 列ms 臀拍m 氏1 ，p o o c b p o n 拥 p v d 。h 目州a ：z 嘴c 虹鲥p 、，a h 捧h 蛔驰：3 ，p v d 蟑鲥訇爿谨f t 砌 d 州口咖s o8 n d3 妇o b s o a c 洲l ： ，s o c 饼岫d 伍 叫。矗d a 5 彰s 阳她吨啪 h 司咖：6 。p w 岫a d h g 帅z ”蝴 o 曲j r h i 帕a 口i v t 譬 图1 2 可能存在的p 、，a 生物降解途径【1 】 f i g 1 - 2p o 船i b l ep 、，a 姆a d a b l ep 甜1 w 科sb ym i c o r g ；l n i s m i 等发现p v a 脱氢酶、氧化型p 、，a 水解酶和细胞色素c 的基因共同存 在于同一个操纵子中，并且这个操纵子存在于一个较大的质粒上1 1 4 j 。再结合 s h 硫a o 等关于p v a 降解和电子传递链的研究结果，k a 、a i 进一步提出p 、，a 的 初始降解发生在细胞的周质空间，p v a 脱氢酶在氧化p v a 分子上的羟基的时候， 首先将电子传递给它的辅酶p q q ，接着p q q 又将电子传递给细胞色素c ，最后 可能由细胞色素c 将电子传递给存在于细胞膜上的电子传递链，从而使细胞通过 氧化p v a 而获得能量【6 j 。 4 第一章引言 1 2 立题依据 1 2 1p v a 降解的国内外研究概况 在世界范围内，p 、，a 降解领域的研究工作主要集中在四个方面： ( 1 ) 筛选能够降解p 、，a 的微生物，研究发现这些微生物存在模式有单菌、 两种菌共生和混合微生物体系；研究这些微生物在p 、，a 降解方面的生理特性， 发现部分降解p v a 的微生物需要p q q 作为生长因子。 ( 2 ) 纯化p 、，a 降解酶，发现了p 、，a 脱氢酶、p 、，a 氧化酶、氧化型p 、，a 水 解酶、p v a 酯酶和醛缩酶；研究w r a 的降解机理，已经报道了几种不同的降解 p 、，a 主链的酶系，在这些酶系中，首先由脱氢酶或氧化酶催化p 、，a 羟基的氧化， 接着由水解酶或醛缩酶催化p 、，a 主链的断裂；p 、厂a 降解酶的应用研究，m o r i 等 将p 、，a 降解酶应用到了棉织物的退浆工艺中，实验证明酶法反应条件温和，棉 织物的品质得到了保持，同时退浆废水的生物可降解性得到了提高【2 7 】。 ( 3 ) 克隆与p 、，a 降解相关的基因，成功克隆了p 、，a 脱氢酶和氧化型p 、，a 水解酶的基因，以及相关的血红素c 的基因，并发现了和p 、，a 降解相关的操纵 子和质粒【1 4 ，2 2 ，2 3 捌。 ( 4 ) 通过发酵条件优化提高p 、，a 降解酶的产量和p 、，a 的降解效率；研究 p 、，a 的结构对p 、，a 降解的影响，发现这种影响会因为具体的微生物不同而不同； 研究化学修饰对p 、，a 降解的影响，发现不同的化学修饰对p 、，a 的降解有促进作 用和抑制作用两种情况。 我国在p 、，a 降解领域的研究工作主要可以分为三个方面： ( 1 ) 筛选降解p v r a 的微生物及研究其对p 、，a 的降解性能。已经获得一些 对p 、，a 具有降解能力的微生物，但它们对p 、厂a 的降解效率较低。 ( 2 ) p 、，a 分子的结构特性和化学修饰对p 、，a 降解的影响。p 、，a 的聚合度、 醇解度和外加官能团对p 、，a 的降解都有一定的影响。 ( 3 ) 优化p v a 降解的发酵条件。通过发酵条件优化提高了p v a 的降解效 率和p 、能降解酶的产量。 1 2 2 本课题的研究意义 p 、，a 是一种性能优良的化学高分子，在全世界范围内得到了广泛的应用，其 年产量己超过1 0 0 万吨。但由于p 、，a 在自然环境中存在的时间较短，能够降解 p 、，a 的微生物种类很少，这使得自然环境对其的降解效率较低，最终废弃的p 、，a 导致了严重的环境污染。目前工业废水中的刚a 浓度一般为1 0g l 左右。 对p 、，a 降解的研究主要有两点现实意义：( 1 ) 生产p 、，a 降解酶，将p 、，a 降 解酶应用到工业中现有的相关工艺中去，可以降低能耗和水耗，实现经济效益； 同时提高p 、，a 废水的生物可降解性，实现环境效益。例如：m o r i 等用p 、，a 降解 江南大学硕士学位论文 酶在3 0o c 下对棉织物进行退浆，与传统的热水( 7 0 9 0 0 c ) 退浆工艺相比，在 保持棉织物品质的前提下，酶反应条件温和，从而较低了能耗，同时提高了退浆 废水的生物可降解性，降低了废水处理成本【2 7 】。但是由于降解p v a 需要几种酶 的共同作用，其机理比较复杂；同时p 、，a 降解酶的酶活水平较低，应用效果较 差；再加上对p 、，a 降解酶的应用研究较少，目前市场上尚无商品化的p 、，a 降解 酶。( 2 ) 应用具有高效降解p 、，a 能力的微生物去治理p v a 导致的环境污染，实 现环境效益。例如：将能降解州r a 的微生物细胞投放到含有p v a 的工业废水中， 从而提高p 、，a 的降解效率，或者将微生物细胞投放到固体的p 、，a 废弃物中，加 快p 、後的降解。 本实验室前期筛选到了多种降解p 、，a 的微生物，并针对不同的微生物进行 了初步发酵条件的研究。同国内外报道的p 、，a 降解微生物进行对比，发现本实 验室前期筛选到的混合微生物体系具有两点显著优势：( 1 ) 高效降解p 、，a ，在发 酵2 天内，此混合微生物体系能降解5 0g lp 、，a 的9 0 。( 2 ) 彻底降解p v a ， 在发酵结束的时候，在发酵上清液或者细胞提取液中，同时采用碘量法和凝胶过 滤色谱法都检测不到p v a 。基于这两点，本课题选择此混合微生物体系作为研究 对象，目标是：( 1 ) 提高p 、，a 降解酶的产量，为生产p v a 降解酶制剂做准备。 ( 2 ) 提高混合微生物体系对p 、，a 的降解效率，以便应用混合微生物细胞去治理 p 、，a 导致的环境污染。 1 3 研究内容 本实验室前期筛选到了多种具有p v a 降解能力的微生物，但这些微生物对 p v a 的降解效率较低，并且不能完全降解n 俊。由张颖筛选到了一个能够高效 和完全降解p 、，a 的混合微生物体系。针对此混合微生物体系，本实验室已经初 步优化了培养基和培养条件。本论文的主要目标是提高p 、，a 降解酶的产量和 p 、，a 的降解效率。为此我们从以下三个方面进行了研究。 ( 1 ) 研究混合微生物体系降解p v a 的基本特性。主要从底物p 、，a 的降解、 p v a 的降解产物、降解微生物和p 、，a 降解酶的角度，较全面地了解混合微生物 体系在降解p 、，a 过程中的一些基本特性，为后期的研究奠定基础。 ( 2 ) 通过添加碳源和优化发酵策略提高p v a 降解酶的产量。主要是基于共 代谢理论，添加有利于生产p v a 降解酶的特定碳源。同时基于混合微生物降解 p 、，a 的特定现象，优化具体的发酵策略，以提高p 、，a 降解酶的产量。 ( 3 ) 通过l ，4 丁二醇提高p 、，a 的降解效率。研究1 ，4 丁二醇对p v a 降解 的影响，优化1 。4 丁二醇的添加时间、添加浓度和添加策略。 以上研究内容受到了国家杰出青年基金( 2 0 6 2 5 6 1 9 ) 、9 7 3 项目( 2 0 0 7 c b 7 1 4 3 0 6 ) 和教育部新世纪优秀人才支持计划( n c e t - 0 7 0 3 7 8 ) 的资助。 6 第二章材料与方法 2 1 菌种和培养基 第二章材料与方法 2 1 1 菌种 一个能够彻底降解p 、，a 的混合微生物体系，由张颖从无锡太平洋纺织厂的 污泥样品中筛选得到【1 1 1 。 2 1 2 培养墓 p v a 基础培养基( g l ) ：p 、，a1 7 9 9 眦w ：11 3k d a ，醇解度：9 9 0 ) 5 0 ，酵 母粉2 0 ，k 2 0 41 0 ， 2 p 0 4o 1 2 5 ，m g s 0 4 7 h 2 00 1 0 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，c a c l 2 0 0 2 5 和n a c l0 0 1 ( p h7 2 ) 。 p v a 补料培养基( g l ) ：p v a l 7 9 92 5 ，酵母粉1 0 。 1 ，4 丁二醇补料培养基( g l ) ：1 ，4 丁二醇7 6 5 ，酵母粉3 o 。 葡萄糖补料培养基( g l ) ：葡萄糖1 0 2 ，酵母粉3 0 。 1 ，4 - 丁二醇流加培养基含有l ，4 丁二醇和酵母粉，它们的质量比为2 5 5 ：l 。 2 2 培养方法 2 2 1 发酵条件 摇瓶发酵：将混合微生物体系接种到装有5 0m l 培养基的5 0 0i i l l 摇瓶中。 然后在转速为2 0 0r m i i l ，温度为3 0o c 的摇床上培养。 3 - l 发酵罐上发酵：将混合微生物接种到装有5 0m lp v a 基础培养基的5 0 0 l i l l 摇瓶中。然后在转速为2 0 0 r m i n ，温度为3 0o c 的摇床上培养3 6 h 。接着按 照1 0 ( v 、，) 的接种量，将1 5 0m l 发酵液接种到装有1 5lp 、，a 基础培养基的 3 l 发酵罐中。接种之后，用2 0m o l l 的h c l 和2 om o l l 的n a o h 将发酵液的 p h 值控制在7 2 0 。通过调节通风量( 2 0l m i i l 3 ol m i n ) 和搅拌转速( 2 0 0 r m i n 4 0 0 砒n i l l ) ，将溶氧( d o ) 控制在6 0 左右。温度控制在3 0o c 。 2 2 2 单碳源对生产p 、a 降解酶的影响 采用下面的碳源替换p 、，a 基础培养基中的p v a ，得到6 种单碳源培养基。 这6 种培养基的碳元素含量都为2 7g l 。具体碳源种类及含量( g l ) ：p 、，a5 0 ， 葡萄糖6 8 ，可溶性淀粉6 2 ，正丁酸5 o ，乙酸钾1 1 1 ，1 ，4 丁二醇5 1 。培养 方法见发酵条件。 江南大学硕士学位论文 2 2 3 混合碳源对生产p v a 降解酶的影响 将下面的碳源分别添加到p v a 基础培养基中，同时将酵母粉的含量提高到 4 0g l ，由此得到混合碳源培养基。具体碳源种类及含量( g l ) ：p v a5 0 ( 对照) ， 葡萄糖6 8 ，可溶性淀粉6 2 ，乙酸钾1 1 1 ，1 ，4 丁二醇5 1 。培养方法见发酵条 件。 2 2 4 两阶段发酵和三阶段发酵 两阶段发酵：第一阶段使用p 、，a 基础培养基培养混合微生物；第二阶段在 发酵3 6h 时，向发酵液中分别添加混合碳源培养基中的碳源和酵母粉( 2 0g l ) 。 再继续培养1 2h ，然后终止发酵。 三阶段发酵：第一阶段和第二阶段同两阶段发酵一致。第三阶段在发酵4 8h 时，向发酵液中添加p v a ( 2 5g l ) 和酵母粉( 1 0g l ) 。然后发酵到p v a 的 浓度为1 0g l 左右，或者p v a 的浓度不再发生显著变化。 2 2 5 单点补料发酵 首先使用p v a 基础培养基培养混合微生物。在p v a 降解过程中，单点添加 1 ，4 丁二醇或者葡萄糖补料培养基。 2 2 6 连续补料发酵 首先使用p v r a 基础培养基培养混合微生物。在发酵2 lh 时，单点添加1 ，4 丁二醇补料培养基。继续发酵9h 之后，以0 3g 几m 的速度连续流加l ，4 - 丁二醇 流加培养基。 2 3 末端限制性片段长度多态性( t r f l p ) 分析 根据k e n t 等【2 9 】报道的方法进行t - i 江l p 分析。上游引物为8 f ( 用6 f a m 标 记) ，下游引物为1 4 9 2 r 。这一对通用引物能扩增出不同微生物种类的1 6 sr d n a 。 使用p c r 扩增试剂盒( 融撇，大连) 。p c r 反应体积为5 0 p l ，其中包括5 “l3 c 5 b u 仃c r ，5i i l2 5pp 诞0g c l 2 ， 4p l2 5pp 刚mt 3 ，2p 1 1 0 岬。儿上下游引 物，5p l 基因组d n a ，0 5 l 砌p o l y t m r a s e 和2 6 5p l 灭过菌的去离子水。开 始在9 4o c 下变性2m i i l ，然后做3 0 个循环：9 4o c3 5v5 5o c4 5v 和7 2o c2 m i n 。最后在7 2o c 下延伸1 0m i l l 。用g e le ) 【t m c t i o nm i n i 妣( t a k a r a ，大连) 纯 化p c r 产物。然后用限制性内切酶：月7 b i ，胁i 和施p i 酶切纯化后的p c r 产物。用a b ig e n e t i c 强a l y z 盯对每组酶切产物进行毛细管电泳，用p e a l ( s c 锄c r 分析所得的数据。 第二章材料与方法 2 4 静息细胞对p v a 的降解能力 在不同的实验条件下培养混合微生物体系。在特定的发酵时间取样，采用离 心的方法( 1 0 ，o o o g ，1 0m i l l ) 收集细胞，然后用磷酸钾缓冲溶液( 0 1m o l l ， p h 7 0 ) 清洗3 次细胞。接着将5m l 反应混合液( 1 0g l ( d c w ) 细胞和1 og 几 p 、，a 溶解在磷酸钾缓冲液中( 0 1m o l l ，p h7 0 ) ) 在转速为1 5 0r m i n ，温度为 3 0o c 的水浴中反应1 0h 。检测反应后混合液中的p v a 含量。 2 5 混合微生物体系对不同碳源的耐受能力 用p 、，a 基础培养基培养混合微生物体系。在发酵2 1h 时取样，采用离心的 方法( 1 0 ，0 0 0 g ，1 0m i n ) 收集细胞，然后用磷酸钾缓冲溶液( 0 1m o l l ，p h7 0 ) 清