（发酵工程专业论文）红曲多糖的发酵生产及提纯.pdf

摘要 摘要 红曲是一种“药食同源”的典型代表真菌，红曲培养物具有多种生理活性物质，近来 新发现红曲多糖是一种具有免疫调节、保肝解毒功效的活性物质，本文对红曲菌液态发 酵生产多糖的工艺条件、红曲多糖提取纯化和结构的初步鉴定进行研究。 通过对实验室8 株红曲菌进行筛选，得到一株多糖含量较高的红曲菌z k o a ；优化后 的液态发酵培养基为：蔗糖4 0g l ，酵母粉4 5g l ，k _ i - 1 2 p 0 4 3 h 2 03 5g l ，m g s 0 40 4 g l ，植物油2m l l ：优化发酵工艺后得到的发酵条件是：接种量8 ，种龄3 0h ，发酵 液起始p h 5 0 ，发酵时间9 0h 。在此条件下，红曲多糖的产率最高可达7 6g l 。在搅拌速 率为1 7 0r m i n ，通风量为2 2 n l m i n 的条件下，2 0l 发酵罐中红曲粗多糖含量可达n 7 3 4 g l , 在此条件下，发酵液中红曲多糖的含量( 聊与菌体量的关系为= 0 0 0 0 7 x 6 1 8 孵。 实验研究了红曲多糖的脱蛋白工艺，工艺路线为：发酵液在6 0 下浓缩至原体积的 1 5 一乙醇沉淀得粗多糖一复溶去不容物一上清液用等电点法脱蛋白，去沉淀- - - 0 2 的 木瓜蛋白酶4 5 酶解3 h - - - s e v a g 法脱蛋白一得到无游离杂蛋白的多糖溶液。 脱蛋白后多糖溶液中加入4 倍体积的工业酒精，沉淀多糖，沉淀物干燥后为白色， 色素和其他小分子物质基本得到脱除。 用d e a e 纤维素层析纯化多糖提物，依次用纯水、o 2m o l l n a c l 、0 4m o l l n a c i 、 0 6m o l ln a c l 洗脱，可以得到三个不同等级分子量的多糖，其中两种测得分子量分别 为6 2 7 7 4d 和7 4 6 5 3d 的级分有紫外吸收，可初步判断是蛋白糖；分子量为2 0 0 0d 的 多糖组分有不同的带电情况。h p l c 测定单糖组分，得出此红曲多糖组分中含有葡萄糖 和半乳糖。 关键词：红曲菌发酵红曲多糖脱蛋白纯化离子交换层析h p l c 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t n l ef u n g im o n a s c u sh a sb e e nu s e df o rp r o d u c t i o no fd r u ga n df o o da d d i t i v e sf o ral o n gt i m e v a r i o u sp h y s i o l o g i c a la c t i v es u b s t a n c e si nm o n a s c u sc u l t u r eh a v eb e e nf o u n d o n eo ft h e m ， t h em o n a s c u sp o l y s a c c h a r i d e ，h a st h ef u n c t i o n so fi m m u n o m o d u l a t o ra n dd e t o x i f i c a t i o nt o p r o t e c tl i v e r i nt h i sd i s s e r t a t i o n , t h et e c h n i q u e sf o rp r o d u c t i o no fm o n a s c u sp o l y s a c c h a r i d e s t h r o u g hl i q u i df e r m e n t a t i o nb ym o n a s c u s ，r e c o v e r ya n dp u r i f i c a t i o no ft h ep o l y s a c c h a r i d e s w e r ei n v e s t i g a t e d 1 1 1 es t r a i nm o n a s c u sz k o aw i t hh i g h e rp o l y s a c c h a r i d ey i e l dw a ss e l e c t e da f t e rc o m p a r i n g t h ep r o d u c t i o ny i e l d sb ye i g h tm o n a s c u ss t r a i n s o p t i m i z a t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m r e s u l t st h ec u l t u r em e d i u mf o r m u l a t i o na sf o l l o w s ：s u c r o s e4 0 9 l ，y e a s te x t r a c t4 5 9 l ， k h 2 p 0 4 3 h 2 03 5g l ，m g s 0 40 4g l ，v e g e t a b l eo i l2m l l mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w e r eo p t i m i z e da s ：s e e dc u l t u r ea g ew a s3 0h ，i n o c u l a t i o nv o l u m e8 ，i n i t i a lp ho f f e r m e n t a t i o nm e d i u mi s5 0 t 1 1 ef e r m e n t a t i o nl a s t sf o r9 0h t h eh i g h e s ty i e l do f m o n a s c u s p o l y s a c c h a r i d e sc o u l dr e a c h7 6g l i n2 0lf e r m e n t e r , t h ey i e l do fm o n a s c u sp o l y s a c c h a r i d e s c o u l dr e a c h7 3 4g lu n d e rt h ec o n d i t i o no fa g i t a t i o nr a t e17 0r m i na n dv e n t i l a t i o nr a t e2 2 n l m i n ； i nt h a tc o n d i t i o n ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec o n t e n t so fm o n a s c u sp o l y s a c c h r i d e s ( 叨w i t h t h eb i o m a s s ( x ) i nt h ef e r m e n t a t i o nl i q u i dc a nb ee x p l a i n e da s 形= 0 0 0 0 7x 6 1 8 9 8 。 1 1 1 ct e c h n i q u e sf o rd e p r o t e i n a t i o no fm o n a s c u sp o l y s a c c h r i d e sw e r ei n v e s t i g a t e d ，t h ep r o c e s s w a s ：t h ef e r m e n t a t i o nb r o t hw a sc o n c e n t r a t e dt o1 5v o l a tw a t e r - b a t hb e l o w6 0 一也e e t h a n o lw e r ea d d e dt oo b t a i nc r u d em o n a s c u sp o l y s a c c h r i d e s - - a d d e dw a t e rd i s s o l v e d a g a i n - - - r e m o v e dt h e i n s o l u b l em a t t e r s - - - , t h es u p e m a t a n tw a st r e a t e dt od e p r o t e i n i z eb y i s o e l e c t r i cp r e c i t i t a t i nm e t h o d ，r e m o v e dt h ep r e c i p i t a t i o n - - - , t h es u p e r n a t a n tw a st r e a t e db yp a p a i n ( 0 2 b yw v ) a t4 5 f o r 3 h - - - a d d e ds e v a gr e a g e n tt or e m o v et h ep r o t e i n si nt h es u p e m a t e f l u i d 叶t h em o n a s c u sp o l y s a c c h r i d e sc o n t a i n sn of r e eo t h e rp r o t e i nw a so b t a i n e d a d d i n g4t i m e sv o l u m eo f9 5 e t h a n o lt ot h ep o l y s a c c h r i d ec o n c e n t r a t e st op r e c i p i t a t et h e p o l y s a c c h r i d e s 砀ep r e c i p i t a t e sw e r ew h i t ei nc o l o r ，i n d i c a t i n gt h em o n a s c u sp i g m e n t sa n d o t h e rs m a l lm o l e c u e sw e r er e m o v e d m o n a s c u sp o l y s a c c h a r i d e si nt h ec r u d ep r e p a r a t i o n sw e r ef u r t h e rp u r i f i e db yd e a e - c e l l u c o s e c h r o m a t o g r a p h y e l u e n tu s e dw e r ep u r ew a t e r , 0 2m o l ln a c l ，0 4m o l ln a c l ，o 6m o l l n a c l - r e s p e c t i v e l y t h r e ek i n d sp o l y s a c c h a r i d ew e r eo b t a i n e db ya b o v em e n t i o n e dp r o c e s s w e f o u n dt h e r ea r et w ot y p e so fp r o t e i n - p o l y s a c c h a r i d ew h i c hh a v ea b s o r p t i o ni nu vr a n g e ，a n d t h e i rm o l e c u l a rw e i g h tb e i n g6 2 7 7 4 da n d7 4 6 5 3 d ，r e s p e c t i v e l y t h em o l e c u l a rw e i g h to f a o t h e rp o l y s a c c h a r i d ew a s2 0 0 0 d ，a n dt h i sp o l y s a c c h r i d ec a r r i e sd i f f e r e n tc h a r g e a n a l y s i s r e s u l t su s i n gh p l cs h o w e dt h a tg l u c o s ea n dg a l a c o s e w e r et w o c o m p o n e n t s o f p o l y s a c c h a r i d e ，谢t 1 1t h ep r o p o r t i o no f1 9 8 ：1b a s e do n t h e i rp e a ka r e a s k e y w o r d s ：m o n a s c u s ；f e r m e n t a t i o n ；m o n a s c u sp o l y s a c c h a r i d e ；d e p r o t e i n a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ； i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ；h p l c 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：i _ 匀：幺熟队日 期： 哇! 鱼：鱼：么 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 1 多胞1 | 莎。 0 第一章前言 弟一草刖吾 1 1 多糖及其生理功能 多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，分为由同种单 糖构成的同型多糖和由不同单糖构成的异型多糖。许多多糖还与脂类，蛋白或者肽类结 合成多糖复合物；多糖具有分子大小不均一的特点，通常有好几个不同大小的分子量级 分，从几千到几万甚至几十万不等，一般需要通过分级纯化才能得到具有相同分子量大 小的单一组分，有的多糖链上还连有肽链或者脂类等物质。 多糖生物学功能的认识经历了一个反复的复杂辨证认识过程，多糖是所有生命有机 体的重要组成部分，在生物体内不仅作为能量资源和构成材料，而且存在于一切细胞膜 结构中，参与细胞各种生命现象的代谢活动，是继蛋白质、核酸与脂类之后，又一种被 人们广泛关注的生物大分子。自2 0 世纪5 0 年代末人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来 u j ，多糖作为生物活性物质的研究受到日益广泛的重视。近2 0 年来，由于生物学、化学 等学科的飞速发展，人们对多糖及其复合物的活性作用有了越来越深入的认识，多糖逐 渐成为生物学研究领域中的新的热点。研究表明，多糖主要是通过非特异性途径提高机 体对抗原或微生物特异性反应，所以它们常是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞 间信息的传递和感受的关键因子，被称作“生物应答效应剂”( b i o l o g i c a lr e s p o n s e m o d i f i e r s ，b r m ) e 2 】，可调控细胞分裂和分化，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒 等药理作用 3 1 ，用来治疗免疫性缺陷疾病和临床治疗引起的免疫功能下降等疾病，是中 药主要活性成分之一。多糖的生物学活性特点，特别是天然多糖以其疗效显著、无毒副 作用等优点引起人们极大的兴趣，有关研究已渗透到生物学各个领域。 多糖的对肿瘤的治疗作用表现在诱导肿瘤的凋亡，抑制肿瘤细胞生长和转移。真菌 多糖对肿瘤细胞有直接的细胞毒活性，在体外可直接杀死癌细胞，而对正常动物细胞无 杀伤作用，这是其与其它细胞毒性抗肿瘤药物相比具有优势的地方之一；茯苓多糖可提 高细胞膜唾液酸的含量，降低磷脂含量，改变细胞膜中性酯的脂肪酸组成，通过改变细 胞膜生化特性，影响肿瘤细胞新陈代谢而发挥抗肿瘤作用；多糖药物还可以作为辅助药 物以增强抗癌药物的药效，减轻痛症患者放射化疗后的副反应等 4 1 。 多糖有很好的免疫调节活性，主要通过单核巨噬细胞、细胞免疫系统和体液免疫系 统几个层次的作用而提高集体免疫力1 5 j 。它能促进巨噬细胞的合成，并能显著增强小鼠 腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用。给小鼠灌喂红曲多糖，可提高腹腔巨噬细胞吞噬能力， 增加体内淋巴细胞转化率，使非特异性免疫加强，由于巨噬细胞又是特异免疫性的诱导 细胞和效应细胞，它的功能也直接影响着特异性免疫强弱【6 1 。 真菌多糖对心血管也有良好的生物学效应，主要体现在降血压、血脂、血糖、降低 胆固醇和抗血栓等方面，多糖还有抗病毒、消炎、保胃护肝、抗自由基氧化等多种作用。 多糖有较好的生物学活性，但是大部分多糖因为结构复杂，分子量较大，粘度高， 溶解性差，人体不能很好吸收等限制，多糖的研究并不像研究蛋白质和酶一样深入，一 直以来都处于很浅的层面上，但是随生物学、化学等各种研究方法的进步，糖类结构测 江南大学硕士学位论文 定和生物活性研究取得了明显的进展，研究人员发现多糖的各种生物学活性是与多糖的 分子结构和某些特定基团有关，认为多糖像蛋白和酶一样可能在多糖分子中存在一个或 几个寡糖片断的“活性中心”，通过对多糖的某一片段或基团的改变，可以达到增强或改 变多糖活性的目。1 9 8 1 年，德国人通过硫酸酯化木聚糖，研究出一种新的治疗爱滋病等 的药物，临床试用疗效显著，并申请了专利，此后国内外发起了多糖分子修饰的热门研 究。近来研究人员通过分子修饰手段，改变多糖的结构，多糖表现出原多糖没有的其他 药理活性，多糖的研究与应用有了很大的突破。 在真菌多糖结构的分子修饰中常用的改造方法有：降解、硫酸酯化、脱硫酸化、乙 酰化、烷基化等，有可能大大提高多糖的生物活性。其他修饰方法，如磷酸酯化、硬脂 酰化、棕榈酰化、二乙基氨基乙基化、羧甲基化、羟乙基化、碘化、氨化等在多糖分子 修饰中也有运用【7 1 。不同的改造方法对其生物活性的影响各不相同，如香菇本身只有抗 肿瘤活性，但硫酸化后则又具有抗h i v 活性，可抑制由h i v 1 产生的细胞裂变1 8 j 。天然 甘露聚糖没有活性，但在硬脂酰化和磷酸酯化后获得抗肿瘤活性，右旋葡聚糖在棕榈酰 化和磷酸酯化后也具有抗肿瘤活性。多糖经过适当地降解或化学修饰后，提高其活性， 又或者因此降低了分子量却不影响活性，又易于被人体吸收，在临床上多糖制剂得到了 广泛的开发应用。 1 2 多糖的应用 各类多糖中，微生物多糖研究得比较多。微生物多糖又可分为胞内、胞壁和胞外多 糖。微生物胞外多糖与其它微生物工程产品一样，具有地理条件的影响、生产周期短以 及产品结构、性能稳定的优点，可通过深层发酵而实现工业化生产。多糖用途也广，除 了作为药物用于治疗方面，还作为凝固剂、润滑剂、增稠剂、絮凝剂、悬浮剂、凝胶剂、 添加剂等广泛应用于化工、食品、石油、纺织印染、水处理和医药等工业。黄原胶 c x a n t h a n g u m ) ，由于该多糖具有很高的黏度、流动触变性和稳定的理化性质，广泛应用 于食品、医药、采油、纺织、陶瓷、印染、香料、化妆品及消防等领域。研究的较多的 还有桑黄多糖、结冷胶( g e l l a n g u m ) 、热凝多糖( c u r d l a n ) 、小核菌葡聚搪( s c l e r o g l u c a n ) 、 短梗霉多糖( p m l u l a l l ) 【9 - 1 2 j 等。这些产品大多被作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等， 成功地应用于食品、制药、石油、化工等领域。在生物活性研究领域中，通过对多糖的 结构改造，多糖的应用方式也不再局限于针剂，多糖已被制成各种口服液、胶囊、保健 酒等，多糖类保健品得到了较大的开发。但是被广泛认可的微生物多糖大都为胞内多糖 及其复合物，如香菇多糖、裂褶多糖、海藻多糖等，而被成功应用的微生物胞外多糖尚 不多见，目前报道的仅有乳酸菌胞外多糖【1 3 1 、灵芝多糖【1 4 1 、热凝多糖【1 5 1 等少数几种， 红曲多糖的研究也只是近来被人关注。因此，对具有生物活性的微生物胞外多糖的研究 与开发就显得尤为重要。 1 3 红曲多糖的研究现状 红曲菌是我国劳动人员最早发现并应用于食品医药的微生物，是一种腐生真菌，属 2 第一章前言 真菌i ( e u m y c o p f y t a ) ，子囊菌亚门( a s c o m y c o t i n a ) ，子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) ，不整子囊菌 目( p l e c t o m y c e t e s ) ，曲霉科( b u r o t i c e a e ) ，红曲霉属( m o n a s c u sv a n7 7 e g h e m ) 【1 6 j 。 红曲菌在我国有着悠久的应用历史，在古代称为“丹曲 ，是一种“药食同源”的典 型代表真菌，具有抗菌、解毒、消食、健脾等功效。近年来的研究发现：红曲还具有降 血压降血脂和降胆固醇的作用。但是，关于红曲的生理功能及其活性有效成分，却一直 不清楚。自从m o n a c o l i nk ( 莫那可林) 发现以来，红曲菌的药理价值引起了国内外学者的 关注，近年来，运用现代化生物技术、化学方法对红曲里的生物活性物质进行提取分离、 分析和鉴定，对红曲中多种功能成分( 胆固醇抑制剂、降血压降血糖物质、麦角甾醇和 抑菌活性物质等) 进行了多方面的研究。 1 9 9 8 年，田军等人首次发现了红曲中发酵液中存在大量的红曲多糖，并对红曲多糖 进行了报道，这在国内外亦属首次报道。田军还对红曲胞外多糖的提取工艺、结构和理 化性质进行了深入的研究l l 。研究表明：通过葡聚糖凝胶s e p h a d e xg - 2 0 0 可以对其进行 分离纯化，得到较纯的红曲多糖；通过硅胶薄层层析和气相色谱、红外光谱，核磁共振 氢谱等色谱与光谱技术基本确定了红曲多糖的结构组成，红曲多糖分子中是以1 3 位糖 苷键为主，同时亦含有1 2 和1 - 6 位糖苷键；同时红曲多糖的理化性能很好，粉末状，易 溶于水，水溶液粘稠，急性毒性试验l d s o 表明安全可靠。吉林大学的张建峰【6 】等人进行 了红曲多糖的免疫活性等方面的探索：给小鼠不同剂量的红曲多糖，一段时间后测量体 重，肝、脾、肾、心、肺等脏器的重量，计算脏体指数，同时测量了s g o t ，s g p t 含 量。实验结果表明红曲多糖能提高机体的巨噬细胞吞噬能力，增加体内淋巴细胞转化率， 使非特异性免疫加强，有利于免疫能力的提高；通过毒理实验得出，红曲多糖对二硝基 氯苯所致机体的迟发型超敏反应有显著的抑制作用，对三氯甲烷造成的急性肝损伤有一 定的抵抗作用，对小鼠的体重没有不良影响，对肝脏、肾脏、心肺没有毒害作用。通过 一系列实验研究，证明红曲多糖同其他的真菌多糖一样具有提高免疫力、保肝解毒等作 用。赵树欣【l 剐等人也从红曲培养物中分离到一种物质，采用活性炭将红曲中的色素完全 脱去后，并通过h p l c 检测证实该脱色液中无桔霉素存在。抑菌试验显示该样品仍然具 有抗菌作用，从而证实了红曲中除桔霉素和色素之外，还存在其他的抗菌物质。经试验 初步认定该物质属于糖与小肽通过糖肽键相联的糖结合性肽，即糖肽。对该糖肽物进行 抑菌实验，结果显示有抑菌作用；说明红曲中存在一种糖肽类的抗菌物。丁红梅【1 9 】等人 对红曲多糖的抑肿瘤作用进行了研究，表明红曲多糖低、中、高剂量组均能抑制荷瘤小 鼠的肿瘤生长，抑瘤率呈量效关系，对s 1 8 0 肉瘤生长有明显的抑制作用；红曲多糖能提 高小鼠的免疫力，高剂量组免疫器官质量显著增加。研究表明红曲多糖有抗肿瘤作用， 具有较高的开发价值。 红曲胞外多糖作为一种具有较高的医疗、保健价值的微生物多糖，是一类具有开发 潜力的功能性活性物质，含量的提高有利于对其产品的开发和经济效益的提高。红曲可 以通过深层发酵而实现工业化生产，通过发酵法生产红曲多糖，周期短，一般发酵时间 为4 天。但是在国内国外对红曲多糖的研究起步晚，研究少，尤以其红曲多糖的得率较 低这一严峻问题制约着红曲多糖产品的开发，国内对红曲多糖进行的提高含量的研究亦 3 江南大学硕士学位论文 屈指可数，江南大学的赵振峰对一株多糖产生菌发酵培养条件进行优化后，含量达到 3 2 4g l 【2 0 1 ，吉林大学的张建峰对一株红曲菌进行u v 诱变筛选，并对其摇瓶培养条件 进行优化后，使其含量大幅提高，达到5 5 3g l t 6 1 ，但相对与红曲多糖的医疗保健用途 用量来说，含量还是很低，目前红曲多糖的生产工艺条件有待于进一步优化；其高级结 构、医疗价值以及红曲多糖产品的研发还有待于深入发掘，这需要生物学、化学、药学 等各领域的研究人员的共同努力。 1 4 立题意义和实验内容 国内对红曲多糖的发酵生产工艺还处在探索阶段，通过对红曲菌菌种的诱变选育， 对其培养基优化和发酵工艺条件的研究探索，发酵液最高含量可达到5 5 3g l ，尽管多 糖含量有所提高，但相对于原料消耗及生产效率而言，还有进一步提高的必要；而且红 曲菌在生产多糖的同时也伴随着色素和多种蛋白质的生产，这将加重多糖的提取纯化工 艺困难，所以有必要在发酵过程中提高多糖含量的同时，也要尽量提高多糖的提取率和 精制率，减少提取纯化过程中的损失。本文的主要研究内容是筛选出高产多糖而低产色 素的菌种，并对红曲发酵工艺、提取纯化工艺进行研究，以尽可能地得到更多的红曲多 糖，主要对以下几个方面着手进行研究： ( 1 ) 红曲菌种的筛选，选出多糖含量高而色素较低的红曲菌株； ( 2 ) 高产多糖红曲菌株的培养基和工艺条件的优化； ( 3 ) 红曲多糖的提取纯化工艺研究； ( 4 ) 红曲多糖分子量和多糖组分测定。 4 第二章红曲多糖的发酵培养基优化 第二章红曲多糖产生菌的筛选及发酵培养基优化 微生物代谢产物的生产水平受到生产菌种本身性能的影响，还与其生长的环境有关。 培养基是菌丝体赖以生存的营养条件和进行物质、能量交换的场所，培养基的组成及组 分含量对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离纯化、乃至产品的质量和含量都 有重要的影响。培养基中的营养成分包括碳源、氮源、无机盐和维生素等营养物质，碳 源是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素又是提供微生物生命活动中所需能源的原料， 氮源主要用来构成细胞物质和代谢产物，无机盐和维生素作为微生物生理活性物质的组 成或生理活性作用的调节物。由于菌种不同、菌种生长阶段不同、培养目的不同以及发 酵工艺条件的差异，所使用的培养基亦是不同的，因此有利于菌体生长和产物合成的最 佳发酵培养基配方也不同。 红曲多糖这样一类有着较高医疗保健价值的活性物质，含量的提高对其产品的研究 与多糖成品的开发应用有着重要的意义。通过控制培养基的成分与含量，研究出最适合 红曲产多糖的培养基。作者从本实验室保藏的众多菌种中筛选出一株产量较高的红曲多 糖产生菌，并对其发酵培养基进行优化，提高红曲多糖的含量。 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种 实验室保藏的菌种：红曲菌z k o a 、j j l ，y - 4 a 、z h 6 、s p 3 4 8 3 4 、z k 1 、5 a 、s j s 3 0 、 s j s 一3 4 共8 株色素低产菌。 2 1 2 培养基 ( 1 ) 斜面培养基( p d a ) ：马铃薯2 0 0g ( 加水煮沸3 0r a i n ，过滤取上清液) ，葡萄糖2 0 g ，琼脂2 0g ，定容到1 l ，p h 自然。 ( 2 ) 种子培养基：葡萄糖4 0g ，大豆水解液1 2 0m l ，n a n 0 32 5g ，k h 2 p 0 4 3 h 2 02g ， m g s 0 41 0g ，玉米浆1 5m l ，加水定容到1 l 。 大豆水解液的制作：黄豆1 0 0g ，浸泡2 4h ，打成豆浆，取浆液，定容到1 l ，加入 1g 中性蛋白酶，3 7 水解4h ，冰箱保存备用。 ( 3 ) 摇瓶发酵培养基：葡萄糖6 0g ，n a n 0 32 5g ，k i - 1 2 p 0 4 3 h 2 02 5g ，m g s 0 40 2 5g ， 水1 0 0 0m l ，p h 自然。 所有的优化实验均在( 3 ) 的基础上进行成分的改变。 2 1 3 主要试剂 葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、甘油、k a l l 2 p 0 4 3 h 2 0 、m g s 0 4 、n a n 0 3 、( n h 4 ) 2 s 0 4 、 n h 4 c l 、蛋白胨。以上均为分析纯，国药集团试剂有限公司； 大豆、马铃薯，市售； 酵母粉、琼脂，化学试剂，国药集团试剂有限公司； 工业酒精( 9 5 ) 、大豆油( 市售) ； 5 江南大学硕士学位论文 2 1 4 主要仪器及设备 恒温培养箱、恒温水浴锅、恒温回旋式摇床、超净工作台、电子天平、立式圆形压 力蒸汽灭菌锅、冰箱、烘箱。 2 1 5 实验方法 ( 1 ) 孢子悬浮液的制备：取斜面菌种1 支，挑取菌层面加入到装有玻璃珠的无菌水 中，充分振荡3 0r a i n ，镜检孢子数为2 9 5 x1 0 6 个m l 左右。 ( 2 ) 种子液的培养：取胞子悬浮液5m l ，接种到5 0 0m l 瓶装的1 0 0m l 的种子培养 基中，3 2 往复式摇床，转速1 3 0r m i n ，培养2 4h 。 ( 3 ) 菌种筛选发酵培养：将种子液接入到基础发酵培养基中，接种量为8 ，5 0 0m l 三角瓶装液量为1 0 0m l ，转速1 8 0r m i n ，3 3 培养9 6h 。 ( 4 ) 红曲胞外多糖的测定：重量法【2 0 j 将发酵液8 层纱布过滤，离心弃沉淀，滤液在6 0 以下水浴真空旋转蒸发浓缩至原 体积的1 4 ，加入4 倍体积的工业酒精，4 c 沉淀1 2h ，去上清液，沉淀物于6 0 以下烘 箱内烘干至恒重，称重。 对每一组实验都做2 个平行样，取其平均值，考察各因素变化对多糖含量的影响。 ( 5 ) 色素测定及含量计算：取发酵液过滤取5m l ，7 0 乙醇定容到5 0m l ，6 0 恒 温水浴2 h ，每3 0r a i n 混匀一次，以7 0 乙醇做空白，测o d 5 0 5 。 色价= o d 5 0 5 稀释倍数( u m l ) 2 2 结果与讨论 2 2 1 红曲菌种筛选结果 菌种质量是发酵生产水平的重要因素，菌种质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗 传特性和培养条件两方面。本文选定2 1 1 中的8 株低产色素菌作为备选菌株，是由于 红曲菌在一定程度上都能产生色素，只是色素的产量高低不一，同时本文研究的是红曲 胞外多糖，太多的色素会对后续提取纯化造成困难，所以本文以低产色素和高产红曲多 糖作为指标，筛选合适的红曲多糖产生菌。 按2 1 5 中的培养方法，对8 株菌进行筛选，培养基见2 1 2 ( 3 ) ，结果如图2 1 所示： 6 第二章红曲多糖的发酵培养基优化 l234，67 g 菌株 1 z k o a2 j y a3 z h 6 4 s p 3 4 8 3 4 5 z k - 16 5 a 7 s i s - 3 0 8 s j s - 3 4 图2 18 株红曲菌的多糖含量 f i g 2 1t h ep o l y s a c c h a r i d ey e i l do f8s t r a i n so f m o n a s c u ss p p 实验中的8 株红曲菌的产色素能力都很低，色素含量如表2 1 所示： 表2 18 株红曲菌的色素含量 t a b l e 2 - 1t h er e dp i g m e n ty e i l d so f8m o n a s c u ss t r a i n s 菌株名称 色价( u m l ) 红曲菌z k o a 红曲菌j 几y 4 a 红曲菌z h 6 红曲菌s p 3 4 8 3 4 红曲菌z k 1 红曲菌5 a 红曲菌s i s 3 0 红曲菌s s 3 4 如图2 1 和表2 1 所示，在液态摇瓶发酵条件下，以上8 株菌都能产生多糖和色素， 但是含量相差较大，其中红曲菌z k o a 的红曲多糖含量最高，达到4 4g l ，同时红曲 菌z k o a 的色素含量较低，只有2 5u m l ，所以，本实验以红曲菌z k o a 为进一步实 验的菌种。 2 2 2 碳源对多糖含量的影响 碳源是微生物生长代谢最重要的营养物质之一，它是构成菌体和代谢产物结构，为 菌体生命活动提供能量的最重要的物质。红曲菌能利用单糖、双糖、多糖等多种碳源进 行生长代谢。本文选择葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、甘油为碳源进行实验，浓度均为 6 0g l ，结果如图2 2 所示： 7 j 4 3 2 1 t-1暑)曩假参 巧记仉弱驺拍墙记 江南大学硕士学位论文 5 4 5 4 o 3 3 5 曙 墨 3 2 j 2 l234j 碳源种类 1 葡萄糖2 麦芽糖3 糊精4 蔗糖5 甘油 图2 - 2 碳源种类对红曲产多糖的影响 f i g 2 - 2e f f e c t so f c a r b o ns o u r c e so nt h ep o l y s a c c h a r i d cy e i l d 如图2 2 所示，红曲菌z k o a 在以蔗糖为碳源时，红曲多糖的含量最高，达到4 8g l ， 由此确定蔗糖为最佳实验碳源，且蔗糖来源广泛，是较理想的生产用碳源。 碳源浓度对产物的含量有较大的影响。碳源浓度的大小，不仅会影响到菌体生长速 度，而且对菌体的代谢、产物的合成以及氧的传递都会产生影响。如果碳源用量过大， 可能会出现阻遏现象，产物的合成则会受到明显的抑制；反之，则菌体生长和产物合成 都会停止。因此，适宜的碳源浓度对微生物发酵相当重要。 本实验设定碳源浓度分别为3 0g l 、3 5g l 、4 0g l 、4 5g l 、5 0g l 、5 5g l 、6 0g l 7 个水平，考察碳源浓度对红曲多糖含量的影响，结果如图2 3 所示： 5 4 j 4 o o 3 3 曙 姜3 2 j 2 卯3 5加彤j 0印 蔗糖浓度( g l 1 ) 一红曲多糖 一o 菌体 图2 - 3 蔗糖浓度对红曲多糖含量的影响 f i g 2 3e f f e c t so ft h ec o n c e n t r a t i o no fs u c r o s eo i lt h ep o l y s a c c h a r i d ey e i l d 如图2 3 ，蔗糖浓度对红曲菌z k o a 多糖含量的影响较大，在蔗糖浓度低于4 5g l 的 时候，红曲多糖含量随蔗糖浓度的增加而增加，最高达到5 0g l ，然当蔗糖浓度大于4 5 g l 的时候，却不利于红曲多糖含量的提高；菌体量在蔗糖浓度为5 0g l 的时候，达到最 高，继续增加蔗糖浓度，菌体量下降。推测其原因，可能是由于碳源作为菌体和产物的 8 (|1￥匝釜 6 5 4 3 2 第二章红曲多糖的发酵培养基优化 构成物质和能量物质，碳源浓度较低时，菌体生长消耗了过多的碳源，则会过早的消耗 至较低水平，使多糖的合成受到限制；当蔗搪浓度过高时，会对菌体生长及多糖的合成 形成抑制，使合成速率减慢，最终导致减产。所以，蔗糖浓度选取4 5g l 为适。 2 2 3 氮源对多糖含量的影响 氮源是菌体合成氨基酸、蛋白质、核酸等的主要物质之一，是微生物发酵的主要营 养要素之，是影响红曲多糖含量的一个重要元素。实验考察蛋白胨、酵母粉、n a n 0 3 、 ( n h 4 ) 2 s 0 4 、n h 4 c 1 对红曲多糖含量的影响，浓度均为2 5g l 。结果如图2 - 4 所示： 豸 囡霾 l234j 氮源种类 1 蛋白胨2 n a n 0 33 酵母粉4 ( n i - h ) 2 s 0 45 n h 4 c 1 图2 4氮源种类对多糖含量的影响 f i g 2 - 4e f f e c t so fn i t r o g e ns o u r c e so nt h ep o l y s a c c h a r i d ey e i l d 在上述5 种氮源中，红曲多糖含量较高的是以蛋白胨或者酵母粉等有机氮源为氮源 的培养基。酵母粉是将酵母细胞内的蛋白质、核酸等进行降解抽提而成的一种营养丰富 的氮源，酵母粉含有机氮源、无机氮、维生素、矿物质以及生长素等多种营养要素，实 验表明酵母粉最利于红曲多糖的生产；蛋白胨是由蛋白质经酶，酸，碱水解而获得的一 种胨，多肽，氨基酸组成的水溶性混合物，成分较酵母粉单一，红曲多糖含量也稍微偏 低。 氮源浓度对红曲多糖的含量有较大的影响，合适的氮源浓度既保证菌体的生长繁殖， 又不因为菌体浓度的过大或者过小而影响红曲多糖的合成，通过实验研究，得到最佳的 氮源浓度，结果如图2 5 所示。 9 j 5 v 、 4 j 3 _ n 4 3 (|1粤曙芒n 江南大学硕士学位论文 5 8 j 6 、 o e 5 4 晤 饭 鞋 j 2 5 2 j33 j44 j 酵母粉浓度( g l 1 ) 一红曲多糖 o 菌体 图2 - 5 氮源浓度对多糖含量的影响 f i g 2 - 5e f f e c t so f t h ec o n c e n t r a t i o no f y e a s tp o w d e ro nt h ep o l y s a c c h a r i d ey e i l d 实验结果表明：4 0g l 的酵母粉浓度是红曲产多糖的最适氮源浓度，在此条件下， 红曲多糖含量达到5 8g l 。继续增加酵母粉的用量，有利于菌体的增长，却不利于红曲 多糖含量的提高。因此选定酵母粉浓度为4 0g l 。 2 2 4 碳氮比对多糖含量的影响 碳、氮是真菌主要的组成元素。碳氮比对微生物的生长和产物形成常有很大的影响， 碳氮比不当会妨碍茵丝对营养物质的吸收，如果碳氮比偏小，会导致菌体生长旺盛，造 成茵体提前衰老自溶；如果碳氮比偏大，菌体则会生长缓慢，产率下降。即使碳氮比合 适，浓度的大小也会影响菌体的生长。同样速效性和迟效性的碳源或氮源，以及有机的 和无机的氮源的比例也会影响菌丝对营养物的均匀吸收【2 1 1 。不同的真菌对碳、氮要求是 不同的。一般说来，真菌要求的碳氮比较高，属于“素食型生物，但是不同的菌类却 有不同情况田】，本实验在原有碳氮比基础上研究碳氮的比例关系对红曲多糖发酵的影 响。 原培养基中蔗糖浓度为4 5g l ，含碳摩尔浓度为1 5 8t o o l l ；酵母粉为4 0g l ，其 中总氮为1 0 ，含氮摩尔浓度为0 0 2 8 6m o l l ，则每升培养基中的碳氮摩尔比为5 5 ：1 ， 在已确定的蔗糖和酵母粉浓度的基础上设定碳氮比为3 5 ：1 、4 4 5 ：1 和7 1 6 ：1 进一步实验， 结果如表2 2 所示： 表2 - 2c n 对多糖含量的影响 t a b l e 2 - 2e f f e c t so fr a t i oo fc no nt h ep o l y s a c c h a r i d ey e i l d 由实验结果可以看出，碳氮比的改变对实验结果影响较大。在原来确立的碳氮含量 1 0 p-1舍￥釜 5 5 j 4 4 3 3 第二章红曲多糖的发酵培养基优化 的基础上，稍低一点的碳氮比有利于多糖的积累，也就是在c ：n = 4 4 5 ：1 时，红曲多糖 的含量最高。这个比例再降低时，也就是蔗糖为3 5g l ，酵母粉为5g l 时，含量降低。 实验结果表明，碳氮比在4 4 5 ：1 时最适于红曲z k o a 产多糖。 2 2 5 矿质元素对红曲多糖含量的影响 菌丝体在生长发育中，还需要一定量的矿质元素，其中p 、s 、k 、m g 这四种矿质 元素必须外界添加才可达到菌体生长所需的的浓度，对于这几种元素来源，首选 k h 2 p 0 4 3 h 2 0 和m g s 0 4 ，它可以同时提供这4 种元素。本部分实验研究k h 2 p 0 4 3 h 2 0 和m g s 0 4 的最适添加量，结果如图2 - 6 和图2 7 所示： l j22 j33 54 k h 2 p o - 烈2 0 浓度( g l - 1 ) 0 20 0 30 3 50 40 4 5 m 醪。| 浓度( g - u 1 ) 图2 - 6k i - 1 2 p 0 4 3 h 2 0 对红曲多糖含量的影响图2 - 7m g s 0 4 对红由多糖含量的影响 f i g 2 - 6e f f e c t so fc o n c e n t r a t i o n so fk i 1 2 p 0 4 3 h 2 0 f i g 2 - 7e f f e c t so fc o n c e n t r a t i o n so fm g s 0 4t h e o np o l y s a c c h a r i d ey e i l d0 1 1t h ep o l y s a c c h a r i d ey e i l d 在这四种元素中，p 是真菌细胞的结构物质，细胞膜的组成成分( 磷脂) ，是核酸的成 分，并积极参与生命的代谢活动。s 是构成细胞的有机成分，如氨基酸、环化胆碱硫酸 等【2 3 1 。k 在所有金属元素中是真菌含量最大