（发酵工程专业论文）植酸酶高产菌株的选育及酶的分离纯化和性质研究.pdf

山东轻t 业学院硕上学位论文 摘要 本文从实验室保存的6 株黑曲霉、1 株米曲霉和采集的3 0 多份土样出发，利 用透明圈法，经过初筛、复筛得到一株产植酸酶的黑曲霉，并将其命名为黑曲霉 q y 。通过条件优化确定了制备黑曲霉q y 原生质体的最佳条件：在液体培养条件 下培养9h 的菌丝；用蜗牛酶：纤维素酶= 7 ：3 的混合酶处理菌丝；在3 7 酶解 2 5h ；酶液p h 值为6 ；用o 7m o l l 的氯化钠作为渗透压稳定剂。通过原生质体 紫外诱变、化学诱变，得到了一株产植酸酶较高的菌株：黑曲霉q y - 1 7 ，在3 0 、 2 2 0r m i n 条件下发酵培养3d ，植酸酶发酵液的酶活力达到3 8 9 4u m l ，是原始菌 株酶活的5 1 7 倍。通过发酵培养基和发酵条件优化，得到黑曲霉q y - 1 7 最佳产酶 培养基是以葡萄糖为碳源，其添加量为3g 1 0 0m l ：玉米浆+ n h 4 n 0 3 为氮源，其 添加量为1 5 + 0 2 5g 1 0 0m l ；m g s 0 4 7 h 2 0 的最适添加量为o 0 7g 1 0 0m l 。最佳产 酶条件为：3 l 、2 2 0r m i n ，2 5 0m l 三角瓶装液量为4 0m l ，接种量为1 0 ，培 养基起始p h6 ，发酵培养7 2h 。在最适条件下培养黑曲霉q y - 1 7 ，酶活可达到5 7 9 8 u m l ，是初始产酶条件下的1 4 9 倍，是原始出发菌株酶活的7 7 倍。 考虑到植酸酶的应用，本文对黑曲霉q y - 1 7 植酸酶经7 0 0 0r m i n 、2 0m i n 离心 的粗酶液的酶学性质进行了研究。发现3 7 时黑曲霉q y - 1 7 植酸酶在p h2 5 和 p h5 5 时都有酶活高峰。该植酸酶在p h2 8 之间的稳定性很好，活性 7 0 ，当p h 8 时，酶迅速失活。这说明该酶在酸性和中性环境下稳定性比较好，在碱性环境中， 容易失活。黑曲霉q y - 1 7 植酸酶最适反应温度为5 5 ，在3 7 6 0 都具有较高 的酶活性，超过6 0 后酶活迅速下降。黑曲霉q y - 1 7 植酸酶具有较好的耐热性， 在6 0 保温1 0r a i n 后酶活保留在8 0 左右，在7 0 保温1 0m i n 后酶活仍能保留 在6 0 左右。该酶对胃蛋白酶具有弱敏感性，在3 7 、p h2 5 下用lr a g m e 胃蛋 白酶处理植酸酶2h ，植酸酶的酶活力仍能保留8 7 9 ，说明黑曲霉q y - 1 7 对胃蛋 白酶具有较强的抗性，这对于它们在单胃动物消化道内保持活性具有非常重要的 意义。1 0 、n 矿、c a 2 + 、m 9 2 + 、f e 2 + 在高浓度时对黑曲霉q y - 1 7 植酸酶有抑制作用； z n 2 + 、c u 2 + 、m n 2 + 在高浓度和低浓度下几乎没有什么抑制作用。黑曲霉q y - 1 7 植 酸酶在p h2 5 、3 7 时对植酸钠的k m 值为o 5m m o l l ，v m 双为5 0 0n m o l m l m i r a 在p h2 5 、5 5 时对植酸钠的k m 值为0 6m m o l l ，v m 麟为1 0 0 0n m o l m l m i n ，这 说明该植酸酶在p h2 5 、3 7 时对植酸钠有更大的亲和力。 对黑曲霉q y - 1 7 植酸酶进行了分离纯化，植酸酶发酵液经过7 0 0 0r m i n 、2 0m i n 离心、沉淀浓缩、d e a ef f 离子交换柱、s u p e r d e x 俐7 5 凝胶柱得到了植酸酶的两 种同工酶：酶i 和酶i i ，s d s p a g e 电泳呈单一条带，分子量分别为4 1k d 和6 8k d ， 总回收率达到4 1 6 。 v 摘要 关键词：植酸酶；黑曲霉；原生质体；菌种选育；条件优化；分离纯化 v i 山东轻t 业学院硕上学位论文 a b s t r a c t i tw a st h a tt h et h e s i ss t a r t e dw i t hs i xs t r a i n so fa s p e r g i l l u sn i g e ra n do n es t r a i no f a s p e r g i l l u so o r y z a e ( p r e s e r v e di nt h el a b o r a t o r y ) t o g e t h e rw i t hm o r et h a nt h i r t ys o i l s a m p l e sc o l l e c t e d w eo b t a i n e do n es t r a i no fa s p e r g i l l u sn i g e r ( n a m e dq y ) t h a tc o u l d p r o d u c ep h y t a s eb yw a yo fc l a r i t y c i r c l em e t h o da f t e rp r e s c r e e n i n ga n dr e s c r e e n i n g t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rt h ep r e p a r a t i o no fa s p e r g i l l u sn i g e r q yp r o t o p l a s t sw e r e a c h i e v e db yo p t i m i z i n gc o n d i t i o n s ：m y c e l i u m sw e r ec u l t i v a t e di nl i q u i dm e d i u mf o r n i n eh o u r s ；a n dt h e nt h e yw e r ed i s a s s e m b l e di nam i x e de n z y m e sw i t ht h ep r o p o r t i o no f h e l i c a s ea n dc e l l u l a s ew a s7 ：3 ：t h et e m p e r a t u r ew a s3 7 a n dt h ep r o c e d u r el a s t e df o r 2 5h ；t h ep ho ft h es o l u t i o nw a s6 ；0 7m o l ln a c lw a su s e da ss t a b i l i z e rt ob a l a n c e t h eo s m o t i cp r e s s u r e b ym u t a g e n e s i su s i n gu l t r a v i o l e tr a d i a t i o no fp r o t o p l a s t sa n d c h e m i c a lm u t a g e n ，am o r ep r o d u c t i v es t r a i nw a so b t a i n e d ：a s p e r g i l l u sn i g e r q y - 17 ， c u l t i v a t e du n d e r3 0 ，2 2 0r m i nf o r3d ，t h ee n z y m ea c t i v i t yw a s3 8 9 4u m l ，5 17 t i m e so ft h ei n i t i a ls t r a i n b yo p t i m i z i n g t h ec u l t u r em e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，t h em o s t p r o d u c t i v ec u l t u r em e d i u mf o ra s p e r g i l l u sn i g e r q y - 1 7w a st ou s eg l u c o s ea sc a r b o n s o u r c ew i t ht h er e c r u i t m e n to f3 10 0m l ；c o r ns t e e pl i q u o ra n dn h 4 n 0 3w e r eu s e da s n i t r o g e ns o u r c ew i t ht h er e c r u i t m e n to f1 5 + 0 2 5 罾10 0m l ；t h eo p t i m a lr e c r u i t m e n to f m g s 0 4 7 h 2 0w a so 0 7 10 0m l t h em o s tp r o d u c t i v ec o n d i t i o n sw e r e31 ，2 2 0 r m i n ，t r i a n g u l a rf l a s k s ( 2 5 0m l ) w i t h ac o n t e n to f 4 0m l ，t h ei n o c u l a t i n gv o l u m ew a s 10 ，i n i t i a lp ho ft h em e d i u mw a s6 ，b ei n c u b a t e df o r7 2h ，a s p e r g i l l u sn i g e r q y - 17 c u l t i v a t e du n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sc o u l dr e a c hae n z y m ea c t i v i t yo f5 7 9 8u m l ， w h i c hw a s1 4 9t i m e so ft h ei n i t i a lc o n d i t i o na n d7 7t i m e so ft h ei n i t i a ls t r a i ni nt e r m s o fe n z y m ea c t i v i t y ，n l ec h a r a c t e r i s t i c so fl i q u i de n z y m ea c q u i r e db yc e n t r i f u g a lt r e a t m e n t ( 7 0 0 0r m i n ， 2 0m i n ) w e r ei n v e s t i g a t e dw h e nc o n s i d e r i n gt h ea p p l i c a t i o no fp h y t a s e ，a n df o u n dt h a t t w om a x i m a la c t i v i t i e so fe n z y m e sa p p e a r e dw h e nt h ep h2 5a n d5 5a tt h et e m p e r a t u r e 3 7 p h y t a s em a n i f e s t e dag o o ds t a b i l i t y ( 7 0 ) w h e nt h ep ha l t e r e dw i t h i nt h er a n g e o f2t o8 i tw o u l db ed e a c t i v a t e dp r o m p t l yw h e nt h ep h 8 t h i si m p l i c a t e dt h a tt h e e n z y m ec o u l dc o u n t e r a c ta c i d i t ya n dn e u t r a lc o n d i t i o nw h i l es e n s i t i v et oa l k a l e s c e n c e t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo fp h y t a s ew a s5 5 ，a n dp o s s e s s e dag o o de n z y m a t i ca c t i v i t y f r o m3 7 t o6 0 d e a c t i v a t e dw h e nt h et e m p e r a t u r ee x c e e d6 0 t h e r m a l e n d u r a n c ew a sp r e f e r a b l e ，a c t i v i t yr e m a i n e da t8 0 a p p r o x i m a t e l ya f t e rk e p ti n6 0 v a b s t r a c t f o r10m i n t h ee n z y m es h o w e dl i t t l es e n s i t i v i t ya g a i n s tp e p s i n w h e nd i s p o s e d 、i t l l p e p s i n ( 1m g m l ，3 7 ，p h2 5 ) f o r2h ，t h e r ew a s8 7 。9 o fa c t i v i t yl e f t t h a t sa l l i m p o r t a n ti nt e r m so fk e e p i n ge n z y m a t i ca c t i v i t yi na l i m e n t a r yc a n a l s p h y t a s ec o u l db e r e s t r a i n e db yk + ，n a + ，c a 2 + ，m 9 2 + ，f e 2 + a th i g hc o n c e n t r a t i o na n dc o u l d n tb er e s t r a i n e d b yz n 2 + ，c u 2 + ，m n 2 + a ta n yc o n c e n t r a t i o n t h ek mo fp h y t a s ea g a i n s ts o d i u mp h y t a t e w a so 5 m m o l l ( p h2 5 ，3 7 ) ，v m 积w a s5 0 0n m o l m l 。m i n ；t h ek mo fp h y t a s e a g a i n s ts o d i u mp h y t a t ew a s0 6m m o l l ( p h2 5 ，5 5 ) ，v m 戤w a s10 0 0n m o l m l m i n i tw a sf o u n dt h a tt h el a r g e ra f f i n i t yt os o d i u mp h y t a t ea tp h2 5a n d3 7 p h y t a s ep r o d u c e db ya s p e r g i l l u sn i g e r q y ol7w a sp u r i f i e d ：f e r m e n t a t i o nb r o t hw a s t r e a t e da f t e rc e n t r i f u g a l i z a t i o n ( 7 0 0 0r m i n ，2 0m i n ) ，a c e t o n ep r e c i p i t a t i o n ，d e a ef f i o ne x c h a n g ec o l u m na n ds u p e r d e x1 m 7 5g e lc o l u m n ，a n dt h e nt w oi s o z y m e s ( e n z y m ei a n de n z y m ei i ) ，s i n g l eb a n dw a ss h o w e di ns d s - p a g e ，t h e i rm o l e c u l a rw e i g h t sw e r e 41k da n d6 8k ds e p a r a t e l y t h et o t a lr e c o v e r yw a s4 16 k e yw o r d s ：p h y t a s e ；a s p e r g i l l u sn i g e r ；p r o t o p l a s t ；s t r a i nb r e e d i n g ；c o n d i t i o n o p t i m i z a t i o n ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n v i i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：生垂煎 导师签名： 里丝 舻 日期： 丝颦年上月监日 山东轻t 业学院硕l 学位论文 第1 章绪论 1 1 植酸与植酸酶概述 植酸( p h y f i ca c i d ，简称p a ) 又名肌醇六磷酸，是维生素b 族的一种肌醇六 磷酸酯。植物性饲料中约含有1 4 的磷，其中6 0 8 0 的磷是以植酸磷的形式 存在于稳定的植酸盐复合物中，这些磷只有在植酸分解酶的作用下才能被游离出 来供畜禽吸收利用。非反刍动物如猪和家禽的消化道内缺少植酸酶，摄入体内的 磷总量的8 0 以粪便的形式排出体外，从而造成磷资源的浪费；同时人们为了满 足动物对磷的需求，又不得不向动物饲料中添加无机磷，增加了饲料成本；另外， 未被消化的植酸经动物排出体外后易造成有机磷富积，引起环境的污染【l 】。植酸还 是一种重要的抗营养因子，它在动物胃肠道消化过程中会与多种金属离子如c a 2 + 、 f e 2 + 、z n 2 + 、c u 2 + 等以及蛋白质螯合形成相应的不溶性复合物，从而降低动物对这 些营养元素的利用率1 2 j 。 植酸酶是9 0 年代出现的一种绿色饲料添加剂，它可以使植酸磷降解成肌醇和 磷酸，提高动物饲料的营养价值。目前植酸酶主要应用于饲料行业【3 】。此外，国外 已开始试用食品级的植酸酶处理日粮。就食品而言，一般的加工处理只能破坏食 品中少量的植酸，大部分植酸可与多价阳离子如c a 2 + 、f e 2 + 、z n 2 + 等结合形成不 溶性复合物。由于人体内缺乏分解植酸的植酸酶，食物中的磷、锌、钙、铁等得 不到有效的利用，而且还会影响蛋白质的吸收利用，继而引起人体微量元素的缺 乏与各种疾病，因而人们纷纷研究消除或降低植物性食品中植酸含量的办法。2 0 世纪9 0 年代，植酸酶是酶制剂工业的一大奇迹，向猪、家禽和鱼日粮中添加微生 物植酸酶或者添加含有较高植酸酶的原料，可使植酸磷得到有效的利用，不必另 外向饲料中添加无机磷就能满足动物对磷的需求，同时也减少了动物粪便对环境 造成的磷污染。因此植酸去除不仅是饲料工业的重要课题，也是环境保护的重要 措施【4 】。 1 1 1 植酸 ( 1 ) 植酸的性质和结构组成 植酸( p h y t i ca c i do ri n o s i t o lh e x a p h o s p h a t e ) 即肌醇六磷酸酯，俗称菲丁。分 子式为c 6 h 1 8 0 2 p 6 ，通式为c 6 h 6 o p o ( o h ) 2 1 6 ，分子量为6 6 0 8 ，化学名称是环己六 醇1 ，2 ，3 ，g ，5 ，6 六磷酸二氢酯，每个碳原子上连有一个带负电的磷酸根，具有很强的 螯合能力，与e d t a 接近，可与多种矿物质离子如镁、钾、钙、锰、铁、锌螯合， 形成不溶性复合物【5 1 。植酸是无色粘稠状液体，易溶于水、9 5 乙醇、丙酮、丙二 醇、甘油等，但几乎不溶于无水乙醚、苯、乙烷、氯仿等。其确切的结构( 见图 1 1 ) 由b a r r e 等确定为船式。植酸遇高温则会分解，但在1 2 0 以下大致是稳定 第l 章绪论 的【6 】o 图1 1 植酸结构 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fp h y t i ca c i d ( 2 ) 植酸的存在形式 植酸( 盐) 广泛存在于谷物籽实和油料作物种子、鸟类和海龟的红细胞内， 人和动物的肌体组织也含有少量植酸。在谷物类食品如小麦、大麦、黑麦等中， 多数植酸存在于谷粒的糊粉层与外壳附近，小麦中含有植酸0 8 7 1 6 4 。豆科植 物的植酸盐分布于整个种子的蛋白质网络中，大豆中含植酸1 o 2 3 ，大豆制品 中植酸含量一般为1 o 3 o 。玉米胚芽中含有较高浓度的植酸盐，玉米中植酸含 量为0 6 9 1 1 4 。吕忠进等人对各种植物原料中植酸含量的研究表明，成熟谷物、 豆类和油料作物籽粒中植酸约占籽粒干重的0 1 4 0 9 9 ，而植酸中的磷含量则占 籽粒中总磷含量的6 0 9 0 。 ( 3 ) 植酸的抗营养作用 植酸在化学结构上具有很强的络合能力。植酸在中性或碱性的条件下，能与 c a 2 + 、m 9 2 + 、z n 2 + 、c u 2 + 、f e 3 + 、m n 2 + 等金属离子络合成难溶性的盐( 图1 2 ) ，从 而降低动物对这些矿物元素在小肠内的吸收，在p h7 4 的条件下，植酸与下列离 子形成的络合物的数量依次减少：c u 2 + 、z n 2 + 、c 0 2 + 、m n 2 + 、f e ”、c a 2 + ；植酸与 下列离子形成络合物的稳定性依次减弱：z n 2 + 、c u 2 + 、n i 2 + 、c 0 2 + 、m n 2 + 、c a 2 + 。 可见，植酸对矿物质元素中利用率影响最大的是锌f 6 l 。在酸性条件下，植酸和氨基 m e t a l - f r e ep h y t a t e e a 。 ；m p 。 o m e t a l - p h ) 嚏a t ec o m p l e x i n1 1 3 t b l e 图1 2 植酸在酸性和碱性条件下的存在方式 f i g 1 2t h eb e i n gm o d eo fp h y t i ca c i di nt h ec o n d i t i o n so f a c i da n da l k a l i n ep h 酸如赖氨酸、组氨酸和精氨酸络合，会影响蛋白质的溶解性和胃蛋白酶的作用。 2 山东轻工业学院硕上学位论文 植酸与蛋白质的这种相互作用与p h 值关系非常密切。在低于蛋白质等电点的p h 条件下，植酸可与蛋白质分子上的碱性基团( 赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基) 结 合形成植酸蛋白质的二元复合物。在高于蛋白质等电点的p h 条件下，经钙、镁 和锌等阳离子作为桥梁形成植酸蛋白质金属离子的三元复合物，这种复合物是不 可溶的，且受蛋白质水解酶作用的程度小于同种单独蛋白质，因此导致蛋白质的 消化率降低r 。植酸还可以直接和消化酶络合，从而限制淀粉酶、胰蛋白酶、酪氨 酸酶、胃蛋白酶和脂肪酶的活性。由于植酸的这种抗营养作用，矿物质和各种营 养元素得不到很好的利用。s a n d b e r g 等发现在体外模拟的生理条件下，脱植酸的 小麦麸中铁的溶解度从3 增加到5 3 ，而脱植酸的黑麦粉中铁的溶解度从3 增 加到2 1 ，直接证实了植酸可抑制矿质元素的吸收、利用。而在含有植酸的谷物 和豆类食品中加入植酸酶，能不同程度地提高各种营养元素的利用率。 1 1 2 植酸酶 ( 1 ) 植酸酶的分类 植酸酶( m y o i n o s i t o lh e x a p h o s p h a t ep h o s p h o h y d r o t a s e ) 是催化植酸及植酸盐 水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶，现已知有三种类型：肌醇六磷酸3 磷酸水 解酶( 3 磷酸水解酶，e c 3 1 3 8 ) ，主要存在于植物和微生物中，它首先使肌醇的 第3 位c 的磷酸解离，然后逐个水解依次降解为五、四、三、二、一磷酸肌醇， 过程需m 9 2 + 参与；肌醇六磷酸6 磷酸水解酶( 6 磷酸水解酶，e c 3 1 3 2 6 ) 主 要存在于植物种子中，它首先使肌醇第6 位c 的磷酸解离，最终产物是单磷酸肌 醇( 2 磷酸肌醇) 和正磷酸；非特异的正磷酸盐单酯磷酸水解酶【8 1 。最近又发现 一种被钙激活的来自百合花粉( l i l yp o l l o n ) 的新型碱性植酸酶，其最适p h 为8 ， 运用核磁共振技术证明该酶作用的起始部位为植酸的第5 位0 p 键，且只能将植 酸水解成i p 3 ，不能彻底水解成肌醇。对黑曲霉n r r l 3 1 3 5 菌株的研究表明，该菌 产生三种胞外植酸酶，分别是：6 植酸酶，即内消旋肌醇六磷酸酶( e c 3 1 3 8 ) ( p h y a ) ；3 植酸酶( e c 3 1 3 2 6 ) ( p h y b ) ；非特异性单酯磷酸水解酶。能分解植 酸磷的活性成分主要是p h y a l 9 。 ( 2 ) 植酸酶的来源及特点 植酸酶的来源很广，植物、微生物、动物均可产生植酸酶。 植物植酸酶 1 9 0 7 年，s u z u k i 等在米糠中首次发现植酸酶，植物植酸酶的活性在不同种类 植物中存在很大差异：黑麦( 5 1 3 0u k g ) 、小麦( 11 9 3u k g ) 、大麦( 5 8 2u k g ) 和小麦麸具有很高的植酸酶活性，而燕麦、玉米、大豆饼、花生饼和棉籽饼中植 酸酶活性很低。植物来源的植酸酶有两种：一种是6 植酸酶( e c 3 1 3 2 6 ) ，主要 存在于植物种子中；另一种是3 植酸酶( e c 3 1 3 8 ) 。植物源的植酸酶的酶活性的 最适p h 在4 8 6 。o 之间，当p h3 0 时活性显著下降，甚至失活，因此这类酶在动 3 第1 章绪论 物胃中高酸性的条件下，难以发挥其催化活性，只适合在鱼类等动物的肠道中起 作用。而且植物源的植酸酶的耐热性不良，其酶活在温度为4 7 5 2 的范围内比较 稳定，在通常饲料加工的过程中温度为7 5 9 3 的情况下，小麦、大麦等的植酸酶 极易失活。 动物植酸酶 在动物中，植酸酶主要存在于脊椎动物的红细胞、血浆以及哺乳动物的小肠 内，但含量很少且活性很低。而牛等反刍动物的瘤胃中植酸酶活性较高，这可能 是瘤胃微生物产生植酸酶的缘故。反刍动物瘤胃微生物产生的植酸酶能有效水解 植酸盐，单胃动物肠道粘膜中的内源性植酸酶及肠道微生物产生的植酸酶活性相 当弱，不能有效地水解植酸盐。 微生物植酸酶 1 9 1 1 年a w o o s 和r g o l d e n 首次发现微生物能够产生植酸酶，1 9 7 1 年n e l s o n 首次证明了a s p f i c u u m 产生的植酸酶可以水解植酸。实际上，自然界中许多细菌、 酵母菌和霉菌都可以产生植酸酶，细菌当中有枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸 杆菌、大肠杆菌等；丝状霉菌，特别是曲霉属，有较强的产植酸酶能力，比如： 黑曲霉( a n i g e r ) 、无花果曲霉( 彳f i c u u m ) 、米曲霉( a o r y z a e ) 、土曲霉( 彳t e r m s ) ， 它们能分泌具有高活力的胞外植酸酶，其中黑曲霉( 彳n i g e r ) 、无花果曲霉 ( a f i c u u m ) 一直被认为是微生物植酸酶主要生产菌而被大量研究，利用微生物发 酵法可以生产商品化植酸酶。a s p e r g i l l u sn i g e ，产生的植酸酶活性最强，而a f i c u u m 的植酸酶产量最大。大多微生物产生的植酸酶主要是3 一植酸酶( e c 3 1 3 8 ) 0 0 1 。 微生物源的植酸酶所耐受的p h 范围较大，一般在2 5 6 0 范围内。例如a n i g e r 和a 驴e u m m 高产菌株产生的植酸酶有两个最适p h ，即p h2 5 和p h5 5 ，因而这 种酶以植酸为底物时有两个活性高峰，这有可能是由于存在两种植酸酶的同工酶 所致。而通常猪和家禽的胃的p h 约为1 5 3 5 ，小肠前端p h 约为5 0 7 0 ，因而这 类植酸酶能较好地适应动物胃肠道的p h 条件，从而有效地发挥其催化作用。大多 数微生物植酸酶活性的最适温度在4 5 7 0 范围内，个别可高达7 7 ，据报道某 些曲霉( a n i g e ，和a f f i c u m m ) 生产的植酸酶有较高的热稳定性，在饲料制粒温度 条件下仍能维持较高的酶活性【l l 】。一般来说，丝状真菌植酸酶为胞外酶，较易分 离纯化，而细菌植酸酶多为胞内酶，但也有如枯草芽孢杆菌和部分肠杆菌属的细 菌产胞外植酸酶。 ( 3 ) 植酸酶的作用机理 植酸酶能将植酸分解为肌醇和磷酸，植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐个切 下，植酸及其盐类的0 p 键断裂，水解产物有i p 5 、i p 4 、i p 3 、i p 2 、i p ，磷酸根从 植酸分子游离出来，同时释放出被植酸螫合的二价和三价阳离子，被动物利用， 终产物为肌醇和磷酸【1 2 】。微生物产生的3 植酸酶作用于植酸时，首先从植酸的第 4 山东轻1 = 业学院硕 学位论文 三个碳位点开始水解酯键释放出无机磷，然后再依次释放出其它碳位点的磷，最 后酯解整个植酸分子，此酶需要m 9 2 + 参与催化过程。来源于植物的6 植酸酶，它 首先在植酸的第六个碳位点开始催化并释放出无机磷。1g 植酸完全分解理论上可 释放出无机磷2 8 1 6m g 。 大多数微生物源的植酸酶的作用机理如下： 植酸_ d 1 ，2 ，4 ，5 ，6 五磷酸肌醇+ d 1 ，2 ，3 ，4 ，5 五磷酸肌醇一1 ，2 ，5 ，6 四磷酸肌醇 - - - 1 ，2 ，5 三磷酸肌醇或1 ，2 ，6 三磷酸肌醇_ 1 ，2 二磷酸肌醇_ 2 磷酸肌醇 1 2 植酸酶的应用 1 2 1 植酸酶在饲料中的应用 国内外大量实验研究明确证明，在单胃动物的饲粮中添加植酸酶，可以提高 植物性饲料中磷及其它矿质物元素的利用率，提高其对蛋白质、淀粉、脂肪等营 养物质的利用率，从而促进动物健康快速生长；减少粪便中磷的含量从而减轻环 境污染。植酸酶在饲料方面的应用效果主要表现在以下几个方面： ( 1 ) 提高饲料中有机磷的利用率，降低饲料成本，预防磷缺乏病 猪、鸡、鸭、鹅及各种水产鱼类均属于单胃动物，自身不能或很少产生植酸 酶，所以在饲料中添加适量的植酸酶，使植物性饲料中所含的有机磷得以充分利 用，可部分或全部替代无机磷，不但可以大大降低成本，而且相对增加了饲料的 配料空耐1 3 】。s i m o n s 等人验证了植酸酶制剂在以玉米、大豆、高粱和葵花籽粕为 主要原料的肉鸡日粮中的应用效果，发现饲料中添加了植酸酶的鸡的钙和磷的利 用率显著提高，排泄物中磷的含量较对照大约低6 0 ；在猪的消化率研究中，由 于添加了植酸酶，同样观察到了磷和钙的利用率显著提高，而且这些元素在粪便 中含量也显著地降低。每千克日粮中添加1 0 0 0 单位植酸酶，培养lh ，可分别使 大豆饼、玉米中植酸盐所含磷的8 5 和1 0 0 被游离出来，如果培养4h ，可使猪 液体饲料中植酸盐所含磷的8 0 被游离，同时在动物胃肠道中被植酸、植酸盐所 螯合的大量矿物元素，由于植酸的降解而被释放。若该技术能够迅速发展并在全 国推广应用，产生的效益将是不可估量的。 ( 2 ) 植酸酶能提高单胃动物对矿质元素和蛋白质的利用率 在低磷的日粮中添加植酸酶后，不仅促进了植酸磷的生物利用率，而且释放 了被植酸鳌合的其它各种矿质元素，如c a 2 + 、z n 2 + 、f e ”、m n 2 + 、c u 2 + 等，增加了 它们的生物利用率，促进了动物矿质营养的平衡，特别是钙、磷平衡和铜、锌平 衡，进而改善动物的组织结构，如提高鸡的骨骼质量使其胫骨灰分含量、磷含量、 胫骨折断力和骨密度显著提高，使鸡的掌骨末端肥大区减小、增生区增加、软骨 组织增加，软骨细胞和骨细胞更加有序化【1 4 l 。周帼萍等报道，在猪日粮中添加植 酸酶，能使m 9 2 + 、z n 2 + 、c u 2 + 、f e 3 + 的表观利用率分别提高1 3 、1 3 、7 和9 【1 5 】。 s e b a s t i a n 等发现在低磷饲料中添加植酸酶，可使公鸡体内p 、c a 、c u 和z n 的相 5 第1 章绪论 对沉积率分别提高1 2 5 、1 2 2 、1 9 3 和1 2 3 ，增加仔鸡体重和促进骨骼矿化。 白东清等发现饲料中添加植酸酶可以使鲤鱼对钙的利用率提高1 3 2 以上。y i 等的 实验结果表明每1 0 个活性单位的植酸酶可以释放出0 9m g 锌。r i m b a c h 等发现在 小鼠日粮中添加微生物植酸酶，可以明显增加锌的吸收。 植酸酶水解植酸，破坏了植酸一蛋白质键，伎蛋白质被释放出来，解除了对蛋 白酶、淀粉酶、脂肪酶的抑制作用，增强了对蛋白质、淀粉、脂肪等营养物质的 消化作用，提高了利用率。猪禽饲料中添加植酸酶可提高猪禽对蛋白质的消化利 用率已被许多实验所证明【1 6 1 。白东清等发现饲料中添加植酸酶可以使鲤鱼对蛋白 质和脂肪的利用率约提高l l 和1 2 。o f f i c e r 和b a t t e r h a m 对猪的实验表明，添加 微生物植酸酶后，猪回肠的蛋白质和必需氨基酸表观消化率提高了9 1 2 。m r o z 研究表明，添加植酸酶后，不仅使蛋白质而且使赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、精氨 酸、缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苏氨酸的表观消化率均得 到改善【l 。另有资料报道，在低磷、低蛋白质水平下添加植酸酶，能使氨基酸的 利用率显著提高，而高磷、高蛋白质日粮中添加植酸酶，对氨基酸的消化率和沉 积率无影响i l 引。r a v i n d r a n 等的研究结果表明，在肉鸡的豆饼饲料中添加微生物植 酸酶可提高肉鸡的表观代谢能力，促进磷、氮和氨基酸在回肠内的可消化性，增 加干物质、磷和氮的储存，对1 5 种氨基酸的回肠消化率提高幅度为8 5 5 ，当考 虑个别氨基酸时，发现t h r 和v a l 的回肠消化率增加幅度最大。 ( 3 ) 植酸酶能提高单胃动物的生产性能 大量实验表明，饲料中添加植酸酶对肉鸡有明显的增重效应，并改善饲料利 用率，减少料肉比：对蛋鸡可避免因磷的摄入不足而导致的产蛋下降、骨质密度 减小、死亡率增加等现象，减少死亡率，增加产蛋率，降低饲料成本1 1 9 1 。日粮中 用植酸酶替代磷酸氢钙的肉鸡，其同增重明显增加，料肉比下降，排出的粪便中 含磷量减少【2 0 1 。楼洪兴报道，用植酸酶代替5 0 的无机磷，实验中肉用仔鸡增重 速度和饲料效率略高于常规无机磷只粮组。每千克日粮中加入2 0 0 单位植酸酶， 可显著提高饲料利用率，促进肉鸡生长，降低腿畸形发生率。植酸酶添加量在2 5 0 u k g 以上时对小鸡具有增重作用，植酸酶添加至5 0 0u k g 时，小鸡的体重增加量 达到稳定水平。植酸酶替代磷酸氢钙饲喂蛋鸡可使蛋重增加，产蛋率上升，料蛋 比降低，蛋壳品质明显改善，破壳率下降。l i m 等报道在蛋鸡日粮中添加3 0 0u k g 的微生物植酸酶，可以提高产蛋率，降低破壳蛋、软壳蛋出现率及粪磷排出量。 植酸酶应用于鹌鹑日粮的实验表明，日粮中添加0 0 1 2 植酸酶后，日粮总磷量降 低3 5 9 ，粪中总磷降低3 6 4 ，同时，产蛋率提高2 0 ，蛋重增加0 2g 枚，蛋 料比降低0 1 2 。陈宝江等在鹌鹑同粮中添加4 0 0g 吨、7 0 0g 吨的植酸酶以替代 4 0 、7 0 的骨粉，结果表明鹌鹑产蛋率和饲料报酬分别提高4 4 8 、3 6 6 和 1 9 1 0 、3 4 0 ，经济效益分别提高1 9 。1 7 ，2 3 6 0 。 6 山东轻1 ：业学院硕l 学位论文 植酸酶替代磷酸氢钙对生长育肥猪生产性能有较大影响。饲喂用植酸酶替代 部分磷酸氢钙的日粮，生长肥育猪的日增重明显增加，饲料转化率提高，粪便中 的磷含量也有明显降低【2 l 】。在生长猪日粮中添加5 0 0u k g 植酸酶，可使日增重提 高8 1 5 ，饲料转化率提高4 8 ，并显著提高c a 、p 的表观消化率，但对干物质、 粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪的表观消化率无显著影响。韩延明等对生长猪、断奶 仔猪和肥育猪进行了植酸酶饲养实验，结果表明，添加微生物植酸酶组的猪增重 和采食量接近添加无机磷组的水平，而蛋白质的表现消化率有所提高。实验还说 明，生长猪从断奶到肥育阶段，植酸酶可代替无机磷1 2 2 。 ( 4 ) 降低环境污染 在动物饲料中添加植酸酶，除了对我国日益扩大的养殖业产生直接的经济效 益外，还可以减少养殖业造成的环境污染【2 3 1 。利用高活性、稳定性强的植酸酶可 以将家禽和猪的有机磷排泄量减少2 5 6 5 ，将有机氮排泄量减少1 0 2 0 。 s i m o n s 等的研究表明在玉米豆粕日粮中添加微生物植酸酶，动物粪中磷的排出量 减少了5 0 。c r o m w e l l 等报道，在猪的玉米豆粕同粮中添加植酸酶，动物粪便中 磷排泄量减少3 4 5 4 。因此，在饲料中添加植酸酶不仅可以降低饲养成本，提 高饲养效益，而且可以减少饲料中不能被利用的磷排出体外造成水体富营养化， 从而有力地减缓由于养殖业而造成的水源污染和环境污染【2 4 。 1 2 2 植酸酶在食品中的应用 食用级植酸酶在食品行业中有很好的发展前景，s a n d b e r g 等研究了食物中的 植酸酶在消化道内降解植酸盐的作用，当在特定食谱中加入失去植酸酶活性的麦 麸时，平均有9 5 的植酸不能被降解，而加入没有经过处理的麦麸时，仅有4 0 的植酸不被降解。由于食物本身含有的植酸酶的活性在食品的加工过程中基本被 破坏了，而人体自身又不能合成植酸酶，所以近几年植酸酶引起了食品行业的广 泛重视。 在国外，植酸酶已经应用于食品的深加工领域。而在国内，到目前为止，还 没有专门应用于食品行业的食用级的植酸酶产品上市，仅限于研究阶段，植酸酶 的作用效果主要集中在增加矿物质的吸收和改善食品加工技术上【2 5 j 。食品级的纯 化植酸酶可用于婴儿食品特别是豆奶制品中以解除抗营养因子，生产高档的婴儿 食品；可以用于处理粮食，以分解粮食中的植酸( 盐) ，减小植酸对微量元素的鳌 合，提高粮食的营养价值；在大豆加工中可对大豆蛋白进行酶催化改性，从而提 高其营养价值和商品价值；面包生产过程中添加植酸酶可以清除揉面中的植酸， 面包制作中用的植酸酶应该是安全无毒的、高活性、钙依赖型；h a r o se ta l 研究了 面包焙烤过程中植酸酶的应用效果，在面包中加入不同含量的植酸酶，最后证实 植酸酶是一种很好的面包改良剂，它在不改变面团p h 的条件下大大缩短了面包的 醒发时间，而且改善了面包的质地：浸渍是玉米浆的生产程序之一，微生物植酸 7 第l 章绪论 酶能加速这一过程，改良株胚的分离，获得高产量的淀粉和面筋，并且能改善玉 米浆的品质；在谷物淀粉加工中处理废弃物，降低对环境的污染。 1 2 3 植酸酶在医药方面的应用 随着近年来植酸酶降解产物低磷酸肌醇在生物体内生理功能的发现，低磷酸 肌醇作为药物的开发和利用的研究工作也正在成为关注的焦点【2 5 1 。研究表明植酸 酶水解植酸产生的低磷酸肌醇和肌醇，可以在动植物及微生物体内相互转化，并 具有非常重要的生理功能。肌醇磷酸化合物是一类重要的有机磷酸化合物，其中 肌醇三磷酸是在肌醇磷脂信号通路中起第三信使的重要作用，而肌醇五磷酸和肌 醇四磷酸则是在鸟类红细胞中起与人体红细胞中2 ，3 二磷酸甘油酸( 2 ，3 d p g ) 相 似的作用，对血红蛋自具有别构调节作用。肌醇二磷酸和肌醇五磷酸也有非常重 要的营养和药用价值，它们能够降低血糖、胆固醇和甘油三脂，同时能够治疗阿 尔落海默病和帕金森病，肌醇有类似维生素b l 和维生素h 的作用，可以治疗肝硬 化、肝炎、脂肪肝、血管硬化、糖尿病等。三磷酸肌醇是植酸盐降解过程中的最 重要的一种中间产物。根据磷酸基团位置分布的不同，三磷酸肌醇有多种同分异 构体，比较常见的有：肌醇1 ，2 ，6 三磷酸、肌醇1 ，4 ，5 三磷酸、肌醇- 1 ，2 ，3 三磷酸、 肌醇1 ，2 ，5 三磷酸、肌醇1 ，3 ，4 三磷酸等，分别简称为i ( 1 ，2 ，6 ) p 3 、i ( 1 ，4 ，5 ) p 3 、 i ( 1 ，2 ，3 ) p 3 、i ( 1 ，2 , 5 ) p 3 。不同结构的i p 3 具有不同的功能，有的异