（水产养殖专业论文）曼氏无针乌贼墨汁的形成及在繁殖中的作用.pdf

宁波大学硕士学位论文 i 曼氏无针乌贼墨汁的形成及在繁殖中的作用 摘 要 采用连续组织切片组织化学及电镜技术对墨囊不同时期的胚胎及 墨腺细胞进行了研究结果表明墨囊壁由明显的三层组成外膜层肌肉 层和黏膜层墨囊导管壁厚从外到内可分为外膜肌层和黏膜墨腺体 呈索状墨汁颗粒游离地存在于索状腺体的间隙之间及墨囊腔中呈现黑 色囊壁中黏膜层中含有蛋白质最多墨腺中含有少量蛋白质墨囊壁和 墨腺含多糖粘多糖或粘蛋白墨腺中含有酪氨酸墨囊壁和墨腺中存在 大量的酸性粘多糖墨囊出现胚胎发育的第 9 天墨腺细胞由无分泌黑色 素功能的 a 型细胞和有分泌黑色素功能的 b 型细胞组成 在 b 型细胞中 可见黑色素颗粒储存在囊泡中囊泡在移出细胞的过程中逐渐变大泡内 的黑色素颗粒逐渐变多囊泡可能通过胞吐的方式排出细胞外黑色素排 出后以颗粒的形式游离于细胞间隙中形成墨汁乌贼的墨汁具有很好的 医用功效营养成分理想 利用经典营养测定方法及氨基酸分析仪气相色谱仪对养殖曼氏无针 乌 贼 墨 进 行 了 研 究得 到 粗 蛋 白 的 含 量11.8g/100g粗 脂 肪 的 含 量 1.48g/100g16 种氨基酸9 种脂肪酸养殖对墨汁的成分没有影响利 用试剂盒测定了曼氏无针乌贼产卵前后墨汁中的酶结果表明墨汁中不 含乳酸脱氢酶和过氧化物酶no 产卵后明显降低no 合酶产卵后酶活性 明显增强超氧化物歧化酶过氧化物酶活性产卵后显著降低碱性磷酸 酶产卵后增强酸性磷酸酶产卵后显著下降酚氧化酶产卵后明显增强 乌贼墨在繁殖季节中参与形成了三级卵膜在乌贼繁殖季节观察繁殖 行为分别于乌贼漏斗伸向腹腕后 68s1520s2530s 惊扰乌贼 得到在 68s 惊扰时乌贼释放一黑色的物质其弹性较强此物质为卵膜 的前体解剖乌贼在漏斗可看到白色的卵呈圆球状直径约 5mm经 1520s 后惊扰乌贼释放的卵表面已被有黑色卵膜但是卵膜外面富含 粘性物质卵的一端较尖卵的柄形成卵柄分叉尚未形成 短径约 10mm 约 2530s 后惊扰乌贼释放的卵已较完整卵的表面粘性物质已较少 卵的表面较光滑光亮卵柄及分叉已形成 三级卵膜在乌贼的胚胎发育中有至关重要作用利用组织切片电镜 宁波大学硕士学位论文 ii 技术渗透模拟滤光装置营养测定及抑菌等方法研究了三级卵膜的物 理及生化性质结果表明物理性质方面曼氏无针乌贼的三级卵膜有黑 色和白色三级卵膜两种三级卵膜不溶于酒精乙醚强酸易溶于二氯 乙醇二乙胺和强碱黑色三级卵膜的抗腐蚀能力较强三级卵膜弹性较 好黑白色三级卵膜弹性分别可达 1.8n 和 1.5n三级卵膜对泥土细 菌及小型藻类均有一定的阻挡作用黑色三级卵膜阻挡作用较强三级卵 膜对光有一定的遮挡作用黑色三级卵膜的遮光作用好于白色三级卵膜 生化性质方面三级卵膜由数层膜构成褶皱状结构透射电镜下观察黑色 三级卵膜中含有墨汁颗粒和杆状细菌黑色三级卵膜和白色三级卵膜的营 养成分存在一定的差异黑色三级卵膜的脂肪含量较低蛋白质含量较高 三级卵膜对溶藻弧菌有一定的抑制作用黑色和白色三级卵膜抑菌率分别 可达 21.50%和 17.03% 关键词曼氏无针乌贼墨囊墨汁酶三级卵膜 宁波大学硕士学位论文 iii the formation of ink and its effect on the proporgation of sepiella maindroni de rochebrune abstract the histology and ultrastructure of ink sac of sepiella maindroni de rochebrune were studied using light and electron microscopy. results showed that the ink sac of sepiella maindroni opened into the end of the recta near the anus ; the wall of the ink sac and its opening consisted of three parts : an endocardium,a muscle layer and a mucosal layer,the ink glands concentrated at the bottom of the ink sac were formed by the hyperplasia of the mucosal epithelium to the cavity of the ink sac,shaped as rope with abundant connective tissue in the centre. the ink sac formed at the stage of heart beat when observed using histology method. the strcture of the ink sac of sepiella maindroni de rochebrune were studied using histochemical methods.hgbpb method,pas method,bakers method and selective fluorescence dyeing method were used to show protein,polysaccharide, tyrosine,acid mucopoly saccharide respectively. the result were:there are lots of protein in the ink sac wall while the pro tein in the ink gland was limited.there were polysaccharide in the ink sac wall and ink gland.there were tyrosine in the ink gland and acid mucopolysac charide were showed in the ink sac wall and ink gland. type a cells which can not secrete melanin and type b cells which can secrete melanin were observed ; melanin granules were seen only in the type b cells. the melanin was deposited in the vesicles. during the vesicles moving out of the cells,they became big and the melanin increased gradually. after that,the melanin granules were released in the intercellular space. the vesicles may be released with exocytosit. then ink formed. the composition and content of amino acids, fatty acids, proteins in ink of cultured sepiella maindroni de rochebrune were determined by classical methods such as amino acids analyzer gas chromatography. the result were: it contained 16 sorts of amino acids,8 sorts of fatty acids and the protein 11.8%. the enzyme in the ink were also studied using kit before and after spawning the results were: there were no ldh and cat in the ink, the activity of no and nos were almost equal before and after spawning, the activity of sod and pod decreased after spawning, the activity of akp increased while the activity of 宁波大学硕士学位论文 iv acp decreased after spawning, the activity of po increased after spawning. the ink is a part of the tertiary egg envelope.the propogation behavior were observed and disturbed 68s,1520s,2530s before funnel finger out to the wrists,the result were as follows: distubed 68s before, the cuttlefish release a black thing with elastic what is the precursors of the egg envelope. the egg could be seen in the funnel,disturbed after 1520s,the egg had been coated with black thing, the outside of the egg had amorphous matter, one side of the egg is apex and the handle had been formed while the bifurcations had not been formed.about 2530s later disturbing,the egg had been completed, the outside of the egg had been smooth, the bifurcations had been formed. during the embryo development the tertiary egg envelope is crucial to the embryo.the physical properties and biochemical properties of tertiary egg envelope were studied. the result were as follows: at the respect of physical properties the tertiary egg envelope could not dissolve in seawater,alcohol, ether, strong acid, it could dissolve in 2-chloroethanol,diethylamine and strong alkali. the elasticity of black and white tertiary egg envelope were 1.8n and 1.5n respectively;the barrier property of black tertiary egg envelope to the sediment,chlorella vulgaris and vibrio alginolyticus was better; the barrier property of black tertiary egg envelope to the light was better than that of white tertiary egg envelope. at the respect of biochemical propertiesthe tertiary egg envelope reductus,which was composed of several layers of envelopes; there were ink particles and rod shaped bactieria in the black tertiary egg envelope; there were differences in the nutritional components between the black tertiary egg envelope and white tertiary egg envelope,the lipid content in the black tertiary egg envelope was lower while the protein content was higher; the tertiary egg envelope had inhibition role on vibrio alginolyticus,the inhibitory rate of black and white tertiary egg envelope was 21.50% and 17.03% respectively. key words: sepiella maindroni de rochebrune; ink sac; ink; enzyme; tertiary egg envelope 独 创 性 声 明 本人郑重声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果尽我所知除了文中特别加以标注和致谢的地方 外论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果也不包含为获得 宁波大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了 谢意 签名_ 日期_ 关于论文使用授权的声明 本人完全了解宁波大学有关保留使用学位论文的规定即学校 有权保留送交论文的复印件允许论文被查阅和借阅学校可以公布论 文的全部或部分内容可以采用影印缩印或其他复制手段保存论文 保密的论文在解密后应遵循此规定 签名_ 导师签名_ 日期_ 宁波大学硕士学位论文 1 引 言 曼氏无针乌贼(sepiella maindroni de rochebrune)俗称墨鱼花粒子 麻乌贼血墨是一种重要的经济渔业资源在中国海洋资源产量中占有 重要的位置曼氏无针乌贼由于具有重要的经济价值而为人们所熟知其 产量占头足类总产量的 60%以上(董正之1989)乌贼的经济价值很高 可食部分约占总体的 92其肉洁白如玉具有鲜嫩脆的特点乌贼 干制品南方叫螟蛹鲞北方叫墨鱼干雄性生殖腺干品叫“墨鱼穗”雌性 缠卵腺叫“墨鱼蛋”均为海味佳品曼氏无针乌贼是我国近海广布性种 曾是我国四大海产渔业大黄鱼小黄鱼墨鱼与带鱼之一以舟山渔 场产量最大在我国沿海知名度很高由于过度捕捞至上世纪 80 年代 乌贼的资源量锐减渔讯消失近十几年来已呈濒危状态 乌贼墨是一种重要的海洋生物药据报道曼氏无针乌贼墨有刺激增 强非特异性免疫作用可以抑制肿瘤生长吕昌龙等19941995凝 血作用谢光临等1994升白增加白细胞数目作用马维娜等 1996抗肿瘤作用高春义等1997乌贼墨能明显逆转癌细胞异常改 变的 tpkpkc 和 pka 活性引起 ras-mapk 信号传导系统抑制使癌 细胞由去分化性增殖向分化性增殖转变产生抗癌促分化作用乌贼墨含 有抗癌活性物质抗癌作用黄枚2004一些学者对乌贼墨进行了研 究认为乌贼墨可能属于蛋白激酶抑制剂类物质赫生等1996侯血云 等2001乌贼墨与鱿鱼墨的部分化学成分与微量元素含量有较大的差 别郑高利等2002)也有学者研究了其多酚氧化酶的部分特征江津津 等2002 乌贼受精卵的三级卵膜部分物质来源于乌贼墨比较黑色三级卵膜的 卵与白色三级卵膜的卵前者不易长霉而后者易长霉腐烂从以上研究 发现乌贼墨在许多方面起到了很重要的作用这就迫切需要我们深入研 究摸清乌贼墨囊的发生乌贼墨的形成与积累过程以及乌贼墨在产卵过程 中参与形成三级卵膜的机制为乌贼墨的作用作为药源提取和作为重要 抗癌物质的体外合成提供理论基础 为了探明乌贼的墨汁形成过程及在繁殖中的作用本研究对乌贼的墨 囊形成墨囊结构墨汁成分及三级卵膜进行研究 宁波大学硕士学位论文 2 第一章 综 述 1 软体动物消化系统中腺体细胞分化及物质分泌方式的研 究进展 软体动物俗称贝类是动物界的第二大门迄今已记载的约有 115 000 种软体动物不仅种类多而且与人类的关系极为密切大多数种类 具有较高的经济价值瓣鳃纲腹足纲和头足纲的种类几乎都可食用有 些种类也有很大的药用价值我国海产贝类的养殖已有四五百年的历史 近年来贝类养殖业又有了新的发展新的养殖种类不断增加随着养殖 业的发展关于贝类的基础生物学研究也在不断的深入有关贝类消化系 统生物学方面的研究是目前十分活跃的研究领域之一目前在这一领域中 关于腺体细胞分化和物质分泌问题争论十分的激烈 有关软体动物消化系统的研究内容广泛涉及种类也较多以下几方 面的研究较为突出消化系统的组织学研究包括腺体细胞的功能和分化 问题腺细胞物质分泌方式的研究 1.1 软体动物消化系统腺上皮细胞分化研究进展 1.1.1 软体动物消化系统腺细胞类型 国内学者对贝类消化系统腺细胞的类型的研究进行较多在很多物种 中都发现腺上皮细胞不止一种存在不同的类型紫贻贝 mytilus edulis 消 化腺为复管腺腺上皮有消化细胞和嗜碱性细胞两种类型(崔龙波等 1999长竹蛏 solen gouldii conrad(崔龙波等2002 )缢蛏 sinonovacula constricta(许星鸿等2003)和毛蚶 scapharca subcrenata (许星鸿等2005) 消化盲囊腺上皮均由胚性细胞(e 细胞)纤维细胞(f 细胞)吸收细胞(r 细胞)和分泌细胞(b 细胞)组成应雪萍2001 发现文蛤(meretrixmeretrix) 肝脏主要由 4 种细胞构成:分泌细胞(b 细胞)储存细胞(r 细胞)吸收细 胞(f 细胞)和胚细胞(e 细胞) 肝脏的上皮细胞类型一直是有关学者争论的问题甲壳类动物肝胰腺 细胞的超微结构研究得较多jacobs(1928)报道 astacas leptodactylus 肝胰 腺的 4 种细胞类型 并分别命名为 e 细胞 胚胎细胞f 细胞纤维细胞 r 细胞吸收细胞和 b 细胞(疱状细胞)在软体动物中loizzi(1971) 对 orconectes virilis 和 procambarus clarkii 的肝胰腺进行超微结构的研 究认为肝小管有三种细胞类型即 r 细胞(吸收细胞) f 细胞(纤维细 胞)和 b 细胞(疱状细胞)boucaud(1972)在对乌贼的肝脏研究中发现了 b 细胞和 r 细胞但没有发现液泡细胞boucaud(1973)在对乌贼的进一步研 宁波大学硕士学位论文 3 究中却发现肝小管由三种细胞类型组成即 b 细胞r 细胞和液泡细胞 液泡细胞又称消化细胞具合成消化酶吸收和排泄消化物质的作用 boucand(1980)进一步对不同发育时期的乌贼肝脏进行了研究结果发现腺 管中有两类主要的细胞类型即未分化的细胞和成熟的消化细胞而前者 又可分为未成熟细胞合成细胞和静止细胞这些细胞的超微结构特征和 功能分别与甲壳类的 e 细胞f 细胞r 细胞及 b 细胞相似这种分类并 不 适 合 八 腕 目 幼 体 (octopus spabralia sponychoteuthis sp) (boucaud-camou1995b)此外 owen(1970)在对双壳类 cardium edule 的 肝脏超微结构研究时也发现这四类细胞的特征 1.1.2 各类型腺细胞的超微结构及功能的研究进展 对于软体动物消化系统中腺细胞的超微结构的观察主要集中在消化 腺上皮细胞之中 不同学者对腺细胞的超微结构的特点根据不同的试验对象都有一 定的差别软体动物各类型腺上皮细胞在分布位置结构及功能等方面具 有一定的特点e细胞主要存在于近端(与导管相连处) 体积较小多边形 核大圆形或椭圆形核质比大胞质内细胞器少粗面内质网很少呈 囊泡状或膨大的管形散布于胞质中线粒体少嵴少有的呈椭圆形有 的狭长有时在e 细胞中可见少量的小脂滴和高尔基体能分化为其它类 型的腺细胞f 细胞散布在r 细胞与b 细胞之间具强嗜碱性核多边 形或近圆形在核周围粗面内质网呈平行或环行排列且具大量的囊泡状 内质网线粒体长形或椭圆形嵴的数量多高尔基体发达f 细胞的功 能目前分歧较大loizzi(1971)和李富花认为f 细胞能合成消化酶而且通 过扩大的超核泡分化形成b 细胞而刘晓云认为f 细胞主要是合成消化 酶然后释放到肝小管中 起细胞外消化作用davis and burnett (1964) 认 为嗜碱性的f 细胞主要功能是转移合成的消化酶而不是消化作用r 细胞 质中也有大量的粗面内质网但胞质中的内质网较f 细胞中少得多多呈 囊泡状或膨大的水管形散布于胞质中 而且大多分布在核附近滑面内 质网占的比例较大此外胞质中还有大量的脂滴游离核糖体和少量的线 粒体高尔基体少见以脂肪滴和糖原粒的形式储存丰富的能量b 细胞 主要位于腺管近端核位于细胞近基部处形状不规则呈多边形细胞 中可见双核存在胞内含有许多大小不一的液泡和消化泡其内的内质网 呈囊泡状数量较多排列不规则呈弥散分布胞质中也具少量脂滴线 粒体小而多为卵圆形具片层嵴及基质均包裹在粗面内质网的缝隙中 主要有分泌的功能 宁波大学硕士学位论文 4 1.1.3 软体动物消化腺上皮分化 目前腺体细胞存在分化行为已达成共识但对不同对象做试验的结 果仍有所争论关于甲壳纲动物肝胰腺细胞的分化问题 经过近 80 年的 研究 已获得比较一致的意见即 b 分泌细胞是由 f 吸收细胞转化而来 的 但对不同对象做试验的结果仍有所争论jacobs(1928)认为细胞分化 过程为 e 胚细胞?f 吸收细胞?r 储存细胞 ?b 分泌细胞ogura(1959)认 为 f 吸收细胞r 储存细胞和 b 分泌细胞是三种独立的细胞而 davis et al.(1964)则认为细胞分化程序 e 胚细胞?r 储存细胞?b 分泌细胞 ?f 吸收 细胞在软体动物中boucaudcamou 1980 对乌贼肝脏的进一步研究认 为肝脏中的四种细胞分化程度 e 胚细胞 ?f 吸收细胞 ?b 分泌细胞 ?r 储 存细胞细胞分化现象在腺上皮细胞中普遍存在胚性细胞的存在为腺体 的增生提供了可能性在腺体不断发育成熟过程中胚性细胞可以不断的 分裂产生新的腺细胞新的腺细胞可以近一步成熟或在之过程中分化为其 它功能的腺细胞腺细胞的主要功能之一是分泌物质细胞在合成和分泌 物质过程中需要有一个物质基础没有很好的原料无法合成分泌物质 可见营养吸收期细胞会出现在腺上皮细胞类型之中在腺上皮的分化程 序中很可能是胚性细胞到营养期细胞再到合成分泌期细胞 1.2 软体动物中腺细胞分泌方式研究进展 腺细胞在分泌时其机能形态的变化因不同种类的分泌腺而不同一 般外分泌腺主要有 3 种分泌方式局部分泌型腺细胞分泌时本身不受到任 何损伤分泌颗粒以外倾作用的方式排出以后又重新形成新的分泌颗粒 顶浆分泌型细胞分泌时只有顶端的部分破坏而变化成分泌物细胞的顶 端变成分泌滴之后仍以细小的细胞或分泌物连丝与细胞体保持一定时间 的联系以后才逐渐断开而落入腺腔中腺细胞未受损伤的使它恢复原状 并重新产生新的分泌物全浆分泌型腺细胞分泌时整个细胞被破坏全部 原生质都变成分泌物全浆分泌腺的腺末房是由许多层细胞构成的靠近 基膜的细胞能分裂增生补充表层因变成分泌物而死亡的细胞 软体动物消化腺细胞分泌方式较为特殊主要通过载体转运的方式将 分泌物质转运出腺细胞 bouncaud-camou(1976) boucher-rodoni (1977) boucher-rodoni(1983) 等对头足类的研究认为头足类消化腺细胞主要产生两种主要的物质棕 色体囊泡和晶体物质bidder(1950)认为大多数头足类的消化腺细胞中 有一种特殊的晶体物质可以作为分泌细胞内酶转运到体外的转运者晶 体物质内还有大量的消化酶认为细胞通过晶体物质释放消化酶到体外 宁波大学硕士学位论文 5 棕色体中也含有晶体物质内含物消化残体通过棕色体排出细胞膜外 jayson m et al(2002)在 sepioteuthis lessoniana 的腺细胞物质分泌过程中 观察到了棕色体排出细胞膜的过程 boucher rodoni et al. (1987) 研究认 为细胞中一种更小的分泌颗粒可能取代棕色体作为酶的载体分泌的酶颗 粒物质可能是结合于这种小颗粒分泌物之上而非储藏在囊泡中排出细胞 外的这是一种特殊的分泌方式kate swift et al.2005对 euprymna tasmanica研究发现酶的分泌和代谢废物的排出是 e. tasmanica 消化腺的两 个主要的作用酶分泌物由消化腺中的消化上皮细胞通过晶体释放代谢 废物通过棕色体释放 有 的 物 种 消 化 腺 细 胞 缺 少 晶 体分 泌 颗 粒 被 认 为 是 酶 的 转 运 者 (boucher-rodoni et al.1987) loligo spp 消化腺导管内腔被一种电子稠密分 泌颗粒充满然而这不在 s. lessoniana 中发生这表明在枪乌贼中消化 酶不像在 loligo spp 中那样有规律的贮存在消化腺中 s. lessoniana 导管内 腔在摄食两小时后被一种稠密分泌物充满大概是含有酶的分泌颗粒释放 的结果在 l. vulgaris 和 l. forbesi 中分泌颗粒由活跃的高尔基联合体产 生(boucher-rodoni et al.1987)在 s. lessoniana 中这些联合体只观察 到形成小的囊泡这些囊泡也许融合成较大的分泌颗粒在热带枪乌贼的 一些合成细胞中发现s. officinalis(boucaud-camou et al.1980;)和 l. vulgaris 及 l.forbesi (boucher-rodoni1987)消化细胞中的粗面内质网大 线粒体和活跃的高尔基联合体都非常相似 s. lessoniana 和 loligo spp 消化 腺产生分泌颗粒 (boucher-rodoni et al.1987)然而枪乌贼 sepioteuthis lessoniana 细 胞 产 生 的 分 泌 颗 粒 比l.vulgaris 和 l.forbesi的 大 (boucher-rodoni1987)它们的来源并不清楚 宁波大学硕士学位论文 6 2 乌贼墨的主要成分及活性成分研究现状 乌贼墨是由墨囊中的分泌腺合成在墨囊中储存遇敌时通过直肠经 肛门喷出墨囊是一个非常发达的直肠盲囊位于内脏团的后腹侧前端 为一细长的管子即墨囊导管在近肛门处与直肠相通开口附近有两组 环形的括约肌因墨囊内储存的墨汁多少不定故其形状和大小变化较大 墨腺位于墨囊底部构成墨囊壁的一部分 乌贼墨汁是由肉眼看不见的黑色颗粒构成的粘稠的混悬液每毫升中 含 200mg 颗粒即 20%(w/v)颗粒呈球形直径变化较大多数为 120 180nm颗粒有两层结构高密度的内核和低密度的外壳内核就是所谓 的乌贼墨黑色素乌贼墨的化学成分为黑色素和蛋白多糖复合体黑色素 是吲哚醌的聚合物与蛋白结合或不与蛋白结合 乌贼墨黑色素是吲哚-56-醌(?)与2-羧基吲哚-56-醌(?)的共聚物 通过酪氨酸在酪氨酸酶的作用下形成多巴醌进一步氧化经多巴色素 5 6二羟基吲哚黑素原色素最后形成的糖类部分主要含有等分 子质量的葡萄糖酸( glca) n-乙酰半乳糖胺墨色藻糖(fuc) 多糖部分 本身无抗肿瘤活性这表明其抗肿瘤活性来自多糖同其他组分的复合体 如肽聚糖和色素肽链部分主要的氨基酸为天冬氨酸苏氨酸丝氨酸 谷氨酸丙氨酸 乌贼墨可溶于乙撑氯醇和二乙胺不溶于水对许多物理化学处理 如加热超声波处理耐受性极强在有机溶剂如酒精乙醚氯仿和强 酸中仍保持颗粒状态乌贼墨黑色素的化学性质也非常稳定在许多液体 介质中不溶但可溶于碱性溶液酸性环境下又产生沉淀 2.1 乌贼墨的主要成分 2.1.1 乌贼墨中的营养成分 主要以野生曼氏无针乌贼和金乌贼为例说明墨的主要营养成分 曼氏无针乌贼墨中脂肪含量为1.34%(陈小娥2000)而金乌贼脂肪 含量为脂肪0.97 %(郑晓东等2003)含脂率均较低曼氏无针乌贼 墨中不饱和脂肪酸占43.4%主要由油酸和棕榈油酸构成油酸占总 脂肪酸26.35%饱和脂肪酸以棕榈酸 和硬脂酸为主其中棕榈酸占总 脂肪酸的31%曼氏无针乌贼墨粗蛋白含量为 10.08g/100g而金乌贼 粗蛋白含量为粗蛋白9.18 %曼氏无针乌贼墨中含有16种氨基酸总 量达到9.922%以天门冬氨酸含量最高金乌贼墨汁有17种水解氨基 酸,氨基酸含量70 mg/g,氨基酸总含量达7%,其中含有必需氨基酸7种, 宁波大学硕士学位论文 7 半必需氨基酸2种 2.1.2 乌贼墨中的微量元素 吕昌龙等(1999)乌贼墨中微量元素的含量进行了测定结果显示乌贼 墨中含有铝钙镉钴铜铁锗钾锂镁锰钠锶钡 锌等21 种微量元素其中镁钠铁锌钙和锶含量较高如表2所示 赵辉等(1999) 采用icp-a es 法测定乌贼墨中的微量元素 回收率为89. 8% 103. 2% 相对标准偏差8% 表 2 乌贼墨中微量元素含量的测定 table 2 the trace element in the ink of cuttlefish 元素 element 含量 contentug g-1 mg cu na fe ca zn 2599.0 143.2 1212.0 5243.0 1440.0 3774.8 乌贼墨中铁钙含量比较高铁在血液功能中起着决定性的作用红 血球生成所需要的造血原料中以蛋白质和铁最为重要乌贼墨具有缩短 凝血时间降低纤溶酶活性的作用这与乌贼墨中高含量的铁有密切关系 微量元素锌为人体必须的一种营养成分它在人体的生长发育免疫组织 修复消化功能等方面的作用已经得到了证实 因此乌贼墨营养成分丰富脂肪酸蛋白质均有较高含量几种微 量元素的含量更是海洋生物中的佼佼者也正是由于乌贼墨中丰富的营养 和微量元素使乌贼墨具有多方面的生理活性 2.2 乌贼墨中的活性成分及作用 我国医药对乌贼的应用历史悠久在本草求真中记载:“乌贼鱼肉 按书止言气味酸平又言其味珍美食则动风与气其治载能益气强志 及通妇人月经可知其性阴故能入肝补血入肾滋水强志而使月事以 时下也海螵蛸系乌贼的内壳据本经记载可收敛止血固精止带 制酸定痛除湿敛疮乌贼墨据本草拾遗所述可“主血刺心痛”现 作为一种中药主要作为止血剂治疗出血性疾病如功能性子宫出血 胃出血等 takaya(1994)最早对乌贼墨中的活性成分进行了提取分离得到了 3 宁波大学硕士学位论文 8 种肽聚糖片段 illexina(mw 约为 100000)b(mw 约为 80000)c(mw 约为 40000)其中片段 a含糖量较高其抗肿瘤活性也较高该片段 多糖部分主要由等克分子比例的葡萄糖醛酸(glca)n-己酰半乳糖胺 (galnac)和岩藻糖(fuc)构成肽部分的主要氨基酸是天冬氨酸苏氨酸 丝氨酸谷氨酸和丙氨酸 2.2.1 乌贼墨的止血作用 乌贼墨的药用价值最早始于止血现代临床应用证明它是一种良好的 全身性止血药对妇科外科内科等多种出血止血效果显著无毒副 作用谢光临等(1994)对其凝血机制作了研究给昆明小鼠口服乌贼墨连 续5d之后检查小鼠的凝血时间结果发现小鼠的凝血时间较对照组明显 缩短观察家兔用药前后血小板的数量和纤溶酶活性的变化结果显示 乌贼墨处理前后家兔的血小板数量无明显改变而纤溶酶活性则出现明 显降低因此乌贼墨的止血作用可能是通过影响纤溶系统特别是降低 了纤溶酶的活性导致纤维蛋白溶解减少从而产生凝血其凝血作用可 能与乌贼墨中铁和钙的含量较高有关 2.2.2 乌贼墨的抗肿瘤活性 进入 90 年代以来乌贼墨抗肿瘤研究一度成为新的热点乌贼墨的 抗肿瘤作用最初是由日本青森产业技术中心和弘前大学发现的乌贼墨中 含有高效抗癌活性成分经提取分离和纯化得到了一种全新结构的粘 多糖这种粘多糖与蛋白分子相连构成一种比较复杂的蛋白- 多糖复合 体 takaya 等(1996)首先对乌贼墨蛋白 多糖复合体进行了体外研究发 现该蛋白多糖对 meth- a 肉瘤细胞无直接的细胞毒作用但可以抑制小鼠 体内的肉瘤细胞的生长并发现小鼠腹腔内巨嗜细胞的活性增强以此推 测其抗肿瘤作用可能通过调节机体免疫功能来抑制肉瘤细胞的生长 吕昌龙等 1999 以白细胞介素1 ( i l - 1 ) 和a 肿瘤坏死因子 ( t n f - a ) 的产生水平及巨噬细胞的吞噬功能为指标, 通过检测乌贼墨提取物 在体内对巨噬细胞的活化作用, 初步了解乌贼墨的抗肿瘤机理吕昌 龙等(2000)对乌贼墨的抗肿瘤作用进行了深入研究结果表明:乌贼墨可降 低移植的meth-a肉瘤细胞和s180肉瘤细胞在小鼠体内的形成率对照组肿 瘤的形成率皆为100%试验乌贼墨组分别为30%和50%而抑瘤率分别为 95.48%和73.91%对肉瘤细胞的抑制率大于对癌细胞的抑制率表明其抑 瘤效果具有一定的选择性吕昌龙(2000)还从免疫学角度对乌贼墨及其他 提取物的抗肿瘤机制作了进一步的研究结果显示乌贼墨及其提取物可提 宁波大学硕士学位论文 9 高肿瘤坏死因子tnf和白细胞介素1il- 1的分泌水平可增加 nk细胞的杀伤活性 2.2.3 乌贼墨的抗菌活性 日本 mochizuki(1991)指出 shiokara一种腌制发酵的鱿鱼产品中 加入乌贼墨能明显改善该产品的保存性能takai 等 也 发 现 toyama kurozukuri一种添加乌贼墨的 shiokara的贮藏期较 akazukuri一种非 常普遍的鱿鱼 shiokara长前者的化学变化缓慢并指出这种变化是由 于在前者中添加了乌贼墨杜铁平等(2004)从乌贼墨中提取到一种浅黄色 吸 湿 粉 末其 对 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (staphylococcus aureus)大 肠 杆 菌 esaherichia coli有抑菌作用该物质得率为 0.52% 2.2.4 乌贼墨的升高白细胞作用 陆通等(1993)发现乌贼墨具有升高白细胞的作用在给小鼠用环磷酰 胺造成外周血白细胞急剧下降后给予乌贼墨饲料观察对外周血白细胞 (wbc)血红蛋白(hb)体重(bw)的影响结果表明治疗组的白细胞回 升较快第 10 天已明显高于对照组(p0.05 宁波大学硕士学位论文 20 表 2.1 养殖曼氏无针乌贼墨的营养成分 table 2.1 the ink composition of cultured sepiella maindroni de rochebrune 养殖乌贼墨汁 ink of cultured sp 野生乌贼墨汁 ink of wild sp p 水分 mositure% 85.470.05 84.38 0.05 脂肪 fatty acids% 1.480.03 1.34 0.05 蛋白质 protein% 11.80.03 10.08 0.05 灰分 ash% 1.250.02 1.37 0.05 表 2.2 养殖曼氏无针乌贼墨中脂肪酸含量 table 2.2 the fatty acid in the ink of cultured sepiella maindroni de rochebrune 脂肪酸名称 name of fatty acids 养殖乌贼墨 含量 mg/g content mg/g 野生乌贼墨 含量 mg/g content mg/g p 肉豆蔻酸 myristic 0.11 0.09 0.05 棕榈酸 palmitic 0.03 0.04 0.05 山嵛酸 behenic 0.06 0.04 0.05 硬脂酸 stearic 0.18 0.19 0.05 花生酸 arachidic 0.01 0.01 0.05 饱和脂肪酸?sfa 0.39 0.37 0.05 棕榈油酸 palmitoleic 0.17 0.13 0.05 油酸 oletic 0.36 0.34 0.05 花生烯酸 arachidic 0.07 0.08 0.05 山嵛烯酸 behenic 0.01 0.01 0.05 不饱和脂肪酸?ufa 0.61 0.56 0.05 由表2.3可知曼氏无针乌贼墨中含有16种氨基酸总量达到约10%以天门 冬氨酸含量最高参1977年联合国粮农组织提供理想的蛋白模式可以清楚地看 到异亮氨酸亮氨酸苏氨酸缬氨酸的含量都远远超过理想模式的标准与 野生曼氏无针乌贼墨汁的氨基酸含量陈小娥2000相比养殖曼氏无针乌贼 墨汁墨汁除谷氨酸和赖氨酸差异较显著外其它氨基酸含量差异均不明显这说 明养殖对曼氏无针乌贼的墨汁成分及含量均没有太大的影响 宁波大学硕士学位论文 21 表 2.3 养殖曼氏无针乌贼墨中氨基酸含量 table 2.3 the amino acid in the ink of cultured sepiella maindroni de rochebrune 氨基酸名称 name of the amio acid 养殖乌贼墨 含量 g /100g content of cultuerd sp g /100g 野生乌贼墨 含量 g /100g content of wild sp g /100g p 天门冬氨酸 asp 1.4180.03 1.414 0.05 苏氨酸 thr 0.4810.05 0.471 0.05 丝氨酸 ser 0.3800.06 0.370 0.05 谷氨酸 glu 1.2330.03 1.291 0.05 甘氨酸 gly 0.7330.13 0.699 0.05 丙氨酸 ala 0.6350.15 0.560 0.05 胱氨酸 cys 缬氨酸 val 0.5860.06 0.596 0.05 蛋氨酸 met 0.2350.05 0.227 0.05 异亮氨酸 ile 0.7830.07 0.750 0.05 亮氨酸 leu 0.9550.10 0.939 0.05 酪氨酸 tyr 0.2830.08 0.277 0.05 苯丙氨酸 phe 0.4660.11 0.451 0.05 组氨酸 his 0.5330.13 0.516 0.05 赖氨酸 lys 0.5980.05 0.529 0.05 总量?aa 10.1700.05 9.922 0.05 必需氨基酸?eaa 4.1230.05 3.963 0.05 非必需氨基酸?neaa 40.210.08 39.91 0.05 2.2.2 曼氏无针乌贼墨中酶的活性 曼氏无针乌贼墨汁中含有的酶较丰富各种酶繁殖前后的活力大小见表 2.4 宁波大学硕士学位论文 22 表 2.4 曼氏无针乌贼墨中的酶 table2.4 the activity of enzyme in the ink of sepiella maindroni de rochebrune 酶的名称 name of the enzyme 产卵前酶的活力 activity before spawning 产卵后酶的活力 activity after spawning p no 0.8290.001 umol g/prot 0.6320.001 umol g/prot 0.05 no 合酶 nos 81.4560.002 u mg/prot 96.4570.002 u mg/prot 0.05 超氧化物歧化酶 sod 833.350.002 u mg/prot 613.550.002 u mg/prot 0.05 过氧化物酶 pod 133.350.001 u mg/prot 80.350.001 u mg/prot 0.05 碱性磷酸酶 akp 4.4810.001 u /100ml 5.5230.001 u /100ml 0.05 酸性磷酸酶 acp 0.3880.001 u /100ml 0.3380.001 u /100ml 0.05 酚氧化酶 po 3.470.001 u/ mg 7.650.001 u /mg 0.05 脂肪% fat% 2.70.1 5.20.2 0.05 4.2.2.4 三级卵膜的抑菌试验 4.2.2.4.1 三级卵膜的抑菌率 白色三级卵膜及黑色三级卵膜的抑菌效果见表3.5曼氏无针乌贼的三 级卵膜对溶藻弧菌有阻挡和抑制作用不同浓度的三级卵膜抑菌作用不 同浓度为0.5 g ml-1的抑菌效果好于浓度为0.25 g ml-1时的抑菌效果黑色 和白色三级卵膜对溶藻弧菌的阻挡率分别可达41.40.1%和24.40.1% 4.2.2.4.2 三级卵膜的抑菌效果 黑白三级卵膜对溶藻弧菌 vibrio alginolyticus 的抑菌效果见图版?:7 图版?:8三级卵膜对溶藻弧菌有较强的抑菌作用在三级卵膜周围均产 生了抑菌圈