（发酵工程专业论文）溶纤酶生产菌株的筛选.pdf

山东轻t 业学院硕十学位论文 摘要 溶纤酶是指能够溶解纤维蛋白的一类物质的总称，微生物是溶纤酶最重要的 来源之一。微生物溶纤酶具有溶纤活力高、不易引起出血、半衰期长和可经消化 道直接吸收等优点，被认为是最具开发潜力、安全、廉价的溶栓药物之一。本课 题从筛选产溶纤酶菌株工作开始，主要完成了以下研究内容： 从富含蛋白质的环境中，采集菌种分离材料1 3 份，经预处理、富集培养、平 板初筛和摇瓶发酵初筛、复筛，最终从一份屠宰场土样中分离获得一株产溶纤酶 菌株w 0 5 ，产酶活力达2 3 0 i u m l ，相当于尿激酶活力8 7 0 i u m l ；对菌株的初步鉴 定结果表明，该菌株的性状特征与巨大芽孢杆菌相似。 采用紫外线单独处理和紫外线一氯化锂复合处理对产酶菌株w 0 5 进行诱变，经 初筛复筛获得一只溶纤酶高产突变株w u l 9 9 ，产酶活力达3 7 0i u m l ，相当于尿激 酶活力1 0 8 3i u m l ，比出发菌株活力提高了2 4 ； 采用单因素实验和响应面实验法对突变株w u l 9 9 发酵产酶培养基和培养条件 进行了优化，确定的最优培养基组成为( g l ) - 糖蜜6 0 ，豆粉1 1 ，酵母膏6 9 ，硫 酸镁0 9 ，氯化钙0 2 ，磷酸氢二钾1 ；确定的最优发酵条件为：初始p h7 2 ，发酵 温度3 7 ，摇床转速1 8 0 r m i n ，种子液种龄1 7 h ，接种量1 0 ，装液量3 0 m l 2 5 0 m l 。 在最优培养基和最优发酵条件下，突变株w u l 9 9 产酶活力达到4 7 0i u m l ，相当 于尿激酶活力1 4 0 8i u m l ，比优化前提高了3 0 ； 研究了突变株w u l 9 9 所产溶纤酶的部分酶学性质。酶的热稳定性实验结果表 明，该酶在无底物情况下常温下稳定，5 0 以上时失活迅速；酶的最适作用温度 6 0 。c ，最适作用p h 为7 5 ；m n 2 + 对其有促进作用，c u 2 + 、n i + 、a 矿对其有抑制作 用，其它离子影响不大。 关键词：溶纤酶，纤维蛋白，酶活力，筛选 a b s t r a c t t h e 妇o m b o l y s i n i sag e n e r i cn a m eo fm a t e r i a lw h i c hc a n d i s s o l v et h r o m b u sf i b r i n m i c r o o r g a n i s m i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts o u r c eo ft h r o m b o l y s i sm e d i c i n e t h e m i c r o o r g a m s mf i b r i n o l y s i nh a sm a n yg o o dq u a l i t i e s ，s u c h a sh i g ht h r o m b o l y s i se m 黟m e a c t i v i t y , n o tc a u s i n gb l e e d i n ge a s i l y , l o n g e rh a l f - l i f e ，d i r e c ta b s o r p t i o nb yd i g e s t i v e t r a c t ； a n di ti st l l o u g l l ta so n eo ft h em o s tp o t e n t i a l ，s a f e ，c h e a pt h r o m b o l y t i c s s t a r t i n g f r o m s c r e e 血gt h es t r a i np r o d u c i n gt h r o m b o l y s i se n z y m e ，t h i st o p i c h a sc o m p l e t e dt h e s e c o n t e n t sm a i n l y , w h i c ha r es p r e a d e do u ta sb e l o w ： t h e13k i n d so fi s o l a t i o nm a t e r i a l s ，c o n t a i n i n gm u c hp r o t e i n ，w e r ed o n eb yh e a t 他a 舡n e n t e n r i c h m e n t ，p l a t es c r e e n i n g w i t hc a s e i na st h eo n l yc a r b o na n dn i t r o g e n r e s o u r c e s h d k e f l a s kf e r m e n t a t i o ns c r e e n i n g ，f i b r i np l a t es c r e e n i n gb yt u r n s f i n a l l y , a 0 b j e c t i v es t r a i nw 0 5 w a si s o l a t e df r o mt h es h a m b l e s ss o i l ，w h o s ep r o t e i n a s ea c t l v l t ) ， w a s2 3 0 i u m lj u d g e db ym e a n so ff l i o n - p h e n o l ，a n d8 7 0i u m l u r o k i n a s ea c t i v i t y e q u i v a l e n t l y i tw a si n i t i a l l yi d e n t i f i c a t e d ；a n di t sc h a r a c t e ri ss i m i l a rw i t h b a c t e r i u m a n t h r r a c o i d e s am u t a n tt r a i n ，d e s i g n a t e dw u l 9 9 ，p r o d u c i n gp r o t e i n a s ea c t i v i t yt o3 7 0 i u m l ，a n d 10 8 3i u m lu r o k i n 2 l s ea c t i v i t ye q u i v a l e n t l y ，2 4 m o r et h a nt h e i n i t i a lo n e ，a f t e rt h e s t r a i nw a st r e a t e db yu v i r r a d i a t i o n ，u v a n dl i c l 一i r r a d i a t i o ns i m u l t a n e o u s l y t h ec u l t m ei r 坨d i u l na n dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ff i b r i n o l y s i np r o d u c t i o n 舶mt h es t r m nw u l 9 9w e r eo p t i m i z e db ys i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n t a n dr e s p o n s es u r l a c e m e t h o d 0 1 0 9 y ；a n di t sf i b r i n o l y s i np r o d u c t i o na c h i e v e4 7 0i u m l ，a n d 1 4 0 8i u r n l u 】的k i n a s ea c t i v i t ye q u i v a l e n t l y , 3 0 m o r et h a nt h ei n i t i a lo n e t h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u mf o rf i b r i n o l y s i np r o d u c t i o nw e r e ( u n i tg l ) ：m o l a s s e s 6 0 s o v b e a i lf l o u r11 ，y e a s te x t r a c t6 9 ，m g s 0 40 9 ，c a c l 20 2 ，k 2 h p 0 41 ；a n dt h eo p t i m a l f e n n e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rf i b r i n o l y s i np r o d u c t i o nw e r e ：i n i t i a lp h7 2 , t e m p e r a t u r e 3 7 * ( 2 ，r o t a t i o ns p e e do fr o c k i n gb e d18 0 r m i n ，s e e da g e17h , t h eq u a n t i t yo fi n o c u l a t l o n 10 ，b r o t h sv o l u m ei ns h a k e f l a s k3 0 m l 2 5 0 m l p a n i a lc h 钺a c t e r i a z a t i o no ff i b r i n o l y s i np r o d u c i n gf r o mt h es t r a i nw u i mw a s s t u d i e d t h e 丘b r i n o l y s i ni ss t a b l eu n d e rc o m m o nt e m p e r a t u r e ，a n dw o u l d b ed e v i t a l i z e d a b o v e5 0 。c ：i t sm a x i m 啪a c t i v i t yi s a t6 0 ( 2a n dp h7 5 t h ee n z y m ea c t i v i t yw a s s t r o n g l va d v a n c e db ym n 2 + ，a n ds t r o n g l yi n h i b i t e db yc u 十、n i + 、g g + k e yw o r d s ：f i b r i n o l y s i n ，f i b r i n ，e n z y m ea c t i v i t y ，s c r e e n i n g i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 己属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 做作者签名：煎至 同期： 遮年月盟日 导师签名：同期：年上月坦日 山东轻工业学院硕f ：学位论文 第1 章绪论 1 1 溶栓药物的发展 血管栓塞性疾病极大地危害着人类的健康，是当前死亡率最高的疾病之一； 目前，最有效的治疗方法是使用溶栓类药物进行溶栓治疗【l 】。溶栓类药物是指能够 直接或协助溶解血纤维蛋白( 血栓的主要基质) 的一类物质的总称；目前临床上 正式批准使用的有：链激酶( s k ) 、葡激酶( s a k ) 、尿激酶( u k ) 、尿激酶原( p r o u k ) 、 组织型溶纤酶原激活剂( t p a ) 、对一甲氧苯甲酰溶纤酶原链激酶启动剂复合物 ( a p s a c ) 和蚓激酶、蛇毒制剂等。 从2 0 世纪6 0 年代溶栓类药物上市到现在已有4 0 多年历史，根据其作用特点及生 产方式，大致可以分成三代：第一代主要包括链激酶( s k ) 和尿激酶( u k ) ，它们缺 乏纤维蛋白选择性，易引起过度出血，副作用大；第二代主要包括组织型溶纤酶原 激活剂( t p a ) 、尿激酶原( p r o u k ) 、蚓激酶等，它们对纤维蛋白的亲和性有所提 高，但仍存在半衰期短、用药剂量大、价格昂贵、易引起内出血等缺陷1 3 j ；为此， 第三代是运用分子生物学理论和基因工程技术进行重组和修饰，将现有的溶栓药物 分子的多种优点融合于一体，设计改造出新溶栓药物，这类药物目前大多还处于实 验阶段，需要进一步研究【2 】。另外，开发新型天然产物，寻找新型结构和功能的溶 栓化合物，并将其转化为基因工程产品正成为当今溶栓药物研究的热点。 目前已发现的溶栓活性物质主要来源于人体、动物和微生物【4 j ，具体分类见表 1 1 。其中微生物代谢产物是溶栓活性物质的重要来源，如早期研究的链激酶( s k ) 、 葡激酶( s a k ) 等溶纤酶原激活剂，都已经临床应用；目前j 下处于热点研究的纳豆 激酶、豆豉酶等可直接降解纤维蛋白的溶纤酶，都极有可能成为新一代的溶栓药 物。从微生物代谢产物中寻找天然、新型的溶纤酶已成为今后溶栓药物发展的一 个重要方向。 表1 1 溶纤物质米源 t a b l e1 1t h er e s o u r c eo ft h r o m b o l y s i sm a t t e r 来源 溶纤物质 人体 动物 微生物 尿激酶 蛇毒制剂、蚓激酶 链激酶、葡激酶、纳豆激酶、豆豉酶 1 2 微生物溶纤酶的研究历史和现状 1 9 8 7 年，日本的须见洋行教授首次对纳豆及其提取物作了系统研究，发现其 提取物可以在纤维蛋白平板上产生明显的溶圈，进一步研究表明是纳豆菌在发酵 过程中产生的一种具有溶纤活性的丝氨酸蛋白酶，将其命名为纳豆激酶( n k ) s l ， 第1 章绪论 从此揭开了微生物溶纤酶的研究历史。现分别就微生物溶纤酶的相关的研究进展 介绍如下。 1 2 1 产溶纤酶微生物 从同本学者首次发现微生物分泌溶纤酶之后，有关产溶纤酶微生物的研究非 常活跃。国内外学者们相继开始从各国传统的大豆发酵食品中分离筛选具有溶纤 活性的菌株，如我国的豆豉、酱油、米酒、虾酱，韩国的豆饼酱，印尼的丹贝， 印度的天酪等等，并从中分离得到多种产溶纤酶的微生物。随着研究的深入，除 发酵食品外，还在土壤、稻草、水等其它环境中发现了此类微生物。 目前已报道的产溶纤酶的微生物主要为细菌，少量真菌，主要包括枯草芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌、粪链球菌、镰饱菌、假单胞菌、链霉菌、曲霉菌、根霉菌 等等；各种来源的微生物溶纤酶及其研究者情况见表1 2 。 表1 2 各种来源的微生物溶纤酶 t a b l e1 2a l lk i n d so fm i c r o b es t r e p t o k i n a s e 因为纳豆激酶是从日本传统食品纳豆中发现的，且基于食品安全性的优势， 使得产溶纤酶微生物的筛选育种工作主要集中在食品微生物领域。阎家麒、董明 盛等人都从豆豉中分离得到产溶纤酶活力较高的枯草芽孢杆菌l l o ji l6 j ；彭勇等从豆 豉中分离到纳豆杆菌d c 2 和解淀粉芽孢杆菌d c 4 1 2 0 1 ；孙月娥等从豆豉中分离到 枯草杆菌d c 2 ，又经紫外线、亚硝基胍、丫射线与硫酸二乙脂复合诱变后，选育到 高产突变株d c f m 9 ，产纤溶酶活力较出发菌株提高了1 3 1 8 附2 1 1 ；杜连祥等从南 2 山东轻t 业学院硕士学位论文 方小药酒中分离到一株根霉( r h i z o p u sc h i e n s i s ) 1 2 # 分泌溶纤酶【冽；k i m 等从韩国 传统食品一豆饼酱中分离到一株枯草杆菌分泌溶纤酶，并将其命名为枯草激酶1 2 9 1 ( c k ) ；w o n g 等从香港的调味品虾酱中分离到一株菌分泌一种具溶纤作用的中性蛋 白酶【2 8 j ；y a s u d am 从印尼食品丹贝中分离到少孢根霉分泌丹贝激酶【2 7 】。 除发酵食品外，还从其它环境中分离到一些分泌溶纤酶的微生物，如王骏等 从云南土壤中筛选得到一株链霉菌y 4 0 5 ，分泌新型纤溶酶s w - 1 ；陈波等从采自 高海拔的大雪山顶的枯草样中分离得到一枯草芽孢杆菌z 3 l 可分泌纳豆激酶【8 】；刘 晨光等从海洋微生物假单胞菌获得一种新型溶纤酣9 】；英国w a l t o no a k s 等从粪链 球菌中提取得到一种具纤溶作用的中性金属内肽酶【3 川；l e e 等还从密环菌 ( a r m i l l a r i e l l am e l l e a ) 发酵物中分离到具溶纤作用的金属蛋白酶【2 酬。 产溶纤酶的微生物来源较为广泛，开发新的菌种和新型溶纤酶种类，有利于 扩大酶源。开发性能更优良更具工业化潜在价值的酶类及其生产菌株己引起了人 们的高度重视。随着研究的逐渐深入，新型的产酶菌株和酶种将不断被发现。 1 2 2 微生物溶纤酶的发酵工艺 微生物溶纤酶生产方式主要分为固体表面发酵工艺和液体深层发酵工艺。 固体发酵具有成本低、设备简单、产酶活力高、易推广等优点【3 2 1 。目前，一 部分来源于食品微生物的溶纤酶仍采用传统的固体表面发酵工艺，如纳豆激酶、 豆豉溶纤酶等；其培养基主要是以黄豆为主要原料，加入其它必要的营养成分而 得到的。雄迎新等对菌株b a c i l l u ss u b t i l i s0 3 1 2 0 1 产纳豆激酶的固体浅盘发酵工艺进 行了优化，以煮熟的大豆为原料，接种1 0 种龄6 h 的种子液，3 7 ，发酵2 4 h ，酶 产量达1 9 3 1 i u g 其中种子培养基组成为( g l ) ：酵母粉2 0 ，麦芽糖5 ，n a 2 h p 0 43 ， k h 2 p 0 43 ，m g s 0 40 5 。并与液体发酵进行了比较，认为传统的固体发酵依然是纳 豆菌最佳的培养途径【3 4 。鲍艳霞等研究了纳豆菌以豆制品副产物一豆渣为原料进 行固体发酵条件的工艺优化。其培养基为豆渣：麸皮5 ：2 ，含水量6 5 ，接种1 0 种龄1 4 h 的种子液，3 0 ，发酵9 6 h ，酶产量达1 5 7 7i u g ；其中种子培养基组成( g l ) 为：葡萄糖1 0 ，蛋白胨1 0 ，n a c i5 ，p h 7 2 7 4 【3 3 j 。 虽然固体发酵有其简单廉价的优势，但同时也存在易染菌，难散热，回收率 低等不足，从而很难满足有严格要求的药品尤其是生物制品的生产要求，因此许 多学者转而研究微生物溶纤酶的液态发酵工艺。这主要集中在原料的开发利用和 发酵条件优化方面，其中发酵培养基对微生物产酶影响较大。王发祥等研究纳豆 芽孢杆菌( b a c i l l u sn a t t o ) b n 0 3 0 1 的发酵条件，发现蔗糖、甘油是较好的碳源，葡萄 糖等单糖浓度高反而会抑制其生长，大豆成分的有机氮源明显比其它氮源有利于 菌体生长，在无机氮源下几乎不生长【3 5 1 。目前所用生产原料中，氮源以大豆成分 为主，碳源差异较大，有小分子的麦芽糖、木糖、葡萄糖，也有大分子的可溶性 淀粉、玉米粉等，不同研究者使用的液体发酵培养基和培养条件具体见表1 3 。 第1 章绪论 表1 3 不同研究者使用的液体发酵培养基和培养条件 t a b l e1 3 m e d i u m sa n dc o n d i t i o n so fs t r e p t o k i n a s el i q u i df e r m e n t i o nu s e db yd i f f e r e n tr e s e a r c h e r s 菌株 培养基 g l 发酵条件 温度 周期装液量转速种龄种量 hm lr m i nh 产量 i u m l b a c i l l u s 可溶淀粉3 0 ，豆浆全汁2 0 ， s u b t i l i s 一3 74 45 0 2 5 01 7 01 055 7 6 s b s d 6 】 c a c l 2 0 2 , p h 8 3 玉米粉5 ，豆渣2 0 ，麸皮5 ， b a c i l l u s n a h 2 p 0 4 6 ，n a 2 h p 0 4 1 ， n a 加【3 7 l c a c l 2 0 2 ，m g s 0 4 0 5 ，p h 3 5 自然 b a c i l l u s 麦芽糖2 0 ，酵母膏4 0 ， s u b l i l i s l 3 8 c a c l 2 0 3 ，p h 7 o 3 4 b a c i l l u s 可溶淀粉2 0 ，胰胨5 ， s u b t i l l i s c a c l 2 0 2 ，酵母膏2 ， 3 0 n a t t o k 2 h p 0 42 5 ，k h 2 p 0 41 ， b s n 3 9 i p h 7 0 大豆蛋白胨3 0 ，葡萄糖2 0 ， b a c i l l u s n a 2 h p 0 46 ，n a h 2 p 0 41 ， 刀口f f d 【4 0 】c a c l 2 0 2 ，m g s 0 40 5 ， 3 7 p h 7 0 7 22 5 2 5 01 8 01 447 1 4 2 4 8 1 0 0 5 0 02 0 06 8 1 4 3 0 0 6 05 0 5 0 01 5 01 8 2 022 3 5 8 6 01 0 0 5 0 02 0 01 627 3 6 b a c i l l u s 胰蛋白胨2 2 7 ，a ：糖2 0 ， s u b t i l i s h n a 2 h p 0 4 5 3 7 ，n a h 2 p 0 4 1 ， 3 02 5 2 5 01 5 0941 3 1 4 l 1 1 4 1 1 c a c l 2 0 2 m g s 0 4 0 5 p h 7 0 1 2 3 微生物溶纤酶的分离纯化 目前，对纳豆激酶分离纯化的相关研究很多。纳豆激酶是胞外酶，主要存在 于培养基质或发酵液中，一般提取步骤为：固体发酵产物经生理盐水低温浸提收 集上清液为粗酶液，发酵液经离心得到上清液为粗酶液；然后经硫酸铵分级沉淀， 去除杂蛋白；将溶纤酶沉淀透析或超滤除盐即得粗酶。进一步的纯化一般用凝胶 层析法，如用s e p h a d e xg 1 0 0 、s e p h a c r y l s 2 0 0 、s e r i n es e p h a r o s e2 b 等柱层析分离， 分部收集，经紫外检测收集活性馏分，再经离子交换柱层析、冷冻干燥即得纯酶 制品。若要得到电泳纯的酶制品，还需要进行s d s p a g e 凝胶电泳。 杨志兴等用s e p h a d e xg 1 0 0 、s e p h a c r y l s 2 0 0 两种层析方法纯化一种枯草杆菌 4 山东轻工业学院硕十学位论文 纤溶酶，得到电泳纯的酶比活为5 4 3 4 i u m g ，活力回收率为4 0 2 i 1 9 1 。丁贵平以 s e p h a d e xg 一1 0 0 分离纳豆激酶得其比活为1 2 4 4 i u m g ，酶活回收率为5 3 5 7 1 4 引。郝 淑凤等人采用s e r i n es e p h a r o s e2 b 和s e p h a c r y ls - 2 0 0 柱层析对一种枯草杆菌溶纤酶 进行分离纯化，所得产品纯化倍数为3 0 ，活力回收率为4 0 ，酶活力达1 6 8i u m g 4 3 。 韩润林等将层析后的酶样品继续进行s d s p a g e 凝胶电泳，酶的比活力达至u 9 8 0 0 u m g 1 8 j 。另外，王金英等、董明盛等、李丙锦等、f u j i t a 等对纳豆固体发酵产溶 纤酶的分离纯化过程也进行了研究探讨【删 4 5 】1 4 6 1 4 7 】。 1 2 4 溶纤酶基因的克隆和表达 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展，在溶纤酶高产菌种选育方面， 除依靠传统的诱变方法外，利用分子生物学技术构建高产菌株方面也取得了突破。 采用基因工程技术对溶纤酶基因进行克隆并实现高效表达，近年来该领域研究进 展很快，取得了许多成果，有力地推动了微生物溶纤酶生产技术、酶学性质及应 用的发展。 张淑梅、黄志立、罗立新等已经分别利用p c r 技术从分泌溶纤酶的枯草杆菌 基因组中扩增得到了酶基因，利用基因重组技术构建了n k 基因的表达载体，并 在e c o l i 中实现了表达【4 8 】 4 9 】【5 0 】；潘秋辉等在不改变蛋白质序列的i j i 提下，对纳豆 激酶n 端序列进行改造，实现了纳豆激酶成熟肽的高效表达【5 l l ；谢秋玲等研究了 一种提高n k 基因表达量的有效方法，并实现了n k 酶原基因、n k 基因的克隆及 其在大肠杆菌中的表达【5 2 】；彭勇等对豆豉枯草杆菌d c 2 所产的溶纤酶进行了基因 克隆，并在大肠杆菌中实现了融合蛋白的表达【2 0 1 。 除了溶纤酶基因在大肠杆菌中的表达，还有在枯草杆菌、酵母菌中的表达研 究。刘北域等用p g e m 3 z f ( + ) 质粒和p c r 的方法构建枯草杆菌表达质粒，并完成 了n k 基因在枯草杆菌中的表达及其纯化【5 3 】；罗立新等成功构建了纳豆激酶基因 重组酵母菌1 5 。基因工程技术在筛选高产优良的产酶菌株方面发挥了重要的作用。 1 2 5 微生物产溶纤酶的活力测定方法 溶纤酶的活力高低是根据其水解血纤维蛋白的能力大小判断的。目前其酶活 力测定方法有纤维蛋白平板法、血清板法、纤维蛋白块溶解时间法( c l t ) 、四肽 底物法、酶联反应吸附法等等。 纤维蛋白平板法是目前最常用的溶纤酶活力测定方法，1 9 5 2 年由a s t r u p 5 4 】建 立，最早用于尿激酶( u k ) 、组织纤溶酶原启动剂( t - p a ) 的活力测定；其原理是： 以凝血酶和纤维蛋白原作用制成人工血栓平板，然后将少量酶注入，如果具有溶 纤活力，就会在平板上形成溶解圈，根据酶对血栓纤维蛋白的水解圈面积大小来 表示酶活力的大小。后来纤维蛋白平板法又经过了一些改进，如董明盛等向其中 加入一定量的琼脂糖作固体支持物【l 叫；赵明等用聚丙烯酰胺代替琼脂作载体，用 平板电泳制胶模具代替玻璃或塑料平皿，并用蛋白染色法指示纤维蛋白溶解情况， 5 第1 章绪论 这样提高了灵敏度和标准度【5 5 1 。纤维蛋白块溶解时间法( c l t ) 和血清板法是分别 根据纤维蛋白降解的时间和纤维蛋白在降解过程中吸光度的变化来衡量溶纤酶活 力的。这几种方法都是通过表观现象的变化来判断酶活力情况，操作比较简便， 但是灵敏度和精确度都比较低。酶联免疫吸附法( e l i s a ) 是利用特异性酶联吸附来 精确测定酶活力，主要应用于医学领域。此法灵敏度好，精度高，但操作复杂， 使用成本高【5 州。 由于溶纤酶的作用底物纤维蛋白较昂贵，所以试用其它结构类似的蛋白质作 替代品进行酶活力测定，以便降低成本，使操作更加快捷。如四肽底物法和f l i o n - 酚法就是分别以四肽s u c a l a a l a - p r o p h e p n a 和酪蛋白为替代底物，根据枯草杆 菌蛋白酶e 的酶活测定方法改进的【5 7 】。它们简便迅速成本又低，适用于某些过程 中大批量的酶活测定，比如菌种筛选，但是它们不能完全反映其溶纤活性，其溶 纤活性与所测得的蛋白酶活力之间是否有相关性有待进一步研究 5 8 1 。 综上所述，每种酶活力方法都有其优势和局限性，因此在实际应用中可根据 不同情况灵活选择。 1 2 6 微生物溶纤酶产品的开发 研究表明微生物来源的溶纤酶，如纳豆激酶、豆豉溶纤酶、天醅溶纤酶，具 有对纤维蛋白作用时间长，效果比较显著，可以明显缩短优球蛋白溶解时间等优 点，是很有潜力的溶栓药物；微生物发酵法生产溶纤酶具有成本低、周期短、易 控制等优点，开发前景广阔。 比如开发较早的纳豆激酶，来源于食品，安全性高，分子量小，无毒副作用， 除可以直接溶纤外，还能促进体内产生t p a j ，具有温和、持续溶栓的特点，故可 以开发成液体酶口服剂或含酶健康饮料【2 5 1 。目前的纳豆激酶的保健食品主要是将发 酵液经盐析沉淀、透析脱盐及冷冻干燥后，再用少量葡萄糖或乳糖调配制成1 6 1 j 。 日本是最大的纳豆激酶生产国，已有4 0 0 多家工厂生产纳豆及纳豆激酶产品， 并在世界各地设有销售服务机构；此外，朝鲜和韩国也都有生产。目前市场销售的 含纳豆激酶的产品有日本大和药品株式会社的纳豆激酶胶囊、韩国的d a e w o n 制药 公司的p o w e rr r 软胶囊和n a t t o k i n a s e 2 0 5 0 胶囊等；主要作为溶解血栓、增进体力、 以及降低胆固醇和促进血液循环的保健食品，但尚未有该类药物制剂上市1 4 6 j 。 在国内，随着对微生物溶纤酶研究的不断深入，在开发保健食品的同时也正 在开发相应的酶产品。台湾已可自行生产纳豆激酶原料，其品质与纯度均已达国 际水准，现还出口欧美日等国。内蒙古吉蓝太化工集团呼和浩特市制药厂也已经 有纳豆激酶的固体和液体产品上市；纳豆激酶制剂一恩开胶囊己处于中试阶段1 6 2 j 。 目前微生物溶纤酶仍以食品开发为主，少数转向具有预防血栓疾病功能性食品( 保 健品) 、食品添加剂的开发利用，在医药方面的应用还处在研究阶段。 6 山东轻工业学院硕 ：学位论文 1 3 立题的背景及意义 据世界卫生组织( w h o ) 统计，全球因患心脑血管疾病死亡人数在9 0 年代就占 到总死亡人口的2 9 ，列第二位，预计到2 0 2 0 年将增至3 6 ，居首位，严重危害 着人类的健康和生命【1 2 1 。在我国，随着人们生活水平和生活方式改变导致膳食中 高脂肪、高蛋白的过量摄取和老龄化社会的到来，加之防治工作的相对滞后和困 难，人群心脑血管疾病的发病率和死亡率不断上升，血栓性疾病造成的损失也极 为严重。目前的溶栓药物产品种类及产量还不能满足市场不断增加的需求，并且 当l j 使用的溶栓药物存在用药方案比较复杂、半衰期短、价格昂贵、易引起机体 出血等许多缺点 2 1 。 因此，世界各国都致力于研究开发治疗血栓性疾病的新型药物；开发高效、 低毒、价廉、适合我国国情的的新型溶栓药物，是摆在我们面前的一项首要任务， 其中血栓溶解酶是一个重要的方向。目前，发酵工业技术已经非常成熟，而且微 生物资源又非常丰富，这就为寻找新的溶纤酶生产菌株、研究开发天然新型血栓 溶解酶提供了一条有利的新途径。所以微生物溶纤酶一直是一个很活跃的研究领 域，并且将在今后的很长一段时间内都是。 我国在微生物溶纤酶方面做了一些工作，研究多集中在食品微生物的筛选诱 变及产酶条件的研究，对其它环境中新型产酶菌种及其所产溶纤酶的研究开发较 少，因此继续寻找不同微生物来源的溶纤酶，并对新酶本身作较深入的研究，以 得到具有工业化潜在应用价值的新酶源，丰富产溶纤酶菌种库和酶种类，具有重 要的学术意义和实践价值。 本课题从筛选产溶纤酶菌株基础工作做起，对菌株发酵生产溶纤酶的工艺及 其所产酶的酶学性质进行研究，为进一步开展相关研究奠定基础。 1 4 课题的主要研究内容 发酵生产溶纤酶时，发酵液酶活性大小与出发菌株及发酵过程有很大的关系， 所以首先准备进行菌种筛选，以得到溶纤酶高产菌株，为后续研究创造良好条件； 然后将对高产菌株的发酵条件进行优化，以充分利用菌株的生产潜能、提高酶得 率、降低成本；同时，对菌株所产溶纤酶的酶学性质进行初步研究。因此本研究 将解决以下几方面问题： 1 4 1 溶纤酶产生菌的筛选 采用平板透明圈和摇瓶发酵相结合的方法，从土壤等分离材料中分离获得性 能稳定的溶纤酶产生菌，并对菌株的遗传稳定性、形态特征、生理生化性能等进 行研究。 1 4 2 通过诱变提高菌株产酶活力 采用物理、化学因素对产酶出发菌株进行诱变处理，提高菌株产酶能力。 7 第1 章绪论 1 4 3 产酶菌株培养基和发酵条件的优化 对产酶菌株的培养基和培养条件进行优化，确定最优产酶培养基组成和最优 发酵条件。 1 4 4 菌株所产溶纤酶酶学性质的初步研究 对菌株所产溶纤酶稳定性和动力学性质进行初步研究。 8 山东轻工业学院硕十学位论文 第2 章溶纤酶生产菌的筛选 2 1 引言 利用微生物技术生产溶纤酶的关键是寻找适合工业生产的优良菌株，日本学 者从纳豆中发现并分离出产溶纤酶的纳豆菌，从此揭开了微生物溶纤酶的研究历 史，此后各国研究人员又从其它发酵食品中相继筛选到许多能够产生纤维蛋白溶 解酶的微生物。近年来也有从土壤和其他样品中筛选产溶纤酶微生物的报道。 本研究选择富含蛋白质或者纤维蛋白的土壤和食品等作为分离材料，经预处 理、富集培养、平板透明圈法筛选和摇瓶发酵筛选，分离筛选产溶纤酶目的菌株。 2 2 材料与方法 2 2 1 分离材料 纳豆、屠宰场土样、豆地土样等1 3 份分离材料。 2 2 2 实验试剂 尿激酶标准品( 6 9 0 i u 支) ， 牛血凝血酶( 1 9 0 b p 支) ， 牛血纤维蛋白( 7 2 m g 可凝蛋白支) ， 以上药品购自于中国药品生物制品检定所； 2 2 3 实验器材 g n p 一9 0 8 0 型隔水式恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司 f i n n p i p e t t e ( 1 5 m l ) 1 0 0 1 0 0 0 ( g l ) 沪制0 1 1 5 0 2 2 2 号 微量进样器( 5 0 p l ) 沪制0 1 0 7 0 0 1 5 号 上海高欣玻璃仪器厂 7 2 2 型光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司 j y 2 0 0 2 电子天平上海精密科学仪器有限公司 c h k b 1 4 5 光学显微镜日本日立公司 x w - 8 0 a 漩涡混合器上海精科实业有限公司 h h 6 数显恒温水浴锅江苏金坛市荣华仪器制造有限公司 y x q 0 2 型手提电热式灭菌锅山东华新医疗器械厂 卧式电热式蒸汽消毒器衡阳医疗器械厂 p h s 2 c p h 计 上海伟业仪器厂 l c t - i d s a 净化工作台济南绿洁空气净化设备厂 b c d 2 8 冰箱青岛海尔集团 h z q y 振荡箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 c r 一2 2 e 高速冷冻离心机日本日立公司 l d 4 2 a 离心机北京医用离心机厂 9 第2 章溶纤酶生产菌株的筛选 m e l ”l 。l e ra e 2 0 0 8 1 2 型磁力衡温搅拌器 2 2 4 培养基 ( 1 ) 分离培养基 富集培养基( g l ) 羊血粉2 平板分离培养基( g l ) 酪蛋白 1 5 磷酸氢二钾4 处理琼脂 2 0 平板完全培养基( g l ) 葡萄糖5 硫酸镁0 2 1 2 1 灭菌1 5 m i n ( 2 ) 斜面保藏培养基( g l ) 蛋白胨 1 0 琼脂 18 ( 3 ) 摇瓶发酵培养基( g l ) 蛋白胨 2 0 p h 7 0 - 7 2 ( 4 ) 细菌鉴定培养基吲 淀粉水解培养基( g l ) 蛋白胨 5 可溶性淀粉2 0 1 2 1 灭菌3 0 m i n 日本日电公司 上海县会行农机厂 p h7 0 7 2 硫酸铵 2 硫酸镁 o 2 蒸馏水配置 牛肉膏 3 琼脂 1 8 柠檬酸钠 1 磷酸二氢钾6 p h7 0 7 2 蛋白胨 1 0 p h 7 2 牛肉膏 5 氯化钠 5 p h 7 0 7 2 葡萄糖 2 0 氯化钠 l o 牛肉膏 5 琼脂 1 8 氯化钠 5 p h7 0 7 2 配制时，先用少量水将淀粉调成糊状，在火上加热，边搅拌加水及其他成分， 溶化后补足水分。 半固体营养琼脂( g l ) 蛋白胨 1 0牛肉膏3氯化钠 5 琼脂3蒸馏水配置p h 7 4 7 6 1 2 1 灭菌1 5 m i n 明胶培养基( g l ) 蛋白胨 1 0 p h7 4 7 6 明胶 1 2 蒸馏水配置 1 2 1 灭菌1 5 m i n 1 0 山东轻工业学院顾十学位论文 纤维素酶活性测定培养液 g l ) 硝酸钾 1 0 硫酸镁 5 磷酸氢二钾5p h 自然 碳源利用培养基 g l ) 硫酸铵2 6 4磷酸二氢钾2 3 8 硫酸镁 1 0硫酸铜0 0 6 4 氯化猛0 0 7 9硫酸锌0 0 1 5 p h 6 8 7 0 1 2 1 灭菌2 0 m i n 糖醇发酵培养基 e l ) 磷酸氢二铵1氯化钾 0 2 酵母膏0 2琼脂5 - - 6 溴甲酚紫( 0 0 4 ) 1 5 m l p h 7 0 - - 7 2 m r 和v - p 实验培养基( g l ) 蛋白胨 5 葡萄糖 5 p h 7 0 - - - - 7 2 1 15 灭菌3 0 m i n 细菌完全培养基 显著水平p = 0 3 3 最高指标时各个因素水平组合y = 4 7 0 8 8 ，x l = 1 8 5 ，x 2 1 8 2 ，x 3 = 一o 2 7 ， 从以上统计数据可以证明该模型回归显著，相关系数r = 0 8 9 6 ，表明模型与实 际情况拟合较好，因此可以用方程4 1 对菌株w u b 产溶纤酶发酵条件进行分析和 预测。结果表明，该模型的响应面最优值，即菌株w u b 最优发酵条件为：酵母膏 6 9 9 l ，种龄1 7 h ，装液量3 0 m l ，此时模型达到预测最大产酶量4 7 0 8 8 i u m l ，相 第4 章菌株w u l 9 9 产溶纤酶发酵条件的优化 当于尿激酶活力1 4 0 8 i u m l 。 为了检验模型预测的准确性，在最优发酵条件和原始发酵条件分别进行发酵 实验，所得实际产酶量分别为3 6 0 i u m l 和4 6 5 i u m l ，可见该模型能较好地模拟 和预测实际发酵情况。 4 3 5 菌株w u l 9 9 条件优化前后生长及产酶比较 采用优化i j 后的两种发酵培养基和培养条件，进行发酵培养，比较菌体生长 曲线和产酶进程的变化，结果见图4 8 。 6 0 0 5 0 0 j 喜4 0 0 、，3 0 0 嚣2 0 0 罐1 0 0 0 o1 02 03 04 05 06 07 0 时间( h ) 1 0 8 o 0 6 蚓爱 适8 0 4 恒害 o o 2 o + 条件优化后产酶进程 一条件优化前产酶进程 + 条件优化后菌体生长曲线一卜条件优化前菌体生长曲线 图4 8 菌株w u l 9 9 在条件优化前后生物量及产酶进程比较 f i g 4 8t h ec o m p a r i s o no f g r o w t hc u r v ea n da l z y m ea c t i v i t yi ni n i t i a lc o n d i t i o n sa n do p t i m a lc o n d i t i o n s 结果表明，菌株w u l 9 9 在优化前后的菌体生长曲线比较，菌株w u i m 在条件 优化前后的生长曲线变化趋势基本一致，但生物量有所增加；菌株w u l 9 9 在优化 前后的产酶进程比较，产酶进程趋势一致，产酶水平提高到4 7 0 i u m l ，相当于尿 酶活力1 4 0 8 i u m l ，产酶水平较高。 4 4 本章小结 通过单因素实验逐一考查了菌株w u l 9 9 溶纤酶发酵培养基组成和发酵条件的 众多因素，及响应面法综合考查各因素间的交互效应，最终确定出其最优的发酵 培养基组成和发酵条件。最优培养基为( g l ) ：糖蜜6 0 ，豆粉1 1 ，酵母膏6 9 ，硫 酸镁0 9 ，氯化钙0 2 ，磷酸氢二钾1 ；最优发酵条件为：初始p h7 2 ，发酵温度 3 7 ，摇床转速1 8 0 r m i n ，种子液种龄1 7 h ，装液量3 0 m l 2 5 0 m l ，接种量1 0 。 在最优培养基和最优发酵条件下，突变株w u l 9 9 产酶活力达到4 7 0 i u m l ，相当于 尿激酶活力1 4 0 8 i u m l ，比优化前提高了3 0 。 山东轻工业学院硕t ：学位论文 第5 章菌株w u l 9 9 产溶纤酶酶学性质的初步研究 5 1 引言 酶是一种具有活性的蛋白质，其活性受到诸多环境因素的影响，为避免酶在 提取和保存过程中失活而造成损失以及更好地利用酶，很有必要研究了解酶的基 本性质。 酶的性质包括酶的稳定性和酶反应条件，如温度、储存稳定性及反应p h 、温 度、离子强度、金属离子等因素对酶反应的影响。本文对菌株w u l 9 9 所产溶纤酶 的粗酶酶学性质进行了初步研究。 5 2 材料与方法 5 2 1 菌种 菌株w u l 9 9 5 2 2 实验试剂 同2 2 1 所列 5 2 3 实验器材 同2 2 2 所列 5 2 4 培养基 液体发酵培养基( g l ) 糖蜜6 0豆粉1 l酵母膏6 9 硫酸镁0 9氯化钙o 2磷酸氢二钾l 5 2 5 酶液的收集 3 0 m l 种子液培养基装于2 5 0 m l 三角