（发酵工程专业论文）牛奶中主要过敏原的消除及检测技术的研究.pdf

摘要 本论文使用胰蛋自酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对市售牛奶进行水解，通过正交实验 优化，并用牛奶过敏者血清测定其水解效果。研究表明，胰蛋白酶的最适水解条件为温度 在4 0 ，p h 8 0 ，酶与底物质量比为5 ，水解时间为3 小时，木瓜蛋白酶的水解最佳条件 为6 5 ，p h 6 5 ，酶与底物质量比为4 ，水解时间为3 小时，菠萝蛋白酶的最佳水解条件 为6 0 ，p h 6 5 ，酶与底物质量比为4 水躬时间为2 小时。在酶的最佳水解条件下，用 三种酶依次对牛奶进行水解，水解后的奶液对牛奶过敏者血清特异性i g e 的抗原性最小， 在可测定的范围内，几乎已经不表现出抗原性。经分析表明，牛奶中的几种主要的过敏原 表位存在着上述实验用酶的识别位点，甩蛋白酶水解时，酶分子对过敏原的表位进行攻击， 破坏过敏原表位的结构，从而消弱或消除了牛奶蛋白的过敏原性。 本实验利用建立的过敏性动物模型的血清，作为参照血清，对实验所用的过敏者血清 的特异性进行了验证。结果表明，此例牛奶过敏者血清中的抗体，对牛奶中过敏蹶蛋自是 特异性的，并且初步建立了利用牛奶过敏者血清对酶解后的牛奶中过敏原抗原性程度的 e l i s a 检测。本实验通过动物模型，检测了几种细胞因子对机体免疫功能的调节作用。结果 表瞬，豚鼠分剐口服和注射抗原后，佐剂、干扰素、白介素一2 可以提高体内特异性i g e 和 i g g 的含量，自介素一l l 对体内特异性i g e 和i g g 有降低的效果。 关键询：牛奶过敏：过敏原表位；血清特异性i g e ：e l i s a ；蛋白质的酶解 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , u s i n gt r y p s i n , p a p a i na n db r o m e l a l nh y d r o l y z em i l k , t h r o u g ho r t h o g o n a l e x p e r i m e n ta n du s i n gt h es e r u n lo f t h ep e r s o nw h i c hi ss e n s i t i v et om i l ka l l e r g e nt oo p t i m i z et h e b e s tm e t h o do fh y d r o l y z em i l ka l l e r g y r e s e a r c hs h o w st h a tt h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sf o r t r y p s i n ：t e m p e r a t u r ea t4 0 。c 。p h 8 0 ，t h er a t eo fq u a l i t yb e t w e e ne n z y m ea n ds u b s t r a t ei s 5 ，h y d r o l y s i st i m ei s3h o u r s ；t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rt h eh y d r o l y s i so fp a p a i n ：6 5 。c ，p h 6 5 ， t h er a t eo fq u a l i t yb e t w e e ne n z y m ea n ds u b s t r a t ei s4 h y d r o l y s i st i m ei s3h o u r s ；t h eb e s t c o n d i t i o n sf o rt h eh y d r o l y s i so f b r o m e l a i n ：6 0 。c ，p h 6 5 ，t h er a t eo f q u a l i t yb e t w e e ne n z y m ea n d s u b s t r a t ei s4 ，h y d r o l y s i st i m ei s2h o u r s i nt h eb e s te n z y m a t i ch y d r o l y s i sc o n d i t i o n s ， h y d r o l y z et h em i l kb ya d dt h ee n z y m ei nt u r na n da f t e rh y d r o l y s i so ft h em i i lt h er e s u l tb y e l i s at e s tb e t w e e nc o w v $ m i l k a l l e r g ya n ds e r u ms p e c i f i ci g eo f t h ep e r s o ni si nt h el e a s ta n di t h a sa l m o s tn od e m o n s t r a t e da n t i g e nf r o mt h em i l k a n a l y s i ss h o w st h a ts e v e r a lo ft h em a j o r a l l e r g e n si nm i l kh a v ee p i t o p e sw h i c ha t et h ee n z y m et h a tu s ei nt h ee x p e r i m e n tr e c o g n i t i o n s i t e s e n z y m e sm o l e c u l e sa t t a c kt h es i t ew h e r ei nt h es p a c e so ft h ee p i t o p eo nt h ep r o t e i na n d d a m a g et h es t r u c t u r eo ft h em i l ka l l e r g e n s ，t h u sw e a k e n i n go re l i m i n a t i n gt h ea l l e r g e no fm i l k p r o t e i n s t h ee x p e r i m e n t a la n i m a lm o d e le s t a b l i s h e da i mt oo b t a i na l l e r g i cs e r u m 髂c o n t r a s t 。t h e e x p e r i m e n t a la n i m a lm o d e ls e r u mb eu s e di nt h et e s to f t h es e l l l m si g es p e c i f i c i t y t h er e s u l t s i n d i c a t et h a tt h es e l x l m si g ef r o mm i l ka l l e r g yp a t i e n t si ss p e c i f i ca l l e r g yt oc o w sm i l kp r o t e i n a n de s t a b l i s h e dt h ef o u n d a t i o nw i m s p e c i f i c i t y d e t e c t i o no ft h i se x p e r i m e n t a n dw e e s t a b l i s h e dt h em e t h o db yu s eo fc o w sm i l ka n ds e n s i t i v e l ys e r u mt od e t e c tt h ed e g r e eo f e n z y m eh y d r o l y s i so ft h em i l ka l l e r g e np r o t e i n b yt h eu s eo fa n i m a lm o d e l ，w ef o u n da d j u v a n t , i f na n di l - 2c a l li m p r o v et h eq u a n t i t yo ft h es p e c i a ll g ea n dl g g a n dt h ei l l1c a nd e c r e a s e t h eq u a n t i t yo f t h es p e c i a li g ea n di g g k e yw o r d s ：m i l ka l l e r g e n ，e p i t o p e ，s e r u ms p e c i f i ci g e ，e l i s a 。h y d r o l y s i sp r o t e i n 第一章前言 第一章前言 1 1 课题的研究背景 1 1 1 人类食物过敏的现状 人类对食物过敏的认识经历了一个漫长的过程，直至, j 2 0 世纪8 0 年代末食物过敏仍然被 认为是食品安全领域的一个次要问题。近i o b l 5 年由于过敏性疾病发病率增加的事实和 转基因技术的发展、转基因农作物商品化，人们丌始重新评价食物过敏的问题，食物过敏对 大众健康的影响才开始受到重视，成为全球关注的公共卫生问题之一。 流行病学研究显示，约3 3 的过敏反应由食物诱发。几项以双盲对照食物激发实验阳性 为诊断标准的人群研究显示，0 5 2 的成人和6 8 的儿章有食物过敏问题。“1 。美国 对4 8 0 名新生儿进行的前瞻性研究显示，2 8i j 6 的被调查儿章在3 岁前有过食物不良反应，经 食物激发实验证实其中8 9 6 儿童至少对一种食物过敏。1 ，在美国食物有过敏反应人群中，其 中1 4 为婴幼儿。容易引起食物过敏的食品主要有8 种，它们是花生、牛奶、鸡蛋、面粉、 黄豆、果仁、鱼以及水生贝壳类动物食品等，多数为高蛋白食品。其中对花生过敏最为严 重。h i l l 等”1 报道，澳洲3 岁以下儿章食物过敏患病率约为3 7 ，2 岁以下儿章对蛋类过 敏者为3 2 ，对牛奶过敏者为2 o ，对花生过敏者为1 9 。法国将近4 的人对某些食品 过敏，而在法国未成年入中，对食品有过敏反应的比例已经达n 8 。调查表明，在法国儿 童中，对蛋类过敏的人数最多，占过敏患几的3 4 ，其次是对花生、牛奶和鱼等；在成年 人中，对香蕉、浊梨、草莓、李子等水果过敏的人最多，其次是对油料、干果及西芹、香 芹、茴香等蔬菜。荷兰白种人食物过敏发病率成人为1 4 ，儿童为5 7 “1 。有关亚洲和 非洲国家食物过敏的人群研究很少，在日本，在全国范围进行了正式的食物过敏调查，调 查结果显示，有食物过敏症状的婴幼儿占全部调查对象的1 3 ，其中l o 有严重症状。导致 过敏的主要食物为：鸡蛋5 5 、牛奶2 4 、其它依次为巧克力、花生、大豆、奶酪、小麦、 面条、蟹和虾。在中国，重庆医科大学儿章医院在一年内对3 0 4 0 名2 岁以下的儿童进行食 物过敏流行病调查，确诊1 6 0 名儿童产生食物过敏，发病率为5 2 。中国一项以开放性食 物激发试验为诊断依据的研究显示，2 岁以下幼儿食物过敏率为5 3 。 1 1 ，2 食物诱发变态反应的途径 食物诱发变态反应的途径主要有以下几种： ( i ) 食入：为食物变应原致敏最常见的途径，胃肠道是与食物变应原接触最直接、频率 最高的系统。故亦为最易受累的系统。 第一章前言 ( 2 ) 吸入：高度敏感患者在烹调过程中吸入微量食物变应原亦可诱发症状。 ( 3 ) 接触：高度敏感患者皮肤接触致敏食物变应原或皮试等均可诱发症状。 ( 4 ) 授乳：有文献报导哺乳母亲进食婴儿敏感的牛奶、鸡蛋等抗原性很强的大分子食物 变应原，食物耐受烹调、消化并穿过生物膜，既使仅有极微量进入乳汁亦可诱发症状。 ( 5 ) 通过胎盘：有文献报导新生儿出生后第一次进食亦可发生食物变态反应，这可能是 由于母体血清中的特异性i g e 抗体通过胎盘使胎儿被动致敏，孕妇妊娠最后3 个月大量进食 某些食物如鸡蛋、牛奶可能使胎儿被动致敏。 1 1 3 目前对食物诱发变态反应的研究 在食物过敏的研究方面。r c a a l b e r s e 在1 9 9 7 年发表文章，对长期以来模糊不清的过 敏性食物概念进行解释，认为过敏性食物至少应有三种解释，即：与i g e 抗体反应的食物； 能诱发过敏反应的食物：能诱发过敏敏感作用的食物。并指出，能够产生上述三种反应的 食物为完全过敏性食物；只与i g e 抗体反应的食物为非诱发性食物；与i g e 抗体反应的食物 并能诱发过敏反应的食物为非敏感性诱发食物。 从评价和监测角度考虑，食品过敏原的生物学活性，主要指食品过敏原激发机体引起 过敏症的能力或潜力，包括两方面的含义嗍：一是指过敏活性即食品过敏原激发已致敏个 体发生过敏症的能力，虽然引起的过敏症程度因人而异，但针对特定的人群，标明食品成 分及含量对他们有很好的提示作用；二是指致敏活性即食品或其特定成分初次进入机体， 诱发机体致敏的可能性，主要指那些新开发的食品特别是转基因蛋白质食品、合成添加荆 等，其针对不特定人群，应在生产实践中尽可能避免食品中含有致敏活性成分。 对人类健康构成威胁的食物过敏原主要来自食物中含有的致敏蛋白质、食品加工储存 中使用的食品添加剂和含有过敏原的转基因食品。其中9 0 的过敏原是蛋白质，但并非所有 蛋白质都会引起过敏。具有抗原特性的蛋白质大多数为具有酸性等电点的糖蛋白，其分子 量在l o 8 0 k d a ，通常能耐受食品加工、加热和烹调，并能抵抗肠道的消化作用。由蛋白质 引起的过敏反应多为i g e 介导的i 型变态反应。 另据研究发现，大豆中的主要过敏原主要有：胰蛋白酶抑制剂、b 一聚大豆球蛋白的 q 一亚单位、以及g 1 yi l lb d3 0 k 、g l yn lb d2 8 k 、g l ymi a 、g l ymi b 、g l ym2 、g l y 1 1 1 3 等；小麦中的主要过敏原有：四聚体e l 一淀粉酶抑制剂c m l 6 、四聚体q 一淀粉酶抑制剂 c m l 7 、分子量分别为4 7 - k d a 、3 6 - k d a 、3 1 一k d a 、2 7 - k d a 、2 0 - k d a 、1 7 - k d a 的蛋白质：大麦 中的主要过敏原有：四聚体a 一淀粉酶抑制剂c m b 、及分子量分别为3 8 一k d a 蛋白质( 发现 在大麦酿造的啤酒中) 、1 6 一k d a 的蛋白质( 发现在大麦酿造的啤酒中) 、1 0 一k d a 的蛋白质 2 第一章前言 ( 发现在大麦酿造的啤酒中) ：水稻中的过敏原主要有；分子量分别为3 3 一k d a 、1 6 一k d a 、 1 4 1 6 一k d a 的蛋白质：玉米中的主要过敏原有：分子量分别为6 9 - k d a 、3 3 一k d a 的蛋白质： 乳中的主要过敏原为：酪蛋白、a 一乳白蛋白、b 一乳球蛋白，牛血清蛋白和y 一球蛋白； 鸡蛋中的过敏原主要有：卵白蛋白( 4 3 k d a ) 、卵类粘蛋白( 2 8 k d a ) 和卵类转铁蛋白( 7 8 k d a ) ； 花生中的主要过敏原有，分子量为6 5 k d a 和1 7 k d a 的类豌豆球蛋白的种子贮存糖蛋白( a r ah l 和a r ah 2 ) ：雪鱼中的主要过敏原为原肌球蛋白。另外，国际食品生物技术委员会和国际生 命科学研究院过敏与免疫研究所一起，建立了食物国民原数据库，目i i f 已有1 9 8 种过敏原 ( 包括食物过敏原) 的氨基酸序列是已知的。 1 2 国内外研究动态和趋势 1 2 1 国内外对食品中过敏原的消除方法 不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的不同，这 些性质是由于蛋白质的氮基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可 以是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常 确定的二级结构( o 螺旋、b 折叠和各种转角) 、三级结构和四级结构，形成独特的大小、 形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差 异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。 1 2 1 1 物理消除方法 ( 1 ) 热处理法的影响 许多研究表明在加热条件下乳清蛋白与酪蛋白可能发生以下反应： ib l g ( b 乳球蛋白) 和酪蛋白复合物的形成 i i b l g 自身的相互作用 i i ib l g 聚集体与k 一酪蛋白之间形成复合物 8 一l g 与a l a ( a 一乳清蛋白) 的相互作用以及两者与酪蛋白的作用 在热处理过程中，随着加热强度不同产生的乳清蛋白与酪蛋白的变化也不同。m o t t a r 等研究认为盯1 ，乳清蛋白与酪蛋白的热缔合作用有两个过程，即在加热强度不大时，o l a 变性纯度较小，主要是变性并结合在酪蛋白胶束表面，形成表面附属丝状物，呈不规则“沟 纹”状态，表面疏水性很高：当加强度再加时a l a 开始变性沉淀，覆盖了附属丝状物， 填塞了表面“沟纹”，形成了光滑的胶束表面，降低了表面疏水性，增加了蛋白持水力。 ( 2 ) 超虑法 据报道“1 ，桃子果汁对热( 1 2 1 8 ，l o 3 0 m i n ) 由显著的稳定性，只有在超虑这步 3 第一章前言 处理中对桃汁才有降低过敏原性的作用，但对于果肉型果汁味道和口感也因超虑而失去。 这可能是因为评价口感的关键分子也同时被去除的结果。 1 2 1 2 化学消除方法 ( 1 ) f e c l ，盐析法 对于酸性乳清，将一定量的l m o l lf e c l ，溶液加到5 0 m 1p h 调整到4 2 乳清中，使f e c l 。 最终浓度达7 5 m o l l ，同时滴加3 m o l ln a o h 维持p h ，在温度4 c 反应2 h ，然后离心分离 ( 1 0 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，此时，9 0 的b l g 与血清蛋白共沉，而7 0 9 6 的i g s ( 9 2 免疫化学 活性i g g ) 与9 5 o l a ，则留在上清中。上清中的铁离子在p h 8 9 和4 下处理后可作为 沉淀除去，除去率为9 8 ，而i g g 的活性不失去。 ( 2 ) n a c l 盐析法 将乳清超虑浓缩1 0 1 5 倍后调整p h = 2 ，添 j i n a c l ，使最终浓度达7 ，2 0 c 下维持2 0 m i n 后，离心分离( 1 0 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，几乎所有的b - l g 留在上清液中，而其它蛋白都留 在沉淀中，将沉淀溶于p h = 4 o 的水中，然后在水中透吸，在冷冻干燥，可得到去除b l g 的乳清蛋白。 ( 3 ) 凝胶过滤法 将s e p h a d e x g - - 7 5 分装入5 段k s 4 5 0 凝胶柱子，用0 1 m o l lp h 6 3 磷酸缓冲液平衡。将 5 0 0 9 超虑浓缩后的乳清蛋白溶于5 l 缓冲液中，调p h = 6 2 或6 4 ，然后离心分离( 3 5 0 0 r m i n ， 2 0 r a i n ) ，将上清液装样，用磷酸缓冲液洗脱，流出液在2 8 0 n m 下测吸光度，乳清蛋白可分 三级，其中i 级组分主要为牛血清、t 3 一l g ，酪蛋白残余、i g s 、l f 及l y 等，i i 级组分为高 纯度b l g ，i i i 级组分主要为c l l a 。 ( 4 ) 金属螯合作用 过渡金属离子c u ”、z n 2 + 和n i ”等以亚胺络合物的形式键合到固定相上，由于这些金属 离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属一蛋白螫合物， 使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合，从而遮蔽了蛋白的抗原性。 另外，多聚磷酸盐沉淀法、( n h 4 ) # 0 法分级分离、等电点沉淀法也用于对牛奶中的 乳清蛋白进行分离。 1 2 1 3 生物技术方法 ( 1 ) 发酵法 虽然关于食品过敏原发酵处理方面的科学信息还有所缺少，但酱油却是一个发酵产品 的例子，它包含了小麦和大豆蛋白，也许个别产品会有所不同，但最近证明，在大豆发酵 4 第一章前言 终产物中，还存在有大豆蛋白的过敏原性叫尽管如此，抑制性分析方法的结果认为b - l g 的免疫活性在发酵酸奶产品中如酸奶酪，比非发酵牛奶中含量已显著消弱“”。认为这是由 蛋白水解和酸使蛋白变性共同引起的结果。 ( 2 ) 蛋白酶水解法 食物中的完全蛋白质经酶解作用，主要达到两个目的，其一：降低分子量大小，改变分 子结构，消除抗原决定簇，最终降低免疫原性：其二：选择有特殊氨基酸组成的肽段，以利于 特殊人群的蛋白质、氨基酸的代谢。蛋白质的水解可通过酸、碱及酶解三种方式来实现， 酸碱水解作用较强烈，水解程度和水解位点不易控制，产物的营养品质难以保证，一般不 用于生产蛋自酶解营养物。酶永解通常在p h 6 8 ，4 0 6 0 c 的温和条件下进行，避免了极 端的化学和物理条件，减少副反应，还可以选择酶解的作用位点。氨基酸的组成在酶解后 精制前基本不变，产物在水溶液、热稳定性和各种试剂的耐受性，如对p h 、金属离子的耐 受性等方面都有所改变。 牛乳蛋白质的as 一酪蛋白经凝乳酶作用而产生的分解物a 。一i 部分上，在其氨基酸顺 序2 4 1 9 9 部位中存在抗原。p 一酪蛋白则在其分子全体部位分散有抗原决定部位。所以用 蛋白酶把具有抗原的决定部位的片段进行水解之后，则显著降低了其抗原性。乳清蛋白中 的b 一乳球蛋白以及q 一乳白蛋白的分子结构中也都存在过敏原，所以用筛选的蛋白酶将乳 蛋白质的抗原决定部位加以水解破坏之后，就可以防止牛乳过敏。通过酶部分降解乳清蛋 白的多肽骨架，增加其分子内或分子间交联或连接特殊功能基团，可以改变乳清蛋白质的 功能性质“1 ”。部分降解常用蛋白酶，其最直观的表现是溶液粘度下降，乳清蛋白分子量降 低。 ( 3 ) 基因改造 利用遗传学理论和基因技术，对奶牛基因进行改造，使其所产乳中的过敏原性蛋白质 结构发生变化，失去至敏性，从而达到消除过敏原的目的。 1 2 2 牛奶中超敏原的主要检测方法 1 2 2 1 体内检测方法 通过体内试验，定量或半定量地对食物过敏原的过敏活性进行检测，此类方法特别强 调明确界定实验系统和被检测物广泛应用并有待完善的实验体系有： 双盲对照食物激发实验( d o u b l e b l i n d e d ，p l a c e b o c o n t r o l l e df o o dc h a l l e n g e s ， d b p c f c ) m a y 等最早报道了d b p c f c 方法“”，发现d b p c f c 阳性儿童的皮肤试验阳性只有2 9 9 6 。 b o c k 等对5 0 0 例儿科病例进行d b p c f c 实验认为本实验高度安全“”。欧洲变态反应和临床免 第一章前言 疫学会评定d b p c k 为唯一的判断食物过敏原的结论性实验，并被认为是食物过敏反应诊断 的标准方法“ 虽然d b p c f c 在诊断食物过敏中是一金标准，但结果受多因素影响，甚至包括心理反应 而出现自发性症状。实践中也不易操作，实验剂量、安慰剂及双盲控制等环节还有待完善。 皮肤试验( s k i np r i c kt e s t i n g ，s f r ) s p t 已成为过敏原标准化的推荐方法，在过敏诊 断中的应用极为普遍，也是食物过敏原生物活性评价的一个较合理方法“”。s p t 合理性在 于小量过敏原经皮诱导产生典型的皮肤反应如水泡和红斑，在一定浓度范围内，测量红斑 或水泡面积来定量过敏原生物学活性0 7 ，结果可用终点滴度( 即产生阴性反应的最大浓 度) 或标准组胺相当活性( 1 0 m g m l h i s t a m i n eq u i v a l e n tp r i c k ，i o h e p ) 表示。 s p t 虽然简便易行，但往往需要多达数十点针刺，对试验者造成创伤和极大痛苦，此 外，病人必须符合并在严格控制的条件下进行实验，如：皮肤完整、未使用对皮肤反应有 极大影响的药物，实验物质必须保证除了过敏原特性外而不具传染性及毒性。皮试结果有 时与病史并不完全一致，皮试阳性可能不出现症状，相反，一些阴性结果却出现过敏症状， 因此s p t 试验要与血清学实验结合分析，以免不必要的食物限制“。 1 2 2 2 体外检测方法 利用体外实验检测和评价食品过敏原生物活性，比体内实验更安全和符合伦理。目前， 研究和实践中主要应用组胺释放实验和i g e 测定两类方法。 ( 1 ) 组胺释放实验( h i s t a m i n er e l e a s i n gt e s t ，h r t ) 过敏原激发致敏的靶细胞，引 起细胞释放组胺，组胺含量可应用荧光测定法、放射免疫法等方法测定，与适宜参照进行 比较，确定组胺释放率阳性标准，从而进行过敏原活性测定及鉴定的一类方法。 由于组胺测定必须在抽血后2 4 h 1 内测定，造成该技术应用于食物过敏原检测与评价有 一定局限性，并且由于体外细胞组胺释放的影响因素较为复杂，且组胺测定方法也较为繁 琐，该方法仍未推广应用。 ( 2 ) i g e 检测，过敏原与i g e 结合是过敏原发挥生物活性的中心环节，因此测定过敏 原特异性i g e 在过敏症诊断及过敏原评价中具有重要地位“”。 放射过敏原吸附实验( r a d i oa ll e r g os o r b e n tt e s t ，r a s t ) ： 此实验是利用过敏病人血中的i g e 作为抗体，与固定相上过敏原和食品中的过敏原( 游 离) 竞争结合，经过一定时间培养后，清洗去游离抗原和抗体，再用标记的兔或羊抗i g e 的抗体检测与固定相抗原结合的人i g e 量，从而计算出食品中的抗原量。此法用于测定不 同类型蛋白质过敏原，如花生和乳清等。 6 第一章前言 免疫杂交电泳法： 将食品蛋白电泳，再将电泳蛋白转移到硝基纤维素薄膜上。用病人血清和抗体i g e 标 记抗体依次培养，可以却定蛋白质的其它性质( 如分子量等) 。 利用动物抗体的免疫测定： 利用动物抗体的免疫检测抗原的方法有很多，也较成熟。它是通过对一些常见的过敏 原制备出一些动物的单克隆抗体，食品中的这些过敏原可以通过酶联免疫吸附法( e l i s a ) 和放射性免疫法( r i a ) 来检测。 此外，酶标记过敏原吸附实验( e n z y m e1 i n k e da l l e r g o s o rb e n ta s s a y s ，e a s t ) 及荧 光和化学发光标记的检测技术均已建立，多种e l i s a 方法也已用于特异性i g e 检测，检测 限可达0 0 0 5 n g m l 嘲1 。 1 2 3 目前蛋白质水解度的测定方法 测定蛋白质水解度的方法很多，它们都是依据以下三个原则：滴定释放出的质子、可 溶性蛋白质、游离氨基酸和s n - t c a 指数法。 1 2 3 1 滴定水解中释放出的质子( p h - s t a t 发) a d l e r - n i s s e e l1 9 7 9 年用p h s t a t 技术滴定水解过程中释放的质子而测定蛋白质的水 解度，国外常用p h - s t a t 法，此法需要特别的仪器，国内很少采用这种方法进行水解度的 测定嘶删。 1 2 3 2 游离氨基氮( 自由一氨基) 蛋白质水解液中游离氨基的量会随着水解的进行而增加，因此水解液中游离氨基氮的 含量也可以表征蛋白质水解的程度，常用的方法有三硝基苯磺酸法( t n b s ) 、甲醛滴定法、 茚三酮法、0 p a 和荧光胺法等。 1 2 3 - 3 可溶性蛋白质 随着水解的进行，蛋白质的长链逐渐被切断，溶解度增加，所以蛋白质水解液中可溶 性蛋白质的含量在一定程度上也可以表征蛋白质的水解程度。测定水解液中可溶性蛋白质 的方法有凯氏定氮法、f o l i n 一酚法、双缩尿法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝g 一2 5 0 染色 法等“捌。 1 2 3 4s n - t c a 指数法 s n - t c a 是指在特定条件下，三氯乙酸( t c a ) 水溶液中可溶性氮的物质的量分数。三 氯乙酸是一种蛋白质沉淀剂，它可以沉淀蛋白质和太短。随着水解反应的进行，蛋白质肽 链被切成大小不等的片段，三氯乙酸溶解指数提高。 第一章前言 1 3 课题的研究依据 1 3 1 食物变态反应的发病机制 1 3 ，1 1i g e 介导的食物变态反应的发病机制 食物变应原进入易感者体内诱导产生大量特异性i g e 抗体，与肥大细胞、嗜酸性粒细胞 的高亲和力受体( f cer i ) 及巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜碱粒细胞和血小板的低 亲和力受体( f c r i i ) 结合。当再次摄入食物变应原后与之结合。使上述细胞脱颗粒释 放组胺、p g 、l t s 、p a f 等原发及继发炎性介质，并与被趋化至受累组织中的嗜酸性粒细胞 释放的各种介质及毒性蛋白如e c p 、e p o 、e p x 、m b p 等共同引起速发、迟发或双相反应。 临床表现的严重程度主要与患者的易感性及食物交应原性的强弱有关。i g e 介导的食物变 态反应起病快，可于进食后几分钟至l - - 2 d 时发病。 1 3 1 2 非i g e 介导的食物变态反应 i i ，i i i 、i v 型超敏反应均可涉及，但目静尚缺乏直接证据。牛奶诱发的血小板减少 可涉及i i 型超敏反应。食物诱发吸收不良综合症、食物诱发小肠结肠炎涉及i i i 和i v 型超 敏反应。j n i g e 介导的食物变态反应诱发症状所需食物量较l g e 介导型为大。 近来有报道部分食物变态反应患者血清中i g g 4 增高，而i g e 及其它i g g 不一定增高。有 人认为i g g 4 是一种同种细胞趋化抗体，在抗原激发下可使嗜碱性粒细胞释放介质。但亦有 研究结果不支持上述讨论。i g g 4 在食物变态反应中的作用尚无定论，有待进一步研究。 过敏原的免疫效应机制包括细胞免疫，但i g e 介导的免疫应答是食品过敏的主要效应， 其机制为i 型超敏反应，包括致敏和发敏两个阶段。一定量的过敏原可诱导易感个体产生 足够量的i g e ，i g e 通过血循环分布全身，并与肥大细胞( m a s tc e l l ，m c ) 、嗜碱性粒细胞 ( b a s o p h i l ，b a s ) 膜表面特定的受体结合，从而使机体处于致敏状态。当再次接触含相同 或相似过敏原成分的食品时。过敏原分子特异性识别致敏细胞膜表面的i g e ，诱导细胞脱 颗粒释放炎症介质而触发食物过敏症。 i g e 的产生依赖t 细胞的复杂调节机制活化特定的b 细胞克隆，诱导抗体的类型转换而 合成。现已部分证实坼，这一机制是由c d 4 + t 细胞亚群t h t h 。及相应的细胞因子平衡格局 调控的。t h ：细胞及其分泌产生的i l 一4 和i l - 1 3 是激发和维持i g e 效应的主要因子，而t h 及 其释放的i f n - y 是i g e 合成的拮抗因素。t h ：极化不仅促进i g e 生成，而且刺激局部m c 和嗜酸 性粒细胞活性，在激发过敏反应中起关键作用啪1 。研究认为。1 ，c d 8 + t 细胞可能也影响i g e 的生成及过敏反应。 8 第一章前言 1 4 牛奶中超敏原种类及理化性质 牛奶单含有2 0 多种蛋白质，其中有5 种可引起过敏反应，包括酪蛋白、o 一乳白蛋白、9 一乳球蛋白、牛血清蛋白和y 一球蛋白这些蛋白质都能被吸收，其中一乳臼蛋白，8 一乳球 蛋白被认为是引起小儿过敏的主要过敏原。 1 4 1 酪蛋白( c a s e i n ) 酪蛋白是乳腺上皮细胞合成的。是乳中特有的一组磷蛋白，含有大量的磷和钙。酪蛋白 以磷酸酯键与丝氨酸的羟基结合，酪蛋白中还含有少量已糖、氨基塘和唾液酸等残基。常 乳中，酪蛋白在牛乳中占总蛋白的8 0 。在猪乳中可能超过6 0 。乳中酪蛋白分为as - 酪蛋 白、8 一酪蛋白、y 一酪蛋白和k 一酪蛋白四种类型，其中y 一酪蛋白实际上是b 一酪蛋白的 酶解产物。 ds 一酪蛋白是乳中主要的酪蛋白。在牛的脱脂乳中，as l 一酪蛋白约占全酪蛋臼( t 酪蛋白) 的3 8 。as 2 一酪蛋白约占t 酪蛋白的1 0 。b 一酪蛋自在乳中的含量仅次于as 一 酪蛋白，在牛乳的脱脂乳中约占t 酪蛋自的3 5 。y 酪蛋自在牛乳的脱脂乳中约占t 酪蛋 白的3 。k 一酪蛋白是唯一含有糖成分的，并对钙不敏感而对凝乳酶敏感的酪蛋白。在牛 乳的脱脂乳中，k 一酪蛋白约占t 酪蛋白1 3 。k 一酪蛋白的水解产物有两个片段：副一k 一酪 蛋白，和酪蛋白的巨肽。k 一酪蛋白的糖基有三种，即唾液酸、半乳糖和n 一乙酰氨基半乳 糖。酪蛋白在乳中是以微团状态存在的，称为酪蛋白微团。酪蛋白是一种有很强相互作用 的蛋白质，在乳中有缔合现象。酪蛋自在2 0 ，p h 4 6 时从脱脂乳中沉淀析出。 酪蛋白含有几乎全部必需氨基酸，是新生幼仔最具营养价值的蛋白质。其次。酪蛋白 能增加新生幼仔对钙磷的吸收啪1 酪蛋白在新生幼仔胃肠道蛋白酶作用后，可释放多种生 物活性肽。这些活性肽对幼仔的消化、营养和免疫等发挥调节作用。”。如牛b c a s o m o r p h i n 和免疫调节肽。x 一酪蛋白还可以刺激新生幼仔胃肠内有益菌落的生长，例 如人乳中k 一酪蛋白可以刺激婴儿胃肠内双歧杆菌的生长” 1 4 2a 一孚l 白蛋白( a l a ) a l a 由乳腺上皮细胞合成，在所有哺乳动物乳中均存在，尤其在人乳中含量较高，然 而在一些乳糖含量低或无的水生赌乳动物( 如海豹和海狮等) 乳中含量较低。在牛脱脂乳 中含量为0 6 1 7 9 l a l a 是一个结构紧密球型蛋白，其三维大小为2 2 4 4 7 5 r i m 的扁椭圆体。在生理状态的p h 下，d l a 的二级结构包括2 6 d 一螺旋、1 4 8 一结构和6 0 无 序结构。牛a - l a 的分子量为1 4 t 4 7 1 4 1 7 5 ，p i 为4 2 0 4 ：5 0 。a - l a 在p h 5 4 9 范围内有 一个稳定的结构，它是对热最稳定的乳清蛋白。a l a 含有微量塘基成分，有n 一乙酰氨基葡 9 第一章前言 萄糖、唾液酸、半乳糖、n 一乙酰氮基半乳糖、甘露糖和岩藻糖等。a l 的一级、二级和三 级结构均相似于溶菌酶蛋白，然而这两种蛋白质没有任何已知的相同生物学功能，有人认 为n l a 是由一编码溶菌酶的古代基因复制、分化和进化而来。 a l a 是乳糖合成酶的一个亚基。它控制着乳中乳糖的含量。b l e c kg t 等。”报道，通过 将牛。一l a 基因转移到猪上，后者在泌乳中特异性a - l a 在乳腺中显著增多，结果转基因母 猪在泌乳早期乳糖含量显著增加。一l a 含有与钙有高度亲和力的结合位点，有助于钙大量 分泌入乳中。q l a 与细胞膜有非特异性的结合特性，有人发现a - l a 是细胞生长的抑制 剂。a - l a 富含赖氨酸、半胱氨酸和色氨酸，有非常高的营养价值。另掘报道汹母乳中 a l a 含量显著受母体所在环境中有害杀虫荆如d d t 、林丹和六六六等影响，因此有人建议 将d l a 作为环保的生物标记。 1 4 3e 一乳球蛋白( b - l g ) b l g 是反刍动物和猪等乳中主要的乳清蛋白之一。在牛常乳中约占5 0 。长期以来认 为p l g 是反刍动物和猪等乳中特有的乳清蛋白，近年来报道人乳中有少量b l g 存在b l g 也是由乳腺上皮细胞合成的乳特有蛋白。牛乳中b l g 的分子量为1 8 2 7 7 1 8 3 6 3 ，p i 为 5 1 3 ，在牛脱脂乳中含量为2 0 4 o g l 。在生理状态的p h 下，0 - l g 常常以稳定的二聚体形 式存在，二聚体像一个拉长的椭圆体，长约6 。9 5 n m ，宽约3 6 n m 。b 一乳球蛋白的理化性质和 p h 值关系很大，在p h 9 0 不可逆失活。c a + 对酶活性有稳定作 用；重金属离子、有机磷化合物、d f p 、天然胰蛋自酶抑制剂对其活性有强烈抑 制。临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理，食品加工等。 准确称取9 份离心后牛奶2 0 o g ，适当稀释后，分别装进9 个5 0 m l 烧杯中，对 烧椴= 编号为l 至9 ，进行胰蛋白酶的酶解，酶解4 4 , 时，酶解时采用不同的酶与底 6 第二章材料与方法 物质量之比并且在胰蛋白酶的最佳酶解温度和p h 值的范围内采用不同的酶解湿 度和不同的酶解p h 值，每隔一小时用移液管分别吸取9 个烧杯中的酶解液l m l 装 入1 5 m l 的离心管中，把装有酶解液的离心管放入8 5 的水浴锅中高温灭酶i o 分 钟，酶解奶样在2 0 下保存。以酶与底物质量比( e s ) 、p h 值、酶解温度( t ) 、 酶解时间为因素，采用k ( 3 ) 设计正交实验。具体因素水平见表2 1 。 2 3 4 ( 6 0 0 0 n f u ) 5 ( 7 5 0 0 n f u ) 8 0 8 5 4 0 4 5 2 3 2 4 3 2 木瓜蛋白酶对牛奶的水解 木瓜蛋白酶( p a p a i n ) 性质：由番木瓜( c a r i e a p a p y a ) 的果汁和叶子分离而 得的蛋白酶混合物，内含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、溶菌酶等。淡褐色无 定形粉末或颗粒，微吸湿，有硫化氢臭。木瓜蛋白酶由2 1 1 个氨基酸残基组成， 分子量约2 1 0 0 0 ，p 1 8 7 5 ，最适温度5 5 - 6 5 。木瓜蛋白酶是巯基蛋白酶，其活性 受氧化剂氧化或重会属抑制。略溶于水、甘油，溶于乙醇、氯仿和乙醚。用于防 止啤酒冷藏的混浊，肉类嫩化，羊毛的防缩，牙齿上蛋白质沉积物的除去，临床 上用于抗炎消肿，驱虫和辅助消化。 准确称取9 份离心后牛奶2 0 o g 。稀释并分别装进9 个5 0 m l 烧杯中，对烧杯编 号为l 至9 ，进行木瓜蛋白酶的酶解，酶解4 4 , 时，酶解时采用不同的酶与底物质 量之比并且在木瓜蛋白酶的最佳酶解温度和p h 值的范围内采用不同的酶解温度 和不同的酶解p h 值，每隔一小时用移液管分别吸取9 个烧杯中的酶解液l m l 装入 1 5 m l 的离心管中，把装有酶解液的离心管放入8 5 的水浴锅中高温灭酶酶解 奶样在2 0 下保存。以酶与底物质量比( e s ) 、p h 值、酶解温度( ，r ) 、酶解时 间为因素，采用b ( 3 ) 设计正交实验。具体因素水平见表2 2 。 第二章材辩与方法 表2 2 木瓜蛋白酶酶解因素水平表 诗卜、旦素 a ( e s ) 8 ( p h )c ( t ，)d ( t ，h ) l3 ( 1 8 0 0 0 u )6 05 51 2 4 ( 2 4 0 0 0 u )6 5 6 0 2 3 5 ( 3 0 0 0 0 u ) 7 06 53 2 4 3 3 菠萝蛋白酶对牛奶的水解 菠萝蛋白酶( b r o m e l a i n ) 性质： 又称菠萝酶。由菠萝汁、皮等提取的筑基 蛋白酶。浅黄色无定形粉末。分子量3 3 0 0 0 。对酪蛋白、血红蛋白、b a e e 的最适 p h 值是6 8 ，对明胶是p h 值5 0 。酶活性受重金属抑制。略溶于水，不溶于乙醇， 丙酮、氯仿和乙醚。它优先水解碱性氨基酸( 例如精氨酸) 或芳香族氨基酸( 例如 苯丙氨酸、酪氨酸) 的羧基侧上的肽链，选择性水解纤维蛋白。可分解肌纤维， 而对纤维蛋白原作用微弱。可用于啤酒澄清、药用助消化和抗炎消肿。在食品生 产中，用于嫩化肉食品，各类预煮准备、水解蛋白质的生产。 以酶与底物质量比( e s ) 、p h 值、酶解温度( t ) 、酶解时间为因素，采用 l 9 ( 3 4 ) 设计正交实验。具体因素水平见表2 3 。 表2 - 3 菠萝蛋白酶酶解因素水平表 莉卜因素 a ( e s )c ( t ，)b ( p h ) d ( t ，h ) l 3 ( 3 6 g d u ) 5 56 51 2 4 ( 4 8 g d u ) 6 0 7 0 2 3 5 ( 6 0 g d u )6 57 53 2 4 3 4 混合酶对牛奶的水解 按照单一酶水解牛奶最佳效果时的酶与底物质量比、p h 值、酶解温度和酶 解时间，设计混合酶的酶解条件，酶解时先调p h 值到木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的 最佳p h 值范围进行酶解，酶解一段时间后，调p h 值至胰蛋白酶的最佳p h 范围，并 加入胰蛋白酶，到达酶解时间后取出酶解液，在8 5 c 的水浴锅中高温灭酶，酶解 奶样在2 0 下保存以备检测。 第二章材料与方法 2 5 牛奶酶解液的处理 可以通过超滤、浓缩、喷雾干燥等方法对牛奶蛋白水解液进行制粉处理。可 以设计制造一种连续的水解液处理系统，当牛奶蛋白水解物连续通过超滤膜时， 其小分子可连续地流出超滤膜，酶等大分子蛋白质则不能通过超滤膜而流回反应 槽中继续水解，此间不断补充新的牛奶蛋白质溶液于反应槽中，形成一个完整的 连续水解过程。这样的一套连续水解系统，在相同的酶与底物浓度下，其水解效 率较高且处理量较大，但较难控制，滤膜易堵塞，离实际应用仍有一段距离，因 此并未进行进一步研究。 2 6 牛奶过敏者血清特异性l g e 对酶解后牛奶蛋白抗原性的测定 由于牛奶过敏者血清i g e 对牛奶中过敏原蛋白产生的是特意性结合反应，且 其产