（发酵工程专业论文）碱性果胶酶中试生产和稳定性研究.pdf

摘要 果胶酶是指能分解果胶质的一类酶。碱性果胶酶则是指在碱性范围内具有 较高活性的果胶酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶。碱性果胶酶除了在植物病毒 的纯化、纸浆漂白等方面得到应用以外，已成为棉织物预处理过程中至关重要的 生物酶制剂。碱性果胶酶的使用将改变传统的碱精练工艺，不仅减少环境污染， 节约大量的工艺用水，而且可提高棉纺织物的品质。 本文采用一株具有自主知识产权的枯草芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶，在前 期实验室研究的基础上，研究了用价格低廉的合成氮源部分代替有机氮源以降低 原料成本的可行性，并研究了补加碳源对产酶的影响：然后进行了将发酵法生产 碱性果胶酶从7 l 罐放大到5m 3 的中试生产试验研究：最后研究了添加各种稳定 剂和防腐剂以增强碱性果胶酶应用和保藏过程中的稳定性。主要研究结果如下： 1 、用硫酸铵代替部分有机氮源，可以较大幅度地降低培养基成本，替代后的培 养基组成为：酵母膏2g 几，蛋白胨4g ，l ，硫酸铵4g 几，玉米淀粉8g ，l ， k 2 h p 0 4 3 h 2 09 2g l ，k h 2 p 0 43g l ，初始p h7 5 。7l 罐发酵产酶达2 8 _ 3 2 “m l 。 2 、通过7l 罐碱性果胶酶分批发酵试验发现，后期碳源不足是影响碱性果胶酶 产量进一步提高的关键。但简单地增加初糖浓度仅促进菌体大量增长，而产酶并 不能得到大幅度的提高；通过中期补加碳源发现，一次性补糖、分批补糖、恒速 流加补糖酶活分别为3 7 6 1 咖l 、4 9 1 6 妇l 、4 8 5 1 咖l ，比分批发酵产酶分 别提高3 4 、7 5 、7 3 ，从简化工艺考虑，分批补糖是适合碱性果胶酶发酵生 产的方式。 3 、在7l 罐上确定了种子生长曲线，种龄为7 1 0h 时，发酵生产碱性果胶酶的 酶活较高，在工业化生产试验中则通过取样即时测定o d 6 0 0 的方法，选择o d 6 0 0 上升缓慢时进行种子液转接。 4 、在理论计算的基础上结合生产实际，确定lm 种子罐的培养条件为：搅拌转 速3 0 0r m i n ，通气量1 w m ，罐压o 0 5m p a ，温度3 7 ；5m 3 发酵罐的培养条 件为：搅拌转速2 5 0r m i n ，通气量0 6 w m ，罐压o 0 5m p a ，温度3 7 。 5 、在5 m 3 发酵罐中进行碱性果胶酶发酵生产试验，酶活在9h 达到最高1 4 8 9 “ml ，菌体干重至7h 达到最大为8 6g l 。提取采用絮凝、板框过滤、超滤的工 艺，最终产品酶活为1 1 7 7 们n l ，总提取收率为7 9 7 。 6 、研究了在碱性果胶酶酶液中添加糖类、多羟基醇类、金属离子、e d t a 和其 他一些化学物质对酶应用稳定性的影响，最终得到复合稳定剂配方为：乙酸钠 6 、m g c l 2 2 h 2 02 。 7 、研究得到合适的碱性果胶酶的防腐剂配方为对羟基苯甲酸异丁酯o4 。在酶 液中加入对羟基苯甲酸异丁酯o 4 、乙酸钠6 和m g c l 2 - 2 h 2 02 ，该条件下， 江南大学硕士学位论文碱性果胶酶的中试生产和稳定性研究 产品可在常温下保质三个月，酶活保留率达到9 i 6 7 ，符合液体酶保藏标准。 关键词：碱性果胶酶，发酵生产，中试放大，纺织清洁生产，棉织物煮炼 江南大学硕士学位论文 碱性果胶酶的中试生产和稳定性研究 a b s t r a c t p e c t i n a s e sa r et h ep e c t i nd e p 0 1 y m e r i z m ge r l 巧m e s a l k a l i n ep e c t i i l a s e sa r e 山o s e h a v eh i g he n z y m ea c t i v 时a ta i k a l i n ec o n d i t i o n s t h em o s t l ys t u d i e da l k a i i n ep e c t i n s e i st h ep o l y g a l a c t u r o n a t ej y a s e ( p g l ) w h i c hc i e a v e sn 一1 ，4 一g a l a c t u m n o s i d i cl i n k a g e so f p o l y g a l a c t u r o 伍ca c i d ( p g a ) b e s i d e sa 墩a l i n ep e c t i n a s eh a sb e e nu s e di n t 1 1 e p 心石c a 石o no fp l a n tv i r u sa n db l e a c l l i n go fp a p e rp u l p ，i ti sb e c o m i l l gt h ek e ye n z y m e i nm ep m c e s so fc o t t o np r e t r e a 缸n e n t t h e 印p l i c a t i o no fa l k a l i n ep e c t i n a s e sw i l l c h a n g et h et r a d i t i o n a lp r o c e s so fc o t t o np r e 拄e a 恤e n t t h u s ，i tn o to m yd e c r e a s e sm e e n v i r o m e n tp 0 1 l u t j o n ，r e d u c e st 1 1 ec o n s u m p t i o no fi n d u s t r yw a t e r b u ta i s oi r l l p r o v e s m eq u a l i t yo f t e x t i l e h 也i sp a p e r ，s o m eo r g a n i cn i t r o g e ns o u r c ew a si n s t e a do fb ya m m o n i u ms u l p h a t e t or e d u c et h em a t e r i a lc o s t a d d m gc a r b o ns o u r c ew a ss t u d i e da l s o t h e nm e p r o d u c t i o no fa l k a l i n ep e c t i n a s e sw a ss c a l eu p 舶m7l t o5m 3 a t1 a s t ，m es t a b i l i t y i na p p l i c a t i o na n dp r e s e r v a t i o no fa l k a i i n ep e c t i n a s e sw a si m p r o v e db ya d d i n g a d d i t i v e sa n dp r e s e r v a t i v e s t h em a i nr e s u l t sw e r eg i v e na sf 0 1 l o w s ： 1 、a m m o n i u ms u l p h a t ew a su s e dt oi n s t e a do fs o m eo 唱a 1 1 i cm t r o g e ns o u r c et o r e d u c ep r o d u c t i o nc o s t t h es u i 协b l ef e m e n t a t i o nm e d i 啪f o rp g lp r o d u c t i o n c o n t a i n s8 lc o m s t a r c h ，2g 几y e a s te x t r _ a c t ，4 9 lp 印t o n e ，4 9 la m m o n i u l l l s u l p h a t e ，9 2g lk 2 h p 0 4 ，3g lk h 2 p 0 4a n di 工l i t i a lp hi s7 5 2 、f m m7lb a t c hf e r n l e n t a t i o nw ec a nf i n dt h a tt h ek e ys t e pt oe f f e c tt h ep r o d u c t i o n o fa l k a l i n ep e c t i n a s e sw a st h e1 a c ko fc a r b o ns o l i r c e s ot h a ti n c r e a s i n gi n i t i a l c a r b o ns o u r c ew a ss t u d i e d h o w e v e r ，t h ee x p e r i i l l e n t a t i o np r o v e dt h a tm 曲 c o n c e n 仃a t i o no fi n j t i a lc a r b o ns o u r c e1 e a dt oe x c e s s 伊o w t l lo fc e i l a 1 1 dt 1 1 e p r o d u c t i o no fa l k a h n ep e c t i n a s e s c a nn o tb ei m p r 0 v e d1 a 唱e 1 ) ls ot 1 1 s t a d d i n g c a r b o ns o u r c ed u r i n gf e r m e n 协t i o nw a ss m d i e d b ec o n t r a s tt ob a t c hf e m e n t a t i o n ， a d d j n gc a r b o ns o u r c eo n et i m e ，f o u rt i m e sa 1 1 df e d - b a t c hf e 咖e n t a t i o n ，a l k a l i n e p e c t i n a s e sa c t i v i t yr e a c h3 7 6 1u m l 、4 9 1 6 山m l 、4 8 5 1u m lr e s p e c t i v e l yu ，h i l e e n z y m ea c t i v i t yi 1 1 c t e a s eb y3 4 ，7 5 a n d7 3 r e s p e c t i v e l y a d d i n gc a r b o n s o u r c ef o u rt i m e si st h eb e s tm e t l l o d 3 、m a l ( es u r em es e e da g ec u r v ei n7lf b n l l e m o lt h ea l k a l i n ep e c t i n a s ea c t i v i t yi s l a r g e rw h e ns e e da g ei s7 1 0h s o 血a tw ec a n m e n s u r a t e0 d 6 0 0 t od e t e r r n i n em e t i m et ot r a n s f b rs e e d 4 、o nt l l eb a s eo ft h e o r yc a l c u l a t i o na n dc o m b m e 研t 1 1m ep r o d u c t i o nf a c t ，m a l ( es u r e t h ec u l t u r ec o n d i t i o n sa sf o l l o w s ：lm s e e df 色r m e m o r ：a g i t a t o rs p e e d3 0 0r p m ， a e r a t i o nr a t e1w m ，b a c kp r e s s u r ea t0 0 5m p aa n dt e m p e r a n l r e3 7 5m 3 i i i f e r m e n t o r ：a g i t a t o rs p e e d2 5 0 叩m ，a e r a t i o nr a t e0 6w m ，b a c kp r e s s u r ea to 0 5 m p aa n dt e m p e r a t u r e3 7 5 、t h ep r o d u c t i o no fa l k a l i n ep e c t i n a s ei n 5m 3f 毡啪e n t o rw a sc a r r vo u ta n dt h e e n z v m ea c t i v i t vr e a c h e d1 4 8 9 “m la t9hw l i l ed c wr e a c h e d8 6 卫la t7h d o m l s t r e 锄口r o c e s sw a sf l o c c u l a t i o n ，b o a r df i l t r a t i o na 工l dt h e nu l t r a f i l t r a “o n a t l a s t t h ee n z v m ea c t i v i t yw a s1 17 7 “m la i l dt h et o 诅ir e c o v e r yr a t i 0w a s7 9 7 ， 6 、s u g e r s ，p 0 1 y h y d r o x ya l c o h o l s ，m e t a li o n s ，e d t aa n do t h e rc h e m i c a lm a t e r i a i s w a sa d d e di na i k a l i n ep e c t i n a s es o l u t i o nt oi m p r o v et h es t a b j l i t yo fa l k a l i n e p e c t i n a s et h eo p t i m u ms t a b i l i z e da g e n t sw e r ec o m p o s e do fc h 3 c o o n ao f6 a n dm g c l 2 2 h ! oo f2 7 、t h eo p i i m u m p r e s e r v a t i v e sw a si s o b u t y r i c p a r a b e no f0 4 a d d i n go 4 i s o b u t y r i c p a r a b e n ，6 c h 3 c o o n aa 1 1 d2 m g c l 2 2 h 2 0i na l k a i i n ep e c t j n a s e s o l l l t i o nc a i lk e e pi tg o o dd u r i n gn a t u r a lt e m p e r a t u i 。ea r e rt l r e em o n t h sa n dt h e r e s i d u a le n z v m ea c t i v i t vw a s9 1 6 7 i ta c c o r dw i t ht h es t a n d a r do fe 1 1 z v m e s o l u t i o nd r e s e r v a “o n k e y 、v o r d s ：a i k a l i n ep e c t i n a s e ，f 爸珊e n t a t i o np r o d u c t i o n ，p i i o ts c a l e u p ，t e x t i l ec l e a n e r p r o d u c t i o n ：c o n o ns c o u r i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 丑：基。 日期：，r 。否年7 月f 。日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名鼍峻 签名：匝：越 导师签名；张缘 日裳：洲年；置。日 第章绪论 1 1 概述 第一章绪论 近年来，一场世界性的“回归自然”、“绿色消费”、“绿色产品”的浪潮在国际 纺织界掀起，人们对纺织品在生产、穿着和使用中的安全性提出了更高的要求。 美国、欧盟等国家出台一系列与此相关的法律法规和标准即所谓的“绿色标签”， 极大地推动了绿色纺织品的研究和开发，绿色纺织品的发展势在必行。酶制剂作 为一种高效、专一、具有环境亲和性的生物催化剂，其在纺织工业中的应用也将 随之成为必然的趋势。 表1 1 生物酶在纺织工业中的应用 t a b l e1 一lt h o 印p l i c 甜i o no f e n 叫m ei nt e x t i i ei 柚畦时 纺织用酶 淀粉酶 脂肪酶 碱性果胶酶 过氧化氢酶 纤维素酶 纤维素酶。 果胶酶 漆酶 蚩白酶 应用工艺作用 机织棉和化学纤 维彭：物的退浆 退浆 煮练 去除残留过氧化 氢 生物石洗 生物抛光 碳化 牛仔整理 羊毛整理 真丝脱胶 提高了车速、工艺的经济性和稳定性。 去除织物上的甘油三酯类浆类润滑剂。 去除果胶质、蜡质、色素，这些物质会抑制纤维的天然 吸水性，妨碍棉纱和棉织物的染色、印花或整理。传统 工艺用碱煮练去除天然蜡质和其他物质，但污染严重。 活性染料对过氧化物非常敏感，要求用强水洗或用化学 清除剂去除。 织物的均匀高质量整理( 全部用于牛仔服生产) 。传统工 艺采用浮石来获得个性化的磨损、褪色的外_ 观。 去除棉和粘胶织物表面的茸毛、绒球和原纤，处理后有 更清洁、柔软、光滑的外观，手感更好。 去除羊毛中的植物性杂质传统工艺采用强酸处理，然 后通过机械压碎。 可选择性地对靛蓝染料进行褪色，提高了表面磨损效果， 很少引起纤维素纤维强度的损伤。 提高舒适性，改进外观及起球性能。 使真丝服装获得砂洗效果。 生物酶在纺织加工中的工业化应用大约始于1 8 5 7 年，当初是使用麦芽萃取 物来去除印花前织物上的浆料。如今，生物酶在纺织品中的应用领域越来越广， 包括退浆、脱胶、生物抛光、生物石洗、真丝和羊毛整理以及靛蓝漂白 1 1 。所用 江南大学硕士学位论文碱性果胶酶中试生产和稳定性研究 的生物酶包括纤维素酶、脂肪酶、过氧化氢酶和碱性果胶酶等。碱性果胶酶作为 煮练工艺中的重要酶制剂，越来越受到人们的关注。 1 1 1 果胶及果胶酶 果胶按照其化学组成和结构可以分为以下四大类1 2 j ：p e c t i ca c i d s ，p e c t i n i c a c i d s ， p e c t i n 矛口p r o t o p e c t i n 。 p e c t i ca c i d s 和p e c t i n i ca c i d s 即是通常所说的果胶酸( p g a ) ，主要由d 一半乳 糖醛酸脱水缩合，以n 一1 ，4 糖菅键连接形成的直链状聚合物；两者的区别在于 p e c t i n i ca c i d s 的c 2 和c 3 上至少7 5 的羟基被甲酰化或乙酰化；共性是它们c 5 上所带的羧基都是自由的，没有被酯化。 p e c t i n 即是通常所说的果胶( p m g a ) ，是由p g a 分子c 5 上所带的羧基与甲 醇酯化而成。在过去的七十年，人们逐步建立起了对果胶结构普遍接受的认识1 3 】。 新近的研究表明，天然果胶不是线型分子而是多分支分子，是由d 一1 ，4 一半乳糖醛 酸聚糖为主链，由阿拉伯聚糖、鼠李聚半乳糖醛酸、阿拉伯半乳糖聚糖及木糖等 分别组成氏短不同的侧链。目前已有三种果胶多糖从初生胞壁中分离出来。它们 是均一的聚半乳糖醛酸、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖及取代半乳糖醛酸聚糖。 图1 1 果胶结构示意图 f i g u r e l - 1n l es k e t c hm a po f p e c t i ns t r u c t u r e p r o t o p e c t i n 即是通常所说的原果胶。它不溶于水，而不溶于水的原因较为复 杂【3 j ，一般为以下几种：( 1 ) 果胶分子与细胞壁的其他组分连接在一起，如半纤 维素或纤维素等，其中果胶分子上的羧基可能与这些组份分子上的羟基形成酯 键：( 2 ) 果胶分子与多价金属离子连接在一起，如c a 2 + 、f e ”、f e 弘及m 2 2 一等： ( 3 ) 果胶分子的羧基与蛋白质分子的碱基通过盐的形式架接在一起；( 4 ) 果胶 分子间及果胶与其他胞壁组份间以次价键形式相互缠绕在一起；( 5 ) 与一般的果 第一章绪论 胶分子相比，原果胶的分子量较大。 果胶酶是可以分解果胶质的一类酶。 通常情况下，可根据以下标准对果胶酶进行分类：1 ) 果胶、果胶酸或低聚 半乳糖醛酸是否为其优先底物；2 ) 这些底物是被反式消去还是水解；3 ) 切割方 式是任意的( 内切酶) 还是发生在末端方向的( 外切酶) ：4 ) 作用适宜p h ( 酸 性或碱性) 一】。 据以上分类方法，果胶酶一般可分为以下三种类型： 1 果胶酯酶( p e “n e s t e r a s e ，p e ) 切割果胶上的甲氧基团形成果胶酸。 2 解聚酶( d e p o l y m e r j z i n ge 1 1 z y m e s ) 一类解聚酶专一水解底物的糖苷键，又称果胶水解酶，可分为： 1 ) 聚甲基半乳糖醛酸酶( p o l y m e 也y l g a l a 曲【1 r o n a s e ，p m g ) ：可分为内切酶 ( e n d o p m g ) 与外切酶( e x o p m g ) 。 2 ) 聚半乳糖醛酸酶( p o l y g a l a c t u r o n a s e ，p g ) ：也可分为内切酶( e n d o p g ) 与外切酶f e x o p g ) 。 图1 - 2 果胶水解酶作用方式示意图 f j g u r e l 一2n e s k e t c hm 印o f p o j y g a l a c t u r o n a s ea c t j o nm 枷e r 另一类解聚酶则通过反式消去作用切割d 1 ，4 糖苷键，在半乳糖醛酸非还 原末端形成c 4 和c 5 不饱和键，又称果胶裂解酶，可分为： 1 )聚甲基半乳糖醛酸裂鳃酶( p o l y m e 血y l g a l a c t u r o n a t el y a s e ，p m g l ) ：可分 为内切酶( e n d o p m g l ) 与外切酶( e x o p m g l ) 。 2 )聚半乳糖醛酸裂解酶( p 0 1 y g a l a c m m n a t e1 y a s e ，p g l ) ：亦可分为内切酶 ( e n d o p g l ) 与外切酶( e x o p g l ) 。 江南大学硕士学位论文 碱性果胶酶中试生产和稳定性研究 o o h 0 h h h o c 0 0 口o i 图1 3 果胶裂解酶作用方式示意图 + + + 十+ f i g u r e l - 3t h es k e t c hm a po f p o j y g a l a c t u r o n a t ej y a s ea c t i o nm a n n e r 3 原果胶酶( p r o t o p e c t i n a s e ，p p a s e ) 将原果胶分解为水溶性的高聚合度果胶。可分为f 5 】： a 一型原果胶酶( a p p a s e ) ：作用于原果胶内部区域的聚半乳糖醛酸部位。 2 ) b 一型原果胶酶( b p p a s e ) ：作用于与聚半乳糖醛酸链和胞壁组份( 如纤 维素等) 相连的多糖链。 碱性果胶酶一般指聚半乳糖醛酸裂解酶( p g l ) 【6 j ，其最适p h 在8 l o 。所有 e n d o p g l 都能被c a 2 + 激活，有时也能在一定程度上被m 9 2 + 、c 0 2 + 及s r 2 + 等金属 离子激活，这表明经盐桥连接着的聚半乳糖醛酸链可能是其底物，也就是说，果 胶酸盐是其较为合适的作用底物。当底物的聚合度减小时，裂解酶活性也会随之 降低。e x o p g l 可作用于底物释放出低聚半乳糖醛酸，最小底物可以是三聚糖。 1 1 2 碱性果胶酶的应用及其环保意义 表1 2 棉纤维中各组分的含量 t a b l e1 2c o n t e n to fi n g r e d i e n t si nc o n o n 肋e r s 目前，酸性果胶酶已广泛应用于果胶的提取和酒类的澄清中，而碱性果胶酶 第一章绪论 除在植物病毒的纯化、纸浆漂白等方面得到应用以外，在棉织物的精练过程中具 有重要意义。 棉纤维是一个截面呈圆形，具有不同厚薄的管状植物单细胞，其横断面由 许多同心层组成，主要是角质层、初生胞壁、次生胞壁和胞腔。棉纤维中的天然 杂质主要集中在初生胞壁和角质层中，由于产地及气候等多方面因素的影响，其 组分也会有所差异，各组分的具体含量见表1 2i l “。各组份对于棉纤维细胞的生 长都起到了重要的作用。例如，若在棉花纤维表皮细胞上不含果胶质层，则纤维 就不能在生长时伸长。但同时，它又是影响纤维吸水性的重要因素之一。因此在 棉织物精练工艺中，果胶质及其他一些杂质是主要的处理对象。 在传统工艺中，一般使用氢氧化钠强碱溶液在高温下，有时甚至在超过水沸 点情况下，对退浆后的棉织物进行处理，以除去其表面的非纤维素成份。在此过 程中，必须仔细控制条件，否则棉纤维会因形成氧化纤维素而遭到损伤。另一方 面，棉纤维表面因去除了大量起润滑作用的蜡质而失去应有的手感。但更为重要 的是其对环境所产生的负面影响。传统碱精练工艺中除了要加入大量强碱，还要 加入润湿剂、螯合剂、还原剂和软化剂，并且由于碱精练残液具有很高的p h ， 需要加入硫酸或二氧化碳进行中和，无论是用硫酸还是二氧化碳都会增加排出废 水的盐浓度，使废水具有较高的c o d b o d 】，增加了污水处理的负担。 在世界范围内，由于环境质量的恶化和生态平衡的失调，人们已逐渐关注和 重视凡可能对人体健康有影响的各个方面。许多国家政府从保护本国公民身体健 康的角度出发，相继颁布法规法令，对纺织品上的有毒有害物质从法律上给予限 量或禁止。因此利用酶法进行生物精练就成为实现绿色纺织品生产的趋势之一。 生物酶是一种无毒、环境友好的生物催化剂。生物酶用于染整工业具有很大 的优越性：( 1 ) 作为一种生物催化剂，无毒无害。( 2 ) 处理需要的条件( 温度、p h 值等) 较温和。( 3 ) 用量较少。( 4 ) 反应后释放的酶可继续催化另一反应。( 5 ) 处理产 生的废水可生物降解，既减少污染，又节约能源。( 5 ) 纤维强力不下降、手感柔 软、失重少等1 1 2 1 。 最早，人们利用单一的纤维素酶进行生物精练，这无疑减轻了碱精练过程对 环境的污染。但是这种处理工艺的缺点也是很明显的：棉纤维在处理过程中部分 受损造成强度下降，而且在工艺上需要调节酶反应速度。 棉纤维初生胞壁基质的分布模型认为【9 】，胞壁各处的分布是不均匀的，很可 能在初生胞壁的较外层区域非纤维素基质的浓度最高，而随着向次生胞壁的接近 而逐渐减小。从这一基质分布模型来看，任何能够通过攻击基质中一个或多个组 分而断开基质结构的酶都会对纤维的吸水性具有积极的影响，而果胶质是各种非 纤维基质的黏合剂，如果利用果胶酶攻击棉纤维表面的果胶质，对纤维吸水性的 改善应该具有积极影响陋”j 。在应用过程中，“和h a r d i n 指出【9 j ，果胶酶和纤 江南大学硕士学位论文 碱性果胶酶中试生产和稳定性研究 维素酶的结合使用可以显著改善棉纤维的吸水性。在碱性条件下，作为棉纤维主 体的纤维素有润胀的趋向。而果胶酶降解果胶，分敦纤维，又可极大限度地防止 纤维的降解，同时体系具有天然的抗杂菌污染的能力( 大多数细菌或酶的最适p h 在酸性范围内) 。作用时，碱性果胶酶结合于棉纤维表面，对初生胞壁上的果胶 迅速进行分解，产生水溶性产物，并随之一同扩散开。释放出的果胶酶被重新吸 附到另一个果胶位置上，如此重复，一直到酶在特定的条件下失活为止。与传统 工艺相比，生物法处理后的棉织物更柔软，其原因为处理后的织物表面能保留有 一定数量有益的蜡质，而其又不影响织物良好的吸水性能1 1 ”。 综合上述原因，目前国内外关于碱性果胶酶及其在棉织物预处理中的应用的 研究十分活跃。 1 2 国内外研究动态 果胶酶具有广泛的微生物来源，细菌阻1 引、真菌【1 9 _ 2 1 1 和放线菌f 2 2 】都可以产果 胶酶。但能产生碱性果胶酶并具有工业化使用前景的细菌却为数不多，仅嗜碱芽 胞杆菌( b i c i l l u ss p ) 、萝p 软腐欧文氏菌( e c a r o t o v o r a ) 、放线菌( a c t i n o m y c e s s p ) 【2 3 】及螺孢菌( s p l o s p o r as p p ) 【2 4 】等几种。1 9 7 2 年，k o k ih o m ：o s h i 第 一次用嗜碱细菌制得了碱性果胶酶【2 ”。此后相继有报道，从各种不同的环境中筛 选出了产碱性果胶酶的嗜碱菌，其中，j u n w e ic a o 等人分离出的嗜碱细菌n t t 3 3 所产碱性果胶酶对苎麻脱胶就具有良好的效果口。 近年来，国外对碱性果胶酶的研究主要涉及的方面有：利用基因工程的方法 构建产碱性果胶酶的基因工程菌株：对果胶酶结构的研究；发酵法生产碱性果胶 酶的营养条件的研究等。其中研究最多的是构建产碱性果胶酶基因工程菌。 n o v on o r d i s k 公司于1 9 9 9 年推出用基因工程改造菌种生产的品牌为 b i o p r e p 的碱性果胶酶，随后于2 0 0 3 年又推出一种碱性果胶裂解酶s c o u r z y m e l ，更是将人们更多的注意力集中到该方面来。该酶是通过将产酶基因克隆至芽 孢杆菌中，继而经发酵生产制得。它实质是一种碱性果胶裂解酶，比以前由酸性 霉菌产的多组份果胶酶更为有效。可在p h7 9 ，温度5 0 6 0 的条件下，配以 非离子型表面活性剂与金属离子螯合剂一起使用。由于减少了由化学法处理所带 来的不良品质，通过这种方式处理后的织物的自度及强度大为改善。该果胶酶可 单独使用也可与甲基果胶酯酶一起合用。 曰本近年来也开发出了用于生物精练的碱性原果胶酶。t s a k a i 等人发现， 原果胶可通过一种酶的严格水解后成为可溶于水的高聚合度的果胶分子，这种酶 被称为原果胶酶p 。同时还在芽胞杆菌产生的原果胶酶中分离出一c 、一n 及一r 三 种类型。这三种酶分别作用于不同的部位，协同作用。c 型酶能切断阿拉伯糖与 第一章绪论 果胶分子间的呋哺阿拉伯糖苷键，使果胶从细胞壁上游离出来。n 型和r 型酶 以反式消去反应切断果胶聚合物上糖苷键，释放出果胶分子。为此，他们开发了 一种针对棉织物精练的生物化学工艺，并称之为生物精练( b i o s c o u 血g ) 。 上述两种不同的碱性果胶酶虽然其性质有所不同，但作用机理还是比较相近 的。那就是，先采取各自不同作用方式，使不溶于水的原果胶及果胶酸盐等底物 在温和条件下迅速分解为可溶于水的低聚物或半乳糖醛酸等。当这些作为生物胶 的物质被分解后，初生胞壁上其他非纤维素成份也相继被释放出来，并被表面活 性剂等助剂溶解、分散或乳化。与采用传统工艺相比，利用碱性果胶酶处理的棉 织物中的纤维素未被降解，同时也改善了织物的手感、亲水性及对染料的亲合力 等。 国内从9 0 年代初开始对碱性果胶酶进行研究，主要集中在产碱性果胶酶高 产菌株的选育、摇瓶发酵条件优化、酶学性质的初步研究以及少量的基因工程方 面的研究。在碱性果胶酶的发酵研究方面，大多停留在摇瓶条件优化，小型发酵 罐产酶条件的初步研究上，并没有达到工业化的规模，因此，尽快实现碱性果胶 酶的产业化，对推动我国传统纺织工艺的变革具有重要意义。 1 3 本论文的研究目的与主要研究内容 1 3 t 研究目的 碱性果胶酶作为棉纺织物前处理中不可缺少的酶已引起国内外的广泛关 注。n o v on o r d i s k 公司于1 9 9 9 年推出用基因工程改造菌种生产的品牌为b i o p f e p 的碱性果胶酶，随后于2 0 0 3 年又推出一种碱性果胶裂解酶s c o u i z y m el 。这些酶 进入国内市场后，由于价格较高以及我国棉纺织物的特殊性，并没有能够得到广 泛的使用。国内虽然有很多关于碱性果胶酶研究的报道，但至今没有能工业化生 产，没有符合棉纺织物精练工艺的碱性果胶酶推出市场。因此，本论文的研究目 的为，通过对碱性果胶酶发酵生产、使用特性等的进一步研究，为实现碱性果胶 酶的工业化生产和应用提供基础。 1 3 2 前期研究和存在的问题 本研究室在前期研究中p 1 1 从腐烂的水果表皮分离得到一株产碱性果胶酶菌 株，命名为芽孢杆菌( 口d c 肼淞s p ) w s h b 0 4 一0 2 。芽孢杆菌w s h b 0 4 一0 2 产碱性果 胶酶的合适发酵培养基组成为：玉米淀粉8g ，l ，蛋白胨8 l ，酵母膏1 0 l ， 磷酸氢二钾9 2g l 、磷酸二氢钾3g l 。种龄1 4h 、初始p h7 o 、发酵温度3 7 、 接种量8 、发酵时间2 5h ，7 l 罐转速6 0 0 r p m 。口口c f 胁ss p w s h b 0 4 一0 2 所产碱 江南大学硕e 学位论文 碱性果胶酶中试生产和稳定性研究 性果胶酶的适宜温度范围为5 5 6 6 ，适宜p h 范围为9 4 98 ，；在p h 7 5 时， 温度稳定范围为2 5 4 5 。 通过前述研究发现，要实现碱性果胶酶的工业化生产，并在棉纺织工业上得 到真正的应用，还存在很多问题： 1 、发酵培养基中全部使用有机氮源，成本较高，不能满足工业化生产的要 求，必须降低原料成本。 2 、虽然酶反应的适宜温度较高，但酶在5 5 6 0 下稳定性很差，严重影响 酶在棉织物精练工艺中的使用，需要对酶的使用稳定性加以改进。 1 3 3 主要研究内容 本论文研究内容是国家“8 6 3 ”高技术发展计划“用于纺织工业清洁生产的高 效生物催化剂的制备技术”( 8 6 3 2 0 0 3 a a 3 2 2 0 5 0 ) 子课题的一部分，主要研究工作 包括： 1 、以适应工业化生产为目标，对发酵生产碱性果胶酶的碳源和氮源的种类和利 用方式进行进一步研究； 2 、在实验室小试基础上，进行发酵法生产碱性果胶酶的生产性放大试验； 3 、碱性果胶酶的保藏稳定性及其在纺织生产中的应用稳定性研究。 第二章芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶的培养基优化及碳源利用方式的研究 第二章芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶的培养基优化及碳源 利用方式的研究 2 1 前言 产品要实现工业化，要求高品质、低成本。产品的生产成本包括原料成本、 操作成本等。生产碱性果胶酶的原料中氮源部分全部使用复合氮源蛋白胨、酵母 膏，成本很高，因此本章在原培养基的基础上，尝试用价格低廉的合成氮源来代 替部分有机氮源，以降低生产成本；此外，在前期研究中发现，由于碳源消耗过 快，使菌体过早自溶，影响了产酶的进一步提高；因此本章在优化后的培养基基 础上又研究了增加初始碳源浓度和碳源的不同补加方式对产酶的影响。 2 2 材料和方法 2 2 1 菌种和试剂 芽孢杆菌w s h b 0 4 一0 2 ，由武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 c c t c cn o ；m 2 0 4 0 8 2 。 聚半乳糖醛酸( p g a ，丘o mo r a n g e )s i g m a 公司 蛋白胨上海上食肉类有限公司 酵母膏广东一品鲜公司 玉米淀粉无锡润生淀粉油脂公司 其余化学试剂均为国产分析纯 2 2 2 仪器 台式高速离心机 电热恒温水浴锅 回转式恒温调速摇瓶柜 立式圆形压力蒸气灭菌锅 紫外分光光度计u v 3 0 0 0 2 2 3 培养基 美国礼来亚洲公司 江苏省医疗器械厂 上海医疗工业研究所 上海医用核子仪器厂 日本岛津公司 223l 斜面培养基( g l ) ：葡萄糖1 0 、蛋白胨5 、牛肉膏5 、氯化钠5 、琼脂2 0 9 江南大学硕士学位论文 碱性果胶酶中试生产和稳定性研究 p h7 ，o 。 2 2 3 2 种子培养基( l ) 磷酸二氢钾6 ，p h7 o 。 2 l 3 发酵培养基( g ，l ) 磷酸二氢钾3 ，p h7o 。 2 2 4 培养方法 蔗糖2 0 、蛋白胨l o 、玉米浆3 0 、磷酸氢二钾1 8 4 、 玉米淀粉8 、酵母膏1 0 、蛋白胨8 、磷酸氢二钾92 、 2 2 4 1 斜面培养：将冰箱中的保藏菌种接入斜面培养基，3 7 恒温箱培养2 4h 。 22 42 种子培养：将保藏好的菌种接入种子培养基中，5 0 0m l 三角瓶装5 0m l 培 养基，回转式摇床转速2 0 0r m j n ，3 7 ，培养1 4h 。 2 2 4 3 摇瓶发酵培养：种子以8 ( v v ) 的接种量接入发酵培养基中，回转式摇 床转速2 0 0r m i n ，3 7 ，培养2 4h 。无特别说明，装液量均为2 5 0m l 三角瓶中 装2 5 m l 。 2 2 4 4 7 l 发酵罐培养：全自动发酵罐k b t7 l ( k o b i ot e c h c o ，l t d ，韩国) 装液量 4l ，接种量8 ( v v ) ，搅拌转速6 0 0 “m i n ，通气量1 ：1 ，温度3 7 。 2 2 5 分析方法 225 1 碱性果胶酶粗酶液制备 取一定量发酵液于1 0 0 0 0 币州i i l i n 5m i n 离心，上清液作为碱性果胶酶活性 测定的样品。 22 52 碱性果胶酶活性测定 反应体系中包括粗酶稀释液2 0u i ，含o 2 聚半乳糖醛酸的甘氨酸一n a o h ( 0 2 m o l l ) 缓冲液( p h9 4 ，含有o4 4m m o l ，l 的c a c l 2 ) 2m l ，以无活性的酶液作 为空白对照，以含底物的缓冲溶液的加入起动酶促反应；反应条件为4 5 反应 15m i n ，用3m 1o0 3m o l ，l 的磷酸终止反应，在2 3 5n m 处测定其吸光度值。 一个标准酶活单位( 1 u ) 定义为：每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1 um 0 1 的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。 酶活计算： 酶活=0 d ! ，1 0 6 稀释倍数混合液体积 1 0 3 ，4 6 0 0 6 酶液体积 式中：4 6 0 0 ( l m o l c m 。) 不饱和聚半乳糖醛酸在2 3 5n m 处的摩尔吸光系数 1 2 哪 t ( m i n ) 一酶促反应时间( 在酶反应的线性范围内) 1 0 第二奄芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶的培养基优化及碳源利用方式的研究 b ( c m ) 一比色杯厚度 2 2 5 3 菌体干重测定 采用细胞干重法。取一定量发酵液于1 0 0 0 0r p m m i n 5m i n 离心，菌泥于 1 0 5 烘至恒重，称重。 2 2 54 还原糖测定 采用d n s 法。取稀释后的粗酶液2m i ，向其中加入d n s 试剂1 5m i ，立即 在沸水浴中加热反应5 分钟，然后立即用流动冷水冷却至室温，再向其中加入蒸 馏水2 1 5m l ，混匀后在分光光度计5 2 0n m 处测定其吸光度值。 2 2 5 5 动力学参数计算 底物的比消耗速率( q s ) 、细胞比生长速率( p ) 和碱性果胶酶的比合成速率 l 西l 一船 1 硝1 硝1d p 1 一a p ( q p ) 分别根据式2 i i 2 i j 婴i 、2 i i 2 i 2 婴百和卧2 i i 。i 旦婴面计 算而得。用o r i g i n a l7 o 绘图软件对实验数据进行插值计算( 时间间隔为0 1h ) ， 再用e x c e l 软件求解不同时刻的q s 、斗和q p 。 2 3 结果和讨论 2 3 1 不同无机氮源对发酵生产碱性果胶酶的影响 3 o 蛭 避 a b cd e f 氮源 图2 ，l 各种无机氮源对发酵生产碱性果胶酶的影响 f i g i l r e2 1e 行e c to f d i 髓r e n tn i 仃o g e ns o u r c e so np g la c t j v 时 a ：硫酸铵；b ：氯化铵；c ：硝酸铵；d ：磷酸氢铵：e ：尿素；f ：硝酸钠 氮源是微生物生长和合成产物所需氮元素的来源，前期研究发现，芽孢杆菌 b