（环境科学专业论文）操纵细胞cam活性对转基因烟草谷胱甘肽和抗坏血酸代谢的影响.pdf

云南师范大学硕士研究生学位论文 缩写表 云南摔范大学壤士研究生学位论文 云南师范大学硕士研究生学位论文 摘要 本文以诱导表达细胞质c a m 的转基因烟草h 1 1 c 和h 1 - 2 c 为实验材料，研 究了操纵细胞c a m 活性对谷胱甘肽和抗坏血酸代谢的影响。 本实验的结果主要分为三个部分： 第一部分利用改进的磷酸二酯酶法测定经过筛选的能良好诱导表达细胞 质c a m 的两个转基因烟草株系h 1 1 c 和h 1 2 c 的c a m 活性。一方面研究经过t c 诱导后转基因烟草中谷胱甘肽含量的变化，同时对经过t c 诱导后的转基因烟草施 加外源c a m 抑制剂处理，测定转基因烟草中谷胱甘肽含量的变化。结果证实：与 未转化的亲本材料h o 2 0 2 0 相比，经过t c 诱导后，转基因烟草株系h 1 1 c 和h 1 2 c 的c a m 的活性显著上调，伴随着c a m 活性的上调，两个转基因烟草的总谷胱甘 肽含量也显著上升，c a m 活性上调幅度大的转基因烟草株系，其谷胱甘肽含量的 上升幅度也比较大( 如h 1 1 c ) ；对经t c 诱导后的转基因烟草h 1 - l c 和h 1 - 2 c 施加 外源c a m 抑制剂后，随着c a m 活性的下降，谷胱甘肽的含量也出现相应的下降 趋势。这就暗示了c a m 活性影响着烟草中谷胱甘肽代谢。 第二部分在第一部分结果的基础上进一步研究c a m 对影响谷胱甘肽生 物合成的两个重要限制因素半胱氨酸含量和y 谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的 调控。结果表明：与未转化的对照h o - 2 0 2 0 相比，经过t c 诱导后，转基因烟草株 系h 1 。l c 和h 1 2 c 的半胱氨酸含量以及y 谷氨酰半胱氨酸合成酶活性显著上升， 而当对经t c 诱导后的转基因烟草h 1 1 c 和h 1 - 2 c 施加外源c a m 抑制剂后，半胱 氨酸含量随着c a m 活性的降低而增加，y 谷氨酰半胱氨酸合成酶活性随着c a m 活性的降低而降低。在实验中我们还发现，无论对转基因烟草进行t c 诱导，或是 经过t c 诱导后施加外源c a m 抑制剂处理，控制半胱氨酸生物合成的关键酶0 乙 酰丝氨酸硫解酶( o a s t l ) 都表现出和半胱氨酸相同的变化趋势。 第三部分进一步研究了c a m 对反映细胞氧化还原状态的g s h g s s g 和 a s d h a 的调控，结果表明经t c 诱导后的转基因烟草总抗坏血酸含量显著上升； 而对经t c 诱导的转基因烟草施加外源c a m 抑制剂后，总抗坏血酸含量显著下降。 另外c a m 对谷胱甘肽抗坏血酸循环中的两个关键酶，即谷胱甘肽还原酶( g r ) 、 抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 也具有调控作用，因此我们推论c a m 通过对g r 和 云南师范大学硕士研究生学位论文 a p x 的调控，实现对反映细胞氧化还原状态的g s h g s s g 和a s a d h a 的调控。 以上研究结果表明，c a m 在转基因烟草谷胱甘肽代谢中，通过对谷胱甘肽生 物合成过程的两个限制因素半胱氨酸和y 谷氨酰半胱氨酸合成酶的调控，实 现对谷胱甘肽代谢的调控。同时c a m 对抗坏血酸谷胱甘肽循环中具有重要作用的 谷胱甘肽还原酶( g r ) 、抗坏血酸专一性过氧化物酶( a p x ) 也具有调控作用， 以此调节细胞氧化还原状态，即g s i - i g s s g 和a s a d h a 的比例。 关键词：转基因烟草、钙调素、谷胱甘肽、抗坏血酸、代谢、氧化还原状态 4 云南师范大学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t u s i n gt w os e r i e so f t r a n s g e n i ct o b a c c oe x p r e s s i n gc 舛o s o l i cc a m 镐e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s ，t h ee f f e c t so f c a ma c t i v i t yo ng l u t a t h i o n ea n da s c o r b a t ea c i dm e t a b o l i s mw a s s t u d i e d t h i sr e s e a r c hi n c l u d e st h r e ep a r t s ： p a r t1c a ma c t i v i t yo f 2s e l e c t e dt r a n s g e n i ct o b a c c ol i n e s 饵1 - 1 ca n dh 1 - 2 c ) w e r em e a s u r e db yp h o s p h d i e s t a r a s e t h e nw es t u d i e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc a m a c t i v i t ya n dg l u t a t h i o n em e t a b o h s mi nt r a n s g e n ct o b a c c o t c i n d u c i b l et r a n s g e n i c t o b a c c oe x p r e s s i n gc y t o s o l i cc a ms h o w e dt h eh i g h e rc o n t e n t so fg l u t a t h i o n et h a nt h o s e w i t h o u tt c - i n d u c t i o na n dc o n t r o l ( h o - 2 0 2 0 ) t h em o r ec a ma c t i v i t yo ft r a n s g e n i c t o b a c c ow a si n c r e a s e d ，t h em o r eg l u t a t h i o n ec o n t e n t sd e t e c t e d ( s u c h 髂h l - l c ) ；o nt h e c o n t r a r y , a f t e rt c - i n d u c t i o n ，t h et r a n s g e n i ct o b a c c ol e a fd i s kw e r et r e a t e dw i t hc a m i n h i b i t o r s ，a n dt h e nt h eg l u t a t h i o n ec o n t e n t sw e r eg r e a t l yd e c r e a s e d 硒t h ec a ma c t i v i t y d i d t h er e s u l t sa b o v ei m p l i e dt h a tc a mm i g h tp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n g g l u t a t h i o n em e t a b o l i s mi np l a n t s p a r t2 b a s e do nt h er e s u l t so f t h ep a r t1 ，w es t u d i e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n c a ma c t i v i t ya n dt h em o s ti m p o r t a n tr e s t r i c tf a c t o r si nt h eg l u t a t h i o n eb i o s y n t h e s i s w h i c hi sc y s t e i n ec o n t e n t sa n dy - g h i t a m y l c y s t e i n es y h t h e t a s e ( - t - e c s ) a c t i v i t y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec y s t e r i n ec o n t e n t sa n d ? - e c sa c t i v i t yo ft h et r a n s g e n i ct o b a c c o w e r eg r e a t l yi m p r o v e da f t e rt c - i n d u c t i o n w h e nt h ec a mi n h i b i t o r sw e r ea d d e dt ot h e t r a n s g a n i ct o b a c c ol e a f d i s kt h a ta f t e r r e i n d u c t i o n , t h ec y s t e i n ec o n t e n t sb e c a m eh i g h e r a n dt h e7 - e c sa c t i v i t yo b v i o u s l yd e c r e a s e dt h a nt h o s ew i t h o u tt c - i n d u c t i o na n dc o n t r o l f h 0 - 2 0 2 0 ) i na d d i t i o n , w em e a s u r e dt h ea c t i v i t y o f0 - a c e t y l s e r i n e ( t h i 0 1 ) l y a s e ( o a s - t l ) w h i c hi st h ek e ye n z y m eo fc y s t e i n eb i o s y n t h e s i s ，a n dt h ee n z y m es h o w e d t h es a l n ec h a n g et e n d e n c ya st h ec y s t e i n ed i d p a r t3w es t u d i e dt h er e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fc a mt oc o n t r o lt h e g s g g s s ga n da s a d h ar a t i ow h i c hr e p r e s e n tt h ec e l lr e d o xs t a t e t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt c - i n d u c i b l et r a n s g e r f i ct o b a c c os h o w e dt h ei n c r e a s e dc o n t e n t so f a s c o b a t ea c i dt h a nt h o s ew i t h o u tt c - i n d u c t i o n ；o nt h ec o n t r a r y , w h e nt h ec a m 云南师范大学硕士研究生学位论文 i n h i b i t o r sw e r ea d d e dt ot h eu m s g e n i ct o b a c c ot h a ta f t e rt c - i n d u c t i o n , t h ea s c o b a t e a c i dc o n t e n t sw e r eg r e a t l yd e l e t e & i na d d i t i o n ，c a ma c t i v i t yc o u l di n f l u e n c et h e a c t i v i t yo fg l u t a t h i o n er e d u c t a s e ( g r ) a n da s c o b a t ep e r o x i d a s e ( a p 均w h i c hi st h e m o s ti m p o r t a n te n y m e si na s c o b a t e - g l u t a t h i o n ec y c l e t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tc a mm i g b tp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei ng l u t a t h i o n ea n d a s c o r b a t ea c i dm e m b o l i s mi nt r a n s g e n i ct o b a c c o i na d d i t i o n c a mc a na l s oa f f e c tt h e g s h g s s ga n da s a d h ar a t i ot h a tr e p r e s e n t st h ec e l lr e d o xs t a t e ，w h i c hi sr e c h i v e d b yc o n t r o l l i n g o fg ra n da p xa c t i v i t yt h a ta r et h e k e ye n z y m e s i i l a s c o r b a t e - g l u t a h i o n ec y c l e k e yw o r d s ：t r a n s g e n i ct o b a c c o ；c a l m o d u l i n ；g l u t a t h i o n e ；a s c o r b a t ea c i d ；m e t a b o l i s m ； c a l m o d u l i ni n h i b i t o t 6 云南师范大学硕士研究生学位论文 i 引言 植物细胞在其生命活动中，由于需氧的代谢活动以及叶绿体、线粒体和质膜 上每时每刻都发生的电子传递过程中的电子泄露，不可避免的会产生大量的活性 氧( r o s ) ，如超氧阴离子自由基( 0 2 ) ，羟自由基( o h ) ，过氧化氢( n 2 0 9 ，单线 态氧( 1 0 2 ) 等( a p e l 和h i r t ，2 0 0 4 ) 。活性氧会导致生物大分子及膜系统的过氧化反 应( c o n h i i l 等2 0 0 1 ；j i a n g 和z h a a g ，2 0 0 1 ；n a g a l a k s h m i 和p r a s a d ，2 0 0 1 ；t h o m a s 等，2 0 0 1 ；g r a h a m 等，1 9 9 8 ) ，并打破细胞内的氧化还原状态( c o o k 等，2 0 0 4 ) 。 近年来越来越多的实验表明细胞内的氧化还原状态能够直接影响细胞的生存和增 殖，同时也会引起负向的反应，如生长抑制和细胞死亡。细胞自身具有完整的调 控体制来调节内环境的氧化还原状态，以保持细胞免受过量的氧化压力的刺激，保 证细胞正常的生理功能。首先，细胞具有自己的氧化还原缓冲体系，其次细胞还 具有由多种抗氧化剂分子和抗氧化酶组成的抗氧化系统( 周彦等，2 0 0 0 ) 。它们都 可以直接或间接的清除r o s ，因此在植物的生命活动中具有举足轻重的作用。 谷胱甘肽和抗坏血酸即是植物中最主要的抗氧化剂( 刘家忠和龚明，1 9 9 9 ) ， 同时也是细胞中最重要的氧化还原缓冲体系( 熊爱生等，2 0 0 2 ) 。谷胱甘肽在植物 体内含量丰富，它在还原态硫的储存和转运以及蛋白质和核酸的合成过程中有重 要作用。抗坏血酸也广泛的存在于植物体内，几乎所有植物细胞器中都含有抗坏 血酸( n o c t o r 和f o y e r ，1 9 9 8 ) 。它除了在植物抵抗氧化胁迫方面具有重要作用外， 还可以调节细胞的分裂和伸长，并参与某些基因的转录和翻译( h o m m a n 等，2 0 0 0 ) 。 植物体内谷胱甘肽和抗坏血酸水平的高低与植物对各种生物及非生物胁迫的忍耐 程度密切相关( 陈坤明等，2 0 0 4 ；m a y 等，1 9 9 8 ) 。 谷胱甘肽是一个由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的小分子三肽化合物，是 细胞内最为丰富的非蛋白巯基化合物( n o c t o r 等，1 9 9 7 ；a l s c h e r ，1 9 8 9 ；m e y e r 和 f f i c k e r ，2 0 0 2 ) 。谷胱甘肽在植物体内以还原型( g s h ) 和氧化型( g s s g ) 的方式存在， 二者可以在相关酶的作用下互相转化。在氧化状态，g s h 在谷胱甘肽过氧化物酶 ( g p x ) 的作用下被氧化为g s s g ，后者在谷胱甘肽还原酶( g r ) 的作用下以n a d p h 作为电子供体，还原成g s h ( n o c t o r 等，1 9 9 8 ) ，因而构成胞内一个主要的氧化还原 缓冲体系，g s h ，g s s g 的比例反映了细胞的氧化还原状态。在生理条件下以g s h 云南师范大学硕士研究生学位论文 占绝大多数，g s h g s s g 的比例接近9 0 ( c o o k 等2 0 0 4 ) 。谷胱甘肽的主要生物学 功能是保护生物体内蛋白质的巯基，从而维护蛋白质的正常生物活性，同时它又 是多种酶的辅酶和辅基。谷胱甘肽分子结构中含有一个特异性的y 一肽键，由谷氨 酸的r 一羧基与半胱氨酸的a 一氨基缩合而成，且半胱氨酸侧链基团上连有一个活 泼巯基，是其许多重要生理功能的结构基础。这个巯基具有很强的亲和力，能够 与多种化学物质及代谢产物结合，清除体内的超氧阴离子自由基，保护细胞膜的 完整性，具有抗脂质氧化作用，使细胞免受其害，从而维持细胞的正常代谢( 周宇 光等，2 0 0 3 ) 。细胞巯基的氧化还原状态的变化被认为是细胞信号转导氧化还原调 节的关键因素，有实验指出，某些转录因子的d n a 结合能力依赖于g s h 中半胱氨 酸残基上的巯基基团的氧化还原状态( s t a a l 等，1 9 9 0 ；s u z u k i 和f o r d ，1 9 9 9 ) 。因此 对g s h g s s g 的调节是氧化还原调节的一种重要形式，g s h g s s g 在细胞信号传导 过程中的多个环节发挥着重要的调节作用( b a r f o r d ，2 0 0 4 ；p a o l i c c h i 等，2 0 0 2 ) 。 目前，还原型谷胱甘肽( 6 s h ) 的生物合成途径已经得到了肯定的证实，它是两 个依赖a t p 的步骤：( 1 ) 由l - 谷氨酸和l 半胱氨酸合成y - 谷氨酰半胱氨酸( y - e c ) ； ( 2 ) y e c 的c 末端和甘氨酸结合成g s h 。这两个反应分别由y - 谷氨酰半胱氨酸 合成酶( y e c s ) 和谷胱甘肽合成酶( c s ) 催化( n o c t o r 等，1 9 9 8 ；麦维军和张明永， 2 0 0 5 ) 。但是普遍认为在谷胱甘肽的生物合成过程中，y - e c s 起主要作用，g s 起 次要作用( h e r s c h b a c h 等，1 9 9 8 ) 。y e c s 是属于含锌金属蛋白，也是唯一一种通 过形成可逆性二硫键而发挥生物活性作用的蛋白。y e c s 全酶是由两个亚单位组 成的异二聚体：一个是y - e c s 催化亚单位( 也叫y e c s 重链单位，y e c s h s ) ， 分子量约为7 3 k d ；另一个是y e c s 调节亚单位( 也叫y e c s 轻链单位，y - e c s l s ) ，分子量约为3 0 k d 。y e c s - h s 含有y e c s 所有底物的结合位点和所 有催化亚基，因此它具有y e c s 所有的催化活性，但其活性仍与y e c s l s 有关 ( 曹守冬和戴爱国，2 0 0 3 ；h i b i 等，2 0 0 4 ) ：y 。e c s l s 虽然不具有催化活，但它 具有调节r e c s 活性的作用。当细胞处于不同的氧化状态下，y e c s l s 调节存 在于两个亚单位之间的二硫键，使得y - e c s 活性区的构象发生改变而引起y e c s 活性发生改变( 程磷令和冉丕鑫，2 0 0 2 ) 。 植物体内谷胱甘肽的代谢主要有三种酶的参与：谷胱甘肽还原酶( g l u t a t h i o n e r e d u c t a s e ，g r ，e c l 6 4 2 ) ，谷胱甘肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g p x ， 云南师范大学硕士研究生学位论文 e c i 1 1 1 9 ) 和谷胱甘肽转硫酶( g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ，g s t ，e c 2 5 1 1 8 ) 。g r 是 主要的抗氧化酶之一，它是一种黄素蛋白氧化还原酶，在真核生物和原核生物中 都有发现。对植物来说，它在氧化胁迫反应中对清除活性氧起关键作用( 郭丽 红，2 0 0 2 ) 。谷胱甘肽必须以还原形式g s h 才能行使清除活性氧的职责，所以细胞 内谷胱甘肽库内的大部分谷胱甘肽处于还原状态，它也参与到g s h ，g s s h 和a s a 的整个循环中，对保持各种物质间的平衡非常重要( 刘家忠等，1 9 9 9 ； f o y e r 等， 2 0 0 1 ：g o m e z 等，2 0 0 4 ；h a d d a d ，2 0 0 2 ：m a y 等，1 9 9 8 ；n o c t o r 等，1 9 9 8 ，2 0 0 2 ； d ep i n t o 等，2 0 0 0 ：k o c s y 等，2 0 0 1 ) 。g p x 被认为是植物抵抗r o s 的关键酶，其 编码的基因在植物中的表达具有组织特异性( l e i s i n g e r 等，2 0 0 1 ) ，它在g s h 的参 与下可催化过氧化氢的还原，并作用于脂质过氧化物，使其变成无毒羟化物，减 轻或阻断脂质过氧化反应，免于细胞代谢异常( 刘家忠和龚明，1 9 9 9 ) 。g s t 主要存 在与胞质中，它催化g s h 与亲电子物质的结合，可以代谢环境污染物，药物和其 他一系列广谱异源物质，最终形成硫醚氨酸排出体外( p i c k e t t 和l u ，1 9 8 9 ； c h u b b e n 等，2 0 0 1 ) 。 除了以上三种酶，植物络合素合成酶( p h y t o c h e l a t i ns y n t h e t a s e ，p c s ) 也参与了 g s h 的代谢过程，g s h 在p c s 的作用下，可与金属离子结合而形成y g l u - c y s 多聚物，在植物抗重金属污染中有重要作用( e d w a r d s 等，2 0 0 0 ) 。 尽管g s h 在植物体内的降解过程还没有完全搞清楚，但一些科学家还是提出 了g s h 可能的降解途径：( 1 ) 通过液泡羧肽酶( c p a s e ) 从g s h 和谷胱甘肽结合物上 ( g s - x ) 去除甘氨酸；( 2 ) 通过y 谷氨酰转肽酶( y g t a s e ) 催化的转肽反应，把谷氨 酸从g s h 转移到其他二肽以形成y 谷氨酰循环的潜在底物；( 3 ) 在y g t a s e 的作 用下释放的二肽半胱氨酰甘氨酸( c y s g l y ) ，可进一步在二肽酶( d p a s e ) 的作用下代 谢为游离氨基酸( e d w a r d s 等，2 0 0 0 ) 。 植物中g s h 的生物合成、代谢和降解途径如图l 所示。 云南师范大学硬士研究生学位论文 。叶叭e t y l t r 耐e r a s e e x t r a c e u u a rs o ? 。 i h 奸e l l u ws o z l c h l o r o p l a s ts o ? la t ps u l f u r y l a s e a p s la p sr e d u c t a s e s 0 3 2 g s t 卜盎 l = 竺。 e x p o r t ( t h i 0 1 ) l y a s e g l u t a m a t e + c y s t e i n e 图1 、植物体内谷胱甘肽的生物合成、代谢和降解途径 f i g1 p a t h w a yo f g l u t a t h i o n eb i o s y n t h e s i s ，m e t a b o l i s ma n dd e 霉 a d a t i o ni np l a n t s 因为g s h 广泛而重要的生理作用，通过生物学手段增加植物体内的g s h 水 平无疑在食品、医学、保健、抗衰老等方面具有诱人的前景。目前对谷胱甘肽的 研究主要集中在两个方面，一是g s h 的生物合成过程是如何被调控的，另一方面 是胞内的g s h 水平与氧化还原状态在逆境胁迫下是如何在基因和生理两个方面被 调控的( 陈坤明等，2 0 0 4 ) 。 自从证实c a 2 + c a m 是植物体内信使系统以来，人们对其参与的生理生化功能 进行了大量研究。已经发现以c a - + 、c a m 为核心的钙信使系统参与数十种植物生 云南师范大学硕士研究生学位论文 理生化过程的调控，如植物对环境刺激的响应、激素作用、逆境胁迫、基因表达 和蛋白合成等( b e r g e y 和r y a n ，1 9 9 9 ；l 觚等，2 0 0 3 ：y a n g 和p o o v a i a h ，2 0 0 3 1 周江菊和夏快飞，2 0 0 5 ；宗会和李明启，2 0 0 1 ) 。c a m 影响许多酶的活性，并在某 种程度上对酶有操纵和调控作用。现已有一些初步证据显示植物c a 2 + c a m 信使系 统与抗氧化系统( 包括抗氧化酶和抗氧化剂) 之间有重要联系。我们实验室用c a m 亲和层析法首次发现植物抗氧化系统的核心酶s o d 是一种c a m 结合蛋白，表明s o d 是c a 2 + - c a m 依赖的酶( g o n g 和l i ，1 9 9 5 ) 。此外其他的研究者已发现c a 2 + - c a m 调控 着过氧化氢酶( y a n g 等，2 0 0 2 ) 、n a d 激酶( t u r n e r 等，2 0 0 4 ) 等数十种酶的活性( l i u 等，1 9 9 8 ) 。这些结果都暗示着钙信使系统能参与调节植物的抗氧化酶系统。 k o c s y 等( 2 0 0 1 ) 的研究结果暗示c a m 与作为抗氧化剂的g s h 之间存在重要联系， 但是目前还没有直接的报道证明c a m 和g s h 之间是存在怎样的关系，c a m 是否对 g s h 生物合成有影响? 已有一些报道指出，植物体内谷胱甘肽的生物合成主要是受 到两个限制因素的影响，即体内半胱氨酸浓度以及y 谷氨酰半胱氨酸合成酶( y e c s ) 的活性( n o c t o r 等，1 9 9 8 ：m a y 等，1 9 9 8 ) 。那么c a m 是否对g s h 合成的这两个 限制因素有影响? 如果c a m 对谷胱甘肽生物合成的两个限制因素都有影响，那么 影响效果是相同的还是各有差别? 谷胱甘肽和抗坏血酸既是植物体内重要的抗氧化剂，同时也是细胞内最主要 的氧化还原缓冲体系。由于植物体内存在a s a g s h 循环，c a m 在g s h g s s g 进行调 控的同时，是否也对a s a d h a 比例有影响? 对g s h g s s g 和a s a d h a 比例的调控是 c a m 通过影响哪些环节来实现的? 我们实验室利用诱导表达细胞质c a m 的转基因烟草为实验材料，研究了c a m 对谷胱甘肽和抗坏血酸代谢的影响，以期对上述问题有初步了解。 云南师范大学硕士研究生学位论文 一、植物材料 材料和方法 诱导表达细胞质c a m 的转基因烟草h l - 1 c 、h 1 2 c 以及未转化的空白对照 h o 2 0 2 0 种子。将上述种子置于1 的n a c l 0 中消毒2 5r a i n 、再用无菌水漂洗5 - 6 次后，用0 2m e , l 的赤霉素( g a 3 ) 浸泡，4 c 下过夜。此后，对照h 0 2 0 2 0 种子播 种于含5 0 m g l 的卡那霉素m ) 的m s 培养基中，h 1 1 c 、h 1 - 2 c 播种于含5 0 m g l 的卡那霉素( 弛n ) 、5m g l b a s t a 的m s 培养基中1 6 小时光照培养( 2 4 c 2 6 c 夜 昼) 2 3 周后，选择未黄化的幼苗于不含抗生素的m s 培养基中继续生长2 周左右， 转入盆栽继续生长1 2 月，叶片备用。 二、 处理方法 1 、t c 诱导处理 将上述生长了近两个月的烟草离体叶圆片分成重复的两组，a 组置于含3 m g l 四环素f r c ) 的m s 培养基，b 组置于不含t c 的m s 培养基中，2 4 c 下光照诱导2 4 小时备用。 2 、c a m 抑制剂处理 将上述经t c 诱导2 4 小时的转基因烟草h 1 1 c 和h 1 2 c 叶圆片分别置于含 有0 2 5 、o 5 、0 7 5 和1 0 m m o l l 的c a m 抑制剂c p z 和t f p 的m s 培养基中处 理1 2 小时。 三、测定方法 l 、c a m 的提取 按黄号栋等( 2 0 0 3 ) 方法：取诱导后的烟草叶圆片o 1 9 ，液氮速冻。在冰浴条件 下，加入0 51 n l 提取液( s om m o l lt r i s h c l ，1m m o f le g t a ，1m m o l i l p m s f ， 2 0m m o l l n a i - i s 0 3 ，o 1 5m m o l l n a c l ，p h7 5 ) 进行研磨，在4 下2 0 ，0 0 0 g 离 心3 0r a i n ，取上清液重复离心一次。将上清液分装，液氮冰冻后于8 4 c 下保存备 2 云南师范大学硕士研究生学位论文 用。 2 、c a m 的测定 按黄号栋等( 2 0 0 3 ) 方法：在冰浴中，在含0 0 0 5up d e ( 相当于约15m 的p d e 提取物) 的0 5i n l 反应缓冲液( 4 0m m o l lt r i s - h c l ，4 0m m o l l 咪唑，5 r n n t l o l l m g c | 2 ，0 5m m o l lc a c h ，p h7 5 ) 中，加入标准c a m 或一定体积的植物 c a m 提取液( 一般为6 1 5 山) ，再加入5 0 山2 0m m o l l 的c a m p 以启动反应，转 入3 0 ( 2 水浴下反应3 0r a i n 。反应到时后试管转移到沸水浴中4r a i n 以终止反应， 然后马上冰浴冷却，再加入1 0 0 m l m g m l 的蛇毒，于3 0 ( 2 水浴中反应2 0 r a i n ， 加入7 0 山5 5 t c a 以终止反应。以2 0 0 0 0 g 离心1 0 n f i n ，取6 0 0 m 上清液测无 机磷以测定c a m 的活性。 1 个活性单位的c a m 是指在p h7 5 、3 0 ( 2 和o 0 1m m o l lc a 2 + 存在的条件下， 激活0 , 0 0 8 个单位p d e 到5 0 最大活性时所需要的c a m 的量( s i g m a 公司的c a m 活性定义) 。在每次测定中总是包括一组加入过量的标准c a m ( 5 个单位) 的试管作 为最大激活组，和一组不加c a m 的试管作为p d e 激活的零对照( p d e 基础活性) ， 以此来计算样品中c a m 对p d e 的激活百分率，进而用直线回归方程来计算样品 的c a m 活性。 3 、无机磷的测定 按照l i n d b e r g 等( 1 9 5 6 ) 1 舫法。取6 0 0m 样品，加入等体积的定磷试剂( 3 m m o l l h 2 s 0 4 、蒸馏水、2 5 钼铵酸和l o v i t c ，按1 ：2 ：1 ：1 的比例配制) 。 混匀后置于4 5 c 水浴反应2 5m i l l ，反应结束于室温下冷却，在2h 内测定6 6 0 a m 处的吸光度。 4 、蛋白质的测定 样品蛋白质含量按b r a d f o r d ( 1 9 7 6 ) 方法测定，以牛血清蛋白为标准。 5 、谷胱甘肽还原酶和抗坏血酸专一性过氧化物酶的提取和测定 参考李忠光等( 2 0 0 2 ) ：提取液为5 0m m o l lt r i s h c l 缓冲液，p h7 0 ，内含 云南师范大学硕士研究生学位论文 2 0 0 o 甘油，1m m o v le d t a ，1m m o l la s a ，1m m o l ld t t ，l 础m 洲lg s h ，5 m m o l l m g c l 2 。称取经上述处理的烟草离体叶圆片0 5g ，加入3m l 预冷的提取液， 充分冰预研磨后，转入离心管中，再用2m l 提取液淋洗研钵，合并提取液，于4 下2 0 , 0 0 0 g 离心3 0r a i n ，将上清液分装，液氮冷冻后于8 4 保存或直接进行酶 活性测定。 谷胱甘肽还原酶( g r ，e c1 6 4 2 ) 活性的测定。按照李忠光等( 2 0 0 2 ) 的方法： 反应混合液为5 0m m o y lt r i s - h c l 缓冲液，p h7 5 ，内含0 1m m o l le d t a ，5m m o l l m g c h 。根据n a d p h 的氧化作用，测定在3 4 啦下的吸光度的减少来衡量。 抗坏血酸专一性过氧化物酶( a p x ，e c1 1 1 。1 7 ) 的测定。按照李忠光等( 2 0 0 2 ) 的方法：反应混合液为5 0 m m o l l t l i s - h c l 缓冲液，p h7 0 ，内含o 1m m o l l e d t a ， o 1m m o l l h 2 0 2 。根据在2 9 0 r i m 抗坏血酸被氧化时吸光度下降进行测定。 6 、g s g s s g 的提取和测定 按照k n o r z e r ( k n o r z e r 等，1 9 9 6 ) 的方法，并作如下修改：称取诱导后的烟草叶 圆片0 4g ，液氮速冻。在冰浴条件下，加入预冷的5 磺基水杨酸1i r l l ，充分研磨， 在4 c 下2 0 ，0 0 0 窖离l , 2 0r a i n ，将上清液分装，液氮冰冻后于8 4 c 下保存备用或 直接测定。 按照n a g a l a k s h m i 的方法( n a g a l a k s h m i 永i p r a s a d ，2 0 0 1 ) ，并作如下修改：取上 述提取液5 0 “l ，用5 磺基水杨酸定容至1 0 0 此，( 即加入5 磺基水杨酸5 0 p l ) ，加 入2 4 此1 8 4m o l l 三乙醇胺以及5 0 旺1 0 乙烯毗啶( 用7 0 9 6 乙醇配制) ，于2 5 水浴1 h ，以除去g s h 。此后加入7 0 6 # x l5 0 m m o l l 磷酸缓冲液( p h7 5 ，内含2 5 m m o l le d t a ) ，2 0p l1 0m m o l ln a d p h 和8 0p l1 2 5m m o l ld t n b ( 二硫硝基 苯甲酸) ，充分混匀后于2 5 c 保温1 0r a i n ，加入2 0 皿5 0u m g r ，总体积为1m l ， 立即混匀，读出3m i l l 时的o d 值。 此法用来测定g s s g ，总的谷胱甘肽( g s h + g s s g ) 的测定只要把上述的乙烯 毗啶用等体积的蒸馏水替代即可。以5 磺基水杨酸为溶剂，用同样的方法制作 g s s g 标准曲线。 7 、a s a d h a 的提取和测定 按照k _ i l o i z 时f k n o r z e r 等，1 9 9 6 ) 1 勺方法，并作如下修改：称取诱导后的烟草叶 圆片o 4g ，液氮速冻。在冰浴条件下，加入预冷的5 磺基水杨酸1m l ，充分研磨， 云南师范大学硕士研究生学位论文 在4 c - f 2 0 ；0 0 0 x g 离一t , 2 0m i l l ，将上清液分装，液氮冰冻后于一8 4 ( 2 下保存备用或 直接测定。 按照j i 跹g ( j i a n g 和z h a n g ，2 0 0 1 ) 的方法，并作如下修改：取上述提取液1 0 0 啦，加入2 4 此1 8 4 m o l l 的三乙醇胺、2 5 0 r t l5 0 m m o l l 的磷酸缓冲液( p h 7 5 ，内 含2 5 m m o l l e d t a ) 和5 0 u l1 0 m m o l l 的d t r ，于2 5 ( 2 下水浴1 0 m i n 。此后加入 5 0 止0 5 的乙基马来酰亚胺，充分混匀后分别加入1 0 的t c a ，4 4 的磷酸和 4 的双吡啶各2 0 0 1 t l 。随后加入3 的f e c l 3 1 0 0 1 l ，并于4 0 ( 2 下水浴l h 。到时在 5 2 5 n m 处测定0 d 值。 8 、半胱氨酸的提取和测定 按照y o u s s e f i a n 的方法( y o m s e f i m 等，2 0 0 1 ) ，并作如下修改：称取经上述处 理的烟草离体叶圆片1g ，液氮速冻后加入1 0m l 预冷的提取液( 8m m o l l 抗坏血 酸钠，8 0m m o l l 磺基水杨酸，1m m o l le d t a ) ，充分冰预研磨后，转入离心管 中沸水浴4r a i n ，于o 下2 0 ，0 0 0 g 离心1 5r a i n ，将上清液分装，液氮冷冻后于 8 4 。c 保存或直接进行测定。 总巯基( s h ) 的测定：1m l 上清液与l m l5 0m m o l lp h 5 8 的m e s 在3 0 下 水浴1 0 m i n ，然后加入o 1 m l1 0m m o l ld n t b ( 用p h 7 0 的8 0m m o l l 磷酸钾配制) 以及2m l0 4m o f lt r i s h c i 缓冲液，p h8 0 ，充分混匀后于4 1 5 r i m 测定吸光度。 半胱氨酸含量的测定是基于它的活性巯基可与丙酮醛发生反应。因此，总巯 基的量减去上清液与丙酮醛反应后所测得的巯基量，即为半胱氨酸含量。 9 、y 谷氨酰半胱氨酸合成酶0 e c s ) 的提取和测定 按照o g a w a 的方法( o g a w a 等，2 0 0 4 ) ，并作如下修改：提取液为o 1m o l lh c l ， 称取经上述处理的烟草离体叶圆片0 1g ，液氮速冻后加入1i n l 预冷的提取液，充 分冰预研磨后，转入1 5m l 离心管中，于4 下2 0 ，0 0 0 g 离心1 0r a i n ，将上清 液分装，液氮冷冻后于8 4 c 保存或直接进行酶活性测定。 将2 0 0 儿上清液与4 0 0 此反应混合液( 5 0r a r a o l lt r i s - h c l 缓冲液，p h 7 6 ， 内含o 2 5 m m o l l 谷氨酸，1 0 m m o l l a t p ，1m m o l l 二硫赤藓糖醇，2 m m o l l 半 胱氨酸) 在2 5 。c 下反应1 h ，然后加入6 0 0i x l 定磷试剂( 3m m o l l h 2 s 0 4 、蒸馏水、 云南师范大学硕士研究生学位论文 2 5 钼铵酸和1 0 v i t c ，按1 ：2 ：1 ：l 的比例配制) 。混匀后置于4 5 c 水浴 反应2 5 r a i n ，反应结束于室温下冷却，在2 h 内测定6 6 0 眦处的吸光度。 i 0 、0 乙酰丝氨酸硫解酶( 0 a c e t y l s e r i n e ( t h i 0 1 ) l y a s e ) 的提取和酶活性的测定 按照b l a s z c z y k 的方法0 3 l a s z c z y k 等，2 0 0 2 ) ，并作如下修改：准确称取经上述 j 处理的烟草离体叶圆片o 1g ，液氮速冻后加入1 6 0 “l 预冷的o 1m o f lt r i s h c i 缓冲液，p h 7 6 ，于1 5m l 离心管中充分冰预研磨后，于4 c 下2 0 ，0 0 0 占离心1 5 m i l l ，将上清液分装，液氮冷冻后于8 4 c 保存或直接进行酶活性测定。 反应液终体积为1 4 5 吐，内含1 0 0n a n o l f l t r i s - h c l ，p h 7 6 ，1 0 0