（发酵工程专业论文）纤维素酶产生菌的选育鉴定及产酶性能研究.pdf

摘要 摘要 优良的纤维素酶产生菌的选育对于生物质转化成燃料乙醇及其他轻化产品 的开发具有重要意义。本文从自然环境筛选出8 株具有不同种属特征的野生型 纤维素酶产生菌，选择其中的一株优势菌为出发菌株，进行产酶条件的优化和 诱变育种工作，提高其产纤维素酶能力。为进一步研究细胞纤维素酶固定化， 实现全细胞催化分解纤维质合成燃料乙醇的深入研究打下基础。本论文的主要 工作和研究成果如下： ( 1 ) 从南昌地区的枯枝、秸秆、土壤中采样，在羧甲基纤维素琼脂培养基 上培养，以刚果红为指示剂，分离纯化出3 5 株产纤维素酶菌株。以酶活值作为 复筛标准，筛选出8 株产羧甲基纤维素酶和滤纸酶活力相对较高的菌株。通过 菌落形态、菌丝及孢子形态等生理特性分析，依次鉴定为：柱隔孢霉( r a m u l a r i a n s l ) ，康氏木霉( t r i c h o d e r m ak o n i n g i in s 2 ) ，灰绿青霉( p e n i c i l l i u mg l a u c u m n s 3 ) ，白腐菌( w h i t e r o t f u n g i n s 4 ) ，绿色木霉( zv i r i d e p e r s e x f x n s 5 ) ， 灰绿曲霉( a s p e r g i l l u sg t a u c u sn s 6 ) ，黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e rn s 7 ) ，禾生腐霉 ( p y t h i u m g r a m i n i c o l a n s 8 ) 。它们的羧甲基纤维素酶活( c m c 酶活) 分别为：2 9 7 9 7 i u m l ，3 0 0 1 1h ，m i ，1 5 4 8 3i i ，m i ，1 4 6 6 8i u m l ，3 0 8 1 4i u m l ，9 4 5 1 m l ， 2 1 8 0 2i u m l ，2 0 3 0 2 l l ；滤纸酶活( f p a 酶活) 分别为：6 5 6i u m l ，5 6 3 i u m l ，4 2 9 l ，9 6 3i u m l ，8 0 2i u m l ，1 1 2i u m l ，4 5 8i u m l ，1 1 3 6 i u m l 。其中绿色木霉( zv i r i d ep e r s e xf xn s 5 ) 在适宜的发酵条件：麸皮： c m c - n a ( 1 ：1 ) 各6 9 l ，硫酸铵4g l ，发酵温度3 0 ，时间3d ，发酵液 c m c 酶活和滤纸酶活分别达到3 5 2 1 1i iy m i ，和1 3 9 6i u m l ，比初筛酶活3 0 8 1 4 i i j m l 和8 0 2i u m l 分别提高1 4 2 6 和7 4 0 6 。 ( 2 ) 采用响应面法对灰绿青霉p e n i c i l l i u mg l a u c u mn s 3 生产纤维素酶的发 酵条件进行优化，通过p l a c k e t t b u r m a n 实验方法研究有关碳源、氮源、无机盐、 发酵时间、摇床转速等1 8 个选择的发酵因子对菌株发酵产纤维素酶活力的影响， 结果显示影响产酶的显著因子是麸皮、c m c 的含量和发酵时间。根据实验结果 和经验方法对显著影响因子的取值范围进行预估，并采用b o x b e h n k e n 设计实 验对显著因子进行优化，应用响应面模拟预测和摇瓶发酵实验验证，结果表明， i l 摘要 优化发酵条件为培养基中麸皮含量6 0 u l ，c m c 含量7 0 9 l ，发酵时间9 6 小时， 摇瓶发酵液中c m c 酶活均接近3 0 9i u m l ，优化预测值和实验验证值拟合度达 到9 9 ，比初始培养基和发酵条件下菌株产c m c 酶活9 4 5 1i u m l 提高了2 2 7 。 ( 3 ) 以发酵条件优化的菌株p e n i c i l l i u mg l a u c u mn s 3 为出发菌，采用紫外 线、亚硝酸钠复合诱变，在u v ( 1 5 w 、距3 0 c m 辐照9 r a i n ) 、0 3 亚硝酸钠协 同诱变条件下，经多轮反复诱变，得到菌株p e n i c i l l i u mg l a u c u mn s 3 c l ，其发酵 液c m c 酶活和滤纸酶活分别达到4 0 0 0 7i u m l 和9 4 7i u m l ，比出发菌酶活 3 0 9n ，m i 和7 3 7i u m l 分别提高2 9 4 7 和2 8 3 5 。 关键词：纤维素酶；分离筛选；鉴定；响应面优化；诱变 a b s t r a c t a b s t r a c t s c r e e n i n gh i g hy i e l d c e u u l a s ep r o d u c i n gs t r a i ni s v e r yi m p o r t a n t t ot h e d e v e l o p m e n to ft h eb i o m a s si n t of u e le t h a n o la n do t h e rl i g h t b a s e dp r o d u c t e i g h t d i f f e r e n t s p e c i e sc e l l u l a s e - p r o d u c i n gf u n g i 、析t hw i l d - t y p e c h a r a c t e r i s t i c sw e r e s e l e c t e df r o mt h en a t u r a le n v i r o n m e n ti nt h i sa r t i c l e t h e nt h ep e n i c i l l i u mg l a u c u m n s 3s e l e c t e dw a sa so r i g i n a ls t r a i n ，r e s p o n s es u r f a c ed e s i g nu s e dt oo p t i m i s ei t s c e l l u l a s e p r o d u c i n gc o n d i t i o n a f t e r w a r d si tw a sm u t a t e db ys y n e r g i s t i cm u t a t i o n t or a i s i n gi t sc e l l u l a s e - p r o d u c i n gc a p a c i t y s u mu pa b o v e ，a l lt h e s ew o r ke s t a b l i s ha b a s i sf o rf u r t h e rd e v e l o p m e n to fw h o l e - c e l lc a t a l y t i cd e c o m p o s i t i o no fc e l l u l o s ea n d u t i l i z a t i o ni nt h ei n d u s t r i a l i z a t i o np r o d u c t i o no ff u e le t h a n 0 1 t l l i st h e s i s sm a i nw o r k c o n t e n t sa n dr e s e a r c hr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： s c r e e n e db ya g a rp l a t ec o n t a i n e dc m c n aa n dc o n g or e di n d i c a t o r ，t h i r t yf i v e c e l l u l a s e - p r o d u c i n gs t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mr o t t e nw o o d , s t r a wp i l e sa n ds o i l s a m p l e di nn a n c h a n ga r e a a f t e rs e c o n ds c r e e n i n gb a s e do nt h e i rc e l l u l a s e p r o d u c i n g a c t i v i t i e s ，e i g h tc e l l u l a s e p r o d u c i n gs t r a i n s 谢t hh i g h e rc m c a s ea n df p aa c t i v i t i e s w e r eo b t a i n e d t h r o u g ht h ea n a l y s i sa n di n v e s t i g a t i o na b o u tt h e i rc o l o n y , m y c e l i u m ， s p o r em o r p h o l o g ya n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，t h ee i g h ts t r a i n sw e r ec l a s s i f i e d a sr a m u l a r i an s 1 ，t r i c h o d e r m ak o n i n g i in s 2 ，p e n i c i l l i u mg l a u c u mn s 3 ，w h i t e r o t f u n g in s 4 ，zv i r i d ep e r s e xf xn s 5 ，a s p e r g i l l u sg l a u c u sn s 6 , a s p e r g i l l u sn i g e rn s 7 , p y t h i u mg r a m i n i c o l an s 8 u n d e rs h a k e nf l a s k sc u l t u r ec o n d i t i o n s ，t h e i rc m c a s e a c t i v i t i e sr e a c h e d2 9 7 9 7i u m l ，3 0 0 1 1i u 触，15 4 8 3n j 】【i l l ，1 4 6 6 8r m m l ， 3 0 8 1 4 m l ，9 4 5 1i u m l ，2 1 8 0 2 m l ，2 0 3 0 2i u m la n df p aa c t i v i t i e sw e r e 6 5 6i u m l ，5 6 3i u m l ，4 2 9i u m l ，9 6 3i u m l ，8 0 2 l ，1 1 2i u n 1 l ， 4 5 8 m l ，1 1 3 6i u m l ，r e s p e c t i v e l y w i t ht h ea p p r o p r i a t ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ： c m c 6 9 l ，w h e a tb r a n6 9 l ，( n h 4 ) 2 8 0 44 9 l ，c u l t u r e d3 d sa tt h et e m p e r a t u r e3 0 c ， t h ec m c a s ea n df p a a s ep r o d u c e db ys t a i nzv i r i d ep e r s e xf xn s 5r e a c h e d35 2 11 i u m la n d1 3 9 6i u f m l ，w h i c hi n c r e a s e d1 4 2 6 a n d7 4 0 6 t h a nt h a to ft h e o r i g i n a la c t i v i t i e s3 0 8 1 4i u m la n d8 0 2i u m l i v a b s t r a c t r e s p o n s es u r f a c ed e s i g n w a su s e dt o o p t i m i s e t h e c e l l u l a s e - p r o d u c i n g c o n d i t i o no fp e n i c i l l i u mg l a u c u mn s 3 t h e r ea l e18 f a c t o r se f f e c to nt h e c e l l u l a s e - p r o d u c i n gf e r m e n t a t i o n , s u c h a st h ef e r m e n t a t i o nt i m e ，s h a k i n gs p e e d , c o n c e n t r a t i o no fc a r b o ns o u r c e s ，n i t r o g e ns o u r c g sa n di n o r g a n i cs a l t s t h ei n f l u e n c e o ft h e18f a c t o r sw a se v a l u a t e db yp l a c k e t t b u r m a nd e s i g n t h er e s u l ts h o w e dt h a t w h e a tb r a n , c m c - n aa n dt h ef e r m e n t a t i o nt i m ep l a y e di m p o r t a n tr o l e s i nt h e c e l l u l a s ep r o d u c t i o n a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fp l a c k e t t - b u r m a nd e s i g ne x p e r i m e n t ， t h er a n g eo ft h ei n f l u e n t i a lf a c t o r sc o u l db ee s t i m a t e d ，ab o x - b e h n k e nd e s i g nw a s e m p l o y e dt oo p t i m i z et h es i g n i f i c a n tf a c t o r sa n dt h er e s u l t sw e r es h o w ni nr e s p o n s e s u r f a c eg r a p h t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：6 0 9 lw h e a t b r a n ，7 0 9 lc m c - n a , a n d9 6h o u r sf e i m e n t a t i o nt i m e u n d e rt h ea b o v eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，t h ea c t i v i t yo fc e l l u l a s ep r o d u c e db yp e n i c i l l i u mg t a u c u m n s 3r e a c h e d3 0 9 i u m l ，w h i c hh a di n c r e a s e d2 2 7 t h a nt h a to ft h e o r i g i n a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sp r o d u c e d a f t e rf e r m e t a t i o nc o n d i t i o n so p t i m i s i n go ft h ep e n i c i l l i u mg l a u c u mn s 3 ，a s e v e r a lo f s y n e r g i s t i c m u t a t i o nh a v eb e e nc a r r yo u tf o r i n c r e a s i n g i t s c e l l u l a s e - p r o d u c i n gc a p a c i t y ah i g h e rc e l l u l a s e p r o d u c j n gs t r a i nn a m e dn s 3 c lh a d b e e ng o t t e n , w h i c hw a sb r e e d e dt h r o u g hi n d u c i n gm u t a t i o nt r c a t r n e n t to fu l t r a v i o l e t l i g h ta n ds o d i u mn i t r i t e t h eo p t i m a ld o s a g eo fm u t a n tb yu va n ds o d i u mn i t r i t ew a s 9m i n u t e sw i t l l15 wu vl i g h ti n3 0 c md i s t a n c ea n d0 3 c o n c e n t r a t i o n u n d e rt h e r e p e a t e ds y n e r g i s t i cm u t a t i o n s ，t h e c m c a s ea n df p a a s ep r o d u c e db ym u t a n t p e n i c i u i u mg l a u c u mn s 3 c lr e a c h e d4 0 0 0 7i u m la n d9 4 7i u m l ，w h i c hi n c r e a s e d 2 9 4 7 a n d2 8 3 5 t h a nt h a to f t h eo r i g i n a la c t i v i t i e s3 0 9i u m la n d7 3 7i u m l k e yw o r d s ：c e l l u l a s e ； i s o l a t i o na n ds c r e e n i n g ； i d e n t i f i c a t i o n ； r e s p o n s e s u r f a c eo p t i m i z a t i o n ；m u t a t i o n v 目录 目录 摘要_ i i a b s t r a c t ：j 第一章绪论。l 1 1 纤维素概述1 1 1 1 纤维素生物质的组成1 1 1 2 纤维素的结构l 1 2 纤维素酶概述- 3 1 2 1 纤维素酶系的组成3 1 2 2 纤维素酶的作用机理3 1 2 3 纤维素酶的来源5 1 2 4 纤维素酶的应用5 1 3 纤维素酶产生菌选育的现状及发展趋势1 0 1 3 1 纤维素降解菌的分类1 0 1 3 2 国内纤维素酶产生菌选育发展状况1 2 l - 3 - 3 国外纤维素酶产生菌选育的发展现状1 4 1 3 4 纤维素酶产生菌选育发展。1 4 1 4 课题来源与研究意义1 5 1 4 1 课题来源15 1 4 2 研究的意义l5 1 5 论文研究主要内容1 6 第二章产纤维素酶优势菌种的筛选与鉴定17 2 1 材料与方法：1 7 2 1 1 材料17 2 1 2 方法2 0 2 2 结果与讨论2 l v i 目录 2 2 1 筛选菌株形态学分析与鉴定2 l 2 2 2 筛选菌株的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活3 2 2 2 3 优势菌株一绿色木霉( zv i r i d ep e r s e xf xn s 5 ) 的产酶研究3 2 2 3 本章小结3 5 第三章响应面法优化灰绿青霉p e n i c i l l i u me , t a u c u mn s 3 产酶条件3 6 3 1 材料与方法3 6 3 1 1 材料3 6 3 1 2 方法3 7 3 2 结果与讨论3 8 3 2 1 显著影响因素的筛选3 8 3 2 2 显著影响因子的b o x b e h n k e n 设计优化4 l 3 2 3 响应面模型拟合与实验验证4 3 3 2 4 讨论4 6 3 3 本章小结4 6 第四章灰绿青霉p e n i c i l l i u mg l a u c u mn s 3 的诱变育种一4 7 4 1 材料与方法4 7 4 1 1 材料4 7 4 1 2 方法4 8 4 2 结果与讨论5 0 4 2 1 紫外诱变的结果5 0 4 2 2 紫外与亚硝酸钠复合诱变的结果5 2 4 2 1 3 讨论5 4 4 3 本章小结5 4 第五章结论与展望5 6 5 1 结论5 6 5 2 进一步工作的方向5 7 致谢5 8 参考文献5 9 v l i 第一章绪论 1 1 纤维素概述 1 1 1 纤维素生物质的组成 第一章绪论 秸秆的干物质由灰分和含氮化合物与非含氮化合物组成。含氮化合物包括 蛋白质和其他含氮物；非含氮化合物包括纤维素、半纤维素和木质素等。其中 非含氮化合物约占秸秆干重8 0 。水稻、小麦及玉米等农作物秸的纤维素、 半纤维素及木质素含量如图1 1 【1 1 。 ， 图! - 1 木质纤维原料的构成 f i g 1 1s l r u c t u r eo fl i g n o c e i l u l o s em a t e r i a l 纤维素、半纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，是世界上最丰富的可再 生资源，由p 1 ，4 - 糖苷键连接单糖而形成晶体结构，必须转化成微生物可利用的 形式( 如：葡萄糖、乙醇等化合物) 才能生物转化成能源或生物化工产品f 2 】。用纤 维素酶水解纤维素对环境没有任何污染，使得丰富的生物质资源可以通过生物 转化变成绿色能源和可再生的生化产品【3 】。 1 1 2 纤维素的结构 纤维素( c e l l u l o s e ) 是由毗喃型葡萄糖残基以肛l ，4 糖苷键连接而成的不分 支的线性直链葡聚糖大分子物质，直链状大分子纤维素折叠，形成具有高结晶 第一章绪论 毋随。回婶傩 纤维三糖基 图1 2 纤维素的部分结构 f i g 1 - 2 p a r to f t h em n m t u r eo f c e l l u l o s e 纤维素资源有：木浆( 纤维素9 3 8 ) 、青干草粉、木屑、糠醛渣、稻草( 蔗 渣、稻壳、麦秆、花生壳粉、玉米穗轴等) 等农副产品、滤纸( 其他纸类) 、木 纸浆、啤酒滤饼、制糖工业甜菜废丝、洋麻等【5 1 。 2 第一章绪论 1 2 纤维素酶概述 1 2 1 纤维素酶系的组成 纤维素结构复杂，任何一种单一的酶都难以高效地水解它，能降解天然纤 维素的纤维素酶是一个复杂的多酶体系。纤维素酶是由许多具有高效作用的水 解酶组成的，主要来自于真菌和细菌。根据各纤维素酶功能的不同可分为三大 酶系1 6 j - ( 1 ) 外切一p 1 ，4 葡萄糖酶( e x o - p - 1 ，4 - g l u c a n a s e ) ：此酶主要为p - 1 ，4 葡聚糖纤 维二糖酶( c b h 或c 1 酶) ，它是从纤维素的非还原糖端水解p 1 ，4 葡萄糖苷 键，产生纤维二糖。此类外切酶单独作用于天然纤维素时，几乎检测不出还原 糖的生成，对取代基纤维素如c m c 也只是微弱作用，但与内切葡聚糖协同作 用则可有效地分解天然纤维素。 ( 2 ) 内切一p 1 ，4 葡聚糖酶( e n d o b 一1 ，4 - g l u c a n a s e ，e g ) ：是随机内切纤维素分 子内的p l ，4 一葡萄糖苷键，产生纤维寡糖、纤维二糖葡萄糖，由于它并不是单 一组分，而是包括多个组分，组分数又随菌株而异，称c x 。因大都用羧甲基纤 维素( c m c ) 为底物测试其活力，故称c m c 酶。e g 可水解c m c 、膨胀纤维 素以及纤维降解中间产物纤维糊精，对纤维素的降解能力随还原末端及键长度 增加而下降。e g 专一性不强，对水溶性纤维素都有作用，取代基对酶活性影响 不大。e g 占纤维素酶制剂量的2 0 一3 0 。 ( 3 ) p l ，4 - 葡萄糖苷酶( p l ，4 - g l u c o s i d a s e ，b g ) ( e c 3 2 1 2 1 ) ：它可水解纤 维二糖、纤维寡糖及其他b 葡萄糖苷，产生葡萄糖，又称纤维二糖酶 ( c e l l o b i a s e ，c b ) 。但该酶对其底物特异性不高。b g 在纤维素酶制剂中，含量最 少，只占l 左右。 1 2 2 纤维素酶的作用机理 纤维素类物质的结构特点和酶反应的模式影响着反应速度。由于自然界中 的纤维素具有对酶高度抵制的结晶区结构，而且酶活性结合位点数是有限的， 由此决定反应速度比较慢。纤维素是否易于酶解在很大程度上决定于酶与结合 位点接触的难易性，因为这将决定酶吸附到固体底物的难易性。关于纤维素怎 第一章绪论 样转化成葡萄糖已经提出了几种不同的机制。最初的概念是r e e s e 等提出的，也 就是( c i c x ) 学说，它的基本水解模式【7 l 是： c 1c x p 葡萄糖苷酶 结晶纤维素啼无定形纤维素纤维二糖_ 葡萄糖 图1 - 3c 1 - c x 假说的酶解机理 f i g 1 3m e c h a n i s mo fc e u u l o s ed e g r a d a t i o nb ye n z y m eo fc i - c xh y p o t h e s i s 另一种观点以e n a r i 等人为代表的顺序作用假说，认为先是由外切型葡聚 糖酶( c b hi 和c b hi i ) 水解不溶性纤维素，生成可溶性的纤维糊精和纤维二糖， 然后由内切型葡聚糖酶( e gi 和e g l ) 作用于纤维糊精，生成纤维二糖；再由b g 将纤维二糖分解成二个葡萄糖。 纤维素 c b hi 、c b 纤维糊精 b hi 、c b h i i 纤维二糖 b g 葡萄糖 图l - 4 顺序作用假说 f i g 1 - 4o r d e rm o d e r o fc e l l u l o s eh y d r o l y z a t i o n 但是目前普遍接受的酶解机制是协同降解模型，即纤维素内切酶先内切无 定形纤维素产生新的末端( 还原端或非还原端) ，然后纤维素外切酶从还原端或 非还原端外切纤维素链，产生纤维二糖( 或葡萄糖) 。 皿阻l 腹菌鞲熘表解玎绣丧的结i 蝻l h 钛嚣还勰瑞承解 f 缝最汹# 锅佚 e g 书玎维磊巾瑚l 潋机摩销足邃彤k 醑缎 f 维 袅的聚白瞧 cf 蠢站龋区；r 逆繇螭；n r 嚣妻：塌 图1 - 5 协同作用降解作用模型 第一章绪论 f i g 1 - 5c o o p e r a t i o nm o d e lo fc e l l u l o s eh y d r o l y z a t i o n 1 2 3 纤维素酶的来源 纤维素酶分布非常广泛。原生动物、节肢动物、软体动物和昆虫等都能产 生纤维素酶，动物的瘤胃中有共生的纤维分解菌。在高等植物中也有纤维素酶， 其作用是使细胞壁松弛，关系到种子发芽、细胞生长。 微生物是获取纤维素酶主要来源，纤维素酶生产茵有细菌、放线茵和丝状 真菌，不同的菌种产生的纤维素酶中所含各种酶的比例是不同的，放线菌的纤 维素酶产量低，研究很少。细菌主要产葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素没 有活性，所产生酶是胞内酶或吸附在菌壁上，很少能分泌到细胞外，增加提取 纯化难度，在工业上少应用。丝状真菌具有产酶诸多优点：产生的纤维素酶为 胞外酶，酶的分离和提取方便，产酶效率高，而且产生纤维素酶的酶系结构较 为合理，同时可产生半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶等。从纤维素酶的工业化制 备及其应用角度看，研究丝状真菌产酶具有更大意义。从目前研究进展来看， 木霉、曲霉和青霉具有较为稳定的性状、优质高产纤维素酶的能力和较好“抗代 谢阻遏”能力，被认为是具有工业应用开放价值的菌株【8 j 。 1 2 4 纤维素酶的应用 目前纤维素酶的应用研究主要集中在微生物纤维素酶的应用上。现在纤维 素已被广泛地应用于食品工业、饲料加工、能源工业等多个领域中。 1 2 4 1 纤维素酶在食品工业的应用 在食品工业中，纤维素酶已被用在：水果和蔬菜汁以及橄榄油的提取，果 汁的澄清，提高谷物的浸泡效率和水分的吸收，大豆类食品发芽中豆衣的除去， 从大豆和叶子中分离蛋白质以及谷物和马铃薯中淀粉类组分的有效分离等；另 外，纤维素酶也被用来增加食品的营养成分，从纤维素废弃物中提取纤维寡糖、 葡萄糖和其他可溶性的糖，以及去除细胞壁以利于有用物质，如酶、多糖和蛋 白质的释放等。将纤维素酶用于酱油酿造，可以改善酱油质量，缩短生产周期， 提高产量。日本人在制造半化学酱油时，在大豆粉中加入纤维素酶和半纤维素 酶进行前处理，再以稀酸水解，能使残余碳水化合物减少，氮的溶出率亦提高。 我国江南部分地区采用纤维素酶对酱油进行处理，使其浓度提高，色素减少。 第一章绪论 纤维素酶运用制酒工业，可提高酒精和白酒的出酒率。在用纤维素进行酒精酿 造时，先用纤维素酶处理原料生产出葡萄糖，同时接种酿酒酵母将葡萄糖发酵 成酒精，能大大促进纤维素的糖化，提高酒精产量。 1 2 4 2 纤维素酶在饲料加工业的应用 全球每年要生产6 亿多吨饲料，价值5 0 0 亿美元。生产的饲料9 0 用 来喂养家禽、猪和反刍动物，1 0 是宠物和鱼类的饲料。一方面纤维素酶被加 入到反刍动物和单胃动物的饲料中作为一种补充；另一方面纤维素酶被用在纤 维素物质的预处理，如谷物的去壳，青贮饲料的处理等，提高反刍动物和单胃 动物的消化能力。另一个有意义的应用是含纤维素酶基因的转基因动物可以分 泌一些需要的纤维素酶到胃肠道中帮助粗糙食物的消化。 纤维素酶在纺织、造纸等方面均有很大的应用潜力，还可用瘤胃微生物分 泌的纤维素酶对城市垃圾进行处理，纤维素酶还广泛应用于医药以及制造洗涤 剂等1 9 1 2 4 3 纤维素酶在能源工业的应用 随着化石燃料尤其是液体燃料的日益紧张，利用生物技术和可再生资源进 行乙醇工业化生产，以燃料乙醇作为石油能源的替代或补充绿色能源成为各国 的研究热点【l0 1 。纤维素是地球上资源最丰富的有机物，其能量来自太阳，通过 植物光合作用固定下来。每年地球上由光合作用生成的植物体总量达1 5 x 1 0 l l k g ，4 0 是纤维素。按全球人1 2 1 平均，每人每天可分摊到5 6 蚝【1 1 】。据农业部公 布的统计数据，中国秸秆资源量达6 亿吨，目前有3 亿吨用于薪柴燃料消耗， 其余均被焚烧。按照美国每4 吨秸秆产出1 吨乙醇的技术水平，这些原料将能 生产1 5 亿吨燃料乙醇【挖】。我国在国民经济和社会发展第十个五年计划纲要 中对使用乙醇汽油提出了明确要求，国家有关部门已将其作为调整和优化产业 结构的重点工作【1 3 】。 ( 1 ) 燃料乙醇的定义与标准： 乙醇俗称酒精，它以玉米、小麦、薯类、糖蜜等为原料经发酵、蒸馏而制 成。按照我国国家标准“变性燃料乙醇”( g b l 8 3 5 0 2 0 0 1 ) 和“车用乙醇汽 油”( g b l 8 3 5 1 2 0 0 1 ) 的规定，变性燃料乙醇是将乙醇通过专用设备、特定脱水工 艺，并加入一定量的变性剂，生产出含量在9 9 2 ( v v ) 以上的无水乙醇。这种经过 变性处理后的乙醇，也称变性燃料乙醇，不能食用，仅能用于调配车用乙醇汽油【1 4 】。 其质量标准见表1 1 。 第一章绪论 车用乙醇汽油，就是把变性燃料乙醇和无铅汽油以一定比例混配形成的一 种汽车燃料，是替代和节约汽油的最佳燃料。为规范燃料乙醇发展，一些国家 制定了相应的国家标准，表1 1 为我国变性燃料乙醇国家标准( g b l 8 3 5 0 2 0 0 1 ) 。 表1 1 我国变性燃料乙醇国家标准( g b l 8 3 5 0 2 0 0 1 ) t a b1 - 1s t a n d a r d so f d e n a t u r e df u e le t h a n o lo f o u rc o u n t r y ( g b l 8 3 5 0 - 2 0 0 1 ) 项目指标 外观 乙醇( v ) 甲醇( v ) 胶质m 1 0 0 m l 。 水分( v n ) 无机氯( 以c l 一计) m g l 酸度( 以乙酸计) m g l 铜m g l p h 值m g l 清澈透明，无肉眼可见悬浮物和沉淀物 9 2 1 9 5 0 卯8 s 3 2 5 9 0 8 6 5 9 0 。 为防止车用乙醇汽油在发动机燃烧过程中腐蚀金属部件及堵塞管路系统。 标准中还规定了甲醇、实际胶质、无机氯、酸度、铜的限量指标。 车用乙醇汽油是指在不含甲基叔丁基醚( m t b e ) 含氧添加剂的专用汽油中， 按体积比加入一定比例( 我国目前暂定为1 0 ) 的变性燃料乙醇，由车用乙醇汽油 定点调配中心按车用乙醇汽油标准的质量要求，通过特定工艺混配而成的新 一代清洁环保型车用燃料【l 引。它是替代和节约汽油的最佳燃料。其质量标准见 表1 2 。 表1 - 2 车用乙醇汽油质量标准( g b l 8 3 5 1 2 0 0 1 ) t a b1 - 2q u a l i t ys t a n d a r d so f a u t o m o t i v ee t h a n o lg a s o l i n e 7 第一章绪论 。 ( 2 ) 车用乙醇汽油( 燃料乙醇汽油) 的优点是： 提高燃油品质：车用乙醇汽油中的乙醇，既是一种能源，又是一种性能 优良的汽油品质改良剂。首先，乙醇作为“绿色”增氧剂，可完全替代汽油中含氧 添加剂m t b e 的使用，因m t b e 对地下水资源危害严重，一些发达国家已立法 禁止使用。燃料乙醇按1 0 的比例混配入汽油中，可使氧含量达到3 5 ，助燃 效果好，使汽油中不能燃烧的部分充分燃烧，提高汽油的燃烧热值。而且，由 于乙醇中的辛烷值( r o n ) 指数可达1 1l ，乙醇按1 0 的比例混配入汽油中，可使 辛烷值提高2 3 个单位，提高油品的抗爆性能。 降低有害尾气排放：汽车有害尾气的排放，已成为一种严重的环境污染 源。车用乙醇汽油由于燃烧充分，可使汽车有害尾气排放总量降低3 3 以上。 根据中国汽车研究中心2 0 0 1 年所做的车用乙醇汽油8 x1 0 4 k m 行车试验检测数据 表明：排放尾气中一氧化碳明显降低，最大降低率已达5 5 ，算术平均值降低 率3 0 8 、碳氢化合物算术平均降低率为1 3 4 。 燃烧充分、减少积碳：车用乙醇汽油由于燃烧彻底，解决了普通汽油由 于燃烧不完全而形成的碳粒积聚问题，能有效地消除发动机燃烧室、气门、火 花塞、排气管、消声器等部位积碳，避免因积碳而引起故障，保证了发动机在 设计的工作点上工作，延长发动机的使用寿命。 燃油系统自洁：车用乙醇汽油中加入的乙醇是一种性能优良的有机溶剂。 具有良好的清洁作用，能有效地消除油箱和油路系统中燃油杂质的沉淀和凝结， 使油路畅通。 目前获国家批准生产变性燃料乙醇的省( 市、区) 有湖南、四川、黑龙江等十 六个省，计划生产能力约3 5 0 万吨，能满足市场发展需求的5 0 。生产变性燃 料乙醇已被国家列为产业发展重点扶持项目，鼓励有资源条件的省( 市、区) 发展 变性燃料乙醇生产【1 6 j 。 ( 3 ) 我国纤维素乙醇生产的现状： 长期来看，木薯也只是中国生产燃料乙醇的过渡性原料，还不足以改变中 国整个能源结构。承担改变中国能源结构重任的是以秸秆为代表的植物纤维。 开发大规模生产木质纤维类生物质燃料乙醇的工业技术，是解决燃料乙醇原料 第一章绪论 成本高、原料有限的根本出路。 2 0 0 6 年8 月2 6 日，天冠集团第一个1 0 0 0 0 吨年纤维乙醇生产厂在南阳市镇平 县开工奠基，其中一期3 0 0 0 n e 年生产装置将投资5 1 0 0 万元，建设期一年。投产 运行后预期成本在5 5 0 0 元吨左右，和现有粮食燃料乙醇的成本相当。建设内容 包含与本工程配套的纤维素酶生产线，以保证本项目对纤维素酶、纤维二糖酶、 木聚糖酶的需要。 华东理工大学从“八五”期间就开始研究农林废弃物生产燃料乙醇技术，先后 承担了国家“八五”、“九五”、“十五”科技攻关与8 6 3 计划，目前已经建成6 0 0 吨 年的酸水解法纤维乙醇生产中试装置，并通过了科技部的鉴定。该项目利用锯 末和稻壳为原料，目前的生产成本在6 0 0 0 元吨左右【l7 1 。 天冠万吨纤维乙醇项目进入试运行。2 0 0 8 年5 月8 日，由河南天冠集团建设 的1z i t 纤维乙醇一期产业化示范项目进入试运行阶段。项目建设包括纤维素酶和 t 纤维乙醇生产装置，基本做到纯生物制作乙醇。位于南阳市工业园建设的一期 年产50 0 0t 的纤维乙醇项目已经完工，顺利产出了第一批纤维酒精。天冠集团预 计在一期50 0 0t a 纤维乙醇基础上，进一步完善优化工艺及设备，通过半年的稳 定运行和生产，争取在2 0 1 0 年底再建2 0 个左右0 6 万1 万t 的纤维乙醇工厂，形成 初步的产业化区。2 0 1 5 年前形成纤维乙醇年产量达n l o o 万t 能力。产品除直接作 为汽油替代能源之外，同时配套建设5 0 万t a t , 烯及下游工程，实现石油资源的又 一替代【18 1 。 中国科学院于2 0 0 7 年1 2 月中旬启动“纤维素乙醇的高温发酵和生物炼制” 项目，鉴于纤维素乙醇的生产技术，设备制造、工厂的建设等问题，预计“十一五” 期间不具备大规模工业生产的能力。安徽丰原集团正在拓展燃料乙醇生产原料 和相关技术的创新，提出了秸秆原料生产乙醇先分离后发酵的工艺路线。国有 企业抢先进入非粮燃料乙醇生产领域，生物燃料的巨大市场空间强烈吸引传统 能源企业。近一年中，中石油、中海油等国内石油公司纷纷进入这一产业，紧 跟中粮集团投资生物燃料的发展热