（发酵工程专业论文）聚唾液酸发酵和分离纯化工艺的研究.pdf

摘要 摘要 聚唾液酸是唾液酸单体以0 【2 ，8 或a 2 ，9 糖苷键连接起来的线性聚合物，是少数几种 细菌的胞外荚膜多糖组分。聚唾液酸不仅是组织工程和生物医学领域中的重要支架化合 物，而且可以作为提高多肽、蛋白类药物稳定性和半衰期的可降解控释剂。聚唾液酸经 过水解后，分离纯化可以得到唾液酸，再结合化学法和酶法可以转化成为药用价值很高 的唾液酸类衍生物。 本论文研究了不同搅拌转速对大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l ik 2 3 5 分批发酵生产聚唾液 酸过程的影响，并根据发酵前、后期菌体细胞比生长速率和聚唾液酸比合成速率达到最 大值所需搅拌转速的不同，提出了两阶段搅拌转速控制策略：发酵前期( o 1 5h ) 控制 搅拌转速5 0 0r m i n ，发酵中后期控制搅拌转速7 0 0r m i n 。两阶段搅拌转速控制策略使 聚唾液酸产量达到3 9 6 6m g l ，比恒定搅拌转速5 0 0r m i n 和7 0 0r m i n 分别提高了31 8 和4 9 3 。将两阶段搅拌转速控制策略与分批补料发酵技术结合，聚唾液酸产量提高到 5 1 0 8m g l ，山梨醇的转化率达到0 1 2 g 。 研究了不同初始山梨醇浓度下的聚唾液酸分批发酵过程。结果表明，分批发酵过程 不能实现聚唾液酸高产量、高底物转化率和高生产强度的相对统一。在此基础上，研究 一次性流加、分批流加和恒速流加等不同培养方式对聚唾液酸发酵的影响，可以发现一 次性流加、分批流加和恒速流加等几种培养方式都可以实现菌体细胞和聚唾液酸的高 产。综合比较来看，一次性流加培养方式可以实现聚唾液酸高产量、高得率和高生产强 度的统一，聚唾液酸产量达至u 6 6 3 8m g l 。 在已有的研究基础上，从发酵液中提取聚唾液酸，并考察了柱层析技术和超滤技术 对聚唾液酸粗品精制的效果，确定了聚唾液酸精制的工艺，即：聚唾液酸粗品经截留相 对分子量为1 0 0k d a 超滤膜分离后，再经d e a ef a s tf l o w 离子交换层析柱、s e p h a c r y s - 2 0 0h r 凝胶层析柱分离，最终得到的聚唾液酸的纯度为9 9 7 1 ，其中蛋白质含量未 检出，内毒素含量为1 0 0 5 0 0e u m g p s a 。 关键词：聚唾液酸：搅拌转速；流加发酵；分离纯化 a b s t r a c t a b s t r a c t p o l y s i a l i ca c i di sah o m o p o l y m e ro fs i a l i ca c i dw i t ha 一2 ，8o rq - 2 ，9k e t o s i d i cl i n k a g e so ra m i x t u r eo fa - 2 ，8a n da - 2 ，9w h i c ha r ef o u n di nb a c t e r i a lc a p s u l a rh o m o p o l y s a c c h a r i d e p o l y s i a l i c a c i di sn o to n l yap r o m i s i n gs c a f f o l dm a t e r i a lf o rt h ea p p l i c a t i o ni nt i s s u e e n g i n e e r i n go ro t h e rb i o m e d i c a la p p l i c a t i o n s ，b u ta l s op o l y s i a l i ca c i dh a sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n i nc o n t r o l l e d - d r u gr e l e a s ea sp o l y s i a l i ca c i dc a l lp r o l o n gt h ea c t i v el i f ea n di m p r o v et h e p h a r r n a c o k i n e t i c so fp e p t i d e sa n dp r o t e i n s p o l y s i a l i ca c i dc a nb eh y d r o l y z e di n t os i a l i ca c i d s i a l i ca c i d sa n di t sd e r i v a t i v e sw e r eo b t a i n e da f t e rp u r i f i c a t i o na n dc o n v e r s i o nb yc h e m i c a l a n de n z y m a t i cm e t h o d s p r o d u c t i o no fp o l y s i a l i ca c i db yb a t c hf e r m e n t a t i o n s 、析t 1 1e s c h e r i c h i ac o l ik 2 3 5a t d i f f e r e n ta g i t a t i o nr a t e sw a si n v e s t i g a t e d b a s e do nt h a tm a x i m a lv a l u e so fs p e c i f i cg r o w t h r a t ea n ds p e c i f i cp r o d u c t i o nr a t eo fp o l y s i a l i ca c i do b t a i n e da td i f f e r e n ta g i t a t i o nr a t e si n d i f f e r e n tc u l t u r es t a g e s ，at w o - s t a g ea g i t a t i o nr a t ec o n t r o l l i n gs t r a t e g yw a sp r o p o s e d ，i nw h i c h a g i t a t i o nr a t ew a sc o n t r o l l e da t5 0 0r m i ni nt h ef i r s t15ha n dt h e ns w i t c h e dt o7 0 0r m i n a f t e r w a r d s a sar e s u l t ，t h ep o l y s i a l i ea c i dr e a c h e d3 9 6 6m e g l ，a sc o m p a r e dt ot h a tw i t h c o n s t a n ta g i t a t i o nr a t eo f5 0 0r m i no r7 0 0r m i n , i n c r e a s e db y31 8 a n d4 9 3 ，r e p e c t i v e l y c o m b i n e dt h et w o s t a g ea g i t a t i o nr a t ec o n t r o l l i n gs t r a t e g yw i mf e d b a t c hf e r m e n t a t i o n t e c h n o l o g y , p o l y s i a l i ca c i dw a si m p r o v e dt o510 8m g lw i t hp o l y s i a l i ca c i dy i e l do ns o r b i t o l o f 0 1 2g g d i f f e r e n ti n i t i a ls o r b i t o lc o n c e n t r a t i o n sw e r es t u d i e dt od e t e r m i n et h e i re f f e c t so n m i c r o b i a lg r o w t ha n ds u b s t r a t ec o n s u m p t i o n i tw a sc o n c l u d e dt h a th i 曲c o n c e n t r a t i o n ，h i g h y i e l da n dh i g hp r o d u c t i v i t yo fb o t hc e l la n dp o l y s i a l i ca c i dc o u l dn o tb ec o n s o l i d a t e di na b a t c hp r o c e s s t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc u l t i v a t i o nm o d e ss u c ha ss i n g l es h o r tf e e d i n g ，b a t c h f e e d i n g ，c o n s t a n t - r a t ef e e d i n go np o l y s i a l i ca c i dp r o d u c t i o nw e r ea l s oi n v e r s t i g a t e d h i 曲 p r o d u c t i o no fb i o m a s s a n dp o l y s i a l i ca c i dw e r ea l lr e a l i z e di nt h e s ec u l t i v a t i o nm o d e so f s o r b i t o lf e e d i n g a saw h o l e ，s i n g l es h o r tf e e d i n gc u l t u r ew a st h em o s ts u i t a b l ea p p r o a c ht o a t t a i nn o to n l yh i g i lc o n c e n t r a t i o n sb u ta l s oh i g hy i e l d sa n dh i g hp r o d u c t i v i t i e so fp o l y s i a l i c a c i du n d e rw h i c ht h em a x i m u mp o l y s i a l i ca c i dr e a c h e d6 6 38m g l b a s e do nt h ep r e v i o u sw o r k , p o l y s i a l i ca c i dw a se x t r a c t e df r o mf e r m e n t a t i o nb r o t h r e f i n i n ge f f e c tw a ss t u d i e db yc o l u m n sc h r o m a t o g r a p h ya n du l t r a f i l t r a t i o nt e c h n i q u e t h e o p t i m a lr e f i n i n gp r o c e s s e sw e r ea sf o l l o w s ：t h ec r u d ep o l y s i a l i ca c i dp a s s e du l t r a f i l t r a t i o n m e m b r a n e ( 10 0k d a ) ，t h e nw e r ep u r i f i e db yd e a ef a s tf l o wc o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n d s e p h a c r ys - 2 0 0h r c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i t yo fp o l y s i a l i ca c i dp r o d u c tw a s9 9 71 ，w i t ht h ep r o t e i nn od e t e c t e da n dt h eb a c t e r i a le n d o t o x i n sa t10 0 - 5 0 0e u m gp s a k e y w o r d s ：p o l y s i a l i ca c i d ；a g i t a t i o nr a t e ；f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n ；p u r i f i c a t i o n i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 彩苟 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 兹搦 导师签名： 日 期： 第一章引言 第一章引言 1 1 聚唾液酸的概述 聚唾液酸( p o l y s i a l i ca c i d ，p s a ) 是一些哺乳动物细胞中糖蛋白的组成部分和少数几 种细菌的胞外多糖组分【l 】，是一种链蛋白酶抗性的大分子 2 1 。近年来，随着对聚唾液酸 理化性质、生理功能、代谢途径等研究的深入，聚唾液酸在化妆品、医学等领域的应用 越来越广泛【3 ，4 1 。 唾液酸( s i a l i ca c i d ，s a ) 是一类神经氨酸的衍生物【5 】，在自然界广泛分布，以残基 的形式存在于糖蛋白和糖脂的末端，在许多与糖和蛋白相互作用有关的生理过程中起作 用，参与细胞表面多种生理功能，在调节人体生理、生化功能方面起到非常重要的作用 1 6 】。近年来，唾液酸在国际上被系统研究，科学家已经发现其具有许多重要的生物学功 能。 1 1 1 聚唾液酸的结构 聚唾液酸是唾液酸单体以a 2 ，8 或a 2 ，9 酮苷键( k e t o s i d i cl i n k a g e ) 连接起来的线性聚 合物【7 1 ，主要有三种结构【8 1 ，如图1 1 所示。q 2 ，8 酮苷键连接的聚唾液酸末端相邻的两个 单体形成内酯【9 】( 甲单体的羧基和乙单体的9 号碳位上的羟基脱水缩合形成) ，对聚唾液 酸的稳定起到一定的作用，这也是大多数的聚唾液酸以q 2 ，8 连接的主要原因之一【1 0 】。 江南大学硕士学位论文 图1 - 1 聚唾液酸的三种结构 f i g 1 - 1t h r e es t r u c t u r e so f p o l y s i a l i ea c i d 1 1 2 聚唾液酸的理化性质 纯的聚唾液酸是白色不定型高聚合物，在酸的作用下容易降解成单体的唾液酸。聚 唾液酸水溶性优良，低黏度，生物相容性好，具有生物可降解性【1 1j 。 1 1 3 聚唾液酸的生产方法 微生物发酵法是生产聚唾液酸的主要生产方法，此方法属于生化反应过程，所用原 料相对低廉，具有不可比拟的优点。 聚唾液酸以荚膜的形式存在于少数几种细菌细胞表面。用液体培养时，聚唾液酸以 粘液的形式释放到发酵液中。聚唾液酸进行酸水解或酶水解后，分离纯化可得唾液酸， 为制取唾液酸类药物提供工业化基础。1 9 9 0 年，c a m i n o 【1 2 】等利用大肠杆菌k 9 2 发酵生 产聚唾液酸，产量为4 5 0m g l 。1 9 8 8 年，r o d r i g u e z a p a r i c i 0 0 3 1 等利用大肠杆菌k 一2 3 5 发酵生产聚唾液酸，产量为1 3 5 0m g l ，分子量在2 0 6 0k d a 14 1 。2 0 0 8 年b a s t i a n 1 5 】等利 用ec o l ik 1 分批补料发酵生产聚唾液酸的产量为1 6 0 0m g l 。2 0 0 8 年k a p r e l l 6 1 等通过 溶氧反馈发酵，生产得到聚唾液酸产量为3 0 0 0m g l 。我国对聚唾液酸生产的研究起步 较晚，研究主要是关于菌种选育和培养基优化，如郭良栋【1 7 1 等用大肠杆菌c 8 发酵生产 聚唾液酸，产量为1 2 0 0m g l 。从1 9 9 9 年开始，詹晓北【1 8 】等开始利用大肠杆菌k 2 3 5 发 酵生产聚唾液酸和唾液酸，研究了p h 控制的补料分批发酵工艺，聚唾液酸产量达到3 5 0 0 m g l 。 1 1 4 聚唾液酸生产茵的代谢途径 e c o l ik 1 和e c o l ik 2 3 5 最常见的聚唾液酸生产菌，其代谢途径如图1 3 所示。 2 第一章引言 洲删逆蜘 p e p p v r g l c n 6 p + 一n f a 撇d h * ：- - 6 p 舢叫 g i c n 1 - p i 厂 c c o a o s g i c n a c 1 p p 哪 i 、p p u d p g i c n a c op h 2 0 卜u d p 了一恻“9 蔓缸卫歹 o x a l o a c v 眦 、 i s o c i t r a i e n a d i i + o 5 0 2 + 2 a d p - 2 a l 升n a d n a d p h + n a d - n _ e 啊+ n a i ) p 一辽 n 恻卜岫n a d ( 眦吗 呲触。咖。丸峨鸭 厂 图1 2 聚唾液酸在大肠杆菌中的合成与降解途径 f i g 1 - 2p a t h w a y so fp o l y s i a l i ca c i ds y n t h e s i sa n dd e g r a d a t i o ni nec o l i 1 1 5 聚唾液酸的用途 聚唾液酸不仅是一类重要的新型药物前体【1 9 , 2 0 】，而且是目前发现最好的能够替代 p e g 的可降解缓释剂【2 1 , 2 2 】。聚唾液酸应用于蛋白质和多肽类药物的可降解缓释剂已取得 良好效果，此类药物即将上市，争夺全球约8 0 0 亿美元的市场份额。英国的l i p o x e n 公 司临床试验了聚唾液酸化干扰素，发现其效果比p e g 化的干扰素的半衰期更长；另外 该公司还正在试验其他药物如胰岛素、天冬酰胺酶和人红细胞生长素等i z 3 ，2 4 j 。最近， l i p o x e n 公司与印度血清研究所( s e r u mi n s t i t u t eo f i n d i al t d l ) 合作生产聚唾液酸，并 且获得5 5 0 万美元的风险资金用于开发治疗糖尿病、肺炎球菌感染和丙肝药物的聚唾液 酸控释的药物。日本大洋化学公司的蛋黄唾液酸低聚糖是用蛋黄制取的一种功能性碳水 化合物，可作为婴儿的食品配料和营养增补剂【2 5 】；美赞臣公司也在其配方奶粉中提高了 江雨大学坝士学位论文 唾液酸含量，使其更接近母乳的黄金标准。美国n e o s e 医药公司目前正在研究用唾液酸 抗粘附药物来对付幽门螺旋杆菌以治疗胃溃疡和十二指肠溃疡1 2 6 1 。 1 2 课题来源 本课题是国家8 6 3 计划项目( 2 0 0 6 a a 0 2 2 2 0 7 ) “针对微生物多糖高粘度发酵的关 键技术与设备的重要组成部分。 1 3 本论文研究的目的和内容 目前国内外比较关注聚唾液酸的应用性研究，而对聚唾液酸发酵生产研究还处于起 步阶段。随着聚唾液酸在化妆品，医药等领域越来越广泛的应用，需要我们大量地生产 高纯度聚唾液酸，因此实现聚唾液酸的高产和高纯度是聚唾液酸药物工业化的关键技 术。 本论文在实验室规模上以大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l ik 2 3 5 ) 为生产菌株，从搅拌转 速和碳源流加模式的角度探索影响聚唾液酸合成的相关因素，建立高效制备聚唾液酸的 发酵模式和提纯工艺，为工业化放大生产聚唾液酸提供参考。 本论文的具体研究内容主要分为以下几个部分： 1 比较不同搅拌转速对大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l ik 2 3 5 分批发酵生产聚唾液酸过程 的影响，并根据发酵前、后期菌体细胞比生长速率和聚唾液酸比合成速率达到最大值所 需搅拌转速的不同，提出了分批发酵过程的两阶段搅拌转速控制策略，以进一步提高聚 唾液酸的合成能力。 2 在3 0l 发酵罐上考察分批发酵条件及流加发酵条件( 一次性流加、分批流加和 恒速流加) 对e s c h e r i c h i ac o l ik 2 3 5 发酵生产聚唾液酸的影响，确定较为适宜的聚唾液 酸流加发酵生产条件。 3 在实验室研究基础上从发酵液中粗提取聚唾液酸，并考察柱层析技术和超滤技术 对聚唾液酸粗品分离纯化的效果，确定聚唾液酸精制的工艺流程，进一步提高聚唾液酸 的纯度，降低聚唾液酸样品中蛋白质和内毒素的含量。 4 第二章实验材料与方法 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 e s c h e r i c h i ac o l ik 2 3 5 w x j y l 1 1 ( 诱变突变株) 。 2 1 2 培养基 1 斜面培养基( g l ) n a c l5 ，胰蛋白胨1 0 ， 2 上罐一级种子培养基( g l n a c l5 ，胰蛋白胨1 0 ， 3 上罐二级种子培养基( g l 牛肉膏3 ，p n7 2 7 4 ，琼脂1 5 - 2 0 。 牛肉膏3 ，p h 7 2 7 4 。 山梨醇2 0 ，硫酸铵0 6 2 5 ，磷酸氢二钾2 5 ( 含结晶水) ，m g s 0 40 9 ，胰蛋白胨1 5 ， p h 7 8 。 4 上罐发酵培养基( g l ) 山梨醇6 0 ，硫酸铵2 ，5 ，磷酸氢二钾浓度为2 5 ( 含结晶水) ，m g s 0 40 9 ，胰蛋白 胨1 5 ，p h7 8 。 2 1 3 主要试剂 山梨醇 牛肉膏 胰蛋白胨 琼脂 ( n 1 4 4 ) 2 s 0 4 k 2 h p 0 4 , 3 h 2 0 n a c l h c l n a o h c u s 0 4 无水m g s 0 4 h 2 s 0 4 正丁醇 丁酸丁酯 间苯二酚 唾液酸标准品 食品级 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 s 东莞市嘉蜜宝糖液有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 p f a n s t i e h ll a bi n e 公司 江南大学硕士学位论文 n a l 0 4 s n c l 2 2 h 2 0 变色酸 珍珠岩 酒精 c p c 考马斯亮蓝g 2 5 0 牛血清蛋白 无水乙醇 鲎试剂 细菌内毒素检查用水 细菌内毒素工作标准品 2 1 4 层析柱填料 填料名称 d e a ef a s tf l o w s u p e r d e x7 5p g s e p h a e r ys - 2 0 0h r 2 1 5 主要仪器 仪器名称 7 l 发酵罐 n b s 摇床 电子天平 高速冷冻离心机 分光光度计 p h 计 隔水式电热恒温培养箱 电热鼓风干燥箱 3 0 l 发酵罐 恒温水浴锅 水循环真空泵 离心超滤管( 1 0 0k d a ) a k t a 分离纯化系统 分析纯 分析纯 分析纯 工业级 工业级 化学纯 分析纯 生化试剂 化学纯 化学纯 化学纯 化学纯 型号 h i p r e p16 6 0 h i l o a d1 6 6 0 h i p r e p16 6 0 型号 b i o f l o l l 0 c 2 9 w t 2 1 0 2 3 k 1 5 7 2 2 i n o l a bl e v e ll p x y d h s 35 x 4 0 1 0 1 2 n l f 2 2 h h s s h z d ( i ) v i v a s p i n 黼人e x p l o r e r1 0 0 6 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 信阳市崇真助滤剂有限公司 江南大学物资库提供 上海青浦合成试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 湛江安度斯生物有限公司 湛江安度斯生物有限公司 湛江安度斯生物有限公司 生产厂家 美国g e 公司 美国g e 公司 美国g e 公司 生产厂家 n b s n b s 江苏常州万得天平仪器厂 美国s i g m a 公司 上海精密科学仪器有限公司 德国w t w 公司 上海跃进医疗器械厂 上海实验仪器总厂 瑞士比欧生物工程公司 江苏省医疗器械厂 浙江黄岩求精真空泵厂 德国赛多利斯公司 瑞典安玛西亚公司 第二章实验材料与方法 2 2 实验方法 2 2 1 培养方法 1 菌种活化 将保存的斜面菌种，接一环到新鲜的斜面培养基上，3 7 ，培养1 2h 。 2 种子培养 一级种子培养：将一环生长良好的斜面培养物接种至装有1 0 0m 1 种子培养基的5 0 0 i i l l 三角瓶中培养，摇床转速2 5 0r m i n ，温度3 7 ，培养8 1 0h 。 二级种子培养：将4m l 一级种子接入至装有1 0 0m l 的种子培养基的5 0 0m l 三角瓶 中培养，摇床转速2 5 0r m i n ，温度3 7 ，培养1 2h 。 3 发酵罐培养 7l 发酵罐分批培养及控制方式：装液量为4l ，接种量4 ( v v ) ，发酵温度3 7 ， 通气量1 5 v v m 。灭菌前加入少量泡敌以控制发酵过程中的泡沫。发酵过程中待p h 自 然降至6 4 时，流加2m o l l n a o h 控制p h 恒定，搅拌转速按要求调整。 3 0l 发酵罐分批培养及控制方式：装液量为1 8l ，接种量4 ( v v ) ，发酵温度 3 7 ，搅拌转速6 0 0r m i n ，通气量1 5 v v m 。灭菌前加入少量泡敌以控制发酵过程中的 泡沫。发酵过程中待p h 自然降至6 4 时，流加氨水控制p h 恒定。 3 0l 发酵罐流加发酵培养及控制方式：装液量为1 8l ，接种量4 ( v v ) ，发酵温 度3 7 ，搅拌转速6 0 0r m i n ，通气量1 5 v v m 。灭菌前加入少量泡敌以控制发酵过程 中的泡沫。发酵过程中待p h 自然降至6 4 时，流加1 2 5 氨水控制p h 恒定。发酵一定 时间后向发酵罐中按要求流加山梨醇。 2 2 2 分析方法 1 聚唾液酸的测定：间苯二酚法【2 7 】 r 试剂的配制：间苯二酚o 2g 溶解在l om l 水中，并加入8 0i i l l 浓盐酸和0 2 5m lo 1 m o l l 的硫酸铜，去离子水定容到1 0 0m l 。 标准曲线的绘制：分别吸取0 ，0 2 ，0 4 ，0 6 ，0 8 ，1 0 ，1 2 ，1 4 ，1 6 ，1 8m l1 0 0 m g l 的标准唾液酸溶液于试管中，加水至2 0m l ，加入2 om lr - 试剂，沸水浴1 5r a i n ， 流水冷却后加入4 0m l 有机溶液( 丁酸丁酯：正丁醇，8 5 ：1 5 ，v v ) ，剧烈振荡，冰水浴 冷却1 0m i n ，离心( 1 0 0 0r m i n ，5 m i n ) ，将有机相转入lc m 比色皿中，以水作对照试 验，在5 8 0 n l i l 处测光密度。 样品分析：发酵液经离心( 4 0 0 0r m i n ，1 5m i n ) 得上清液，吸取o 0 3 0 1m l 上清液 于试管中，操作步骤与做标准曲线相同，测得的光密度由标准曲线查算出样品液的聚唾 液酸量。 2 山梨醇的测定【2 8 】 高碘酸钠溶液：0 4gn a l 0 4 溶于1 0 0m l 的1 6 的硫酸溶液。 氯化亚锡溶液：2 3 5gs n c l 2 2 h 2 0 溶于1 0i t l l 浓盐酸，加热溶解，定容至1 0 0m l 。 变色酸溶液：取5 0g 变色酸钠盐溶于去离子水，定容至1 0 0m l ，0 保存2 4h 后 7 江南大学硕士学位论文 备用，测定时吸取上述溶液41 1 1 l ，用9 6 硫酸定容至1 0 0m l 。 山梨醇标准曲线绘制：分别吸取0 ，0 2 ，0 4 ，0 6 ，0 8 ，1 0 ，1 2 ，1 4 ，1 6 ，1 81 1 1 l 1 0 0m g l 的标准山梨醇溶液于试管中，加水至2 0m l ，加入o 5m l 高碘酸钠溶液，反应 1 0m i n ，加入0 5m l 的氯化亚锡溶液终止反应。加入5 oi i d 变色酸溶液，沸水浴反应3 0 m i n ，冷水浴冷却，加入去离子水稀释至2 5i i d 。以作对照试验，于5 7 0n n l 处测光密度。 样品分析：发酵液经离心( 4 0 0 0r m i n ，1 5m i n ) 得上清液，稀释一定倍数后，吸取 2 om l 样液于试管中，操作步骤与做标准曲线相同，测得的光密度由标准曲线查算出样 品液的山梨醇。 3 菌体浓度测定 吸取o 5i i l l 样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，摇匀，采用7 2 2 分光光度计于6 0 0n n l 测定o d 值，乘以稀释倍数。所得的o d 值与吸光度菌体干重曲线对照，计算出菌体浓 度。 4 蛋白质含量的测定：考马斯亮蓝结合法【2 9 】 标准蛋白液：牛血清白蛋白( o 1m g m 1 ) ，准确称取牛血清白蛋白0 2g ，用0 9 n a c i 溶液溶解并稀释至2 0 0 0m l 。 染液：考马斯亮蓝g 2 5 0 ( 0 0 1 ) ，称取o 1g 考马斯亮蓝g 2 5 0 溶于5 0m 1 9 5 乙 醇中，再加入1 0 0m l 浓磷酸，然后加蒸馏水定容到1 0 0 0m l 。 蛋白质标准曲线的绘n - 取o ，0 1 ，0 2 ，0 3 ，o 4 ，0 6 ，0 8 m l 蛋白质标样( 0 1m g m 1 ) ， 加水至1 “。加入4i i d 考马斯亮蓝染液，放置3 分钟后，于5 9 5n l l l 处测吸光值。 样品分析：取一定体积的样品液，其蛋白质含量不超过1 0 0m g ，其测定方法与标准 曲线测定方法相同。 5 内毒素的测定：凝胶法1 3 0 j 选择所需的规格及灵敏度的鲎试剂、细菌内毒素工作品及细菌内毒素检查用水。准 备各种规格吸管或移液器或注射器、稀释内毒素用玻璃管、反应试管架、计时器、旋涡 混合仪、恒温水浴箱( 3 7 4 - 1 ) 。 稀释细菌内毒素工作品：取内毒素工作品( 冻干品) 1 支，开启，按细菌内毒素工 作品使用说明书加入检查用水溶解后分步稀释至所需浓度备用。 鲎试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇至少3 0 秒 至试剂完全溶解。注意不要引起气泡，溶解后的试剂应在短时间内使用( 即配即用) 。 检查操作：取复溶后的o 1m l 支规格的鲎试剂原安瓿8 支，其中2 支作供试品管， 2 支作阴性对照管，2 支作阳性对照管，2 支作供试品阳性对照管。每支供试品管加入 o 1i i d 供试品；阴性对照管加入0 1m l 检查用水；阳性对照管加入0 1 叫浓度为2 九的 内毒素溶液，供试品阳性对照管加入o 1i i l l 含2 九内毒素的供试品。封闭管口，轻轻摇 匀，垂直放入3 7 + 1 的恒温器中孵育6 0 4 - 2 分钟，然后取出观察结果。试管在孵育期间 应避免任何的振动。( 九为凝胶法鲎试剂的标示灵敏度，单位是e u m l 。) 结果判断：将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转1 8 0 度时，管内的内容物呈坚实 凝胶，不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为( + ) ；不呈凝胶或虽生成凝胶但不能 8 第二章实验材料与方法 保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为( 一) 。阴性对照管均为阴性，阳性对照管、 供试品阳性对照管均为阳性，试验有效，否则无效。 6 聚唾液酸纯度的测定 将解离得到的溶液用酒精沉淀，沉淀物经7 5 酒精洗涤后干燥，得到聚唾液酸样品。 取一定质量的样品溶于水后，测定其中p s a 含量。 7 聚唾液酸分子量及纯度的鉴定 采用高效凝胶过滤色谱法( h p g f c ) 色谱条件：色谱柱u l t r a h y d r o g e l “l i n e a r3 0 0m m x7 8t u m i d 2 ；流动相0 1m o l l n a n 0 3 ，流速0 9m l m i n ；柱温4 5 。 样品制备：样品溶解于流动相中，用微孔过滤膜过滤后供进样。 9 第三章结果与讨论 第三章结果与讨论 3 1 两阶段搅拌转速控制策略发酵生产聚唾液酸 好氧发酵过程中的溶解氧既是重要的环境因素，也是参与菌体生长、细胞代谢维 持和产物形成不可或缺的营养因素。氧在好氧微生物生命活动过程中的作用主要有参与 微生物细胞内的氧化反应、作为细胞内呼吸链末端电子受体和维持细胞内氧化还原电位 等。因此，如何保证发酵过程中氧的供给既能满足生产菌株对氧的需求，又使氧的供需 矛盾不成为发酵生产的限制因素，是稳定和提高生产、降低成本的关键。 微生物发酵法是聚唾液酸生产的主要方法。目前对聚唾液酸发酵生产的研究还处 于初步阶段，主要集中在通过优化营养条件提高聚唾液酸的产量，而环境条件也是提高 聚唾液酸产量的重要影响因素之一。聚唾液酸发酵生产属于好氧发酵，搅拌作用直接影 响发酵基质的传递和溶氧水平，最终与发酵生产能力和产品质量息息相关，是发酵过程 优化控制的重要参数。 本研究着眼于搅拌转速对e s c h e r i c h i ac o l ik 2 3 5 分批发酵生产聚唾液酸过程的影响， 在考察不同搅拌转速对其影响的基础上，提出了两阶段搅拌转速控制策略，以进一步提 高聚唾液酸的合成能力。 3 1 1 搅拌转速对聚唾液酸分批发酵过程的影响 搅拌在聚唾液酸发酵过程中有两个作用：一方面，强化气液间氧的传递，既维持发 酵液中有足够的溶氧，为细胞提供氧气，又可使发酵液中的各营养基质混合均匀，有利 细胞的吸收和利用；另一方面，搅拌产生剪切作用，既影响细胞的生长，又可加速细胞 荚膜( 主要为聚唾液酸) 从细胞表面脱离。但是，聚唾液酸大分子过早从细胞表面脱离 也会影响聚唾液酸的分子量，因此在聚唾液酸发酵过程中必须控制合适的搅拌转速。本 研究分别选择三个搅拌转速( 3 0 0r m i n ，5 0 0r m i n 和7 0 0r m i n ) 来考察其对聚唾液酸分 批发酵过程的影响，结果如图3 1 所示。 t i m e ( h ) ) _ b i o m l t s $ 叶卜p s a 9 一s o r b i t o l1 6 r d o 哪 姗 咖 2 野 o 江南大学硕士学位论文 t i m e ( h ) 呤b i o m u s s 廿p s a 弋内r b i t o l4 d 0 t i m e ( h ) - 比恒定搅拌转速( 5 0 0r m i n 和7 0 0r m i n ) 下聚唾液酸产量分别 提高y 3 1 8 和4 9 3 ：山梨醇的转化率( 0 0 9 5g g 比恒定搅拌转速( 5 0 0r m i n 和7 0 0 r r a i n ) 下山梨醇转化率分别提高了4 7 9 和2 5 5 。将两阶段搅拌转速控制策略与分批补 料发酵技术结合，聚唾液酸产量进一步提高至u 5 1 0 8m g l ，山梨醇的转化率提高到0 1 2 g g 。 3 2 聚唾液酸流加分批发酵工艺 聚唾液酸发酵是典型的生长耦联型发酵，产量随着菌体的生长而增加。因此为了增 加聚唾液酸产量，必须想办法提高培养体系中细胞密度，而流加发酵方式是工业上较为 理想的选择。流加发酵即补料分批培养，是种介于分批发酵和连续发酵之间的特殊培 养模式，它是在微生物的分批培养过程中向生物反应器中间歇或连续补加一种或多种限 制性底物直到培养结束后才排出培养液的一种操作方式【3 4 】。早在1 9 1 5 年酵母生产者就 将流加发酵技术应用于调节面包酵母在麦芽汁中分批培养的生长速度，但直到1 9 7 3 年 咖 咖 哪 咖 咖 咖 6 5 4 3 2 l o 、i，薯宣一 江南大学硕士学位论文 才由y o s h i d e l 3 5 1 提出“补料分批培养这个术语，并从理论上采用数学模型对其进行了 深入的研究。补料分批培养操作能使发酵系统中保持低的营养物浓度，一方面消除了碳 源快速利用引起的阻遏效应，另一方面又避免了培养基中某些成分的毒害作用，而且还 可以起到稀释发酵液以降低粘度的效果。由于流加发酵可以延长细胞对数生长期和平衡 期的持续时间，增加生物量和平衡期细胞代谢产物的积累，因此发酵工业中大多采用这 种培养方式进行生产【3 6 】。流加发酵的类型很多，按补料的方式分有连续补料、不连续补 料和多周期补料等；而每次补料又分为快速补料、恒速补料、指数速率补料和变速补料 等。 本实验室前人根据经验确定的变速补料发酵过程中，碳氮源过多的累积，对菌体的 生长以及产物合成的一些酶系产生了抑制，从而导致菌体量开始下降，影响了聚唾液酸 的产量。因此如何在较短时间内提高细胞密度和聚唾液酸的产量就一直成为研究者们努 力的方向之一，其中采用流加发酵方式是最主要的方法。 基于以上的考虑，本研究首先考察了分批发酵下细胞的生长情况和聚唾液酸的合成 过程，并在此基础上重点研究了不同的流加方式( 一次性流加，分批流加和恒速流加) 对细胞培养及聚唾液酸合成的影响。 3 2 1 分批培养下聚唾液酸的发酵过程 碳源是构成细胞和聚唾液酸的碳架及能量来源，在聚唾液酸分批发酵过程中，碳源 ( 山梨醇) 浓度决定着培养基的碳氮比，直接影响到细胞的增殖速度。但是较高的初糖 浓度会影响细胞合成聚唾液酸的能力，从而导致聚唾液酸产量明显降低，而较低的初始 山梨醇浓度又会限制细胞的生长，不能得到较高的生物量，进而影响聚唾液酸的总产量， 因此为了得到较高的细胞得率和聚唾液酸产率，首先考察了两种初糖浓度( 4 0g l 和6 0 g l ) 条件下聚唾液酸的发酵过程，如图3 5 所示。 从图3 5 可以看出，当初始山梨醇浓度为4 0g l 时，随着发酵的进行，细胞快速生 长，聚唾液酸也不断合成，山梨醇浓度迅速下降。发酵1 4h 时，菌体细胞生长进入平衡 期；聚唾液酸合成速率明显降低；山梨醇浓度低于1 0g l 。发酵结束时，聚唾液酸最终 产量达到3 2 8 3m g l 。如图3 5 ( b ) 所示，当初始山梨醇浓度为6 0g l 时，整个发酵过 程中，山梨醇浓度不断降低，发酵结束时山梨醇剩余8 2 8g l 。发酵1 8h 时细胞生物量 达到最大值( 1 4 8 8g l ) ，发酵结束时聚唾液酸最终产量达到4 3 0 8m g l 。 1 6 第三章结果与讨论 毫 邑 磊 毫 三 磊 l i n i t i a ls o r b i t o l ：( a ) 4 0g l ；( b ) 6 0g l 图3 - 5 分批培养方式下的聚唾液酸发酵过程 f i g 3 - 5t i m e - c o u r s eo fp o l y s i a l i ca c i db a t c hf e r m e n t a t i o n 对不同初始山梨醇浓度下的分批发酵过程进行总结( 表3 2 ) ，初始山梨醇浓度从 4 0 9 l 提高至6 0 l ，细胞对山梨醇的利用速率加快，山梨醇的平均消耗速率、菌体生物 量和聚唾液酸产量相应提高；细胞及聚唾液酸的生产强度也呈上升趋势。而与之相对的 是，最终菌体细胞对山梨醇产率系数和聚唾液酸对山梨醇产率系数明显降低。由此可见， 分批发酵过程并不能实现高产量、高得率和高生产强度的统一。 对于菌体细胞生长和聚唾液酸合成，提供足够的山梨醇是必需的。所以选择整个发 酵过程中总的山梨醇浓度为6 0 l 是合适的，但是有必要通过流加发酵方式来解除高山 梨醇浓度对菌体细胞生长的抑制，并通过流加细胞生长和产物合成所需的碳源，提高细 胞生长量，以期进一步提高目标产物聚唾液酸的产量，实现聚唾液酸发酵生产的高产量、 高得率和高生产强度的统一。 1 7 、_，暑vlo=qi息w 加 如 加 m o 一、_，嚣一10=二lo 砷 卯 如 加 璩 o 江南大学硕士学位论文 表3 - 2 不同初始山梨醇浓度聚唾液酸分批发酵过程动力学参数比较 t a b l e3 - 2c o m p a r i s o no fp a r a m e t e r si nb a